7.1.

PRIN INTRODUCERE PERFORMAN

CROMATOGRAFIA

DE

LICHIDE

DE

NALT

Prin cromatografie se nelege procedeul de separare a dou sau mai multor substane pe baza afinitilor lor diferite fa de o faz staionar i o faz mobil care este n micare n raport cu faza staionar. Figura 8.1. ilustreaz clasica schem a separrii cromatografice a doi solui pe o coloan mpachetat cu un adsorbent solid, prin care circul un solvent. Solutul A are o afinitate relativ mai mare fa de materialul fazei staionare dect solutul A. Ca urmare solutul B este eluat din coloan mai ncet dect solutul A, rezultnd separarea lor. Cromatografia de lichide (LC) este cea mai veche i probabil cea mai puternic form de cromatografie. Cromatografia, ca tehnic de separare, a fost

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

descoperit i denumit astfel de Tswett n 1903 [65, 66]. De atunci, dezvoltarea tehnicii cromatografice s-a realizat destul de ncet i numai n ultimii ani a cunoscut o dezvoltare foarte rapid. Cromatografia de lichide de nalt performan se bazeaz pe dezvoltarea ctorva domenii din cadrul LC: aparatura, coloane speciale i materiale de umplere (suporturi cromatografice), teoria procesului cromatografic, etc. Un rol important l-a jucat realizarea unor echipamente ce pot realiza presiuni ridicate, volume-moarte (dead-volume) reduse i detectoare foarte sensibile. La acestea se adaug realizarea unor suporturi cromatografice speciale, care au permis separri cromatografice rapide, reproductibile i de mare performan. Putem considera c nceputurile cromatografiei de lichide moderne au avut loc pe la sfritul anilor 50, cnd Spackman, Stein [67] i Moore [68] au introdus analiza automat a amestecurilor de aminoacizi. Aceasta a fost urmat de lucrrile de pionierat ale lui Hamilton [69] i Giddings [70] n fundamentarea teoretic a HPLC, ct i de lucrrile HPLC de schimb-ionic ale lui Scott i de permeaie n gel ale lui J.C. Moore [68]. Din 1969 lucrrile publicate referitoare la HPLC sau nmulit enorm de mult, orice cuantificare fiind subevaluat. Tehnica i teoria HPLC au ajuns astzi la maturitate, dei exist nc multe pori deschise spre perfecionarea lor.

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

Figura 7.1. Ilustrare a separrii cromatografice: (a) amestecul de solui A i B sunt adugai la captul superior al coloanei cromatografice ; (b) dup ce faza mobil (solventul) a percolat coloana pentru ctva timp, soluii A i B sunt separai n coloan; (c) solutul A elueaz din coloan; (d) solutul B elueaz din coloan, separarea fiind ncheiat cu succes.

HPLC are foarte multe aplicaii, n diferite domenii:

Industria farmaceutic: controlul calitii medicamentelor; analize de me-

dicamente i metabolii
Cercetarea medical clinic: dozare de medicamente i metabolii Industria alimentar: dozare de aditivi, pesticide i alte substane toxice

contaminante
Toxicologie: dozare de medicamente (droguri) i metabolii Protecia mediului: dozare de pesticide, clorofenoli, hidrocarburi aromatice

policiclice ct i a altor poluani

Biochimie: elucidarea structurii proteinelor ct i a altor substane de interes

biochimic
Petrochimie: analiza unor compui specifici Industria polimerilor: analiza monomerilor, aditivilor i a altor compui

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

specifici.
la care se adaug i domeniul foarte nou al sistematicii biochimice.

Cromatografia tradiional pe coloan (fie ea de orice tip - de adsorbie, partiie sau de schimb ionic), n strat subire i pe hrtie, i cromatografia de lichide modern sunt toate forme ale cromatografiei de lichide. Diferenele dintre toate aceste procedee se refer la detalii de echipament, material cromatografic, tehnica de lucru, dar cromatografia de lichide modern are cteva avantaje majore fa de celelalte tehnici menionate: vitez sporit de separare, posibilitatea de a separa amestecuri complexe, uurin n executare, etc. Pentru a aprecia mai bine avantajele cromatografiei de lichide moderne s facem dou comparaii: ntre cromatografia de lichide i cea de gaze i ntre cromatografia de lichide modern i cea tradiional. 7.2. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE COMPARAT CU CROMATOGRAFIA DE GAZE Capacitatea excepional a cromatografiei de gaze (GC) de a separa i analiza amestecuri foarte complexe este astzi unanim recunoscut. Comparat cu metodele cromatografice anterioare, GC realizeaz separri mult mai rapide i eficiente. Exist sisteme cromatografice pentru GC total automatizate, la preuri acceptabile, cu performane excelente. Totui multe amestecuri nu pot fi rezolvate de GC, fie din cauz c substanele respective nu sunt volatile, fie c sunt instabile termic i se descompun n timpul cromatografierii. S-a estimat c numai 10% din compuii organici pot fi separai corespunztor cu ajutorul GC, fr modificri chimice prealabile. Cromatografia de lichide, pe de alt parte, nu cunoate limitri datorit volatilitii sau instabilitii termice a probelor. Astfel, LC este ideal pentru separri de macromolecule i specii ionice (de interes biomedical), pentru produi naturali sensibili i pentru o mare varietate de alte substane cu mas

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

molecular mare, mai puin stabili, cum ar fi: proteinele, aminoacizii, acizii nucleici, polizaharidele, pigmenii vegetali, lipidele polare, substanele de interes farmaceutic (hormoni, vitamine, antibiotice, etc.), coloranii, surfactanii, medicamentele, pesticidele, etc. Cromatografia de lichide are unele avantaje fa de GC i poate rezolva (de cele mai multe ori) separri mai complexe deoarece: n LC sunt utilizate dou faze (una staionar i alta mobil) cu selectiviti diferite fa de moleculele supuse separrii, fa de doar una n GC. Separarea cromatografic este rezultatul unor interacii specifice ntre moleculele probei cu fazele staionar i mobil. Aceste interaciuni sunt absente n ce privete faza gazoas mobil a GC, dar sunt prezente n cazul LC, furniznd astfel o variabil n plus n ce privete controlul i mbuntirea separrii. n LC exist (cel puin pn acum) o mai mare varietate de suporturi cromatografice; n LC se utilizeaz temperaturi sczute (cel mai adesea temperatura ambiant). n LC se poate utiliza o mare varietate de detectoare: colorimetre (eventual combinate cu reactoare unde se desfoar reacii de formare a compuilor colorai), spectrofotometre n UV, fluorimetre, detectoare de conductivitate, de refracie, detectoare polarografice, detectoare radiometrice, etc. corespunztor elimin necesitatea unei separri complete. Un mare avantaj al LC fa de GC este faptul c dup separarea cromatografic substanele pot fi uor recuperate n eprubete separate, cu ajutorul colectoarelor de fraciuni. Trecerea de la LC analitic la cea preparativ se face relativ uor, recuperarea componentelor separate fiind n anumite cazuri de separri cromatografice n LC utilizarea unui detector

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

cantitativ. Exist posibilitatea de recuperare a componentelor i n GC, dar procedeul este mult mai complicat i cel mai adesea necantitativ. n ciuda avantajelor menionate ale LC fa de GC, aceasta din urm este aplicat cu prioritate dac nu sunt de ateptat probleme speciale n ceea ce privete separarea componentelor amestecului de analizat. Separrile prin GC sunt n general mai rapide i mai sensibile i, cel mai adesea, mai puin costisitoare. 7.3. CROMATOGRAFIA TRADIIONAL S considerm acum diferenele dintre sistemul cromatografic tradiional i cel modern: n LC clasic, o coloan este, n general, utilizat o dat (n cel mai bun caz de cteva zeci de ori) dup care este golit i reumplut (eventual materialul de umplere este regenerat). Aceasta reprezint o mare cheltuial att de manoper ct i de material. Aplicarea probei, pentru a se face corect, necesit o mare pricepere din partea operatorului. Curgerea solventului (eluentului) prin coloan se realizeaz prin cdere liber (pe baza acceleraiei gravitaionale), sau cu ajutorul unor pompe peristaltice. Separrile cromatografice dureaz, n varianta clasic, cteva ore (uneori cteva zile), fiind prin urmare procedee mari consumatoare de timp i de efort uman. Variantele LC pe hrtie (paper chromatography = PC), aprut prin ani 40 i a cromatografiei n strat subire (thin-layer chromatography = TLC) din anii 50 a simplificat ntr-o oarecare msur multe din operaiile necesare executrii cromatografiei. Astfel, realizarea stratului (patului) cromatografic n TLC sau PC s-a simplificat mult i a devenit mult mai ieftin. Hrtia cromatografic sau plcile gata turnate pentru TLC pot fi astzi cumprate la preuri acceptabile. Aplicarea probelor n aceste tehnici este mai puin
DE

LICHIDE

MODERN

COMPARAT

CU

CEA

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

pretenioas, existnd de altfel i dispozitive care ajut la realizarea acestei operaii. Curgerea solventului se realizeaz, cel mai adesea prin capilaritate, hrtia sau placa cromatografic fiind introdus ntr-un tanc cromatografic nchis, ce conine o mic cantitate din solventul eluant. n acest fel, singura intervenie a operatorului const n urmrirea frontului de solvent pentru a opri procesul cromatografic la timpul dorit. Detectarea i cuantificarea substanelor separate se realizeaz prin stropirea hrtiei sau plcii uscate cu reactivi cromogenici corespunztori, pentru a se crea spoturi colorate pentru fiecare component separat. Tehnica PC i TLC a simplificat mult procesul cromatografic i a redus timpul de separare, care, n special n cazul TLC este de ordinul minutelor (3060 min.). Totui, anumite limitri, caracteristice metodelor cromatografice "patdeschis" (open-bed) s-au pstrat i la aceste tehnici: reproductibilitate redus; dificultate n realizarea determinrilor cantitative; timpi de separare mai lungi i rezoluii mai sczute dect n cazul GC;
capacitate limitat de realizare a separrilor preparative (de ordinul

miligramelor); automatizare dificil. Cromatografia de lichide modern utilizeaz coloane nchise, care pot fi refolosite de sute sau chiar de mii de ori, fr a periclita performanele separrilor. Cu toate c aceste coloane sunt foarte scumpe (de la 400 DM n sus), innd cont de faptul c perioada de via este foarte lung, practic utilizarea lor este mai economic dect cea a coloanelor deschise (open-bed column). Cu toate c i coloanele HPLC se pot ncrca individual de fiecare operator, cel mai adesea, acestea se cumpr gata umplute, astfel c se poate elimina aceast operaie mare consumatoare de timp i care necesit o mare pricepere din partea

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

operatorului. Injectarea probelor se realizeaz cu ajutorul unor dispozitive speciale -valve de injecie, bucle de injecie - care fac ca operaia s fie rapid i foarte uor de executat. Curgerea solvenului prin coloan se realizeaz cu ajutorul unor pompe de mare presiune, motiv pentru care tehnica se numete cromatografie de mare presiune (High Presure mai Liquid

Chromatography = HPLC). n funcie de presiunea cu care este mpins faza mobil n coloan, metodele cromatografice pot fi clasificate n cromatografie la presiune redus (sub 5 bari), la presiune moderat sau medie (5-50 bari) i la presiune nalt (peste 50 bari). Curgerea solventului sub presiune are o serie de avantaje: viteza de curgere este rapid i (aproape) perfect controlat, ceea ce duce la reducerea dispersiei moleculare i la o (aproape) perfect reproductibilitate a separrilor cromatografice.

Detectarea i cuantificarea substanelor separate se realizeaz n mod continuu cu ajutorul detectoarelor de diferite tipuri i a integratoarelornregistratoare ce fac parte component din sistemele cromatografice HPLC. Aceste sisteme sunt (sau pot fi) complet automatizate: probele pot fi injectate automat cu ajutorul injectoarelor automate, operaiile executate de sistemul de pompe, detectoare i integratoare pot fi de asemenea controlate de ctre un calculator, iar regsirea substanelor separate se poate realiza cantitativ cu ajutorul colectoarelor de fraciuni. Intervenia manual a operatorului este minim, n cel mai ru caz, reducndu-se la efectuarea injectrii probei n coloan, el putnd face alte operaii n timp ce sistemul cromatografic lucreaz. Operaiile fiind automatizate, performanele cromatografice sunt excepional de ridicate, dac le comparm cu metodele de CL clasice, motiv pentru care metoda se mai numete cromatografie de nalt performan (High Performance Liquid Chromatography = HPLC). n plus, ridicarea la scar, adic trecerea de la cromatografia analitic la cea semi-preparativ i preparativ se realizeaz

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

foarte uor. Datorit curgerii solventului sub presiune, cu vitez mare, prin stratul cromatografic, timpul de cromatografiere a fost mult redus, marea majoritate a separrilor realizndu-se n mai puin de 20 minute. Pentru realizarea diferitelor separri cromatografice, exist o multitudine de suporturi cromatografice, care fac posibile separri de mare finee - cum ar fi izomerii optici. Marele "dezavantaj" al LC moderne (pe care de acum ncolo o vom numi simplu HPLC) const n preurile foarte ridicate ale aparaturii care trebuie s fie de cea mai mare precizie, al materialului cromatografic care trebuie s fie de cea mai bun calitate, al solvenilor de eluie care trebuie s fie ce cea mai mare puritate, motiv pentru care iniialele HPLC pot s nsemne i High Price Liquid Chromatography. Iat rezumativ cteva caracteristici tipice ale cromatografiei clasice (de joas presiune) i ale cromatografiei moderne (HPLC) Tabel 7.1. Caracteristici generale ale cromatografiei de lichide clasic i ale HPLC

Caracteristici Dimensiunea particulelor Viteza de curgere Presiunea de operare Timpul de separare Volumul probei Rezoluia Neajunsuri

LC clasic 100-300 m 10-30 ml cm-2 h-1 <5 bar

HPLC 3-10 m 100-300 ml cm-2 h-1 >50 bar

24 h, sau chiar mai 0.1-3 h mult Variabil (ml-litri) Bun Timp de procesare lung Mic (l-ml) Poate fi excelent Cost ridicat al aparaturii

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

7.4. ECHIPAMENTUL FOLOSIT N CROMATOGRAFIA DE LICHIDE Echipamentul necesar pentru LC poate fi asamblat din componente care pot proveni de la diferii fabricani sau (cel mai bine) poate fi un sistem cromatografic complet asamblat provenit de la un singur productor. Exist enorm de multe firme productoare de sisteme cromatografice. Se poate pune ntrebarea: Care este cel mai bun sistem cromatografic ? Rspunsul, fr a fi evaziv, este c nu exist un echipament "cel mai bun" deoarece cerinele pentru un anume aparat depind de problemele specifice pe care acesta este chemat s le rezolve. Tabelul 7.2. prezint sumar unele dintre acestea.

Tabelul 7.2. Criterii pentru echipamentele HPLC Performan e Cerine Adaptabilit ate Utilizabil pentru probe din Materiale cu mare rezisten diferite clase i tipuri de chimic substane Vitez Coloane selective, Diferite tipuri de detectoare cu Pompe de mare presiune Detectoare i tuburi de conecreduse Caracteristici sistemului ale Cerine ale echipamentului

eficien mare

Vitez volumetric sporit tare cu volume moarte foarte a fazei mobile

Vitez mare de ieire a da- nregistratoare i sisteme rapide telor de prelucrare a datelor

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

Performan e Cerine Reproducti bilitate

Caracteristici sistemului

ale Cerine ale echipamentului

Controlul operaional al Controlul precis al: parametrilor - temperaturii coloanei - temperaturii detectorului compoziiei fazei mobile

(gradient) - vitezei fazei mobile - rspunsului detectorului Senzitivitat e Detectoare foarte rapid Benzi nguste cu rspuns Design atent al detectorului Raport semnal/zgomot redus Coloane eficiente

n figura 7.2. se prezint schematic un sistem LC, cu componentele sale de baz. La configuraia de baz se pot aduga diferite alte componente, utile pentru anumite analize speciale sau deosebite.

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

Aa cum s-a mai menionat, iniiale HPLC pot s semnifice i high price liquid chromatography deoarece echimapentele HPLC sunt foarte scumpe. Un sistem cu configuraie de baz, ca cel din fig. 7.2.. cost n jur de 20000 DM, coloanele cost de la 400 DM n sus i exemplele ar putea continua. Deoarece n
Fig. 7.2. Schema general a unui sistem LC: 1 - rezervor de faz mobil; 2- element de nclzire; 3 - agitator magnetic; 4 - pompe; 5filtru; 6 - restrictor de pulsuri de presiune; 7 - precoloan (opional); 8 coloana analitic; 9 sistem de injectare a probei; 10 - termostat (opional); 11 - detector; 12 integrator/nregistrator sau sistem de prelucrare a datelor

acest caz preul este un factor limitativ, este important de tiut care sunt cerinele unui bun sistem HPLC, cci dei este recomandabil achiziionarea unui sistem HPLC integrat, rezultate similare se pot obine i prin asamblarea de componente provenind de la firme diferite i care ar putea fi mai ieftine. Urmrind fig. 7.2.. se constat c principial sistemul HPLC nu difer de un sistem cromatografic de joas sau medie presiune, toate avnd practic aceeai diagram de curgere a fazei mobile i componentelor probei: rezervorul de faz mobil (sistemul de creare a gradientului) pompa (monitorul de presiune) injectorul coloana detectorul colectorul (sistemul de creare a gradientului i monitorul de presiune au fost puse n parantez deoarece acestea pot fi ncorporate n pomp).

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

7.5. DIFERITELE VARIANTE ALE CROMATOGRAFIEI DE LICHIDE Retenia moleculelor probei de ctre faza staionar se poate realiza prin patru mecanisme sau procese diferite. Bazate pe acestea exist patru tipuri de LC: lichid-lichid, lichid-solid, schimb ionic i gel-cromatografie. (1) Cromatografia lichid-lichid (sau cromatografia de partiie) implic existena unei faze staionare lichide a crei compoziie este diferit de cea a fazei staionare mobile. Moleculele probei se distribuie ntre faza staionar (lichid) i faza mobil (bineneles, lichid i ea) n funcie de coeficientul de partiie al probei respective fa de cele dou lichide. Faza staionar i cea mobil pot fi dou lichide nemiscibile, sau faza staionar poate fi legat chimic pe particulele de gel ce formeaz suportul cromatografic. (2) Cromatografia lichid-solid (sau cromatografia de adsorbie) implic umplerea coloanei cu particule ce au o mare suprafa. Moleculele probei vor fi reinute prin atracia reciproc cu situsuri active de pe suprafaa particulelor de gel. (3) n cromatografia de schimb ionic coloana se umple cu particule de gel ce prezint fixate pe suprafaa lor grupri ionice (pozitive sau negative) mpreun cu contraionii de sarcin opus. De exemplu, particulele de gel pot avea fixate pe ele grupri SO3, contraionul fiind Na+. Contraionul este, de asemenea, prezent i n faza mobil (sub form de sare NaCl). Moleculele probei, care la rndul lor prezint o anumit sarcin global pozitiv sau negativ (fie n exemplu nostru P+), vor face schimb ionic cu contraionii de pe faza staionar: P+ + SO3Na+ Na+ + SO3P+. Deci ionii de sodiu vor fi nlocuii cu moleculele ionice ale probei. Cu ct sarcina global a acestora este mai mare, cu att retenia va fi mai puternic i deci timpul de retenie mai lung. Moleculele probei care au aceeai sarcin global cu cea a sarcinilor fixate pe

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

particulele de gel (minus n cazul de fa) nu vor fi reinute de loc de materialul de umplere al coloanei i vor migra odat cu faza mobil. (4) n gel-cromatografie (sau cromatografie de excludere molecular, cromatografie de gel-filtrare) perlele de gel ce umplu coloana prezint pori de diferite dimensiuni. Moleculele probei ce prezint dimensiuni mai mari dect porii nu vor putea intra n acetia i vor migra odat cu faza mobil. Moleculele mai mici dect porii, vor ptrunde n acetia, vor parcurge un drum mai lung (intrare i ieire din pori), motiv pentru care vor fi eluate mai trziu dect moleculele mari. n mod normal, se caut ca ntre moleculele probei i cele dou faze s nu existe nici un fel de interacii, singurul criteriu al separrii fiind dimensiunea molecular. 7.6. CROMATOGRAFIA LICHID-LICHID N FAZ INVERSAT Dintre toate tehnicile HPLC, RP-HPLC este cea mai utilizat. Cel puin 60% din separrile analitice se realizeaz prin aceast tehnic. Termenul de faz inversat a fost utilizat prima dat de Howard i Martin [71] care au realizat o LLC (Liquid liquid chromatography) folosind ca faz staionar uleiul de parafin i n-octanul cu elueni apoi. ntr-un astfel de sistem de partiie, metodologia convenional, care utiliza o faz staionar, polar i o faz mobil, mai puin polar a fost inversat, faza mobil devenind mai polar dect cea staionar. RPC (Reversed phase chromatography) difer de majoritatea celorlalte tehnici cromatografice n care forele atractive dintre faza staionar i faza mobil sunt dominante. n RPC, faza staionar este, n general, de natur hidrocarbonat, inert, i singurele interacii cu solutul sunt cele hidrofobe, selectivitatea fiind dominat de efectele solventului. Faza mobil, n RPC, este format fie din ap (singur), fie din ap plus un modificator organic, fie dintrun solvent neapos. Aceste faze mobile diferite au dus la utilizarea de diferite

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

acronime pentru variantele RPC: PARP = plain aqueous reverse phase; MARP = mixed aqueous RP; NARP = non-aqueous RP. n RPC, faza staionar este, n mod uzual, format dintr-o matrice din particule sferice de silicagel pe care s-au imobilizat covalent liganzi n-octadecil. Ali liganzi mult utilizai sunt n-octil i fenil. Pentru separri analitice, diametrul sferelor de silicagel este mai mic de 25 m. Fazele staionare sunt, de obicei, mpachetate n coloane de oel inoxidabil, cu diametrul de 4-5 mm i lungimea de 50-300 mm. Tendina actual este de a se folosi coloane cu diametre mai mici de 4 mm (4 - 1 mm)(norow bore column) mpachetate cu sfere cu diametre mai mici de 5 m. Cele mai utilizate faze mobile sunt soluiile apoase (tamponate) n amestec cu diferite procente de metanol i/sau acetonitril. Fazele mobile sunt pompate la viteze volumetrice ntre 0,5 i 2 mLmin1. Popularitatea RPC este de neles avnd n vedere numeroasele avantaje i marele su potenial. Cel mai mare avantaj al RPC este stabilitatea i ineria fazei staionare, care permite utilizarea unei game largi de solveni: adugarea de sruri, modificarea pH-ului i a temperaturii, etc. 7.6.1 FAZELE STAIONARE UTILIZATE N CROMATOGRAFIA N FAZ INVERSAT Cele mai comune faze staionare utilizate n RPC sunt cele ce conin grupri octadecilsilan (ODS sau C18) legate covalent de matricea de silicagel. Aa cum s-a amintit deja, destul de utilizate sunt i suporturile ce prezint liganzi octil sau fenil. Ca matrice, pe lng silicagel se mai utilizeaz kieselguhrul, alcoolul polivinilic (PVA), sticla, oxizi metalici, etc. Diametrul perlelor utilizate ca matrice variaz ntre 3 i 10 m. Modificarea gelurilor de silice se realizeaz prin fixarea pe suprafaa lor a unor grupri cu caracter hidrofob. Ca o regul general, gruparea hidrofob se leag de silicagel printr-o legtur siloxan stabil. Ea este format n reacia dintre alchil (aril) clorosilan (agentul modificator) cu gruprile silanol de pe

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

suprafaa silica-gelului. Gruprile hidrofobe ataate matricei de silicagel pot fi de tipul etil (C2H5), octyl (C8H17), octadecil (C18H37) i fenil (C6H5). n loc de monoclorsilani se pot utiliza pentru modificarea silica-gelului i di- i triclorsilani, ultimul fiind cel mai eficient. mpiedicrile sterice fac ca modificarea suprafeei matricei, prin reaciile cu clor-silani s nu depeasc 40% din aria sa. n general, densitatea gruprilor hidrofobe este n jur de 2,9 - 3,4 molim2, n timp ce densitatea gruprilor silanol iniial prezente este de 8-9 molim2. Gruprile silanol neprotejate pot duce la adsorbii necontrolabile ale proteinelor sau ale unor molecule mici (n aa numita cromatografie "perechi ionice" - ion-pair chromatogrphy - ionii pot fi adsorbii) ducnd la o descretere a puterii de rezoluie i la nereproductibilitatea procesului cromatografic. Pentru a evita aceste fenomene negative, silica gelul este tratat cu modificatori hidrofobi cu mas molecular mic, cum ar fi trimetil-clor-silanul. Gruprile ionice ale solutului, cum ar fi cele prezente pe suprafaa proteinelor, sunt puternic hidratate i interfer cu liganzii hidrofobi. Prin alegerea convenabil a pH-ului aceste grupri ionizate pot fi aduse ntr-o form neionic, astfel nct interaciile hidrofobe s creasc. La modificrile pH-ului mediului, trebuie inut cont de faptul c matricea de silicagel este stabil pe domeniul de pH 2 - 7,5 i se solubilizeaz treptat la valori alcaline ale pH-ului.

7.6.2 PARAMETRI CE AFECTEAZ RETENIA CROMATOGRAFIC Modificatorii organici. Eluia in RP-HPLC este efectuat datorit prezenei sau creterii gradate a concentraiei unui solvent organic n eluent. Solventul se numete, n acest caz, modificator organic. Importana teoriei solvofobice const n faptul c permite prezicerea caracteristicilor de retenie a

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

soluilor. Aceasta poate fi clar demonstrat prin efectele modificatorilor organici introdui n faza mobil asupra reteniei soluilor. Temperatura. Odat cu creterea temperaturii scad timpii de retenie i deci se mrete viteza de cromatografiere. Ca regul general, o cretere cu 10C duce la o reducere a factorului de capacitate de dou ori. Prin creterea temperaturii se scade viscozitatea solvenilor organici i deci se poate mri viteza de eluare. Adugarea de sruri n faza mobil duce la modificarea factorului de capacitate. Pentru un solut neutru, logaritmul factorului de capacitate va crete linear cu concentraia srurilor. Aceasta este o consecin a creterii lineare a tensiuni de suprafa. pH-ul. Pentru compuii care ionizeaz cnd pH-ul fazei mobile se apropie de pKa-ul solutului se observ schimbri majore n ce privete factorul de capacitate i selectivitatea. Tampoanele. Aa cum s-a amintit deja, supresia ionic este o tehnic util pentru creterea factorilor de capacitate a soluilor. Gradul de ionizare al soluilor poate varia cu concentraia solutului n absena unui tampon, pe msur ce un solut elueaz din coloan, concentraia sa n band variaz i la fel i gradul de ionizare. Astfel de schimbri n ionizare pot duce la apariia cozilor sau a eluiilor ntrziate (cozi inversate). Astfel de probleme pot fi corectate prin tamponarea corect a fazelor mobile. Pe lng faptul c menine constat pH-ul fazei mobile, tamponul mai trebuie s ndeplineasc anumite cerine cromatografice: S fie transparent optic, pentru a permite utilizarea detectoarelor UV-VIS. De exemplu, acetatul, n comun cu ali acizi carboxilici, nu poate fi folosit sub 235 nm, unde ncepe s devin opac optic; Componentele tamponului nu trebuie s precipite n prezena modificatorilor

Cap. VII. Introducere n Cromatografia de Lichide de nalt Performan

organici; Lungimea lanurilor liganzilor hidrofobi. Cu toate c exist suporturi cromatografice cu liganzi hidrocarbonai imobilizai a cror lungime variaz de la 2 la 18 atomi de carbon, totui cel mai comod este a se modifica compoziia fazei mobile, care de altfel constituie i factorul dominant n determinarea rezoluiei. n ce privete efectul lungimii lanului hidrocarbonat utilizat ca ligand hidrofob, pe msur ce numrul atomilor de carbon crete i retenia soluilor. Retenia depinde i de densitatea acestor liganzi, astfel c putem spune c retenia soluilor pe astfel de suporturi cromatografice crete odat cu coninutul de carbon al fazei staionare.

Referat realizat de http://www.referate-online.org