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MÉTODO DO ÁCIDO DINITROSALICÍLICO (DNS) – MILLER (1959) Utilizado para a quantificação de açúcares redutores (AR) 1) Reagentes ♣ Ácido dinitrosalicílico (DNS

); ♣ NaOH 2N; ♣ Tartarato duplo de Sódio e Potássio (Sal de Rochelle); ♣ Glicose ou uma mistura de frutose e glicose (10mM). 2) Metodologia ♣ Preparação do reagente DNS Adicionar 50 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 2N a 2,5 g de DNS e aproximadamente 125 mL de água destilada e agitar até à dissolução. Posteriormente, adicionar 75g do sal de Rochelle e completar o volume da solução para 250 mL. Este reagente é instável na presença de luz e CO2. ♣ Obtenção da curva padrão Conforme Tabela 1, após adicionar o reagente de DNS, agitar a mistura e levar os tubos ao banho-maria a 100 ºC durante 5 minutos. Deixar esfriar a temperatura ambiente e completar o volume para 5 mL com água destilada. Fazer a leitura em λ =540nm no espectrofotômetro U.V. Tabela 1. Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares redutores.
Tubos 1 2 3 4 5 * Volume reacional = 5 mL. Glicose (10 mM) (mL) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 Água (mL) 0,75 0,65 0,55 0,45 0,35 DNS (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 µmol de AR 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0

Obs.: Para quantificar AR de um extrato de tecidos convenientemente preparado, pode-se usar até 0,75 mL de alíquota e seguir as mesmas recomendações para a obtenção da curva padrão.

20mL de H2SO4 concentrado.V.6 0.0 Antrona (mL) 2. Resfriar a temperatura ambiente ou no gelo e fazer a leitura em λ = 620nm em espectrofotômetro U.0 2.2 0.0 2. Tabela 2.0 µg de AST 0 6 12 24 36 48 60 * Volume reacional = 3 mL.0 Água (mL) 1. Agitar os tubos e levá-los ao banho-maria à 100ºC por 3 minutos.0 2. Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares solúveis totais.0 mL.4 0. adicionar primeiramente a solução de glicose e depois o reagente Antrona.0 0. Obs. 2) Metodologia ♣ Preparação do reagente antrona: Adicionar 40 mg de antrona a 1 mL de água destilada e após.333 mM.0 2. ♣ Glicose 60 µg/mL ou 0.2 0. .1 0.0 0.4 0.: Para quantificação de AST em tecidos vegetais pode-se usar alíquotas de até 1. ♣ Obtenção da curva padrão Conforme Tabela 2. Tubos 1 2 3 4 5 6 7 Glicose (60 µg / mL) (mL) 0.0 2.0 2.YEMM & WILLIS (1954) Utilizado para quantificação de açúcares solúveis totais (AST) 1) Reagentes ♣ Reagente Antrona.6 0.8 1.9 0.8 0. (Este reagente deve ser preparado na hora do uso e sob resfriamento). Este sistema deve ser mantido em gelo. ♣ H2SO4 concentrado.MÉTODO DA ANTRONA .

V.3 µmol de aa 0.7 Etanol 60 % (mL) 1.7 1.0 Água (mL) 1.1 µmol / mL) (mL) 0.: Em tecidos vegetais seguir o procedimento de extração mais indicado para cada tecido e.01M em 100 mL de metilcelosolve).3 1.0 mL Obs1. completar com etanol 60% e agitar novamente. Obs2.5 mL. agitar e levar ao banho-maria à 100ºC por 20 minutos para desenvolver a coloração.YEMM & COCCKING (1955) Utilizado para quantificação de α−aminoácidos 1) Reagentes ♣ Tampão citrato de sódio 0. usar alíquotas de até 1.3 1. ♣ Etanol 60% (v/v).3 1.3 1.2 0. C = 1.4 0.0 0.: Os reagentes.00 0. pH = 5. B e C. posteriormente. fazer a leitura em λ = 570nm no espectrofotômetro U. quando guardados separadamente e de modo adequado.0 mL de extrato.8 0.04 0.1µmol/mL.2 0. ** Volume reacional = 4. Procedimento para obtenção da curva padrão de aminoácidos.7 1.02 0.2M.0 Reagentes A+B+C (mL)* 1.6 0.06 0. Posteriormente.8 1.7 1.6 0.08 0. Tabela 3.4 0.3 1.2 mL.7 1.0 0. podem ser armazenados por até 30 dias. Tubos 1 2 3 4 5 6 Glicina (0. 2) Metodologia Conforme Tabela 3. ♣ Glicina ou qualquer outro aminoácido em concentração 0. Após o resfriamento. ♣ Ninhidrina 5% em Metil Celosolve ♣ KCN 2% em Metil Celosolve* (2 mL de KCN 0.10 * A = 0.0 mL. B = 0. * Metil celosolve = Etileno glicol monometil éter .0.7 1. após a adição do padrão de aminoácidos e dos reagentes A.ENSAIO DA NINHIDRINA .

Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas utilizando-se como padrão BSA 1 mg/mL.04 0. ♣ Procedimento para obtenção da curva padrão Proceder conforme Tabela 4.0 5. Adicionar 100 mL de H3PO4 85% e completar para 1 L.00 Comassie Blue G-250 (mL) 5.0 5.1mL retiradas de soluções de 20. ♣ Soro Albumina Bovina (BSA) (1mg/mL ou 10 µg/0.08 0. 80 e 100 •µg de BSA/0.10 0.02 0.0 5.10 Água (mL) 0.1mL). Deixar 12 horas agitando em overnight e filtrar. Tubos 1 2 3 4 5 6 BSA (1 mg / mL) (mL) 0. as concentrações finais serão: 0. Tabela 4. .06 0.V.7% de etanol. agitar os tubos em vórtex e fazer a leitura no espectrofotômetro U.01% de Comassie. 40.5% de ácido fosfórico e 4.08 0. Dessa forma. H3PO4 e etanol.MÉTODO DE BRADFORD (1976) Utilizado para quantificação de proteínas totais 1) Reagentes: ♣ Comassie Blue G-250.1 mL Erros de pipetagem podem ser minimizados utilizando-se alíquotas de 0. em ë= 595 nm.06 0. (Ácido fosfórico deve ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol e nunca o contrário). Após. Se assim for.0 5. 60. a curva seguirá o padrão mostrado na Tabela 5.0 5.0 µg de proteína 0 20 40 60 80 100 * Volume reacional = 5.04 0.02 0. 8.1mL.00 0. 2) Metodologia ♣ Preparação do reagente Comassie-blue G-250 Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95%.

1 de H2O 0.1 Comassie Blue G-250 (mL) 5.1N. .0 µg de proteína 0 20 40 60 80 100 Obs 1: A quantificação de proteínas em extratos vegetais pode ser feita usando-se volumes iguais do extrato e de TCA (10%) que posteriormente deve ser centrifugado e o pellet ressuspendido com NaOH 0.1 0. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas utilizando-se como padrão soluções diluídas de BSA.0 5.1 mL BSA (X µg / 0.0 5.Tabela 5.1 mL) (mL) 0.0 5.0 5.1 0. retirar uma alíquota de 0.1 0.1mL e proceder conforme recomendações da curva padrão. Tubos 1 2 3 4 5 6 * Volume reacional = 5. Após.0 5.1 0.