PRÁCTICA DE LABORATORIO: CÁLCULO DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA CATALASA

INTEGRANTES:

Cruz Carrillo Angélica Delgado López Michelle Odette Espinoza Martínez Juan Fernando Méndez Arellano Beatriz Ivonne Nicolás Callejas Ricardo Alejandro Ulloa Bulnes Diana Karen

GRUPO: 608

FECHA DE ENTREGA: 30 de noviembre 2011

CÁLCULO DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA CATALASA

Introducción El en presente trabajo nosotros, como equipo, hemos hecho una investigación basada en los últimos temas vistos en clase referentes al metabolismo, que recordemos es un ³conjunto integrado de reacciones químicas que tienen lugar en el organismo y que nos capacitan para extraer energía del medio´ (Roach, Benyon, 2003, p. 3) centrándonos en la acción catalizadora de las enzimas que a su vez conlleva un incremento de velocidad de las reacciones químicas realizadas por los organismos generando a su vez una menor energía de activación. Comenzaremos definiendo una enzima como ³catalizadores orgánicos por excelencia; que actúan en muy pequeñas cantidades sobre las moléculas reaccionantes y se recuperan íntegras al final de la reacción.´ (Cervantes, 2009). Estas enzimas tienen 3 características principales como lo menciona Bohinski (1981): Son los catalizadores más eficientes que se conocen« En segundo lugar, la mayoría de las enzimas se distinguen por una especificidad de acción« La tercera característica, y quizá la más notable, es que la acción de muchas enzimas son reguladoras (p. 174). Como vemos, las enzimas son proteínas funcionales formadas por aminoácidos que tienen un papel importante en el proceso del metabolismo. Son las responsables de todas las reacciones químicas de la célula en las cuales se forman o rompen enlaces covalentes. En nuestro trabajo experimental nos centraremos en las velocidades de reacción enzimática, específicamente de la enzima catalasa. La catalasa (peróxido de hidrógeno: peróxido de hidrógeno oxidorreductasa, EC 11.11.1.6). Ilustración 1. Es una de las enzimas más abundantes en la naturaleza y se encuentra ampliamente

1

Se conoce como número EC al esquema de clasificación numérica de las enzimas que se basa en las reacciones químicas que catalizan. <http://definicion.de/enzima/>

distribuida en el organismo humano, aunque su actividad varía en dependencia del tejido; ésta resulta más elevada en el hígado y los riñones, más baja en el tejido conectivo y los epitelios, y prácticamente nula en el tejido nervioso. A nivel celular se localiza en las mitocondrias y los peroxisomas, excepto en los eritrocitos. (Ela. Miranda, Céspedes Miranda, Enzimas que participan como barreras fisiológicas para eliminar los radicales libres: II. Catalasa, el 27 en de <http://bvs.sld.cu/revistas/ibi/vol15_2_96/ibi01296.htm>, noviembre de 2011) consultada

Figura 1. Ejemplo de la estructura de los números de clasificación enzimática.

Es importante aclarar qué son los peroxisomas y su relación con la catalasa. ¿Qué son los peroxisomas? Son unos cuerpos esféricos que se asemejan a los lisosomas y su misión es liberar a la célula de sustancias tóxicas como el peróxido de oxígeno (H2O2) y otras de tipo oxidante, y para ello contienen enzimas relacionadas con el metabolismo de la molécula de oxígeno (Tobella, Sales, 2010, p. 17). Complementando esta definición con algo que nos concierna más respecto a la catalasa, Horton (1981) menciona que los perixosomas contienen la enzima catalasa, la cual cataliza la descomposición del H2O2 en H2O y O2, destruyendo de este modo el H2O2 tóxico a medida que se forma. El secuestro del metabolismo

generador de peróxido dentro de organelos especializados protege al resto de la célula de subproductos tóxicos de la oxidación. (p. 1.17). La catalasa se encuentra en casi todas las células aeróbicas, donde acelera el rompimiento de peróxido de hidrógeno (producto tóxico de las células). A veces, la reducción de oxigeno al agua es incompleta y se produce ³superóxido´, una sustancia sumamente tóxica. Una enzima rompe el ³superóxido´ y forma agua y peróxido de hidrógeno, que es menos tóxico. La catalasa entonces rompe el peróxido de hidrógeno para producir agua y oxígeno. El mecanismo de la catálisis2 de la catalasa no se ha aclarado completamente, pero la reacción general es la siguiente: 2H2O2-2H2O2+0 (Elizabeth M. Boon, Catalase: H2O2. H2O2 Oxidoreductase)

Figura 2. Modelo molecular de la catalasa, donde el sustrato de H2O2 está representado por las partículas grises, y el sitio activo donde se realizan las reacciones enzimáticas está de un color más oscuro.

2

Transformación química motivada por sustancias que no se alteran en el curso de la reacción. <http://buscon.rae.es/draeI/SrvltConsulta?TIPO_BUS=3&LEMA=catalisis>

Objetivo Con este trabajo pretendemos medir la velocidad de reacción3 enzimática de la enzima catalasa por medio de un dispositivo creado con materiales reciclados aprovechando esa característica física de la materia llamada impenetrabilidad que dice que dos objetos no pueden ocupar simultáneamente el mismo lugar. De igual modo probaremos que existe una liberación de oxígeno por parte del hígado provocada por la enzima catalasa al momento de agregar el peróxido de hidrógeno en el frasco que contiene a éste.

Metodología: Como material necesitaremos 1 manguera transparente pequeña, 1 manguera transparente grande, 1 frasco pequeño, 1 frasco grande, 1 pistola de silicón, 1 tabla de madera, 1 cinta métrica, 1 cronómetro, 1 jeringa e Hígado de pollo. Y nuestras sustancias serán agua oxigenada y agua natural

Procedimiento para armar el dispositivo: 1. Primero para comenzar a armar el dispositivo pegamos con ayuda de la pistola de silicón el frasco grande a la tabla de madera y lo llenamos de agua. 2. Realizamos dos pequeños agujeros en la tapa por donde entrarían las dos mangueras, tanto la grande como la pequeña. 3. Introducimos la manguera grande en el frasco con agua y con ayuda de un alambre que enredamos en la tapa se sostuvo la manguera hacia arriba y ahí detrás se le coloco la cinta métrica de aproximadamente 25 cm.

La velocidad de una reacción puede medirse como la velocidad de formación de uno o más de su productos o bien la velocidad de utilización de sus reactivos. Ambas variables (velocidad de reacción y concentración de los reactivos) son directamente proporcionales, así que matemáticamente debe existir un valor constante. <http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/cinetica%20enzimatica.html>

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4. Posteriormente colocamos a un lado el frasco pequeño en donde introduciríamos el hígado de pollo y también le hicimos dos agujeros pequeños en la tapa. 5. Después unimos los frascos mediante la manguera pequeña que introducimos en los dos agujeros que tenían en la tapa cada uno de los frascos y sellamos muy bien con silicón para que no hubiera fuga.

Funcionamiento del dispositivo: 1. Colocar un trozo de hígado en el frasco pequeño. 2. Después con ayuda de nuestra jeringa tomamos alrededor de 5 ml de agua oxigenada. 3. Con ayuda de la jeringa vaciamos el agua oxigenada poco a poco dentro del frasco pequeño que contenía el hígado por medio del agujero y tapamos el orificio inmediatamente evitando cualquier escape de oxígeno como se puede observar en la Ilustración 3
Figura 3. Imagen del dispositivo, siendo probado en el laboratorio.

Observamos que al hacer contacto el agua oxigenada con el hígado de produce una reacción, esto hace que se libere oxígeno el cual pasará por la manguera hacia el otro frasco y con la presión que hace el agua observaremos como sube el agua por la manguera y así podremos medir que tanto subió cada dos segundos con ayuda de la cinta métrica.

Resultados
Realizamos cuatro repeticiones del experimento para calcular la velocidad de reacción de la enzima catalasa en el hígado con el agua oxigenada, y los resultados obtenidos se presentan a continuación mediante las tablas 1,2,3,4 y sus gráficas correspondientes (Figura 4,5,6,7) que comparan el tiempo de reacción con el volumen de agua que se eleva en la manguera graduada.

Tabla 1. Primer resultado del experimento.

Tabla 2. Segundo resultado del experimento.

Tiempo (s) 2 4 6 8

Volumen (ml) 2 5 8 10

Tiempo (s) 2 4 6 8

Volumen (ml) 2 5 7 9

Tabla 3. Tercer resultado del experimento.

Tabla 4. Cuarto resultado del experimento.

Tiempo (s) 2 4 6 8

Volumen (ml) 1 3 5 7

Tiempo (s) 2 4 6 8

Volumen (ml) 3 8 14 20

En cada una de las tablas se representan el volumen del agua que subió por la manguera graduada de 2-8 ml en un rango de tiempo de aproximadamente cada 2 segundos en los cuatros intentos realizados. (Tablas 1, 2, 3). En el caso de la Tabla 4 notamos que en promedio aumentaba de 5 a 6 ml por cada dos segundos, esto es debido a que se colocó una mayor cantidad de agua oxigenada a una mayor velocidad, que provocó que la reacción enzimática se efectuara más rápidamente sin perder su incremento contante.

Para tener una idea más clara del comportamiento de las reacciones, las graficamos. Pondremos los valores del tiempo en el eje de las X y el volumen en el eje de las Y. La línea recta que se encuentra en las gráficas es la pendiente, cuyo valor calcularemos más adelante.

Figura 4: Velocidad de reacción enzimática de la enzima catalasa en el primer experimento.

Experimento 1
14 12 10
Volumen (ml)

8 6 Pendiente 4 2 0 0 2 4 6
Tiempo (s)

8

10

12

Figura 5: Velocidad de reacción enzimática de la enzima catalasa en el primer experimento.

Experimento 2
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4
Tiempo (s)

Volumen (ml)

Pendiente

6

8

10

Figura 6: Velocidad de reacción enzimática de la enzima catalasa en el primer experimento.

Experimento 3
8 7 6 5 4 Linear (Volumen) 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10

Figura 7: Velocidad de reacción enzimática de la enzima catalasa en el primer experimento.

Experimento 4
25

20

Volumen (ml)

15

10

Pendiente

5

0 0 2 4 Tiempo (s) 6 8 10

A continuación se presentan los cálculos que utilizamos para encontrar la pendiente de cada una de las mediciones de las reacciones:

Discusión El experimento se llevó a cabo con el dispositivo 4 veces para verificar el correcto funcionamiento. Tanto las tablas como las gráficas muestran diferentes resultados, es lógico que sea así porque tienen un marco de error que se pudo haber cometido al medir el hígado o el H2O2, pero están próximos entre sí, son semejantes y por lo tanto tomando en cuenta lo anterior, el dispositivo funciona adecuadamente en la medición del oxígeno liberado. Sin embargo debido a errores que surgen en la realización del prototipo y los experimentos observamos sobretodo en la tabla 4 que hay un incremento en la velocidad en la que aumentan los mililitros en la manguera. Como se explicó con anterioridad el hecho de que el H2O2 haya sido colocado a mayor velocidad provocó que la reacción enzimática realizara la ruptura de Hidrógeno Y oxígeno más velozmente que en los casos anteriores, aunando que la cantidad de agua oxigenada fue mayor que en el caso de los experimentos 1, 2 y 3. Los resultados de graficas muestran una aceleración, después la gráfica llega a una constante, lo que se conoce como Equilibrio Químico, la manera en que mide la velocidad es calculando la pendiente, así podemos ver la eficiencia de la enzima catalasa para romper los iones del H2O2.

Conclusión El equipo llego a la conclusión de que el hígado contiene altos niveles de la enzima catalasa que al reaccionar con el peróxido de hidrogeno (agua oxigenada) produce H2O y O2. En las 4 pruebas del experimento, la velocidad de reacción tuvo valores aproximados en los 3 primeros intentos, con variaciones de 1 a 3 mL, y en el cuarto intento la velocidad incremento considerablemente, pues en los valores se disparan hasta el doble de lo que se venía midiendo, esto es debido a que se incrementó la cantidad de peróxido de hidrogeno, con esto pudimos comprobar que la velocidad de reacción depende de las concentraciones de los reactivos que se manejan. Esta prueba no es totalmente efectiva pues no podemos asegurar que existe un alto porcentaje de efectividad, además de que el margen de error no es tan bajo. El experimento nos da valores aproximados mas no los correctos, sin embargo nos podemos dar una idea aproximada de la velocidad de las reacciones enzimáticas con respecto a la cantidad de hígado y al volumen de agua oxigenada que se ponen a reaccionar, tomando en cuenta también que la velocidad con que se agrega el H2O2 influye en la velocidad de reacción Esto nos sirve para entender cómo se mide la velocidad de reacción de una enzima en forma experimental; además de que así podemos observar y entender más ampliamente cómo funciona el peróxido de hidrogeno con los tejidos, y qué efectos tiene cuando entra en contacto con nuestra piel, además de la propiedad como antibacterial, las bacterias anaerobias, mueren al estar en contacto con oxígeno, es por esta razón que el oxígeno producido por esta enzima tiene efecto bactericida sobre estos microorganismos. Esto nos ha servido para corroborar lo visto en clase respecto al tema de metabolismo y la acción de las enzimas en este proceso.

Bibliografía  Bohinski, R. (1978). Bioquímica. México: Fondo educativo Interamericano S.A.  Cervantes. M. (2009). Biología general. México: Publicaciones Cultural.  Horton. H y Moran. L. (1995). Bioquímica. México: Prentice Hall Hispanoamericana, S.A.  Roach. J y Benyon, S. (2003). Lo esencial en metabolismo y nutrición. (2ª Ed), España: Elsevier España, S.A.  Tobella, J y Sabater, G. (2010). Medicina personalizada posgenómica: Conceptos prácticos para clínicos. España: Elsevier Masson.  Volk. W. (1996). Microbiología Básica. México: Harla. 

(Ela. Miranda, Céspedes Miranda, Enzimas que participan como barreras fisiológicas para eliminar los radicales libres: II. Catalasa, en <http://bvs.sld.cu/revistas/ibi/vol15_2_96/ibi01296.htm>, consultada el 27 de noviembre de 2011)  (Elizabeth M. Boon, Catalase: H2O2. H2O2 Oxidoreductase, en <http://www.callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/om m/catalase/frames/cattx.htm, consultada el 20 de noviembre 2011>, consultada el 28 de noviembre de 2011) 

<http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen2/ciencia3/059/htm/ sec_7.htm>  <http://buscon.rae.es/draeI/SrvltConsulta?TIPO_BUS=3&LEMA=catalisis>  <http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/cinetica%20enzimatica.htm l>  http://academic.uprm.edu/~jvelezg/lab7-2.pdf

Autoevaluación

NOMBRE Cruz Carrillo Angélica Delgado López Michelle Odette Espinoza Martínez Juan Fernando Méndez Arellano Beatriz Ivonne Nicolás Callejas Ricardo Alejandro Ulloa Bulnes Diana Karen

CALIFICACIÓN 10 10 10 10 10 10

Titulo: Velocidad de reacción enzimática de la enzima catalasa Introducción: Las enzimas son catalizadores orgánicos por excelencia; que actúan en muy pequeñas cantidades sobre las moléculas reaccionantes y se recuperan íntegras al final de la reacción. La catalasa es una de las enzimas más abundantes en la naturaleza y se encuentra ampliamente distribuida en el organismo humano, aunque su actividad varía en dependencia del tejido; ésta resulta más elevada en el hígado y los riñones, más baja en el tejido conectivo y los epitelios, y prácticamente nula en el tejido nervioso. A nivel celular se localiza en las mitocondrias y los peroxisomas, excepto en los eritrocitos. La catalasa se encuentra en casi todas las células aeróbicas, donde acelera el rompimiento de peróxido de hidrógeno (producto tóxico de las células). Materiales: * 3 vasos que servirán como frascos * 1 hígado de pollo * 1 botella de agua oxigenada (H2O2) Hipótesis: Vaso 1. El hígado, junto con el H2O2 van a reaccionar soltando oxígeno, lo que provocará una presión que

empujará nuestra mano y calentará el fondo del vaso. Vaso 2. Al poner a reaccionar hígado molido con agua oxigenada, la enzima catalasa actuará más rápido. Vaso 3. La reacción será mucho menor pues se le habrán restado propiedades al hígado. Metodología: 1. En el vaso 1, colocar una parte del hígado, vaciarle un poco de agua oxigenada y tapar inmediatamente con una mano la boca del vaso. (Figura 1) 2. Cortar otro trozo de hígado casi del mismo tamaño que el anterior, licuarlo, colocarlo en el vaso, verterle agua oxigenada y observar lo que sucede. (Figura 2) 3. Hervir agua y colocar un pedazo de hígado nuevo, dejarlo allí de 2 a 3 minutos. Sacar el trozo de hígado del agua, depositarlo en el vaso y agregar agua oxigenada. Observa la reacción. (Figura 3) Figura 1. Hígado sin macerar en Figura 2. Reacción del hígado Figura 3. Hígado hervido en presencia de H2O2. macerado al aplicarse el H2O2. presencia del agua oxigenada.

Descripción. Discusión. Con el hígado en este estado sí notamos la reacción producida por la enzima catalasa. Al agregar agua oxigenada se observa de inmediato que ocurre una reacción al aparecer burbujas que demuestran la presencia y liberación de O2. Esto es el resultado de la ruptura de los agentes oxidantes como lo es la catalasa presentes en la capa externa del hígado.

Descripción. Discusión. Debido a la acción de la enzima catalasa, el agua oxigenada (H2O2) rompe sus enlaces y se transforma en H2O + O2. La liberación de oxígeno es lo que produce el burbujeo intenso. La presencia de burbujas es mucho mayor que en el vaso 1 debido a que al estar triturado el pedazo de hígado los enlaces están más susceptibles a romperse pues las enzimas se encuentran en la capa posterior del híago y al macerarse, estas enzimas abarcan todo el trozo de hígado.

Descripción. Discusión. En el caso del trozo de hígado que ha sido cocido no se observa aparición de burbujas de H2O. Esto es debido al tratamiento térmico realizado, el cual desnaturaliza la enzima catalasa que, en consecuencia, no degrada el agua oxigenada. Se llama desnaturalización a la pérdida de proteínas, quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero e inclusive hay vambis en sus propiedades físicas y/o químicas.

Bibliografía: Horton, H. (1995). Bioquímica, Ed. Omega, México. Infografía: www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_54_act.asp www.menorcaweb.net/cnaturals/aula/guions/bioquímica/text5.pdf