Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur

larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam listrik memancarkan spektrum yang lebar terdiri atas panjang gelombang. Panjang gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu mampu mempengaruhi selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan subyektif akan ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200 ± 380 nm), daerah visible (380 ± 700 nm), daerah inframerah (700 ± 3000 nm) (Khopkar 1990). Spektrofotometer bekerja berdasarkan pada prinsip penyerapan gelombang cahaya (radiasi) yang dilewatkan pada suatu larutan. Spektrofotometer yang digunakan adalahvisible atau menggunakan cahaya tampak, yang panjang gelombang terukurnya berkisar antara 340 nm ± 1000 nm. Panjang gelombang maksimum dicari untuk mengetahui seberapa besar energi cahaya tertinggi yang diserap oleh suatu larutan. Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk. Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu : a. Sumber Cahaya Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang (l ) adalah 350 ± 2200 nanometer (nm). b. Monokromator Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu (monokromatis) yang bebeda (terdispersi). c. Cuvet Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars, plexigalass, kaca, plastic dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk pengukuran di daerah sinar tampak (visible). d. Detektor Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital. Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer, bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Transmitans adalah perbandingan intensitas cahaya yang ditransmisikan ketika melewati sampel (It) dengan intensitas cahaya mula-mula sebelum melewati sampel (Io). Persyaratan hukum Lambert Beer, antara lain: radiasi yang digunakan harus monokromatik, energi radiasi yang diabsorpsi oleh sampel tidak menimbulkan reaksi kimia, sampel (larutan) yang mengabsorpsi harus homogen, tidak terjadi fluoresensi atau phosporesensi, dan indeks refraksi tidak berpengaruh terhadap konsentrasi, jadi larutan tidak pekat (harus encer). Spektrofotometer UV-Vis membandingkan cuplikan standar yaitu substrat gelas preparat. Hasil pengukuran dari spektrofotometer UV-Vis menunjukkan kurva hubungan transmitan dan panjang gelombang ( ) (Basset 1994). Spektrofotometer terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan, yaitu: spektrofotometer Vis (Visible), spektrofotometer UV (Ultra Violet), spektrofotometer UV-Vis, dan Spektrofotometri IR (Infa Red). Pada spektrofotometri Vis, yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 ± 750 nm. Berbeda

Lapisan hidrofobik ini mengikat wilayah non-polar dari pewarna melalui gaya van der walls sehingga posisi amina positif tertarik pada muatan negatif dari pewarna tersebut. 2009. Basset J et al. Konsep Dasar Kimia Analitik. Day R dan Underwood A. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC Cairns D. Hal ini disebabkan oleh penstabilan anion dari pewarna biru commasie oleh kation dari pewarna merah commasie. misalnya untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm.5-1000 m. Selama pembentukan kompleks pengikatan protein ini. Oleh karena itu. spektrofotmetri IR berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah yang mempunyai panjang gelombang 2. Spektrofotometri UV-Vis menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda. Pada spektrofotometri IR digunakan untuk analisa kualitatif. 1994. Terjemahan dari : Essentials of Pharmaceutical Chemistry Second Edition. Pengikatan protein ini diperkuat oleh interaksi ionik antar kedua muatan. Jumlah protein yang mengompleks ini adalah ukuran untuk menentukan konsentrasi protein dengan membaca absorbansinya (Bradford 1976). Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Senyawa yang dapat menyerap sinar UV terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna (bening dan transparan). pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV.dengan spektrofotometri visible. kadar protein pun menjadi sebanding dengan absorbansi jika diukur menggunakan kurva standar (Bradford 1976). 1990. ketika mengikat protein (terjadi perubahan warna).[1][2] Pengujian kadar protein dengan metode Bradford adalah suatu metode dengan pewarnaan protein yang didasarkan pada pengukuran absorbansi. Panjang gelombang yang digunakan untuk pengukuran protein dengan metode Bradford adalah 595 nm. terjadi pelepasan elektron bebas dari pewarna merah commasie yang mempengaruhi lapisan hidrofobik protein. Hal ini dikarenakan pada panjang gelombang 595 nm absorbansi sebanding dengan pewarna yang terikat pada protein. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Perubahan warna yang dilakukan oleh dye commassie (komponen reagen Bradford) dari pewarna merah commasie ke pewarna biru commasie disebabkan oleh pengikatan protein.[2] Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet. Uji Bradford sangat cepat dan menggunakan jumlah protein yang relatif sama dengan uji Lowry. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam. Penerjemah : Sopyan Iis. Terjemahan dari : Quantitative Analysis Sixth Edition. Metode Bradford cukup akurat dan sampel yang berada di luar jangkauan dapat diuji . Metode Bradford mempunyai ketelitian yang tinggi karena koefisien penghentian dari kompleks albumin larutan standar BSA adalah konstan selama rentang konsentrasi flip-10. Jakarta : Universitas Indonesia (UI-Press) Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Khopkar S. Sedangkan. Penerjemah : Puspita Rini. Uji ini didasarkan pada pengamatan bahwa absorbansi maksimum untuk larutan pewarna asam Coomassie Brilliant Blue G-250 bergeser dari 465 nm ke 595 nm. 2002. sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator dan dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. Jakarta : Erlangga. Intisari Kimia Farmasi Edisi Kedua.[1] Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Pengikatan protein menyebabkan zat pewarna biru commasie pada reagen Bradford menjadi stabil.

stirer.ulang dalam beberapa menit. Enam tabung reaksi dibersihkan dan dikeringkan. yang diyakini bertanggung jawab atas pengikatan pewarna untuk protein (Stoscheck 1990). Tabung ketiga diisi larutan BSA 20 µL dan larutan NaCl 80 µL. bulb. Satu per satu tabung dimasukkan ke dalam spektrofotometer untuk dibaca absorbansinya.1 mg/mL. Tabung pertama diisi larutan BSA 0 µL dan 100 µL larutan NaCl. Semua tabung dikocok dengan alat stirer dan dibiarkan antara lima belas menit sampai satu jam. Uji ini didasarkan pada observasi bahwa absorbansi maksimum untuk larutan asam pewarna Coomassie Brilliant Blue G-250 bergeser dari 465 nm ke 595 nm. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam percobaan spektrofotometri ini adalah spektronik 20. kuvet. dan gelas ukur. Nilai absorban yang diperoleh digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel. pipet volumetrik. Tabung keenam diisi larutan BSA 100 µL dan larutan NaCl 0 µL. Tujuan Percobaan Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein suatu sampel dengan metode spektrofotometri menggunakan kurva standar. Konsentrasi sampel ditentukan dengan memasukkan nilai absorban ke persamaan garis yang sudah diperoleh pada percobaan pertama. larutan NaCl. larutan Bovine Serum Albumin (BSA) 0. tabung reaksi. Reagen Bradford 5 mL ditambahkan ke dalam masing-masing tabung. Dalam rentang linier dari sampel protein (5-25 g / ml). Uji ini memiliki ketepatan yang tinngi karena koefisien penghentian kompleks larutan BSA adalah konstan selama rentang konsentrasi flip-10. Tabung keempat diisi larutan BSA 30 µL dan larutan NaCl 70 µL. Tabung kedua diisi larutan BSA 10 µL dan larutan NaCl 90 µL. Metode Bradford tidak mengukur adanya ikatan peptida tapi mendeteksi asam amino yang spesifik. ketika pengikatan protein. dan reagen Bradford. terutama untuk menentukan kadar protein dari fraksi sel dan menilai konsentrasi protein untuk elektroforesis gel. . Lapisan hidrofobik dari protein berinteraksi menstabilkan anion dari pewarna biru coomassie. Bradford direkomendasikan untuk penggunaan umum. Pengukuran absorbansi pada larutan sampel diulang sebanyak dua kali. gelas piala. seperti arginin.1 mg/mL dan larutan NaCl disiapkan. Setelah itu dibuat kurva hubungan antara absorban dengan konsentrasi protein dalam tabung beserta persamaan garisnya. Larutan sampel protein dipipet ke dalam tabung reaksi dan diukur absorbansinya. Bahan ± bahan yang digunakan adalah akuades. Prosedur Percobaan Larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0. Tabung ke-1 digunakan sebagai blanko. semakin banyak protein yang terikat oleh pewarna coomassie tersebut. Komponen reagen Bradford terdiri dari Larutan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol 95% dan 100 ml 85% (w/v) asam fosfat (Bradford 1976). Tabung elima diisi larutan BSA 50 µL dan larutan NaCl 50 µL. Panjang gelombang yang digunakan adalah 595 nm.

Pewarna biru Coomassie mudah mengikat protein arginina dan residu lysna (bukan dalam bentuk asam amino bebas). dianjurkan untuk memilih protein yang memberikan nilai absorbansi mendekati konsentrasi sampel protein yang diujikan. Larutan BSA adalah protein yang paling berlimpah dalam serum. Larutan BSA dan IGg adalah larutan standar yang biasa digunakan untuk menentukan kadar protein dengan metode Bradford (Keenan 1992). Hal ini menyebabkan kesetimbangan bergeser sehingga menghasilkan lebih dari warna biru pada protein. Metode ini juga cukup akurat dan sampel yang berada di luar jangkauan dapat diuji ulang dalam beberapa menit. sodium dodesil sulfat (SDS). Metode Bradford tidak mengalami gangguan yang disebabkan oleh berbagai bahan kimia yang berada dalam sampel (Stoscheck 1990). terutama untuk menentukan kadar protein dari fraksi sel dan menentukan konsentrasi protein untuk elektroforesis gel. Uji Bradford direkomendasikan untuk penggunaan umum. Sebuah konsentrasi yang tinggi akan menyebabkan buffer konsentrasi protein berlebih karena menipisnya proton bebas dari larutan dengan basa konjugasi dari buffer. Kelemahan utama metode Bradford adalah kekhususan reagennya yang dapat mengakibatkan variasi respon tes untuk protein yang berbeda. Fungsi dari penambahan NaCl ke dalam larutan BSA adalah untuk melarutkan protein yang akan diukur. Semakin banyak protein yang larut maka pengompleksan antara protein dan zat warna dalam reagen Bradford akan semakin sedikit terjadi. meningkatnya konsentrasi detergen dapat mengganggu pengukuran konsentrasi protein dengan etode ini. Larutan BSA yang digunakan memiliki enam konsentrasi yang berbeda. dan peran terbatas dalam pemeliharaan pH. Detergen lain mengganggu pengukuran uji ini pada konsentrasi yang tinggi.00333% W / V untuk 0. Uji protein Bradford adalah prosedur sederhana untuk penentuan konsentrasi total protein dalam larutan. Semakin banyak NaCl yang ditambahkan maka semakin banyak protein yang larut. uji ini kurang akurat untuk atau asam protein dasar. Gangguan lain mungkin berasal dari buffer digunakan ketika mempersiapkan sampel protein. Selain itu. cenderung menghambat situs pengikat reagen pewarna. Gangguan yang disebabkan oleh SDS adalah dua modus yang berbeda dan masing-masing terjadi pada konsentrasi yang berbeda. Larutan ini berfungsi dalam transportasi asam lemak. Enam konsentrasi tersebut diukur absorbansinya untuk mengetahui konsentrasi dari .0667%) dalam larutan pewarna coomassie. Hal ini ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang semakin rendah jika NaCl yang ditambahkan semakin banyak (Khopkar 2007). Warna yang dihasilkan menyebabkan peningkatan absorbansi pada 595 nm. Sebagai contoh. Uji ini tergantung pada perubahan absorbansi berdasarkan pengikatan pewarna Coomassie Blue G 250 dengan protein. Prinsip dari percobaan ini adalah menentukan konsentrasi sampel protein dengan menggunakan kurva standar yang menghubungkan antara konsentrasi protein dari larutan BSA dengan absorbansinya. Oleh karena itu. Protein adalah fungsi dari konsentrasi garam. Hal ini dapat menyebabkan ketidakakuratan konsentrasi protein yang diukur dalam larutan. menjaga cairan agar tidak bocor keluar dari sistem peredaran darah. Larutan BSA sering digunakan untuk membantu menstabilkan larutan encer enzim di laboratorium atau untuk mencegah antigen non-spesifik mengikat antibodi. Ini tidak akan menjadi masalah jika konsentrasi protein yang diukur rendah (Stoscheck 1990). Konsentrasi SDS yang berada di atas konsentrasi misel kritis. dapat ditemukan dalam ekstrak protein karena digunakan untuk mengeluarkan isi sel dengan cara merusak lapisan ganda membran lipid. asosiasi detergen sangat kuat dengan pewarna hijau coomassie.Keuntungan uji Bradford sangat cepat sehingga dapat mengefektifan waktu percobaan. Untuk konsentrasi SDS di bawah konsentrasi misel kritis (dikenal sebagai CMC. 0.

0.778. 0. hal tersebut dikarenakan terjadinya kesalahan selama praktikum.3 mg/mL. Absorban sampel protein ulangan pertama adalah sebesar 0. Pengukuran absorban sampel protein dilakukan sebanyak dua kali. Simpulan Percobaan ini mempraktikkan cara menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan menggunakan metode Bradford.688 dan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0 .46 %. 1. Persamaan garis yang diperoleh dari kurva yang menghubungkan nilai absorbansi dengan konsentrasi larutan BSA adalah y = 0.275.969. Kesalahan tersebut dapat disebabkan oleh pengukuran volume yang tidak tepat saat menambahkan larutan BSA dan larutan NaCl serta kesalahan pengkalibrasian spektrofotometer sehingga diperlukan menghitung absorbansi terkoreksi untuk masing-masing pengukuran.3 mg/mL.46 %.802.069x dengan r sebesar 96.95 + 0.062. Rataan konsentrasi sampel ulangan pertama dan ulangan kedua adalah sebesar 0. Hasil percobaan menunjukkan nilai absorbansi yang semakin tinggi seiring dengan berkurangnya volume NaCl yang ditambahkan dan meningkatnya volume larutan BSA yang ditambahkan. Panjang gelombang yang digunakan yaitu 595 nm. Konsentrasi larutan sampel diperoleh dengan cara memasukkan nilai absorbansi yang terukur ke dalam persamaan garis kurva antara konsentrasi protein dengan absorbansi. Tabung keempat diisi larutan BSA 30 µL dan larutan NaCl 70 µL menunjukkan nilai absorbansi sebesar 0. 0.657 dan nnilai absorbansi terkoreksi berturut-turur adalah 0. Konsentrasi larutan standar bovine serum albumin (BSA) pada masing-masing tabung reaksi adalah 0. Konsentrasi yang diperoleh mendekati konsentrasi yang tertera dalam label sampel protein yaitu 1 mg/mL atau 100 mg/dL. dan 1 mg/mL.133.1 mg/mL. 0.333 mg/mL sedangkan konsentrasi sampel yang diperoleh dari ulangan kedua adalah sebesar 1. Tabung ketiga yang berisi larutan BSA 20 µL dan larutan NaCl 80 µL menunjukkan nilai absorbansi sebesar 0. 0.963 dan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0.2 mg/mL.969.821.5 mg/mL.069x dengan ketepatan sebesar 96.99%. Absorbansi yang terukur berturut-turut adalah 0. 0.114.8 mg/dL. Tabung kedua yang berisi larutan BSA 10 µL dan larutan NaCl 90 µL menunjukkan nilai absorbansi sebesar 0.963. 1 mg/mL.657 dan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0.090.688.802 dan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0.927. Oleh karena itu.5 mg/mL. Absorban sampel ulangan kedua adalah sebesar 1.821 dan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0.978 mg/mL.133. Absorban sampel ulangan pertama adalah sebesar 0.sampel protein melalui kurva standar yang menghubungkan absorbansi dengan konsentrasi larutan BSA.95 + 0. Konsentrasi sampel yang diperoleh adalah 97.275.1 mg/mL. 0.927. Tabung pertama yang berisi larutan BSA 0 µL dan 100 µL larutan NaCl menunjukkan nilai absorbansi sebesar 0.090. 0.2 mg/mL.778 dan nilai absorbansi terkoreksi sebesar 0. 0.114. Tabung kelima diisi larutan BSA 50 µL dan larutan NaCl 50 µL menunjukkan nilai absorbansi sebesar 0. Pengukuran protein dalam sampel jarang dinyatakan dalam mg/mL. 0. Persamaan garis yang diperoleh dari kurva yang menghubungkan nilai absorbansi dengan konsentrasi larutan BSA adalah y = 0. Konsentrasi larutan bovine serum albumin (BSA) adalah 0. Ketepatan yang diperoleh tidak 99. 0. Konsentrasi yang diperoleh dari sampel ulangan pertama adalah 0. rataan konsentrasi sampel perlu dikonversi ke dalam satuan mg/dL. Tabung keenam diisi larutan BSA 100 µL dan larutan NaCl 0 µL menunjukkan nilai absorbansi sebesar 1. 0. 0. Fungsi kurva standar adalah untuk menentukan konsentrasi sampel yang absorbansinya sudah diketahui. 0.623 mg/mL. 0. Absorban . Biasanya pengukuran protein dinyatakan dalam mg/dL.

Sedangkan bentuk anioniknya berwarna biru dengan absorbansi maksimum 590 nm. 248-254. Protein dengan residu arginil dan lysil yang lebih banyak tentu akan menghasilkan warna biru yang lebih intens dibanding protein yang residu arginil dan lysilnya lebih sedikit meskipun jumlah proteinnya sama. Bentuk kationik zat warna ini berwarna merah dan hijau dengan panjang gelombang serapan (absorbansi) maksimum pada 470 dan 650 nm. 2007.4.623 mg/mL. 5 Bradford Protein Assay (image from freewebs. Pengukuran proteinnya sendiri dilakukan dengan menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anionik (biru). Namun secara umum metode Bradford masih merupakan metode yang paling sesuai dan paling umum digunakan. Keenan R. Pereaksi ini harus difilter dengan kertas saring Whatman no. maka harus difilter lagi saat hendak digunakan. Daftar Pustaka Bradford MM . sehingga hal ini menyebabkan adanya variasi hasil pengukuran untuk jenis protein yang berbeda-beda. Jakarta : UI Press. Konsentrasi protein larutan standard harus diukur sebelum digunakan dengan mengukur absorbansinya pada 280 nm.333 mg/mL sedangkan konsentrasi sampel yang diperoleh dari ulangan kedua adalah sebesar 1.1990. dimana zat warna ini memiliki empat formasi ion berbeda dengan nilai pKa 1.. 1992. Konsentrasi sampel dalam satuan mg/dL adalah 97. lebih cepat dan lebih sensitif dibanding metode Lowry.com) Salah satu prosedur analisa kandungan protein dalam larutan adalah menggunakan metode Bradford yang pertama kali dideskripsikan oleh Bradford (Bradford et al.978 mg/mL. 1976). Standar Protein Bovine -globulin dengan konsentrasi 1 mg/ml (atau 100 µg/ml untuk microassay) digunakan sebagai larutan stok (disimpan beku pada suhu -20oC). Ada dua jenis assay protein dengan metode Bradford. Khopkar S. dan biasanya hal ini dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan pada 595 nm.15. Analitical Biochemistry 72 . Konsentrasi yang diperoleh dari sampel ulangan pertama adalah 0. 1. Jakarta : Erlangga.82 dan 12. Biokimia Laboratorium. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Material yang digunakan Pereaksi (Reagent) Pereaksi yang digunakan dibuat dengan melarutkan 100 mg Coomassie Blue G-250 dalam 50 ml ethanol 95%. Rataan konsentrasi sampel ulangan pertama dan ulangan kedua adalah sebesar 0. 1990. Metode ini lebih simple. Metode Bradford didasarkan pada pengikatan zat warna Coomassie Blue G-250 ke protein. Quantitation of Protein. 111-116 Stoscheck CM . 1 dan disimpan dalam botol amber (gelap) di suhu ruang. Analitical Biochemistry 184.8 mg/dL. Larutan ini kemudian dicampurkan dengan 100 ml asam fosfat 85% dan diencerkan sampai volume 1 L dengan aquadest. Konsep Dasar Biokimia.062. namun jika terbentuk endapan ketika penyimpanan.sampel ulangan kedua adalah sebesar 1. Absorbansi larutan Bovine - . Stoscheck CM. yaitu Standard Assay ±cocok untuk pengukuran kadar protein antara 10 sampai 100 µg± dan Microassay yang dapat mendeteksi antara 1 sampai 10 µg protein. Methods in Enzymology 182. selain itu Bradford juga lebih tahan terhadap interferensi senyawaan nonprotein.1976. Increased uniformity in the response of the Coomassie blue protein assay to different proteins. Zat warna Coomassie Blue G-250 bereaksi cepat dengan residu arginil dan lysil dari protein. Konsekuensinya microassay lebih rentan terhadap interferensi senyawaan nonprotein. Pereaksi ini stabil hingga beberapa minggu.

Siapkan blanko dengan aquadest 100 µl. Hindari terbentuknya busa karena akan mengurangi reproducibility-nya. buatlah seri larutan standard 10.com/protein/bradford-protein-assay-protocol/ . Hindari terbentuknya busa karena akan mengurangi reproducibility-nya. maka bisa dibuat beberapa seri pengenceran (1.com/protein/bradford-protein-assay/ http://www. dst). Jika perkiraan konsentrasi proteinnya tidak diketahui. 1:1000. 20. Nilai absorbansi untuk sampel yang mengandung 10 µg -globulin adalah 0. Inkubasi selama 2 sampai 60 menit. dst).molecularstation. Siapkan secara duplo. Inkubasi selama 2 sampai 60 menit. 80 dan 100 µg/ml. Jadi kurva kalibrasi harus dibuat untuk setiap assay.35.66 dan 0. Untuk kurva kalibrasi. campur dengan membolak-balik tabung atau divortex secara perlahan. 60.45.globulin 1mg/ml pada cuvet 1 cm adalah 1.4. Jangan menggunakan cuvet silika (Quartz) untuk pengukuran spektrofotometer karena zat pewarna dapat terikat pada bahan ini.75. 200. Jika yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) atau Ovalbumin. Catatan: y y Standard 100 µg akan memberikan absorbansi sekitar 0. Sumber: y y http://www. 600. Siapkan blanko dengan aquadest 100 µl. maka absorbansinya masing-masing adalah 0. Tambahkan 5 ml pereaksi Bradford ke dalam masing-masing tabung sample dan standard. Untuk kurva kalibrasi. 400. 40.5 ml. 1:1000. Siapkan secara duplo. Kurva standard-nya tidak linear. 1:100. 1:10. Ukur absorbansi sample dan standard pada panjang gelombang 595 nm. 800 dan 1000 µg/ml. Standard Assay y y y y Pipet 100 µl sample yang mengandung kira-kira 10 ± 100 µg protein. Jika perkiraan konsentrasi proteinnya tidak diketahui. Tambahkan 1 ml pereaksi Bradford ke dalam masing-masing tabung. dan presisi absorbansinya bervariasi bergantung pada lamanya inkubasi. Lalu pipet masing-masing 100 µl ke dalam tabung. Microassay y y y y Pipet 100 µl sample yang mengandung kira-kira 1 ± 10 µg protein ke dalam tabung Eppendorf 1. maka bisa dibuat beberapa seri pengenceran (1. Alat Gelas dan Plastik Alat gelas dan plastik yang digunakan harus benar-benar bersih dan bebas detergen. Ukur absorbansi sample dan standard pada panjang gelombang 595 nm. buatlah seri larutan standard 100.molecularstation. 1:100. 1:10. Lalu pipet masing-masing 100 µl ke dalam tabung. campur dengan membolak-balik tabung atau divortex secara perlahan.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful