Crystallographic Studies on Recombinant Human Stem Cell Factor ­ 141

10 November, 2008

Ogan Gurel Prof. Wayne A. Hendrickson

Crystallization Experiments
The full­length extra­cellular form of SCF is very soluble and after preliminary screening trials, no  crystals were obtained.  Screening with the 141 amino acid­long truncated form was more successful,  however crystals that were ultimately of the orthorhombic form were quickly obtained.  When these  crystals were first observed, their complexity and uniqueness were not completely appreciated.  As it  turns out, the conditions for crystallization are actually quite specific and furthermore a number of  crystal types may appear within the same droplet.  The sensitivity to conditions makes it difficult to  systematically evaluate the multiplicity of crystal types, while this multiplicity complicates the  subsequent diffraction analysis.  Tables 1 & 2 summarize these results.

Photo # 1: Photo # 2:

Orthorhombic crystals (long & block) Hexagonal crystals

Table 1.  rhSCF­141 Crystallization Conditions Crystal Type Initial crystallization  droplet

Equilibrium reservoir &  temperature

ORTHORHOMBIC 1 2 Types A , A , & B

14.5 % PEG 400 2 12.5M  CaCl 50mM HEPES pH 7.5 50mM NaCl 5mM NaAcetate 5mg/ml rhSCF­141

29% PEG 400 2 0.25 M CaCl 100mM HEPES pH 7.5

T = 22°C

HEXAGONAL Type C

0.29M Na.K phosphate               pH 9.0 0.29% PEG 400 57mM NaCl 5.7mM NaAcetate 5.7mg/ml rhSCF­141

2.0 M Na/K phosphate

T = 22°C

Table 2.  Crystallization parameters for the  Orthorhombic form Parameter

Discussion

pH dependence

Crystals grow best (single & clean faces) when  equilibrated to a reservoir at pH 7.5.  Crystals  become poorly formed at pH 7.3 to 7.4 and do not  grow at below pH 7.3.  However, the crystals are  optimally stabilized at a slightly lower pH of7.2 to  7.3.

Temperature dependence

The optimum temperature is 22°C.  Experiments  that were done at 20 °C yielded poorly formed  crystals while those done in the cold room 4 °C  resulted in microcrystalline spherulites.

Divalent cation dependence

Calcium seems to be required for the  orthorhombic (not the hexagonal) crystals.  Substitution with Mg or Zn resulted in phase  separation / precipitation and heavy precipitation  respectively.

b­octyl glucoside (BOG)

Strongly inhibited crystallization at all  concentrations (0.1% ­ 1%).

Different buffers

Crystallization with MOPS or TRIS buffers at the  equivalent or slightly different pH ranges resulted  in poorly formed crystals.  With TRIS the long  forms (A1) seemed to predominate.

Growth characteristics

The crystals grow in 4 to 5 days in the presence of  a heavy precipitate.

Crystal morphology

See picture 1.  Either a "long form" (mostly type  A1) or a "block form" (mostly type A2 & B).

Birefringence

Moderately birefringent (biaxial), which the block  form being slightly stronger.

Crystal dimensions (average)

Long form:  0.3 x 0.15 x 0.15 mmBlock form:  0.35 x 0.25 x 0.25 mm

Diffraction Experiments
Stabilization Initial experiments were made difficult by the relative radiation sensitivity of these orthorhombic SCF  crystals.  The crystals would last less than 48 hours in the x­ray beam with a useful life of just one day.  To improve the crystal lifetimes, stabilization conditions were screened which substantially increased  the useful beam time to over 100 hours.  In addition, stabilization and careful drying also yielded some  improvements in the maximum diffraction limits.  The stabilization conditions are outlined below: Table 3. Stabilization  conditions 30% PEG 400

0.25M CaCl2

100 mM HEPES pH 7.2

100 mM NaCl

Crystals are placed overnight in stabilization vials and then mounted with the stabilization buffer  serving as the mother liquor. Diffraction limits Initial experiments seemed to present confusing results in that some orthorhombic crystals seemed to  diffract well, while others diffracted quite poorly.  The differences in diffraction quality did not seem to  correlate with crystal size and it became apparent that we were potentially dealing with a number of  crystal types.  Although, these types have not been completely defined, their putative diffraction limits  (AFC5 rotating anode, 50kV,  100mA) are listed below: Table 4: Diffraction limits for  the orthorhombic crystals Crystal Type Consistent  Some spots seen to: diffraction limit

A1

3.8

3.7

A2

3.1

2.9

B

2.8

2.7

The hexagonal crystals do not seem to diffract well (only to about 6 Angstroms or so).

Diffraction Photographs
Photo # 1:

Type B (?) still (relatively wet crystal) small angle precession, 0.3 mm collim/Ni filter, F=75mm.

Photo # 2: 

Type A2 still 0.2 degrees, 2.8 hours, 0.5 mm collim/Ni filter, F=75mm Type A1 precession photo 7 degrees, 16 hours, 0.5 mm collim/Ni filter., F=75mm

Photo # 3:

Crystal Parameters
Precession photographs (screened & unscreened) on the orthorhombic crystals show the following  features: Table 5: Reciprocal space features of the  orthorhombic crystals Symmetry mm symmetry in all major zones (both 0  level and upper levels)

Systematic absences

odd absences along all three axes  indicative of a 21 screw.

Reciprocal space angles

All axes are orthogonal.

1 1 1 These features point to space group P2 2 2 .  Crystal form B has not been fully characterized, but is  certainly orthorhombic with at least two screw axes. Table 6. Crystal Parameters Crystal  Space group a (Å) type

b (Å)

c (Å)

Volume( Å3)

n   (# in  au).

solvent  content

A1

1 1 1 P2 2 2

(88.2* 89.2**

84.4* 84.4**

73.1* ) 73.7**

554,849

n=2 n=4

73% 46%

A2

1 1 1 P2 2 2

88.1*

83.4*

72.7*

534166

n=2 n=4

72% 43%

B

2 2 2 P 1 1 ?

81.9

62.5

54.0 ?

276412

n=1 n=2

73% 45%

C

hexagonal by  external  morphology

N.A.

N.A.

N.A.

N.A.

N.A.

N.A.

* by precession ** by area detector refinement Judging from the robustness of the crystals and the quality of diffraction ­­ its limits and water  background) there are most likely 4 molecules per asymmetric unit in the orthorhombic A form.  

Native Data Collection
1 Data were collected on orthorhombic form A  using the AFC6 rotating anode source (50kV, 100mA)  and a Hamlin multiwire area detector (one detector configured at F = 560 mm).   Data collection began  about 1.5 days after initial x­ray irradation and the total actual data collection time took about 24 hours  using 4 orientations (500 frames each at 45 sec/frame).  Unfortunately, the data collection program  went into an unexplained loop and the collection had to be interrupted and resumed.  The later batches  appeared to be affected by radiation damage.  A total of 15269 observations were recorded with 5540  independent reflections.  A quick analysis of the data shows that it falls off rapidly at around 4  Angstroms resolution ­­ a conclusion which is supported by the data below: Table 7.  Data collection statistics by resolution shell. Dmin fac cum R R

Intensity  >3s

4.37

0.114

0.077

70.4

4.24

0.111

0.079

70.1

4.11

0.134

0.081

63.7

4.00

0.133

0.083

60.0

3.90

0.187

0.085

49.4

3.80

0.197

0.087

40.6

2 The data seems to be relatively strong out the 4 Angstroms, and it is hoped that crystal form A  will  yield consistent data out to 3.1 Angstroms, especially if data collection can be quickly started and count  times increased to 60 sec/frame.

Conclusions & further work
The basic elements are in place to begin moving towards solving the phase problem.  The basic strategy  is as follows: 1.  Shift crystallization equilibrium towards A2 through seeding.  Grow  crystals in quantity.

2.  Continue to search through extant crystals for type B.

3.  Collect 3.1 Angstrom native data on A2.

4.  Evaluate improvement in diffraction on A2 with synchrotron  radiation.

5.  Screen for heavy atom derivatives on A2

6.  Begin Se­methionine crystallizations A2

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful