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Separacin de aminocidos por cromatografa en capa fina y deteccin mediante reaccin con ninhidrina
Jess V. Jorrn Novo, M Nieves Abril Daz, Jos A. Brcena Ruiz
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba

RESUMEN

La cromatografa en capa fina es un caso de cromatografa de reparto en la que los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes. Los elementos del sistema cromatogrfico son: soporte, fase estacionaria (disolvente A), y fase mvil o eluyente (disolvente B). Es una tcnica simple en cuanto al equipamiento necesario (placa y tanque cromatogrfico) y de fcil desarrollo. El parmetro experimental asociado a la tcnica es el Rf (coeficiente de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto entre la fase estacionaria y fase mvil, y que depende de su estructura qumica y su hidrosolubilidad/liposolubilidad. A modo de ejemplo, y dentro de la presente prctica, se llevar a cabo la separacin de una mezcla de aminocidos, que se revelarn e identificarn mediante la reaccin con la ninhidrina.

Palabras clave: anlisis cualitativo, biomolculas, coeficiente de reparto, reacciones coloreadas. Abreviaturas empleadas. CCF: cromatografa en capa fina; TLC: thin layer chromatography.

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS 1.1. Separacin de molculas por cromatografa El estudio y caracterizacin de las distintas biomolculas (azcares, lpidos, protenas, cidos nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y purificacin a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier material biolgico. Una de las tcnicas bioqumicas ms clsicas y utilizadas para dicho fin es la cromatografa. La cromatografa incluye una amplia gama de tcnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento fsico-qumico en el que se basa la separacin (cromatografa de adsorcin, de reparto, de cambio inico, de filtracin molecular, hidrofbica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo (cromatografa en papel, capa fina, en columna y de gases).

Todas las tcnicas intentan explotar las diferencias fsicas, qumicas y biolgicas de las distintas biomolculas para llevar a cabo su separacin y aislamiento. Entre dichas propiedades podramos citar: i) Diferencias en solubilidad en diferentes solventes, tanto orgnicos como acuosos. ii) Diferencias en tamao y forma. iii) Diferencias en carga. iv) Diferencias en afinidad por otras biomolculas. Todas estas propiedades y, por tanto, la separacin de diferentes compuestos estn influenciadas por las condiciones del medio de separacin, pH, temperatura, fuerza inica e hidrofobicidad. De forma general, en las tcnicas cromatogrficas existe una distribucin de las molculas entre dos fases, la fase estacionaria o parte del sistema separador que permanece fija en el espacio, y la fase mvil que circula sobre la fase estacionaria en ntimo contacto con sta. 1.2. Cromatografa de reparto En la presente prctica llevaremos a cabo una cromatografa de reparto, en capa fina, para la separacin de aminocidos. En la cromatografa de reparto los componentes de una mezcla se separan en base a una distribucin diferente entre la fase mvil y la fase estacionaria. El movimiento relativo de las molculas a lo largo del sistema cromatogrfico es el resultado de un equilibrio entre las fuerzas de transmisin o arrastre ejercido por la fase mvil en su desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas que tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en criterios de solubilidad) como de adsorcin. La teora de la cromatografa de reparto se basa en que, en general, si dos fases inmiscibles se encuentran en contacto una con otra y si una de las dos fases contiene un soluto, ste se distribuir entre ambas de acuerdo con sus solubilidades relativas. Dicho fenmeno se denomina reparto y viene determinado por el coeficiente de reparto, que es la relacin entre las concentraciones del soluto, en el equilibrio, en las dos fases. En la cromatografa de reparto tenemos un soporte inerte al que est unida la fase estacionaria lquida. La mezcla a separar junto con la fase mvil se hace avanzar a lo largo de la fase estacionaria por capilaridad. En dicho avance, la fase mvil arrastrar consigo un porcentaje de molculas de cada componente a separar de acuerdo con los respectivos coeficientes de reparto. La distancia recorrida por cada uno de los componentes de la muestra depender de la cantidad de solvente o eluyente que se haga pasar y de los coeficientes de reparto, de manera que si stos son diferentes aqulla tambin lo ser, siendo posible la separacin si se utiliza el volumen de eluyente apropiado. En su desplazamiento, las molculas de soluto se distribuirn no puntualmente, sino formando un rea debido a que son parcialmente solubles en las dos fases y a otros fenmenos tales como la difusin. En la cromatografa de reparto se suelen utilizar diversos materiales como soportes: almidn, celulosa, gel de slice, xido de aluminio, etc. Aunque en
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teora se consideran inertes, pueden generar diferentes procesos de adsorcin, por lo que la separacin ocurrir tambin, en parte, debido a la interaccin entre las molculas a separar con dicho soporte, la cual actuara como fuerza de frenado. La fase estacionaria se forma suspendiendo o embebiendo el soporte con el solvente adecuado; ste recubre las partculas del soporte y es retenido por adsorcin y/o capilaridad. El espacio entre las partculas del soporte ser utilizado por la fase mvil para su desplazamiento. Debemos de tener en cuenta que como fase mvil se suelen utilizar solventes hidrfobos cuando haya que separar compuestos no polares y solventes acuosos cuando haya que separar sustancias polares. Por su parte, la fase estacionaria, que debe ser al menos parcialmente inmiscible con la mvil, suele ser por lo general hidroflica, aunque tambin pueden utilizarse compuestos hidrfobos. 1.3. Cromatografa en capa fina En la cromatografa en capa fina, CCF o TLC ("thin-layer chromatography, en la terminologa inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partculas finas y distribuirse uniformemente en forma de lminas. Esto incluye sustancias inorgnicas (gel de slice, xido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgnicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La utilizacin de soportes hidrfobos facilita la separacin de compuestos no polares (lpidos, por ejemplo). En la CCF, la fase estacionaria es una lmina de 0,25-0,50 mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plstico. Aunque muchas casas comerciales suministran placas ya preparadas, stas pueden hacerse en el laboratorio con aparatos especiales que permiten extender sobre la placa de vidrio o plstico la papilla formada por la suspensin del material en un disolvente adecuado (generalmente agua). La placa ha de dejarse secar antes de su utilizacin. Para el desarrollo de la cromatografa, las muestras, en un disolvente adecuado, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es crtico, ya que va a afectar a la resolucin (separacin de los componentes de una mezcla compleja), y depende de la concentracin del compuesto o compuestos de inters en la muestra. Para soluciones concentradas bastar una cantidad muy pequea (rango de l) para aplicar suficiente cantidad de los solutos a separar sin llegar a saturar la capacidad de resolucin de la placa cromatogrfica. Para soluciones muy diluidas, deber aplicarse un volumen suficiente (de hasta varios ml) para asegurar una cantidad detectable de soluto o solutos de inters. En este caso conviene hacer la aplicacin en pequeos volmenes fraccionarios, no procedindose a una nueva adicin hasta haberse secado totalmente la precedente (de lo contrario la superficie de aplicacin se hara muy grande, distando mucho de la situacin ideal de concentracin de la muestra en un solo punto de aplicacin). Una vez aplicada y seca la muestra, la placa se introduce en un recipiente cerrado (tanque cromatogrfico) y uno de los extremos (el ms prximo a la lnea de aplicacin) se sumerge en un disolvente apropiado (fase mvil), cuyo nivel en el fondo del tanque debe quedar por debajo de la lnea de aplicacin. El solvente se desplaza a travs del soporte por capilaridad provocando un reparto de los solutos entre l y la fase estacionaria de acuerdo con sus solubilidades relativas (coeficientes de reparto). Una vez que el solvente haya alcanzado un punto prximo al otro extremo de la placa, sta se saca del tanque y se seca. Las manchas correspondientes a cada compuesto, si
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no son visibles, se pueden revelar mediante tcnicas analticas concretas. Se determina la posicin de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, calculndose el correspondiente valor de Rf. La deteccin de los compuestos una vez realizada la cromatografa se puede llevar a cabo en base a sus propiedades espectroscpicas, fluorimtricas, hacindolos reaccionar con reactivos especficos, radioisotpicamente, etc. La identificacin de tales compuestos se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos de referencia (patrones) de naturaleza qumica conocida. Alternativamente, los diferentes compuestos, una vez localizada su posicin por un mtodo no destructivo, pueden eluirse de la placa raspando las zonas correspondientes y extrayendo el polvo obtenido con un solvente adecuado. Uno de los factores ms crticos en este tipo de cromatografas es la eleccin de la fase mvil, que, bsicamente, suele estar formada por una mezcla de un solvente orgnico con agua y algunas sustancias adicionales tales cmo cidos, bases, agentes acomplejantes, etc., cuya finalidad es aumentar o disminuir la solubilidad de algunos compuestos. Adems de en una sola direccin, la CCF puede tambin realizarse bidimensionalmente. En este caso slo se aplica una nica muestra, que se dispone en uno de los vrtices de la placa y se eluye dos veces, normalmente con solventes diferentes, y en direcciones perpendiculares. La CCF presenta una serie de ventajas respecto a cromatografas alternativas, como es la de papel, tales como las siguientes: i) Una mayor resolucin, obtenindose por lo general manchas ms pequeas. ii) Una mayor velocidad de separacin. iii) Pueden utilizarse un gran nmero de materiales como soportes y disolventes. iv) Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperacin es muy simple. La mayor resolucin obtenida por CCF se debe a que pueden formarse partculas muy finas del soporte, por lo que la relacin superficie/volumen es muy elevada, proporcionando una gran rea superficial por unidad de longitud. Esto se traduce en que la cantidad de muestra que se puede aplicar es mayor y la difusin es mucho menor. La ventaja respecto a la cromatografa en papel es que ste tiene una estructura fibrosa y la capilaridad asociada a las fibras tiende a aumentar la difusin de las molculas. 1.4. Reacciones coloreadas de aminocidos Los mtodos colorimtricos de determinacin de aminocidos se basan en la reaccin especfica de stos con determinados compuestos, dando derivados coloreados. La formacin de color se toma como resultado positivo e indica su presencia, mientras que el no desarrollo de color es indicativo de que no est presente. Para cada prueba se utilizar un control negativo, tambin denominado blanco de la reaccin, en el que el reactivo se aadir a agua destilada (o solvente adecuado). Aunque en la presente prctica se llevar a cabo la determinacin cualitativa de aminocidos (ausencia o presencia de dichos compuestos), las reacciones coloreadas pueden tambin ser utilizadas para la determinacin cuantitativa de dichas biomolculas.
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Hay una amplia gama de mtodos colorimtricos que permiten la determinacin cuali- y cuantitativa de aminocidos. Aunque son mtodos muy generales, algunos de ellos permiten discriminar entre diferentes tipos de estos compuestos. As, hay mtodos de determinacin de aminocidos con el grupo amino libre (mtodo de la ninhidrina), de aminocidos con ncleos aromticos (reaccin xantoproteica), de los que poseen un grupo indlico (triptfano; reaccin con el cido glioxlico), un anillo fenlico (tirosina; reaccin de Millon), de aminocidos azufrados (cisteina; reaccin con nitroprusiato sdico). En todos los mtodos, el aminocido reacciona con otro compuesto formando derivados coloreados que se pueden determinar cuantitativamente por espectroscopa visible. De todos los mtodos reseados, el ms general y utilizado es el de la reaccin con la ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminocidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formacin de amoniaco y anhdrido carbnico, con reduccin del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina (Figura 1). La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molcula de ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que presenta una coloracin azul-prpura, con la excepcin de la prolina que da una coloracin amarillenta (recordar que en la prolina el grupo amino est sustituido). El derivado coloreado presenta mximo de absorcin en torno a 570 nm. La reaccin se lleva a cabo en caliente y a valores de pH comprendidos entre 4 y 8. Las aminas primarias (R-CH2-NH2) dan tambin positiva la prueba de la ninhidrina, aunque en este caso no se libera CO2. La tcnica es muy sensible, por lo que es ideal para detectar concentraciones bajas de aminocidos, utilizndose para revelar su presencia en cromatogramas y fracciones procedentes de otras tcnicas de separacin. La presencia de aldehdos resultantes de la degradacin de la ninhidrina por reaccin con los aminocidos modifica, bajo ciertas condiciones, el color formado, lo que sirve para identificar el tipo de aminocido.

Figura 1. Reaccin de aminocidos con la ninhidrina.

1.5. Objetivos

i) Separacin de aminocidos por cromatografa en capa fina sobre gel de slice. ii) Revelado de los aminocidos mediante la reaccin coloreada con la ninhidrina. iii) Clculo del valor de Rf para cada uno de los aminocidos. Justificacin de las diferencias en Rf de los distintos aminocidos. iv) Identificacin de la naturaleza de aminocidos desconocidos.

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO Se incluye tanto el material de uso particular para cada grupo como el de uso general, as como reactivos. En la Figura 2 se muestra una fotografa del material de uso particular y en la Figura 3 la frmula de los aminocidos empleados. 2.1. Equipamiento Secador de pelo. Placa de silicagel para cromatografa en capa fina. Agitador de tubos. Tanque cromatogrfico. 2.2. Material Gradillas con tubos de ensayo. Juego de pipetas (0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 y 25,0 ml). Propipetas. Probetas (100 y 250 ml). Vasos de precipitado (100 y 500 ml). Frasco lavador con agua destilada. Recipientes de muestras biolgicas de 50 ml. Papel de filtro. Capilares para aplicar muestras. Papel de parafilm. Rotulador de vidrio. Pipetas Pasteur de plstico. Guantes de ltex. Frascos pulverizadores. Tijeras. 2.3. Reactivos Glutamato. Glicina. Lisina. Prolina. Leucina. Solucin problema de aminocidos. Etanol. Hidrxido amnico. Ninhidrina.
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Figura 2. Material empleado en la prctica.

Leucina Prolina Glicina Figura 3. Frmula de los aminocidos empleados.

Glutamato

Lisina

3. PROTOCOLO A REALIZAR Los distintos pasos del procedimiento se ilustran en la Figura 4. 3.1. Paso primero Sobre una placa de silicagel de 20 x 20 cm se traza con un lpiz una recta paralela a uno de los bordes y a una distancia de ste de 2 cm. Sobre esta lnea se pone 6 puntos equidistantes entre si y sobre los bordes. ADVERTENCIAS: No hay que tocar la parte del silica gel de la placa con las manos, ya que la contaminaramos con aminocidos procedentes de nuestras manos. No utilizar nunca bolgrafo ni rotulador. No horadar la placa cuando la marquis. 3.2. Paso segundo
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En cada punto (identificados con el nombre de cada uno de los aminocidos) se aplicarn tres gotas de la solucin de aminocidos y solucin problema (un aminocido en cada punto y en el ltimo la solucin problema). Se utiliza un capilar para aplicar la muestra gota a gota (hacerlo con mucho cuidado). Se seca con un secador de pelo despus de haber aplicado cada gota. Se marca con lpiz, y en el extremo opuesto de la placa, algn indicativo del grupo que realiza la cromatografa. 3.3. Paso tercero Se aade al tanque cromatogrfico eluyente hasta una altura aproximada de 1 cm y sin que ste alcance la zona de aplicacin de las muestras. Se mete la placa en el tanque, se tapa y se deja desarrollar la cromatografa hasta que el eluyente alcance el borde superior, sin llegar a sobrepasarlo (2-3 h aproximadamente). ADVERTENCIA: Se opera en la campana extractora de gases, ya que el eluyente es txico. 3.4. Paso cuarto Terminada la cromatografa se saca la placa, se marca la distancia recorrida por el eluyente, se seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un secador de aire y se roca con un pulverizador que contiene la solucin reveladora (en la campana de gases). La placa se secar hacindole llegar aire caliente con el secador. ADVERTENCIA: Esta operacin debe de hacerse en la campana extractora de gases.

Figura 4. Desarrollo de la prctica.

4. RESULTADOS 4.1. Se representan en una figura, similar a la de la Figura 5, los resultados obtenidos. 4.2. Se indican los valores de distancia recorrida por cada uno de los aminocidos en una tabla y se calculan los correspondientes valores de Rf. 4.3. Se indica la composicin de la solucin problema, justificando la conclusin a la que se ha llegado.

Figura 5. Esquema de los resultados de una cromatografa en capa fina y clculo del Rf. 9

Tabla 1. Distancia recorrida por cada uno de los aminocidos y clculo del Rf Aminocido Distancia recorrida Rf (cm) Glutamato Glicina Lisina Prolina Leucina

5. DISCUSIN Y COMENTARIOS Se deben justificar las diferencias en los valores de Rf para cada uno de los aminocidos, as como las formas de la mancha, tipo de color e intensidad. A partir de la estructura qumica hay que relacionar el mayor o menor valor de Rf con la mayor o menor solubilidad en las fases estacionaria y mvil. A tenor de los resultados obtenidos, se deben responder las siguientes cuestiones: Qu se podra decir de la resolucin de la tcnica y cmo podra aumentarse sta? Qu ocurrira si la longitud de la placa se incrementara de 20 a 100 cm si se aumentara el tiempo cromatogrfico de 2 a 20 horas? Aadir los comentarios adicionales que se crean convenientes y procedentes.

6. BIBLIOGRAFA COMENTADA Es importante hacer hincapi en la importancia de consultar la bibliografa recomendada con el fin de un mejor aprendizaje y para presentar y discutir correctamente los resultados obtenidos en el cuaderno de prcticas. Es importante, as mismo, conocer la estructura y propiedades qumicas de los compuestos que se van a utilizar, en este caso los aminocidos, por lo que se recomienda consultar las notas de clase o algn libro de texto de bioqumica general. Luisot P (1982). Bioqumica Estructural, 2 Ed. Editorial AC. Excelente libro de bioqumica estructural. En el captulo de aminocidos se describen con detalle sus propiedades fsicas y qumicas. Smith I, Feinberg JG (1965) Paper & Thin Layer Chromatography and Electrophoresis. Shandon Scientific Company Ltd. Desarrollo histrico de la tcnica y aplicaciones. Bermdez A, Bernal J, Espinosa E, Cornejo W, Briceo I, Prieto JC, Arrieta L Propuesta para un protocolo de diagnstico de homocistinuria. http://med.javeriana.edu.co/publi/vniversitas/serial/v44n3/0023%20propuesta .pdf

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ANEXO 1: SOLUCIONES 1. Soluciones de los distintos aminocidos (glutamato, glicina, lisina, prolina y leucina) al 1%
Solucin de aminocido al 1 % 100 ml Aminocido 1g n-Propanol 10 ml Agua destilada Hasta 100 ml

2. Solucin de eluyente 2.1. Solucin de hidrxido amnico al 34 %

Solucin de hidrxido amnico 100 ml Hidrxido amnico 34 g Agua destilada Hasta 100 ml

2.2. Solucin de eluyente (etanol: hidrxido amnico, en una proporcin 7:3)

Solucin de eluyente Etanol Solucin de hidrxido amnico 200 mL 210 mL 90 mL

3. Solucin reveladora (se prepara el da de uso)

Solucin de ninhidrina Ninhidrina Agua detilada 100 ml 0,2 g Hasta 100 ml

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