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1

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LLS
SSV
VV2
22
2013
2

R RE EL LA AT TI IO ON NS S S ST TR RU UC CT TU UR RE ES S - - F FO ON NC CT TI IO ON NS S C CH HE EZ Z L LE ES S V VE EG GE ET TA AU UX X

OSMOSE ET PERMEATION (TP1)

A. INTRODUCTION
A première vue, les expériences groupées dans cette manipulation et le matériel biologique
employé peuvent paraître disparates. En fait, il ne sera question ici que de certains types
d'échanges cellulaires (osmose : eau ; perméation : ions) établis entre le vivant et son milieu.
Quant aux sujets d'analyse (tubercules, épidermes, protoplastes..), ils ont été choisis parce qu'ils
permettaient des expériences simples et de courte durée.

Le potentiel osmotique
Le potentiel osmotique, désignée par le symbole Ψs, est fonction de la température, de la
concentration de la substance dissoute, et de ses caractéristiques de dissociation.
Le potentiel hydrique
La notion de potentiel hydrique a été largement discutée au cours.

Pour éclaircir des problèmes de terminologie, nous donnerons le tableau suivant :

Milieu intérieur Milieu extérieur
∆Ψ = Ψ
int
- Ψ
ext

Iso-osmotique Isotonique équilibre ∆Ψ= 0
Hypo-osmotique Hypertonique plasmolyse ∆Ψ> 0
Hyper-osmotique Hypotonique turgescence ∆Ψ < 0


B. Evaluation des paramètres osmotiques

A) Détermination de la potentiel de succion tissulaire

Les tubercules de pommes de terre sont constitués essentiellement de parenchyme de
réserve. En mettant à profit la grande homogénéité de ce tissu, il est possible de réaliser un
certain nombre d'expériences, telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur, sur des
fragments de tubercule.

1. Préparation du matériel

- Prendre trois pommes de terre, les éplucher et les placer dans un récipient plein d'eau.
Découper les tubercules en parallélépipèdes de section carrée (env. 0,5 cm de côté).
- Après les avoir lavés, conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide.
- Ajuster alors les fragments de tissus à une longueur déterminée de 4cm, en supprimant
les bords inférieurs et supérieurs.
- Essuyer légèrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les
répartir en lots de 4.
- Déterminer rapidement, sur les balances, le poids frais (PF
0
) de chaque lot (auquel
on attribuera un numéro).

3

2. Mode opératoire
- Préparer dans 6 tubes falcons de 50 mL des solutions de saccharose aux
concentrations indiquées (ci-dessous), à partir d'une solution stock (2M).






- Incuber vos lots de fragments de pomme de terre dans chacun des tubes.
- Après 1 heure d’incubation, mesurer pour chacun des lots, le poids frais PF
f
ainsi que
la longueur moyenne L
f
de chaque lot (légèrement essuyer les segments sur un papier
sopalin).
On calculera alors :

Pression osmotique d’une solution idéale (formule de Van t’Hoff) :
Π =RT/V.log a
w
≈ i x C
B
x R x T x 1000 en Pa (1 bar = 101325 Pa)
3. Résultats
Reporter sur un graphique, les courbes correspondant au ∆ ∆∆ ∆L et au ∆ ∆∆ ∆PF, en fonction
de la concentration molaire (M) du saccharose.

Pour chacune des courbes, déterminer la valeur de la concentration de saccharose
correspondant à l'intersection avec l'abscisse.

Calculer les valeurs théoriques idéale de Π pour les différentes solutions suivant la
formulation de Van t’Hoff.

Calculer à partir de cette valeur, le potentiel hydrique des tissus (Ψ
W
= Ψ
S
= -Π

car
Ψ
P
= 0 au point d’intersection sur l’axe des abscisses).

Exprimer alors Ψ
W
en MPa et en Bar.


Rappels :

0 °C = 273,15 K ; R = 8,31 J/mol.K ; i = 1 pour le saccharose, 2 pour le NaCl ; C
B
= Concentration Molaire
de la solution.



bécher Ψ
s
(bars)
expérimentale
Concentration
finale (M)
Calcul Ψ
s
(bars)
Solution idéale
1
0 0,00

2
-1,3 0,05

3
-2,6 0,10

4
-5,2 0,20

5
-11 0,40

6
0,60

7
-25,2 0,80

8
1,00

4

B) Quelques propriétés des protoplastes foliaires
Le protoplaste est une cellule dont on a fait disparaître (mécaniquement ou enzymatiquement)
la paroi. En l'absence des potentiels hydrostatiques (pressions) normalement exercées par la
paroi sur le contenu cellulaire, il n'est stable que dans des conditions isotoniques (ou
légèrement hypertoniques) et prend alors une forme sphérique. Les protoplastes permettent
d'étudier un certain nombre de caractéristiques du plasmalemme (perméabilité, charges, ...).
Nous nous bornerons ici à observer la pénétration de deux types de colorants, pour
lesquels le plasmalemme présente une perméabilité sélective.
1. Isolement des protoplastes


1.1. Incubation enzymatique

- Peler délicatement, à l'aide d'une brucelle à pointes fines, l'épiderme inférieur de 3-5
feuilles de mâche (Valerianella olitoria), et découper le mésophylle en carrés de 1mm²
environ. Travailler sur un papier filtre humide, pour éviter le dessèchement.
- Pipeter dans une boîte de Pétri 2 ml d'une solution enzymatique déjà prête, contenant
des cellulases, des pectinases et du sorbitol. Expliquer le rôle de ces divers composés.
- Déposer les fragments de feuilles (face pelée vers le bas) à la surface de la solution
d'incubation.
- Envelopper la boîte de Pétri d'une feuille d'aluminium et incuber à 20-30°C durant 30
minutes sur un agitateur orbital (50-100 tpm) - (Attention à ne pas renverser la boîte).

1.2. Purification

- Filtrer la suspension de protoplastes à travers un filtre nylon (100 µm), pour
éliminer les restes de feuilles non digérées. Rincer le matériel après usage.

- Centrifuger 1,5 mL de la suspension de protoplastes (tubes eppendorf de 1.5 mL, 500
tpm, 5 min).

5

- Eliminer le surnageant et laisser 100-150 µL de solution. Le culot de protoplastes
sera suspendu en tapotant sur le tube. Ne surtout pas vortexer.
- Conserver cette suspension de protoplastes dans son tube eppendorf et agiter
doucement avant usage.
2. Observation et comptage des protoplastes

Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de
comptage de volume connu. C’est une lame épaisse en verre, comportant des rigoles et un
quadrillage :
















Le volume de comptage est déterminé par :
-la surface du quadrillage gravé sur la lame.
-la profondeur de la chambre.

Parmi les 100 rectangles totaux, on trouve 25 rectangles qui sont divisés en 20 petits carrés afin de faciliter
le comptage.
→ Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm
3
= 1 µL

→ Chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm
3
= 10 nL

Pour la Numération

• Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage, et vérifier l’homogénéité de la répartition des
cellules à compter (si la répartition est mauvaise, recommencer). Régler le contraste et la lumière pour observer
la grille et les protoplastes.

• Observer ensuite à l’objectif x40 ou à x60 pour réaliser le comptage (Voir instructions).

• Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du quadrillage.

Lamelle planée Lame porte - objet
Profondeur de la
chambre
Rigoles
Quadrillage
Plateaux
surélevés
Plate-forme centrale
6

Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles qui chevauchent 2
arêtes du rectangle sur 4 (en pratique, on choisit de prendre en compte les cellules chevauchant la ligne
horizontale supérieure, et la ligne verticale droite).






- Prélever une goutte de suspension de protoplastes (env. 20µL) et la déposer sur la
gouttière centrale de la cellule de comptage (Malassez, voir explication). Estimer le
nombre de protoplastes isolés et leur concentration (protoplastes/mL).

- Observer alors, à un grossissement final de 400x-600x, les détails morphologiques
des protoplastes. Dessiner une cellule de protoplaste et déterminez la position des
chloroplastes, des vacuoles etc...

3. Perméabilité sélective

- Pipeter délicatement 20 µL de la suspension de protoplastes.

- Ajouter sur les lames 1 et 2, respectivement, 20µL, des colorants suivants :
I : Rouge neutre 0.1 % v/v en solution TL.
II : Phénosafranine 0.1 % v/v en solution TL.

- Recouvrir d’une lamelle et après 2 min, observez au microscope. NE PAS LAISSER
SECHER !
Pour les deux essais, déterminer, le nombre de protoplasmes colorés (A
compter sur 20 protoplastes sans a priori).
Commenter les résultats.

- Ajouter alors sur les bords d’une lamelle, 20µL d'eau ou de sorbitol à 15%
(Réalisez deux expériences).
Observer en temps réel les phénomènes physiques sur les protoplastes.


C) Observations microscopiques

Les lambeaux épidermiques, constitués d'une assise cellulaire unique, permettent une
observation microscopique aisée des cellules qui les composent. Les vacuoles de ces tissus
occupent la presque totalité de l'espace cellulaire. Il est ainsi possible, en plongeant ces lambeaux
dans des solutions de potentiel osmotique variable, d'étudier les échanges d'eau entre les cellules
et le milieu extérieur, et, d'obtenir, sur la base d'observations microscopiques, des informations
sur le potentiel hydrique cellulaire.
Numération sur le rectangle
= 7 protoplastes
7


1. Mode opératoire

- Inciser délicatement, à l'aide d'un scalpel, un carré de 3 mm de côté environ, dans
l'épiderme intérieur d'une écaille d'un bulbe d'oignon.
- Détacher avec une paire de brucelles à pointes fines, le fragment épidermique ainsi
délimité en le saisissant par un des coins.
- Placer le lambeau (face déchirée vers le bas) entre lame et lamelle dans 1 mL d’une
solution de sorbitol (6 tubes). Ajouter 20µL de Vert de Méthyle et 20µL de Rouge
Neutre dans chaque tube eppendorf.
- Après 5 min., observez entre lame et lamelle au microscope.
- Dessinez les points extrêmes de turgescence et de plasmolyse, puis cherchez les points
encadrant l’isotonie.
Choisir au microscope une zone facilement observable.
Observez la cellule et ses différents compartiments puis évaluez le potentiel
hydrique cellulaire.
2. Evaluation du potentiel hydrique cellulaire
A l'isotonie, le potentiel hydrique de la cellule est égal au potentiel osmotique du
milieu extérieur.
On utilisera des solutions de sorbitol (substance qui ne pénètre pas ou peu dans les
cellules) à différentes concentrations (0 ; 2; 6; 8 ; 10 et 15 %).
En travaillant chaque fois avec un lambeau frais, noter la concentration C, pour
laquelle il y a une légère plasmolyse.

Déterminer la concentration molaire de sorbitol qui se rapproche le plus de
l'isotonie et déduire le potentiel hydrique cellulaire.














8

Annexes :

















9

Etude de la structure racinaire, caulinaire et du processus
d’ouverture stomatique (TP2)

Exécution et montage des coupes anatomiques
1. Exécution
Les échantillons de plante sont au préalable coupé et inclus dans de l’agar à 4 %. L'agar
sert pour les coupes au vibratome (Labonord 100 plus), mais pas vraiment pour protéger un
tissu pendant l'inclusion.

Gardez une dizaine de coupe de chaque échantillon de tige ou de racine, puis procédez aux
colorations de ces coupes.

2. Coloration
Respecter les indications de temps de traitement et de rinçage suivants :
Prendre une plaque multi-puits et ajoutez un volume de 5mL de chaque solution de
coloration ou d’eau distillée. Procédez aux colorations des coupes des échantillons
végétaux. Les transferts d’un milieu vers un autre se font à l’aide d’un tamis après chaque
temps de traitement.

1) eau de javel: 15 min 5) Coloration au rouge Congo: 10 min
2) rinçage abondant à l’eau 6) Rinçage sommaire
3) lavage rapide à l’acide acétique :
1-2 min 7) Coloration au Vert d'iode: 5 min
4) rinçage sommaire à l’eau 8) Rinçage soigneux et montage sur lame.

Résultat
Les tissus cellulosiques apparaissent en rouge; les tissus lignifiés et subérifiés
apparaissent en vert – (¨ ¨¨ ¨ Attention les colorations présentées en cours peuvent être
différentes).
3. Montage
Il est indispensable que lames et lamelles soient propres et sèches et que, par ailleurs, les
surfaces optiques du microscope, en particulier l'oculaire, soient essuyées avec un papier
Kim Wipes (risque de rayures).

Ne monter que 2 à 3 coupes sur une lame en choisissant de préférence les fragments de
coupes les moins colorés ; ce sont en principe les plus minces.

Placer suffisamment de liquide de montage sur la lame pour que toute la coupe soit immergée.
Placer doucement la lamelle sur la préparation en vous aidant d'une aiguille montée. Ne pas
appuyer sur la lamelle pour chasser d'éventuelles bulles d'air : la préparation serait
irrémédiablement inutilisable.

10


Si besoin, ajouter de l'eau en présentant à l’aide des comptes gouttes au bord de la lamelle,
sans la soulever (l'eau pénètre par capillarité), ou au contraire, éliminer les excès d'eau avec
un mouchoir de papier.
II. CONSEILS POUR LE DESSIN
1. Généralités
C Dessiner grand (2/3 d’une page), l'échelle du dessin étant choisie en fonction des
plus petits détails à reproduire (Endoderme ou pôles vasculaires, par exemple).

C Respecter les proportions relatives des différentes parties.

C Faire des traits fins, nets, réguliers, continus (crayon HB).

C Légendes: placées assez loin, brèves mais précises et complètes, écrites lisiblement
et horizontalement; traits de rappel à la règle, se terminant dans le dessin par un point
ou une flèche et ne se croisant pas.

C Le titre comprend le nom complet de la plante (genre, espèce et autres indications
taxonomiques en Latin), de l'organe ou du détail représenté, le sens de la coupe, le
grossissement, etc....
2. Dessin général
C Représenter le contour exact d'un quart de coupe (pas de compas: une coupe n’est
jamais parfaitement ronde) et les limites exactes des différents tissus en veillant
particulièrement aux proportions relatives. Utiliser un tiré pour montrer l'arrêt
"arbitraire" de la coupe.

C Les particularités de votre échantillon doivent être représentées : nombre exact de
faisceaux conducteurs, contours irréguliers d'une lacune, d'un cambium, position
précise d'un canal ou d'une fibre isolée, etc.
Ne pas représenter de cellules, sauf les très gros vaisseaux de métaxylème,
caractéristiques des Monocotylées (voir planche I).

C Utiliser les représentations conventionnelles des différents tissus (voir page
suivante).


A RENDRE pour le TP2, partie n°1 :

1- Pour le compte rendu, rendre une feuille A4 présentant les deux dessins
schématiques d’une structure racinaire et d’une structure caulinaire.

2- Présenter le principe expérimental et rendre un tableau synthétique présentant
les analogies et les différences entre ces deux tissus pour enfin conclure sur
la relation entre la structure et la fonction d’un organe végétal.
11

S SY YM MB BO OL LE ES S U UT TI IL LI IS SE ES S P PO OU UR R U UN N S SC CH HE EM MA A A AN NA AT TO OM MI IQ QU UE E ( (T TP P 2 2) )








Épiderme cutinisé
Suber (quadrillage à 90°
- ici 3 couches)
Exoderme, péricycle,
hypoderme, périderme,
phelloderme
(ici une assise)
Endoderme en 'U'
(Dessin non
schématique)
(Monocotylées)
Endoderme à cadre de
Caspary (Dessin non
schématique)
(Eudicotylédones)
Cambium et phellogène
(assise génératrice)
Collenchyme
Rhizoderme
(Représentation non
schématique des poils
absorbants)
Phloème (points non alignés)
Métaxylème avec gros vaisseaux des
Monocotylées (dessiner la forme exacte
des vaisseaux)
Liber (points alignés en lignes
concentriques vers le centre de
la coupe = rayons)
Xylème primaire ou
protoxylème (A noircir)
Bois homoxylé (Gymnospermes - lignes
concentriques vers le centre de la
coupe = rayons)
Bois hétéroxylé (Eudicotylédones -
lignes concentriques vers le centre de
la coupe = rayons)
Parenchymes (préciser le type)
Sclérenchyme (quadrillage fin
à 45°)
Parenchymes
sclérifiés
(quadrillage lâche à 45°)

12

E ET TU UD DE E D DE ES S P PR RO OC CE ES SS SU US S R RE EG GU UL LA AN NT T L L’ ’O OU UV VE ER RT TU UR RE E
S ST TO OM MA AT TI IQ QU UE E ( (T TP P2 2 S SU UI IT TE E) )
Epidermes isolés
Les études sur épidermes isolés sont réalisées sur des feuilles de plants âgés de trois à quatre
semaines (Arabidopsis thaliana, Commelina communis, Valerianella olitoria, Vicia faba). Les
jeunes feuilles sont prélevées avant l’éclairement du phytotron (les stomates sont fermés).

A l’aide d’une pince, on pelle la face inférieure de la feuille de façon à détacher la couche
épidermique. Chaque couche épidermique est collée, face inférieure sur une lamelle de verre
avec de l’adhésif silicone de type Hollister N°7730 (Medical adhesive) connu pour ne pas
endommager les cellules. Danger très important de fixation tissulaire (peau-organe).

Les lamelles sont ensuite déposées dans des petites boîtes de Pétri contenant 3 ml de milieu
tampon : KCl 10 mM, KOH 30 mM, MES 10 mM, pH ajusté à 6,5 avec de l’acide
iminodiacétique.
Puis les boîtes sont placées à l’obscurité (sous papier aluminium) à température ambiante
pendant quinze minutes, avant l’ajout de molécules pharmacologiques à tester, afin de
normaliser les valeurs d’ouverture stomatique entre les différentes expériences.
Ouverture stomatique

Les lamelles portant les épidermes végétaux seront soumises à quatre types de traitement :
C Traitement lumineux d’une heure sous lampe à lumière froide.
C Traitement obscurité d’une heure supplémentaire (Absence de lumière).
C Traitement lumineux en présence d’acide abscissique à 1µM de concentration finale.
C Traitement obscurité en présence de fusiccocine à 5 µM de concentration finale.
Après 1h de traitement, les épidermes montés sur une lame et sont observés au microscope.


13

Observation

Observer d'abord au faible grossissement du microscope pour centrer la coupe, puis utiliser le
grossissement moyen pour reconnaître les différents tissus et les zones où la
coupe est la meilleure.

Passer au fort grossissement (10x 60) puis régler l'intensité lumineuse en
agissant sur le rhéostat de l'éclairage, le condenseur de lumière et le diaphragme.
Excès ou défaut de lumière sont également nuisibles à une bonne observation.

Utiliser l’oculaire équipé d’une graduation et comparer vos observations avec la lame de calibration
gravée au centième de mm.
Mettre le microscope en position de calibration de facon à faire correspondre vos occulaires avec la
lame de calibration.

Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire et Y pour la lame de
calibration). Calculer la distance entre chaques lignes au niveau de
l’occulaire avec l’équation suivante :

Mesure entre 2 lignes = Y/X x 10 µm

Maintenant, vous êtes capables de mesurer la taille des cellules végétales
en µm grâce à votre calibration. Vous pouvez effectuer un comptage exhaustif des stomates ouvert ou
fermés suivant les conditions expérimentales.

La largeur de l’ostiole, représentative de l’ouverture stomatique, exprimée en micromètre sera
mesurée sous microscope photonique (grossissement 10x60).

Pour chaque traitement, l’ouverture moyenne de 20 stomates sera calculée ainsi que l’écart à
la moyenne ( = Ecart type/racine (n-1)) – Fournir le tableau de valeur avec le compte rendu.



A RENDRE pour le TP2 partie n°2 :

3- Pour le compte rendu, présenter après une courte introduction, les objectifs du
TP, l’Interprétation des observations chez Vicia faba et Commelina communis,
puis finir par une conclusion.

4- Rendre un tableau synthétique présentant les valeurs d’ouvertures des
ostioles pour chaque condition expérimentale et donner les évaluations
statistiques.

14

------------------------------------------------------------------------
Exemple de calcul de l'écart-type :
Voici quatre séries de 5 valeurs:
• Condition A : 10 ; 12 ; 14 ; 16 ; 8
• Condition B : 12 ; 12 ; 12 ; 12 ; 12
• Condition C : 12 ; 13 ; 12 ; 11; 12
• Condition D : 7 ; 17 ; 10 ; 13 ; 13

Calculer la moyenne de ces quatre conditions. Que constatez-vous ?

Quel est la variabilité des valeurs dans chacune de ces conditions ?
Pour les distinguer, on calcule un paramètre appelé écart type (σ)

Exemple de calcul :
σ
A
=


TP3 : ETUDE DE LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET DE
LA GLUTAMATE SYNTHASE DES RACINES DE MAIS

I - Principe
L’ammoniac (NH
3
) qui résulte de la réduction des nitrates ou de celle de l’azote atmosphérique est
immédiatement incorporé sous forme d’aminoacides ou d’amides. L’une de ces dernières, la glutamine, amide de
l’acide glutamique, est le précurseur ou le donneur du groupe aminé de nombreux produits du métabolisme
(tryptophane, histidine, CTP, AMP, ...). La glutamine est formé à partir de l’acide glutamique par action de la
glutamine synthétase:

NH
4
+ acide glutamique + ATP glutamine + ADP + Pi

+ La glutamine synthétase est une enzyme de structure complexe, isolée chez les procaryotes et les
eucaryotes, dont le poids moléculaire varie selon les espèces de 500 à 600 KkDa. Elle peut également
catalyser la formation de γ - glutamyl hydroxamate:

Ac. glutamique + ATP + NH
2
OH γ - glutamyl hydroxamate + ADP + Pi
Mg
2+

Mg
2+

15


C’est la présence de ce composé qui sera recherchée dans des mélanges réactionnels comprenant la glutamine
synthétase extraite de racines de maïs.

+ La glutamate synthase (glutamine : 2-oxoglutarate aminotransférase = GOGAT) catalyse la seconde étape
de l’assimilation de l’azote ammoniacal ; elle permet le transfert d’un groupement NH
2
de la fonction
amide de la glutamine vers l’acide 2-oxoglutarique pour former deux molécules de glutamate.

Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H
+
2 glutamate + NAD
+

Nous nous intéresserons donc au cours de ce TP à la glutamate synthase NADH-dépendante.


II - Préparation de l’extrait enzymatique
Les grains de maïs sont mis à germer pendant 72 h à 26°C en présence de (NH
4
)
2
SO
4
10 mM) et de KNO
3
(10
mM). Les racines (10 g) sont broyées dans un mortier en présence de 15 mL de tampon Tris-HC1 (50 mM) pH
7,4 contenant de 1’EDTA (10 mM), du MgC1
2
(10 mM) et du DTT (10 mM). Après filtration sur étamine, la
suspension obtenue est centrifugée à 14000 rpm pendant 30 minutes. Après élimination du culot, le surnageant
obtenu servira à déterminer l’activité enzymatique étudiée.

III - Activité de la glutamine synthétase

1 / Réalisation de la courbe étalon
La courbe étalon sera effectuée à l’aide de différentes concentrations de γ -glutamyl hydroxamate, les
hydroxamates forment en effet des complexes fortement colorés avec les ions ferriques.
- Introduire dans 7 tubes à essais:
0 - 0,1 - 0,15 - 0,2 - 0,25 - 0,3 et 0,4 mL d’une solution de γ -glutamyl hydroxamate 5 mM.
- Compléter à 1,6 ml avec du tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4. Rajouter dans chaque tube 0,4 mL du réactif
composé de :
- FeC1 6H à 10% dans HC1 0,2 N (1 vol.)
- Acide trichloracétique à 25% (1 vol.) (en préparer 12 ml)
-HCl 6N (l vol.)

Lire les densités optiques à 540 nm après 10 minutes.
16


2 / Détermination de l’activité enzymatique
Dans un tube à hémolyse, mélanger:
- 0,5 ml de tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4
- 0,2 ml de Na-glutamate (0,3 M)
- 0,2 ml d’ATP (30 mM)
-0,1 ml de MgSO
4
(0,5 M)
- 0,5 ml d’extrait enzymatique
- Incuber 5 minutes à 25°C. Ajouter alors 0,1 ml de NH
2
OH (1 vol. de NH
2
OH-HCl N + 1 vol. de NaOH N).
- Incuber 15 minutes à 25°C puis arrêter la réaction avec 0,4 ml du réactif décrit au III-A.
- Réaliser un essai témoin en remplaçant l’extrait enzymatique par du tampon.
- Centrifuger les essais à 5000 rpm pendant 10 minutes et lire les D.O. à 540 nm.
- Exprimer les résultats en nmoles de γ-glutamyl hydroxamate formées par minute et par mg de protéine.

IV - Etude de la glutamate synthase
La détermination de l’activité enzymatique sera effectuée en suivant au spectrophotomètre la diminution de D.O.
à 340 nm correspondant à l’oxydation du NADH.

1 / Réalisation de la courbe étalon
A partir de la solution de NADH 1 mM, préparer les solutions : 25, 50, 100, 150 et 200 tM (Vf= 2,4 mL).
Lire directement les D.O. à 340 nm.

2 / Détermination de l’activité enzymatique
La préparation des mélanges réactionnels 1, 2 et 3 s’effectuera directement dans une cuve de spectrophotomètre
de la manière suivante :

1 2 3
Tampon HEPES-KOH 200mM, pH8,6 renfermant 10
mM de DTT
1,7 mL 1,3 mL 1,6 mL
2-oxoglutarate 10 mM 0,2 mL 0,2 mL 0 mL
NADH 1 mM 0 mL 0,4 mL 0,4 mL
17

Glutamine 100 mM 0,1 mL 0,1 mL 0 mL
Extrait enzymatique 0,4 mL 0,4 mL 0,4 mL

La réaction démarre par l’addition du NADH. Suivre la variation de D.O. à 340 nm toutes les 30 secondes
pendant 5 minutes, du mélange 2 par rapport au mélange 1.
Effectuer la même opération en remplaçant 2 par 3.
Exprimer les résultats en nmoles de NADH oxydé par min et par mg de protéine.
Conclusions.

V - Dosage des protéines par la méthode de Bradford
Cette méthode repose sur la propriété du bleu de Coomassie à se lier, en milieu acide, aux protéines et de former
ainsi un complexe qui absorbe à 595 nm.

1 / Préparation de la gamme étalon
+ Préparation des solutions de BSA
A partir d’une solution de protéine d’albumine sérique bovine (BSA) concentrée à 20 mg.mL
-1
, préparer une
solution fille à 2 mg/ mL
-1
(V= 1 mL).
Préparer ensuite à l’aide de cette solution fille 6 tubes contenant 200 µL de solution de BSA à 0 - 0,25 - 0,5 – 1 -
1,5 et 2 mg. mL
-1
.

+ Dosage au réactif de Bradford
Mélanger 10 µL de chacune de vos solutions de BSA dans le réactif de Bradford dilué 5X dans H
2
O (Vf= 1 mL).
Incuber 5 minutes à température ambiante et mesurer les D.O. à 595 nm en utilisant le tube 0 de la gamme
comme 0 d’absorbance.
Tracer le graphe des D.O. obtenues à 595 nm en fonction de la concentration en BSA (µg.mL
-1
).

2 / Dosage de l’extrait enzymatique
Réaliser un dosage au réactif de Bradford des protéines contenues dans votre extrait après l’avoir dilué 10, 20 et
50 fois. Le mode opératoire sera le même que celui utilisé pour la réalisation de la gamme étalon.
Chaque dilution fera l’objet de 2 mesures.
Déterminer graphiquement la concentration en protéine de votre extrait enzymatique.

18

Préparation des Solutions et matériels, cultures et installation des
Salles : (Version 2011)

TP 1 - préparation des solutions :

Achat à Carrefour de Pomme de Terre (20kg), Mâche (2 paquets) et 2 sacs d’oignons
blancs.
14-18/Mars/2011 -
Solution de Sorbitol : MW 182.2 anhydre
Faire 250 mL d’une solution à 15% w/v de Sorbitol (15g/L) puis, diluer.

Faire des solutions de sorbitol à 1, 5, 10 et 15 % w/v - 50mL de chaque
Faire des fractions aliquotes pour 7x4 eppendorf de 1,5 mL.

Solution de Sucrose :
Solution stock de sucrose à 2M - MW 342.30
Faire 2L : Pour 500 mL à 2M ¬ ¬¬ ¬ 342,30g de sucre
Sera dilué. en TP de 0.1 à 0.8 M

Tampon MES pH6.15 100mM (100mL)
Peser 1.952 g de MES dans 90mL d’eau
Ajouter qqs gouttes de NaOH 10N
Ajuster à 100 mL

Solution TL : (Préparation en TP)
10% Sorbitol
Tampon MES pH 6.15 0.05 M
Ajouter extemporanément (en cours de TP):
50 % de sorbitol 20%
50 % de MES 100 mM
0.1 g de Cellulase Sigma (C-8546)
0.2 g de Pectinase Fluka (17389)

Rouge Neutre et Safranin O :
Diluer à 0.1 % w/v en solution TL sans enzymes (10mg pour 10mL)
Aliquoter en 7x4 eppendorf de 1,5 mL.

Préparation d’une solution de Vert de méthyle (100mL)
en solution aqueuse, acidifiée à l'acide acétique :
Eau bidistillée : 100 ml
Vert de méthyle : 5 g
acide acétique glacial 1 cc
Laisser durant 1 heure sur l'agitateur magnétique, et ensuite filtrer !










19

TP 2 - Préparation des solutions :

7-11/Mars/2011 - Attention, lancer les cultures pour le matériel biologique en avance (4semaines) :
Vicia faba - 7 pots x12 binômes = 84 pots.
Medicago sativa – 2 pots vermiculite x 12 binômes

Solutions à 5 µM fusicoccine et 1 µM ABA. (Risque toxicité).
La préparation des solutions se fait dans EtOH 100% et le stockage à -20°C.

Préparation bouteille Agar à 4% dans de l’eau (4x 100mL).

Préparation des Solutions tampons : (2000 mL)
KCl 10 mM, KOH 30 mM, MES 10 mM, pH ajusté à 6,5 avec de l’acide iminodiacétique.

Préparation des solutions de coloration :
Dilution dans 1000 mL d’eau distillée des solutions de coloration.
1- Vert d'iode à 2/1000
2- Rouge Congo à 2/1000 (Risque toxicité) ¬ A changer pour Carmin ou
Phloroglucinol.
3- Acide Acétique à 1% à partir d'acide acétique Glacial
4- Solution d'eau de javel à 12°
Remplir les comptes gouttes avec les diverses solutions et de l'eau distillée (Faire les
étiquettes si nécessaire).

Installation de la salle pour le TP1:

14 postes avec :
1 vortex pour 2 binômes
1 microscope pour chaque binôme
1 cellule de Malassez pour chaque binôme +
lamelle
4 Lames de microscope +lamelles
1 portoir orange pour tube falcon de 50mL
6 tubes falcon vide + 1 tube de saccharose 2M
1 portoir eppendorf avec :
Þ 4 solutions de sorbitol en eppendorf :
1%, 5%, 10% et 15 %
Þ 2 tubes eppendorf de 1.5 mL vide + 1
tube de 2 mL
1 portoir de pipette avec :
Þ 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL
Þ 1 propipette
1 éprouvette graduée de 50 mL - 100 mL
1 couteau court
1 pince
1 scalpel
1 pissette d’eau 500 mL
1 compte goutte d’eau distillée

1 pipetteman de 200µL
1 pipetteman de 1000 µL
20

1 lot de cône bleu
1 lot de cône jaune
1 sopalin
1 Poubelle de Table

Installation de la salle pour le TP2:
Installer la table orbitale et le Vibratome
Installer les lampes LED/Fluocompacte pour l’éclairage

7 postes avec :
1 lame de calibration 100µm
1 microscope pour chaque binôme
1 vortex par binômes
4 Lames de microscope +lamelles
1 portoir orange pour tube falcon de 50mL (Solution pour Stomate)
1 portoir eppendorf avec :
Þ 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%, 5%, 10% et 15 %
Þ 2 tubes eppendorfs de 1.5 mL vide + 1 tube de 2 mL
1 portoir de pipette avec :
Þ 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL
Þ 1 propipette
1 pince
1 scalpel
1 pissette d’eau 500 mL
1 compte goutte de Javel, Acide acétique, Vert
d’iode et Rouge congo
1 pipetteman de 10-20µL
1 pipetteman de 200µL
1 pipetteman de 1000 µL
1 lot de cône bleu
1 lot de cône jaune
1 sopalin
1Poubelle de Table
2 Supports nylon pour les coupes
2 Plaques 8 puits
1 marqueur





21



Les microscopes LEICA doivent
être équipés d’objectif gradué.
Réticule Leica gradué :






Inventaire des solutions 01/2010 :
Quantité Produit Référence Marque
1kg D-Sorbitol S1876-1kg Sigma
500g Iminodiacetic acid 220000 Aldrich
25g Carmine C1022-25g Sigma
5g MES M3671-50g Sigma
10g Pectinase 17389 Fluka
50g Pectinase 17389 Fluka
5kU Pectinase solution P4716-5kU Sigma
2.5kU Cellulase 2* C8546-2.5kU Sigma
25g Phloroglucinol P3502-25g Sigma













22

Solutions et matériels à préparer pour le TP3
"Etude de la glutamine synthétase (GS) et de la
glutamate synthase (GOGAT) des racines de maïs" version
2010-2011


● Matériel végétal commun pour tous les étudiants

- 2 L Milieu de germination des grains de maïs

(NH
4
)
2
SO
4
(10 mM) 1.32 g/l
KNO
3
(10 mM) 1.01 g/l
A conserver à RT (à préparer et à conserver au laboratoire INRA)

- 5 jours avant le TP
Des grains de maïs sont mis à germer dans des containers en plastique (à l’INRA) sur
2 épaisseurs de sopalin imbibé de milieu de germination. La germination a lieu
pendant 4 à 5 jours à l’étuve à 22°C.


• Solutions communes pour tous les étudiants

- Réactif de Bradford

A conserver à 4°C
Solution mère commune à tous les binômes

- HCl 0.2N

A conserver à RT

- NaOH 1N

A conserver à RT

- EDTA 10 mM

A conserver à RT
Peser 1.86 g pour 500 ml

- DTT 10 mM

Préparer 500 ml - à conserver à RT
Peser 770 mg pour 500 ml

- Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT 10 mM

A conserver à 4°C – ajuster le pH avec KOH

• Solutions à préparer et à aliquoter pour chaque binôme

- Nbr binôme * Bouteille 100 ml H
2
O milliQ ou aliquoter tubes 50ml

A conserver à RT


- Tampon de broyage

Préparer 500 ml - à conserver à 4°C - aliquoter en tubes 50 ml
23


Produit PM C finale
(mM)
pH C finale
(g/L)
A peser (g)
pour 500mL
Tris –HCl 121.1 50 pH=7.4 6.06 3.025
EDTA 372.2 10 3.72 1.862
MgCl
2
6H
2
O 203.3 10 2.03 1.015
DTT 154.3 10 1.54 0.771

- Tampon Tris-HCl 25mM (3.03 g/L) pH=7.4

Préparer 1 l - à conserver à RT - ajuster le pH avec HCl - aliquoter en tubes 50 ml

- FeCl
3
6H 10% dans HCl 0.2N

Préparer 50 ml - A conserver à RT - Aliquoter en tubes 15 ml
Peser 5 g pour 50 ml de HCl 0.2N

- Acide trichloroacétique 25 %

Préparer 50 ml - A conserver à RT - Aliquoter en tubes de 15 ml
Peser 12.5 g pour 50 ml

- HCl 6N

Préparer 50 ml - A conserver à RT- Aliquoter en tubes de 15 ml
Diluer 2 fois la solution commerciale 12 N : 25 ml solution HCl commerciale 12 N + 25 ml
H
2
O

- Na-glutamate (0.3 M)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml
Peser 1.12 g pour 20 ml

- ATP (30 mM)
Préparer 10 ml - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml
Peser 180 mg pour 10 ml

- MgSO
4
(0.5 M)
Préparer 20 ml - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml
Peser 2.46 g pour 20 ml

- NH
2
OH (hydroxylamine)
Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml
Peser 695 mg pour 10 ml H
2
O + 10 ml NaOH 1N
(à prendre au labo symbiose)

- 2-oxoglutarate (10 mM) = α αα α-cétoglutarate

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml
Peser 33.6 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT

- Glutamine (100mM)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml
Peser 293 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT
(à prendre au labo symbiose)

- BSA (20 mg/ml)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 2 ml
Peser 200 mg pour 20 ml

• Solutions à préparer extemporanément = au début de la séance
24


- NADH (1 mM)

Préparer 10 ml - A préparer extemporanément - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes
de 1.5 ml
Peser 7.5 mg pour 10 ml

- γ γγ γ-glutamyl hydroxamate (5mM)

Préparer 10 ml - A préparer extemporanément - A conserver dans la glace pendant la
manip - Aliquoter en tubes de 2 ml
Peser 8.1 mg pour 10 ml de Tris HCl 25 mM pH= 7.4

Installation Salle TP 3 :

• Matériels commun

- 1 centrifugeuse sigma 2K15 + rotor 12139 (salle SN II-4)
- 1 (ou 2, si possible) balance + papier alu
- 1 bain marie à 25°C + portoir pour tubes corning (13*100mm)
- 1 centrifugeuse de paillasse pou eppendorf 2ml
- pour 2 binômes : 1 spectrophotomètre multipasseur blanc
- parafilm
- des gants S/M/L

• Matériels à installer sur la paillasse pour chaque binôme
Quantité*Nbre binômes

- 1 mortier et 1 pilon (placard à côté sorbonne SN 0-4) à conserver au froid avant le
début de la manip
- 1 entonnoir (SN 0-4)
- 1 étamine=gaze pour filtrer l’extrait enzymatique (entrée placard SN 0-4)
- 1 couteau ou scalpel
- 1 tube spécial centri (environ 30 ml avec bouchon vissé) pour la centri sigma et
pour le rotor 12139 (Tiroir salle de prep 524)
- portoir tubes corning
- 14 tubes corning (13*100mm) en verre
- 1 spatule
- 1 vortex (tiroir SN II-4)
- 1 chronomètre (tiroir SN II-4)
- Des cônes jaunes 200µl + 1 pipetman P200
- Des cônes bleus 1000µl + 1 pipetman P1000
- 1 portoir eppendorf 1.5ml
- 8 tubes eppendorf 2ml
- 1 portoir à falcon 50 ml + 1 portoir à falcon 15 ml
- 1 tube falcon 15ml
- 1 bac à glace
- 1 poubelle de paillasse
- 1 pipette en verre de 2ml + 1 pipette en verre de 5ml + 1 pipette en verre de 10
ml+ 1 poire + portoir (salle SN 0-4)
- 1 pissette H
2
O
- 7 cuves spectro 3ml + 4 cuves spectro 1.5ml
1


T
TTR
RRA
AAV
VVA
AAU
UUX
XX
P
PPR
RRA
AAT
TTI
IIQ
QQU
UUE
EES
SS
d
dde
ee P
PPN
NNV
VV


L
LLS
SSV
VV2
22
2013
2

R RE EL LA AT TI IO ON NS S S ST TR RU UC CT TU UR RE ES S - - F FO ON NC CT TI IO ON NS S C CH HE EZ Z L LE ES S V VE EG GE ET TA AU UX X

OSMOSE ET PERMEATION (TP1)

A. INTRODUCTION
A première vue, les expériences groupées dans cette manipulation et le matériel biologique
employé peuvent paraître disparates. En fait, il ne sera question ici que de certains types
d'échanges cellulaires (osmose : eau ; perméation : ions) établis entre le vivant et son milieu.
Quant aux sujets d'analyse (tubercules, épidermes, protoplastes..), ils ont été choisis parce qu'ils
permettaient des expériences simples et de courte durée.

Le potentiel osmotique
Le potentiel osmotique, désignée par le symbole Ψs, est fonction de la température, de la
concentration de la substance dissoute, et de ses caractéristiques de dissociation.
Le potentiel hydrique
La notion de potentiel hydrique a été largement discutée au cours.

Pour éclaircir des problèmes de terminologie, nous donnerons le tableau suivant :

Milieu intérieur Milieu extérieur
∆Ψ = Ψ
int
- Ψ
ext

Iso-osmotique Isotonique équilibre ∆Ψ= 0
Hypo-osmotique Hypertonique plasmolyse ∆Ψ> 0
Hyper-osmotique Hypotonique turgescence ∆Ψ < 0


B. Evaluation des paramètres osmotiques

A) Détermination de la potentiel de succion tissulaire

Les tubercules de pommes de terre sont constitués essentiellement de parenchyme de
réserve. En mettant à profit la grande homogénéité de ce tissu, il est possible de réaliser un
certain nombre d'expériences, telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur, sur des
fragments de tubercule.

1. Préparation du matériel

- Prendre trois pommes de terre, les éplucher et les placer dans un récipient plein d'eau.
Découper les tubercules en parallélépipèdes de section carrée (env. 0,5 cm de côté).
- Après les avoir lavés, conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide.
- Ajuster alors les fragments de tissus à une longueur déterminée de 4cm, en supprimant
les bords inférieurs et supérieurs.
- Essuyer légèrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les
répartir en lots de 4.
- Déterminer rapidement, sur les balances, le poids frais (PF
0
) de chaque lot (auquel
on attribuera un numéro).

3

2. Mode opératoire
- Préparer dans 6 tubes falcons de 50 mL des solutions de saccharose aux
concentrations indiquées (ci-dessous), à partir d'une solution stock (2M).






- Incuber vos lots de fragments de pomme de terre dans chacun des tubes.
- Après 1 heure d’incubation, mesurer pour chacun des lots, le poids frais PF
f
ainsi que
la longueur moyenne L
f
de chaque lot (légèrement essuyer les segments sur un papier
sopalin).
On calculera alors :

Pression osmotique d’une solution idéale (formule de Van t’Hoff) :
Π =RT/V.log a
w
≈ i x C
B
x R x T x 1000 en Pa (1 bar = 101325 Pa)
3. Résultats
Reporter sur un graphique, les courbes correspondant au ∆ ∆∆ ∆L et au ∆ ∆∆ ∆PF, en fonction
de la concentration molaire (M) du saccharose.

Pour chacune des courbes, déterminer la valeur de la concentration de saccharose
correspondant à l'intersection avec l'abscisse.

Calculer les valeurs théoriques idéale de Π pour les différentes solutions suivant la
formulation de Van t’Hoff.

Calculer à partir de cette valeur, le potentiel hydrique des tissus (Ψ
W
= Ψ
S
= -Π

car
Ψ
P
= 0 au point d’intersection sur l’axe des abscisses).

Exprimer alors Ψ
W
en MPa et en Bar.


Rappels :

0 °C = 273,15 K ; R = 8,31 J/mol.K ; i = 1 pour le saccharose, 2 pour le NaCl ; C
B
= Concentration Molaire
de la solution.



bécher Ψ
s
(bars)
expérimentale
Concentration
finale (M)
Calcul Ψ
s
(bars)
Solution idéale
1
0 0,00

2
-1,3 0,05

3
-2,6 0,10

4
-5,2 0,20

5
-11 0,40

6
0,60

7
-25,2 0,80

8
1,00

4

B) Quelques propriétés des protoplastes foliaires
Le protoplaste est une cellule dont on a fait disparaître (mécaniquement ou enzymatiquement)
la paroi. En l'absence des potentiels hydrostatiques (pressions) normalement exercées par la
paroi sur le contenu cellulaire, il n'est stable que dans des conditions isotoniques (ou
légèrement hypertoniques) et prend alors une forme sphérique. Les protoplastes permettent
d'étudier un certain nombre de caractéristiques du plasmalemme (perméabilité, charges, ...).
Nous nous bornerons ici à observer la pénétration de deux types de colorants, pour
lesquels le plasmalemme présente une perméabilité sélective.
1. Isolement des protoplastes


1.1. Incubation enzymatique

- Peler délicatement, à l'aide d'une brucelle à pointes fines, l'épiderme inférieur de 3-5
feuilles de mâche (Valerianella olitoria), et découper le mésophylle en carrés de 1mm²
environ. Travailler sur un papier filtre humide, pour éviter le dessèchement.
- Pipeter dans une boîte de Pétri 2 ml d'une solution enzymatique déjà prête, contenant
des cellulases, des pectinases et du sorbitol. Expliquer le rôle de ces divers composés.
- Déposer les fragments de feuilles (face pelée vers le bas) à la surface de la solution
d'incubation.
- Envelopper la boîte de Pétri d'une feuille d'aluminium et incuber à 20-30°C durant 30
minutes sur un agitateur orbital (50-100 tpm) - (Attention à ne pas renverser la boîte).

1.2. Purification

- Filtrer la suspension de protoplastes à travers un filtre nylon (100 µm), pour
éliminer les restes de feuilles non digérées. Rincer le matériel après usage.

- Centrifuger 1,5 mL de la suspension de protoplastes (tubes eppendorf de 1.5 mL, 500
tpm, 5 min).

5

- Eliminer le surnageant et laisser 100-150 µL de solution. Le culot de protoplastes
sera suspendu en tapotant sur le tube. Ne surtout pas vortexer.
- Conserver cette suspension de protoplastes dans son tube eppendorf et agiter
doucement avant usage.
2. Observation et comptage des protoplastes

Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de
comptage de volume connu. C’est une lame épaisse en verre, comportant des rigoles et un
quadrillage :
















Le volume de comptage est déterminé par :
-la surface du quadrillage gravé sur la lame.
-la profondeur de la chambre.

Parmi les 100 rectangles totaux, on trouve 25 rectangles qui sont divisés en 20 petits carrés afin de faciliter
le comptage.
→ Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm
3
= 1 µL

→ Chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm
3
= 10 nL

Pour la Numération

• Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage, et vérifier l’homogénéité de la répartition des
cellules à compter (si la répartition est mauvaise, recommencer). Régler le contraste et la lumière pour observer
la grille et les protoplastes.

• Observer ensuite à l’objectif x40 ou à x60 pour réaliser le comptage (Voir instructions).

• Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du quadrillage.

Lamelle planée Lame porte - objet
Profondeur de la
chambre
Rigoles
Quadrillage
Plateaux
surélevés
Plate-forme centrale
6

Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles qui chevauchent 2
arêtes du rectangle sur 4 (en pratique, on choisit de prendre en compte les cellules chevauchant la ligne
horizontale supérieure, et la ligne verticale droite).






- Prélever une goutte de suspension de protoplastes (env. 20µL) et la déposer sur la
gouttière centrale de la cellule de comptage (Malassez, voir explication). Estimer le
nombre de protoplastes isolés et leur concentration (protoplastes/mL).

- Observer alors, à un grossissement final de 400x-600x, les détails morphologiques
des protoplastes. Dessiner une cellule de protoplaste et déterminez la position des
chloroplastes, des vacuoles etc...

3. Perméabilité sélective

- Pipeter délicatement 20 µL de la suspension de protoplastes.

- Ajouter sur les lames 1 et 2, respectivement, 20µL, des colorants suivants :
I : Rouge neutre 0.1 % v/v en solution TL.
II : Phénosafranine 0.1 % v/v en solution TL.

- Recouvrir d’une lamelle et après 2 min, observez au microscope. NE PAS LAISSER
SECHER !
Pour les deux essais, déterminer, le nombre de protoplasmes colorés (A
compter sur 20 protoplastes sans a priori).
Commenter les résultats.

- Ajouter alors sur les bords d’une lamelle, 20µL d'eau ou de sorbitol à 15%
(Réalisez deux expériences).
Observer en temps réel les phénomènes physiques sur les protoplastes.


C) Observations microscopiques

Les lambeaux épidermiques, constitués d'une assise cellulaire unique, permettent une
observation microscopique aisée des cellules qui les composent. Les vacuoles de ces tissus
occupent la presque totalité de l'espace cellulaire. Il est ainsi possible, en plongeant ces lambeaux
dans des solutions de potentiel osmotique variable, d'étudier les échanges d'eau entre les cellules
et le milieu extérieur, et, d'obtenir, sur la base d'observations microscopiques, des informations
sur le potentiel hydrique cellulaire.
Numération sur le rectangle
= 7 protoplastes
7


1. Mode opératoire

- Inciser délicatement, à l'aide d'un scalpel, un carré de 3 mm de côté environ, dans
l'épiderme intérieur d'une écaille d'un bulbe d'oignon.
- Détacher avec une paire de brucelles à pointes fines, le fragment épidermique ainsi
délimité en le saisissant par un des coins.
- Placer le lambeau (face déchirée vers le bas) entre lame et lamelle dans 1 mL d’une
solution de sorbitol (6 tubes). Ajouter 20µL de Vert de Méthyle et 20µL de Rouge
Neutre dans chaque tube eppendorf.
- Après 5 min., observez entre lame et lamelle au microscope.
- Dessinez les points extrêmes de turgescence et de plasmolyse, puis cherchez les points
encadrant l’isotonie.
Choisir au microscope une zone facilement observable.
Observez la cellule et ses différents compartiments puis évaluez le potentiel
hydrique cellulaire.
2. Evaluation du potentiel hydrique cellulaire
A l'isotonie, le potentiel hydrique de la cellule est égal au potentiel osmotique du
milieu extérieur.
On utilisera des solutions de sorbitol (substance qui ne pénètre pas ou peu dans les
cellules) à différentes concentrations (0 ; 2; 6; 8 ; 10 et 15 %).
En travaillant chaque fois avec un lambeau frais, noter la concentration C, pour
laquelle il y a une légère plasmolyse.

Déterminer la concentration molaire de sorbitol qui se rapproche le plus de
l'isotonie et déduire le potentiel hydrique cellulaire.














8

Annexes :

















9

Etude de la structure racinaire, caulinaire et du processus
d’ouverture stomatique (TP2)

Exécution et montage des coupes anatomiques
1. Exécution
Les échantillons de plante sont au préalable coupé et inclus dans de l’agar à 4 %. L'agar
sert pour les coupes au vibratome (Labonord 100 plus), mais pas vraiment pour protéger un
tissu pendant l'inclusion.

Gardez une dizaine de coupe de chaque échantillon de tige ou de racine, puis procédez aux
colorations de ces coupes.

2. Coloration
Respecter les indications de temps de traitement et de rinçage suivants :
Prendre une plaque multi-puits et ajoutez un volume de 5mL de chaque solution de
coloration ou d’eau distillée. Procédez aux colorations des coupes des échantillons
végétaux. Les transferts d’un milieu vers un autre se font à l’aide d’un tamis après chaque
temps de traitement.

1) eau de javel: 15 min 5) Coloration au rouge Congo: 10 min
2) rinçage abondant à l’eau 6) Rinçage sommaire
3) lavage rapide à l’acide acétique :
1-2 min 7) Coloration au Vert d'iode: 5 min
4) rinçage sommaire à l’eau 8) Rinçage soigneux et montage sur lame.

Résultat
Les tissus cellulosiques apparaissent en rouge; les tissus lignifiés et subérifiés
apparaissent en vert – (¨ ¨¨ ¨ Attention les colorations présentées en cours peuvent être
différentes).
3. Montage
Il est indispensable que lames et lamelles soient propres et sèches et que, par ailleurs, les
surfaces optiques du microscope, en particulier l'oculaire, soient essuyées avec un papier
Kim Wipes (risque de rayures).

Ne monter que 2 à 3 coupes sur une lame en choisissant de préférence les fragments de
coupes les moins colorés ; ce sont en principe les plus minces.

Placer suffisamment de liquide de montage sur la lame pour que toute la coupe soit immergée.
Placer doucement la lamelle sur la préparation en vous aidant d'une aiguille montée. Ne pas
appuyer sur la lamelle pour chasser d'éventuelles bulles d'air : la préparation serait
irrémédiablement inutilisable.

10


Si besoin, ajouter de l'eau en présentant à l’aide des comptes gouttes au bord de la lamelle,
sans la soulever (l'eau pénètre par capillarité), ou au contraire, éliminer les excès d'eau avec
un mouchoir de papier.
II. CONSEILS POUR LE DESSIN
1. Généralités
C Dessiner grand (2/3 d’une page), l'échelle du dessin étant choisie en fonction des
plus petits détails à reproduire (Endoderme ou pôles vasculaires, par exemple).

C Respecter les proportions relatives des différentes parties.

C Faire des traits fins, nets, réguliers, continus (crayon HB).

C Légendes: placées assez loin, brèves mais précises et complètes, écrites lisiblement
et horizontalement; traits de rappel à la règle, se terminant dans le dessin par un point
ou une flèche et ne se croisant pas.

C Le titre comprend le nom complet de la plante (genre, espèce et autres indications
taxonomiques en Latin), de l'organe ou du détail représenté, le sens de la coupe, le
grossissement, etc....
2. Dessin général
C Représenter le contour exact d'un quart de coupe (pas de compas: une coupe n’est
jamais parfaitement ronde) et les limites exactes des différents tissus en veillant
particulièrement aux proportions relatives. Utiliser un tiré pour montrer l'arrêt
"arbitraire" de la coupe.

C Les particularités de votre échantillon doivent être représentées : nombre exact de
faisceaux conducteurs, contours irréguliers d'une lacune, d'un cambium, position
précise d'un canal ou d'une fibre isolée, etc.
Ne pas représenter de cellules, sauf les très gros vaisseaux de métaxylème,
caractéristiques des Monocotylées (voir planche I).

C Utiliser les représentations conventionnelles des différents tissus (voir page
suivante).


A RENDRE pour le TP2, partie n°1 :

1- Pour le compte rendu, rendre une feuille A4 présentant les deux dessins
schématiques d’une structure racinaire et d’une structure caulinaire.

2- Présenter le principe expérimental et rendre un tableau synthétique présentant
les analogies et les différences entre ces deux tissus pour enfin conclure sur
la relation entre la structure et la fonction d’un organe végétal.
11

S SY YM MB BO OL LE ES S U UT TI IL LI IS SE ES S P PO OU UR R U UN N S SC CH HE EM MA A A AN NA AT TO OM MI IQ QU UE E ( (T TP P 2 2) )








Épiderme cutinisé
Suber (quadrillage à 90°
- ici 3 couches)
Exoderme, péricycle,
hypoderme, périderme,
phelloderme
(ici une assise)
Endoderme en 'U'
(Dessin non
schématique)
(Monocotylées)
Endoderme à cadre de
Caspary (Dessin non
schématique)
(Eudicotylédones)
Cambium et phellogène
(assise génératrice)
Collenchyme
Rhizoderme
(Représentation non
schématique des poils
absorbants)
Phloème (points non alignés)
Métaxylème avec gros vaisseaux des
Monocotylées (dessiner la forme exacte
des vaisseaux)
Liber (points alignés en lignes
concentriques vers le centre de
la coupe = rayons)
Xylème primaire ou
protoxylème (A noircir)
Bois homoxylé (Gymnospermes - lignes
concentriques vers le centre de la
coupe = rayons)
Bois hétéroxylé (Eudicotylédones -
lignes concentriques vers le centre de
la coupe = rayons)
Parenchymes (préciser le type)
Sclérenchyme (quadrillage fin
à 45°)
Parenchymes
sclérifiés
(quadrillage lâche à 45°)

12

E ET TU UD DE E D DE ES S P PR RO OC CE ES SS SU US S R RE EG GU UL LA AN NT T L L’ ’O OU UV VE ER RT TU UR RE E
S ST TO OM MA AT TI IQ QU UE E ( (T TP P2 2 S SU UI IT TE E) )
Epidermes isolés
Les études sur épidermes isolés sont réalisées sur des feuilles de plants âgés de trois à quatre
semaines (Arabidopsis thaliana, Commelina communis, Valerianella olitoria, Vicia faba). Les
jeunes feuilles sont prélevées avant l’éclairement du phytotron (les stomates sont fermés).

A l’aide d’une pince, on pelle la face inférieure de la feuille de façon à détacher la couche
épidermique. Chaque couche épidermique est collée, face inférieure sur une lamelle de verre
avec de l’adhésif silicone de type Hollister N°7730 (Medical adhesive) connu pour ne pas
endommager les cellules. Danger très important de fixation tissulaire (peau-organe).

Les lamelles sont ensuite déposées dans des petites boîtes de Pétri contenant 3 ml de milieu
tampon : KCl 10 mM, KOH 30 mM, MES 10 mM, pH ajusté à 6,5 avec de l’acide
iminodiacétique.
Puis les boîtes sont placées à l’obscurité (sous papier aluminium) à température ambiante
pendant quinze minutes, avant l’ajout de molécules pharmacologiques à tester, afin de
normaliser les valeurs d’ouverture stomatique entre les différentes expériences.
Ouverture stomatique

Les lamelles portant les épidermes végétaux seront soumises à quatre types de traitement :
C Traitement lumineux d’une heure sous lampe à lumière froide.
C Traitement obscurité d’une heure supplémentaire (Absence de lumière).
C Traitement lumineux en présence d’acide abscissique à 1µM de concentration finale.
C Traitement obscurité en présence de fusiccocine à 5 µM de concentration finale.
Après 1h de traitement, les épidermes montés sur une lame et sont observés au microscope.


13

Observation

Observer d'abord au faible grossissement du microscope pour centrer la coupe, puis utiliser le
grossissement moyen pour reconnaître les différents tissus et les zones où la
coupe est la meilleure.

Passer au fort grossissement (10x 60) puis régler l'intensité lumineuse en
agissant sur le rhéostat de l'éclairage, le condenseur de lumière et le diaphragme.
Excès ou défaut de lumière sont également nuisibles à une bonne observation.

Utiliser l’oculaire équipé d’une graduation et comparer vos observations avec la lame de calibration
gravée au centième de mm.
Mettre le microscope en position de calibration de facon à faire correspondre vos occulaires avec la
lame de calibration.

Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire et Y pour la lame de
calibration). Calculer la distance entre chaques lignes au niveau de
l’occulaire avec l’équation suivante :

Mesure entre 2 lignes = Y/X x 10 µm

Maintenant, vous êtes capables de mesurer la taille des cellules végétales
en µm grâce à votre calibration. Vous pouvez effectuer un comptage exhaustif des stomates ouvert ou
fermés suivant les conditions expérimentales.

La largeur de l’ostiole, représentative de l’ouverture stomatique, exprimée en micromètre sera
mesurée sous microscope photonique (grossissement 10x60).

Pour chaque traitement, l’ouverture moyenne de 20 stomates sera calculée ainsi que l’écart à
la moyenne ( = Ecart type/racine (n-1)) – Fournir le tableau de valeur avec le compte rendu.



A RENDRE pour le TP2 partie n°2 :

3- Pour le compte rendu, présenter après une courte introduction, les objectifs du
TP, l’Interprétation des observations chez Vicia faba et Commelina communis,
puis finir par une conclusion.

4- Rendre un tableau synthétique présentant les valeurs d’ouvertures des
ostioles pour chaque condition expérimentale et donner les évaluations
statistiques.

14

------------------------------------------------------------------------
Exemple de calcul de l'écart-type :
Voici quatre séries de 5 valeurs:
• Condition A : 10 ; 12 ; 14 ; 16 ; 8
• Condition B : 12 ; 12 ; 12 ; 12 ; 12
• Condition C : 12 ; 13 ; 12 ; 11; 12
• Condition D : 7 ; 17 ; 10 ; 13 ; 13

Calculer la moyenne de ces quatre conditions. Que constatez-vous ?

Quel est la variabilité des valeurs dans chacune de ces conditions ?
Pour les distinguer, on calcule un paramètre appelé écart type (σ)

Exemple de calcul :
σ
A
=


TP3 : ETUDE DE LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET DE
LA GLUTAMATE SYNTHASE DES RACINES DE MAIS

I - Principe
L’ammoniac (NH
3
) qui résulte de la réduction des nitrates ou de celle de l’azote atmosphérique est
immédiatement incorporé sous forme d’aminoacides ou d’amides. L’une de ces dernières, la glutamine, amide de
l’acide glutamique, est le précurseur ou le donneur du groupe aminé de nombreux produits du métabolisme
(tryptophane, histidine, CTP, AMP, ...). La glutamine est formé à partir de l’acide glutamique par action de la
glutamine synthétase:

NH
4
+ acide glutamique + ATP glutamine + ADP + Pi

+ La glutamine synthétase est une enzyme de structure complexe, isolée chez les procaryotes et les
eucaryotes, dont le poids moléculaire varie selon les espèces de 500 à 600 KkDa. Elle peut également
catalyser la formation de γ - glutamyl hydroxamate:

Ac. glutamique + ATP + NH
2
OH γ - glutamyl hydroxamate + ADP + Pi
Mg
2+

Mg
2+

15


C’est la présence de ce composé qui sera recherchée dans des mélanges réactionnels comprenant la glutamine
synthétase extraite de racines de maïs.

+ La glutamate synthase (glutamine : 2-oxoglutarate aminotransférase = GOGAT) catalyse la seconde étape
de l’assimilation de l’azote ammoniacal ; elle permet le transfert d’un groupement NH
2
de la fonction
amide de la glutamine vers l’acide 2-oxoglutarique pour former deux molécules de glutamate.

Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H
+
2 glutamate + NAD
+

Nous nous intéresserons donc au cours de ce TP à la glutamate synthase NADH-dépendante.


II - Préparation de l’extrait enzymatique
Les grains de maïs sont mis à germer pendant 72 h à 26°C en présence de (NH
4
)
2
SO
4
10 mM) et de KNO
3
(10
mM). Les racines (10 g) sont broyées dans un mortier en présence de 15 mL de tampon Tris-HC1 (50 mM) pH
7,4 contenant de 1’EDTA (10 mM), du MgC1
2
(10 mM) et du DTT (10 mM). Après filtration sur étamine, la
suspension obtenue est centrifugée à 14000 rpm pendant 30 minutes. Après élimination du culot, le surnageant
obtenu servira à déterminer l’activité enzymatique étudiée.

III - Activité de la glutamine synthétase

1 / Réalisation de la courbe étalon
La courbe étalon sera effectuée à l’aide de différentes concentrations de γ -glutamyl hydroxamate, les
hydroxamates forment en effet des complexes fortement colorés avec les ions ferriques.
- Introduire dans 7 tubes à essais:
0 - 0,1 - 0,15 - 0,2 - 0,25 - 0,3 et 0,4 mL d’une solution de γ -glutamyl hydroxamate 5 mM.
- Compléter à 1,6 ml avec du tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4. Rajouter dans chaque tube 0,4 mL du réactif
composé de :
- FeC1 6H à 10% dans HC1 0,2 N (1 vol.)
- Acide trichloracétique à 25% (1 vol.) (en préparer 12 ml)
-HCl 6N (l vol.)

Lire les densités optiques à 540 nm après 10 minutes.
16


2 / Détermination de l’activité enzymatique
Dans un tube à hémolyse, mélanger:
- 0,5 ml de tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4
- 0,2 ml de Na-glutamate (0,3 M)
- 0,2 ml d’ATP (30 mM)
-0,1 ml de MgSO
4
(0,5 M)
- 0,5 ml d’extrait enzymatique
- Incuber 5 minutes à 25°C. Ajouter alors 0,1 ml de NH
2
OH (1 vol. de NH
2
OH-HCl N + 1 vol. de NaOH N).
- Incuber 15 minutes à 25°C puis arrêter la réaction avec 0,4 ml du réactif décrit au III-A.
- Réaliser un essai témoin en remplaçant l’extrait enzymatique par du tampon.
- Centrifuger les essais à 5000 rpm pendant 10 minutes et lire les D.O. à 540 nm.
- Exprimer les résultats en nmoles de γ-glutamyl hydroxamate formées par minute et par mg de protéine.

IV - Etude de la glutamate synthase
La détermination de l’activité enzymatique sera effectuée en suivant au spectrophotomètre la diminution de D.O.
à 340 nm correspondant à l’oxydation du NADH.

1 / Réalisation de la courbe étalon
A partir de la solution de NADH 1 mM, préparer les solutions : 25, 50, 100, 150 et 200 tM (Vf= 2,4 mL).
Lire directement les D.O. à 340 nm.

2 / Détermination de l’activité enzymatique
La préparation des mélanges réactionnels 1, 2 et 3 s’effectuera directement dans une cuve de spectrophotomètre
de la manière suivante :

1 2 3
Tampon HEPES-KOH 200mM, pH8,6 renfermant 10
mM de DTT
1,7 mL 1,3 mL 1,6 mL
2-oxoglutarate 10 mM 0,2 mL 0,2 mL 0 mL
NADH 1 mM 0 mL 0,4 mL 0,4 mL
17

Glutamine 100 mM 0,1 mL 0,1 mL 0 mL
Extrait enzymatique 0,4 mL 0,4 mL 0,4 mL

La réaction démarre par l’addition du NADH. Suivre la variation de D.O. à 340 nm toutes les 30 secondes
pendant 5 minutes, du mélange 2 par rapport au mélange 1.
Effectuer la même opération en remplaçant 2 par 3.
Exprimer les résultats en nmoles de NADH oxydé par min et par mg de protéine.
Conclusions.

V - Dosage des protéines par la méthode de Bradford
Cette méthode repose sur la propriété du bleu de Coomassie à se lier, en milieu acide, aux protéines et de former
ainsi un complexe qui absorbe à 595 nm.

1 / Préparation de la gamme étalon
+ Préparation des solutions de BSA
A partir d’une solution de protéine d’albumine sérique bovine (BSA) concentrée à 20 mg.mL
-1
, préparer une
solution fille à 2 mg/ mL
-1
(V= 1 mL).
Préparer ensuite à l’aide de cette solution fille 6 tubes contenant 200 µL de solution de BSA à 0 - 0,25 - 0,5 – 1 -
1,5 et 2 mg. mL
-1
.

+ Dosage au réactif de Bradford
Mélanger 10 µL de chacune de vos solutions de BSA dans le réactif de Bradford dilué 5X dans H
2
O (Vf= 1 mL).
Incuber 5 minutes à température ambiante et mesurer les D.O. à 595 nm en utilisant le tube 0 de la gamme
comme 0 d’absorbance.
Tracer le graphe des D.O. obtenues à 595 nm en fonction de la concentration en BSA (µg.mL
-1
).

2 / Dosage de l’extrait enzymatique
Réaliser un dosage au réactif de Bradford des protéines contenues dans votre extrait après l’avoir dilué 10, 20 et
50 fois. Le mode opératoire sera le même que celui utilisé pour la réalisation de la gamme étalon.
Chaque dilution fera l’objet de 2 mesures.
Déterminer graphiquement la concentration en protéine de votre extrait enzymatique.

18

Préparation des Solutions et matériels, cultures et installation des
Salles : (Version 2011)

TP 1 - préparation des solutions :

Achat à Carrefour de Pomme de Terre (20kg), Mâche (2 paquets) et 2 sacs d’oignons
blancs.
14-18/Mars/2011 -
Solution de Sorbitol : MW 182.2 anhydre
Faire 250 mL d’une solution à 15% w/v de Sorbitol (15g/L) puis, diluer.

Faire des solutions de sorbitol à 1, 5, 10 et 15 % w/v - 50mL de chaque
Faire des fractions aliquotes pour 7x4 eppendorf de 1,5 mL.

Solution de Sucrose :
Solution stock de sucrose à 2M - MW 342.30
Faire 2L : Pour 500 mL à 2M ¬ ¬¬ ¬ 342,30g de sucre
Sera dilué. en TP de 0.1 à 0.8 M

Tampon MES pH6.15 100mM (100mL)
Peser 1.952 g de MES dans 90mL d’eau
Ajouter qqs gouttes de NaOH 10N
Ajuster à 100 mL

Solution TL : (Préparation en TP)
10% Sorbitol
Tampon MES pH 6.15 0.05 M
Ajouter extemporanément (en cours de TP):
50 % de sorbitol 20%
50 % de MES 100 mM
0.1 g de Cellulase Sigma (C-8546)
0.2 g de Pectinase Fluka (17389)

Rouge Neutre et Safranin O :
Diluer à 0.1 % w/v en solution TL sans enzymes (10mg pour 10mL)
Aliquoter en 7x4 eppendorf de 1,5 mL.

Préparation d’une solution de Vert de méthyle (100mL)
en solution aqueuse, acidifiée à l'acide acétique :
Eau bidistillée : 100 ml
Vert de méthyle : 5 g
acide acétique glacial 1 cc
Laisser durant 1 heure sur l'agitateur magnétique, et ensuite filtrer !










19

TP 2 - Préparation des solutions :

7-11/Mars/2011 - Attention, lancer les cultures pour le matériel biologique en avance (4semaines) :
Vicia faba - 7 pots x12 binômes = 84 pots.
Medicago sativa – 2 pots vermiculite x 12 binômes

Solutions à 5 µM fusicoccine et 1 µM ABA. (Risque toxicité).
La préparation des solutions se fait dans EtOH 100% et le stockage à -20°C.

Préparation bouteille Agar à 4% dans de l’eau (4x 100mL).

Préparation des Solutions tampons : (2000 mL)
KCl 10 mM, KOH 30 mM, MES 10 mM, pH ajusté à 6,5 avec de l’acide iminodiacétique.

Préparation des solutions de coloration :
Dilution dans 1000 mL d’eau distillée des solutions de coloration.
1- Vert d'iode à 2/1000
2- Rouge Congo à 2/1000 (Risque toxicité) ¬ A changer pour Carmin ou
Phloroglucinol.
3- Acide Acétique à 1% à partir d'acide acétique Glacial
4- Solution d'eau de javel à 12°
Remplir les comptes gouttes avec les diverses solutions et de l'eau distillée (Faire les
étiquettes si nécessaire).

Installation de la salle pour le TP1:

14 postes avec :
1 vortex pour 2 binômes
1 microscope pour chaque binôme
1 cellule de Malassez pour chaque binôme +
lamelle
4 Lames de microscope +lamelles
1 portoir orange pour tube falcon de 50mL
6 tubes falcon vide + 1 tube de saccharose 2M
1 portoir eppendorf avec :
Þ 4 solutions de sorbitol en eppendorf :
1%, 5%, 10% et 15 %
Þ 2 tubes eppendorf de 1.5 mL vide + 1
tube de 2 mL
1 portoir de pipette avec :
Þ 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL
Þ 1 propipette
1 éprouvette graduée de 50 mL - 100 mL
1 couteau court
1 pince
1 scalpel
1 pissette d’eau 500 mL
1 compte goutte d’eau distillée

1 pipetteman de 200µL
1 pipetteman de 1000 µL
20

1 lot de cône bleu
1 lot de cône jaune
1 sopalin
1 Poubelle de Table

Installation de la salle pour le TP2:
Installer la table orbitale et le Vibratome
Installer les lampes LED/Fluocompacte pour l’éclairage

7 postes avec :
1 lame de calibration 100µm
1 microscope pour chaque binôme
1 vortex par binômes
4 Lames de microscope +lamelles
1 portoir orange pour tube falcon de 50mL (Solution pour Stomate)
1 portoir eppendorf avec :
Þ 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%, 5%, 10% et 15 %
Þ 2 tubes eppendorfs de 1.5 mL vide + 1 tube de 2 mL
1 portoir de pipette avec :
Þ 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL
Þ 1 propipette
1 pince
1 scalpel
1 pissette d’eau 500 mL
1 compte goutte de Javel, Acide acétique, Vert
d’iode et Rouge congo
1 pipetteman de 10-20µL
1 pipetteman de 200µL
1 pipetteman de 1000 µL
1 lot de cône bleu
1 lot de cône jaune
1 sopalin
1Poubelle de Table
2 Supports nylon pour les coupes
2 Plaques 8 puits
1 marqueur





21



Les microscopes LEICA doivent
être équipés d’objectif gradué.
Réticule Leica gradué :






Inventaire des solutions 01/2010 :
Quantité Produit Référence Marque
1kg D-Sorbitol S1876-1kg Sigma
500g Iminodiacetic acid 220000 Aldrich
25g Carmine C1022-25g Sigma
5g MES M3671-50g Sigma
10g Pectinase 17389 Fluka
50g Pectinase 17389 Fluka
5kU Pectinase solution P4716-5kU Sigma
2.5kU Cellulase 2* C8546-2.5kU Sigma
25g Phloroglucinol P3502-25g Sigma













22

Solutions et matériels à préparer pour le TP3
"Etude de la glutamine synthétase (GS) et de la
glutamate synthase (GOGAT) des racines de maïs" version
2010-2011


● Matériel végétal commun pour tous les étudiants

- 2 L Milieu de germination des grains de maïs

(NH
4
)
2
SO
4
(10 mM) 1.32 g/l
KNO
3
(10 mM) 1.01 g/l
A conserver à RT (à préparer et à conserver au laboratoire INRA)

- 5 jours avant le TP
Des grains de maïs sont mis à germer dans des containers en plastique (à l’INRA) sur
2 épaisseurs de sopalin imbibé de milieu de germination. La germination a lieu
pendant 4 à 5 jours à l’étuve à 22°C.


• Solutions communes pour tous les étudiants

- Réactif de Bradford

A conserver à 4°C
Solution mère commune à tous les binômes

- HCl 0.2N

A conserver à RT

- NaOH 1N

A conserver à RT

- EDTA 10 mM

A conserver à RT
Peser 1.86 g pour 500 ml

- DTT 10 mM

Préparer 500 ml - à conserver à RT
Peser 770 mg pour 500 ml

- Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT 10 mM

A conserver à 4°C – ajuster le pH avec KOH

• Solutions à préparer et à aliquoter pour chaque binôme

- Nbr binôme * Bouteille 100 ml H
2
O milliQ ou aliquoter tubes 50ml

A conserver à RT


- Tampon de broyage

Préparer 500 ml - à conserver à 4°C - aliquoter en tubes 50 ml
23


Produit PM C finale
(mM)
pH C finale
(g/L)
A peser (g)
pour 500mL
Tris –HCl 121.1 50 pH=7.4 6.06 3.025
EDTA 372.2 10 3.72 1.862
MgCl
2
6H
2
O 203.3 10 2.03 1.015
DTT 154.3 10 1.54 0.771

- Tampon Tris-HCl 25mM (3.03 g/L) pH=7.4

Préparer 1 l - à conserver à RT - ajuster le pH avec HCl - aliquoter en tubes 50 ml

- FeCl
3
6H 10% dans HCl 0.2N

Préparer 50 ml - A conserver à RT - Aliquoter en tubes 15 ml
Peser 5 g pour 50 ml de HCl 0.2N

- Acide trichloroacétique 25 %

Préparer 50 ml - A conserver à RT - Aliquoter en tubes de 15 ml
Peser 12.5 g pour 50 ml

- HCl 6N

Préparer 50 ml - A conserver à RT- Aliquoter en tubes de 15 ml
Diluer 2 fois la solution commerciale 12 N : 25 ml solution HCl commerciale 12 N + 25 ml
H
2
O

- Na-glutamate (0.3 M)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml
Peser 1.12 g pour 20 ml

- ATP (30 mM)
Préparer 10 ml - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml
Peser 180 mg pour 10 ml

- MgSO
4
(0.5 M)
Préparer 20 ml - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml
Peser 2.46 g pour 20 ml

- NH
2
OH (hydroxylamine)
Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml
Peser 695 mg pour 10 ml H
2
O + 10 ml NaOH 1N
(à prendre au labo symbiose)

- 2-oxoglutarate (10 mM) = α αα α-cétoglutarate

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml
Peser 33.6 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT

- Glutamine (100mM)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml
Peser 293 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT
(à prendre au labo symbiose)

- BSA (20 mg/ml)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 2 ml
Peser 200 mg pour 20 ml

• Solutions à préparer extemporanément = au début de la séance
24


- NADH (1 mM)

Préparer 10 ml - A préparer extemporanément - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes
de 1.5 ml
Peser 7.5 mg pour 10 ml

- γ γγ γ-glutamyl hydroxamate (5mM)

Préparer 10 ml - A préparer extemporanément - A conserver dans la glace pendant la
manip - Aliquoter en tubes de 2 ml
Peser 8.1 mg pour 10 ml de Tris HCl 25 mM pH= 7.4

Installation Salle TP 3 :

• Matériels commun

- 1 centrifugeuse sigma 2K15 + rotor 12139 (salle SN II-4)
- 1 (ou 2, si possible) balance + papier alu
- 1 bain marie à 25°C + portoir pour tubes corning (13*100mm)
- 1 centrifugeuse de paillasse pou eppendorf 2ml
- pour 2 binômes : 1 spectrophotomètre multipasseur blanc
- parafilm
- des gants S/M/L

• Matériels à installer sur la paillasse pour chaque binôme
Quantité*Nbre binômes

- 1 mortier et 1 pilon (placard à côté sorbonne SN 0-4) à conserver au froid avant le
début de la manip
- 1 entonnoir (SN 0-4)
- 1 étamine=gaze pour filtrer l’extrait enzymatique (entrée placard SN 0-4)
- 1 couteau ou scalpel
- 1 tube spécial centri (environ 30 ml avec bouchon vissé) pour la centri sigma et
pour le rotor 12139 (Tiroir salle de prep 524)
- portoir tubes corning
- 14 tubes corning (13*100mm) en verre
- 1 spatule
- 1 vortex (tiroir SN II-4)
- 1 chronomètre (tiroir SN II-4)
- Des cônes jaunes 200µl + 1 pipetman P200
- Des cônes bleus 1000µl + 1 pipetman P1000
- 1 portoir eppendorf 1.5ml
- 8 tubes eppendorf 2ml
- 1 portoir à falcon 50 ml + 1 portoir à falcon 15 ml
- 1 tube falcon 15ml
- 1 bac à glace
- 1 poubelle de paillasse
- 1 pipette en verre de 2ml + 1 pipette en verre de 5ml + 1 pipette en verre de 10
ml+ 1 poire + portoir (salle SN 0-4)
- 1 pissette H
2
O
- 7 cuves spectro 3ml + 4 cuves spectro 1.5ml
1


T
TTR
RRA
AAV
VVA
AAU
UUX
XX
P
PPR
RRA
AAT
TTI
IIQ
QQU
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EES
SS
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VV


L
LLS
SSV
VV2
22
2013
2

R RE EL LA AT TI IO ON NS S S ST TR RU UC CT TU UR RE ES S - - F FO ON NC CT TI IO ON NS S C CH HE EZ Z L LE ES S V VE EG GE ET TA AU UX X

OSMOSE ET PERMEATION (TP1)

A. INTRODUCTION
A première vue, les expériences groupées dans cette manipulation et le matériel biologique
employé peuvent paraître disparates. En fait, il ne sera question ici que de certains types
d'échanges cellulaires (osmose : eau ; perméation : ions) établis entre le vivant et son milieu.
Quant aux sujets d'analyse (tubercules, épidermes, protoplastes..), ils ont été choisis parce qu'ils
permettaient des expériences simples et de courte durée.

Le potentiel osmotique
Le potentiel osmotique, désignée par le symbole Ψs, est fonction de la température, de la
concentration de la substance dissoute, et de ses caractéristiques de dissociation.
Le potentiel hydrique
La notion de potentiel hydrique a été largement discutée au cours.

Pour éclaircir des problèmes de terminologie, nous donnerons le tableau suivant :

Milieu intérieur Milieu extérieur
∆Ψ = Ψ
int
- Ψ
ext

Iso-osmotique Isotonique équilibre ∆Ψ= 0
Hypo-osmotique Hypertonique plasmolyse ∆Ψ> 0
Hyper-osmotique Hypotonique turgescence ∆Ψ < 0


B. Evaluation des paramètres osmotiques

A) Détermination de la potentiel de succion tissulaire

Les tubercules de pommes de terre sont constitués essentiellement de parenchyme de
réserve. En mettant à profit la grande homogénéité de ce tissu, il est possible de réaliser un
certain nombre d'expériences, telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur, sur des
fragments de tubercule.

1. Préparation du matériel

- Prendre trois pommes de terre, les éplucher et les placer dans un récipient plein d'eau.
Découper les tubercules en parallélépipèdes de section carrée (env. 0,5 cm de côté).
- Après les avoir lavés, conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide.
- Ajuster alors les fragments de tissus à une longueur déterminée de 4cm, en supprimant
les bords inférieurs et supérieurs.
- Essuyer légèrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les
répartir en lots de 4.
- Déterminer rapidement, sur les balances, le poids frais (PF
0
) de chaque lot (auquel
on attribuera un numéro).

3

2. Mode opératoire
- Préparer dans 6 tubes falcons de 50 mL des solutions de saccharose aux
concentrations indiquées (ci-dessous), à partir d'une solution stock (2M).






- Incuber vos lots de fragments de pomme de terre dans chacun des tubes.
- Après 1 heure d’incubation, mesurer pour chacun des lots, le poids frais PF
f
ainsi que
la longueur moyenne L
f
de chaque lot (légèrement essuyer les segments sur un papier
sopalin).
On calculera alors :

Pression osmotique d’une solution idéale (formule de Van t’Hoff) :
Π =RT/V.log a
w
≈ i x C
B
x R x T x 1000 en Pa (1 bar = 101325 Pa)
3. Résultats
Reporter sur un graphique, les courbes correspondant au ∆ ∆∆ ∆L et au ∆ ∆∆ ∆PF, en fonction
de la concentration molaire (M) du saccharose.

Pour chacune des courbes, déterminer la valeur de la concentration de saccharose
correspondant à l'intersection avec l'abscisse.

Calculer les valeurs théoriques idéale de Π pour les différentes solutions suivant la
formulation de Van t’Hoff.

Calculer à partir de cette valeur, le potentiel hydrique des tissus (Ψ
W
= Ψ
S
= -Π

car
Ψ
P
= 0 au point d’intersection sur l’axe des abscisses).

Exprimer alors Ψ
W
en MPa et en Bar.


Rappels :

0 °C = 273,15 K ; R = 8,31 J/mol.K ; i = 1 pour le saccharose, 2 pour le NaCl ; C
B
= Concentration Molaire
de la solution.



bécher Ψ
s
(bars)
expérimentale
Concentration
finale (M)
Calcul Ψ
s
(bars)
Solution idéale
1
0 0,00

2
-1,3 0,05

3
-2,6 0,10

4
-5,2 0,20

5
-11 0,40

6
0,60

7
-25,2 0,80

8
1,00

4

B) Quelques propriétés des protoplastes foliaires
Le protoplaste est une cellule dont on a fait disparaître (mécaniquement ou enzymatiquement)
la paroi. En l'absence des potentiels hydrostatiques (pressions) normalement exercées par la
paroi sur le contenu cellulaire, il n'est stable que dans des conditions isotoniques (ou
légèrement hypertoniques) et prend alors une forme sphérique. Les protoplastes permettent
d'étudier un certain nombre de caractéristiques du plasmalemme (perméabilité, charges, ...).
Nous nous bornerons ici à observer la pénétration de deux types de colorants, pour
lesquels le plasmalemme présente une perméabilité sélective.
1. Isolement des protoplastes


1.1. Incubation enzymatique

- Peler délicatement, à l'aide d'une brucelle à pointes fines, l'épiderme inférieur de 3-5
feuilles de mâche (Valerianella olitoria), et découper le mésophylle en carrés de 1mm²
environ. Travailler sur un papier filtre humide, pour éviter le dessèchement.
- Pipeter dans une boîte de Pétri 2 ml d'une solution enzymatique déjà prête, contenant
des cellulases, des pectinases et du sorbitol. Expliquer le rôle de ces divers composés.
- Déposer les fragments de feuilles (face pelée vers le bas) à la surface de la solution
d'incubation.
- Envelopper la boîte de Pétri d'une feuille d'aluminium et incuber à 20-30°C durant 30
minutes sur un agitateur orbital (50-100 tpm) - (Attention à ne pas renverser la boîte).

1.2. Purification

- Filtrer la suspension de protoplastes à travers un filtre nylon (100 µm), pour
éliminer les restes de feuilles non digérées. Rincer le matériel après usage.

- Centrifuger 1,5 mL de la suspension de protoplastes (tubes eppendorf de 1.5 mL, 500
tpm, 5 min).

5

- Eliminer le surnageant et laisser 100-150 µL de solution. Le culot de protoplastes
sera suspendu en tapotant sur le tube. Ne surtout pas vortexer.
- Conserver cette suspension de protoplastes dans son tube eppendorf et agiter
doucement avant usage.
2. Observation et comptage des protoplastes

Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de
comptage de volume connu. C’est une lame épaisse en verre, comportant des rigoles et un
quadrillage :
















Le volume de comptage est déterminé par :
-la surface du quadrillage gravé sur la lame.
-la profondeur de la chambre.

Parmi les 100 rectangles totaux, on trouve 25 rectangles qui sont divisés en 20 petits carrés afin de faciliter
le comptage.
→ Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm
3
= 1 µL

→ Chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm
3
= 10 nL

Pour la Numération

• Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage, et vérifier l’homogénéité de la répartition des
cellules à compter (si la répartition est mauvaise, recommencer). Régler le contraste et la lumière pour observer
la grille et les protoplastes.

• Observer ensuite à l’objectif x40 ou à x60 pour réaliser le comptage (Voir instructions).

• Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du quadrillage.

Lamelle planée Lame porte - objet
Profondeur de la
chambre
Rigoles
Quadrillage
Plateaux
surélevés
Plate-forme centrale
6

Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles qui chevauchent 2
arêtes du rectangle sur 4 (en pratique, on choisit de prendre en compte les cellules chevauchant la ligne
horizontale supérieure, et la ligne verticale droite).






- Prélever une goutte de suspension de protoplastes (env. 20µL) et la déposer sur la
gouttière centrale de la cellule de comptage (Malassez, voir explication). Estimer le
nombre de protoplastes isolés et leur concentration (protoplastes/mL).

- Observer alors, à un grossissement final de 400x-600x, les détails morphologiques
des protoplastes. Dessiner une cellule de protoplaste et déterminez la position des
chloroplastes, des vacuoles etc...

3. Perméabilité sélective

- Pipeter délicatement 20 µL de la suspension de protoplastes.

- Ajouter sur les lames 1 et 2, respectivement, 20µL, des colorants suivants :
I : Rouge neutre 0.1 % v/v en solution TL.
II : Phénosafranine 0.1 % v/v en solution TL.

- Recouvrir d’une lamelle et après 2 min, observez au microscope. NE PAS LAISSER
SECHER !
Pour les deux essais, déterminer, le nombre de protoplasmes colorés (A
compter sur 20 protoplastes sans a priori).
Commenter les résultats.

- Ajouter alors sur les bords d’une lamelle, 20µL d'eau ou de sorbitol à 15%
(Réalisez deux expériences).
Observer en temps réel les phénomènes physiques sur les protoplastes.


C) Observations microscopiques

Les lambeaux épidermiques, constitués d'une assise cellulaire unique, permettent une
observation microscopique aisée des cellules qui les composent. Les vacuoles de ces tissus
occupent la presque totalité de l'espace cellulaire. Il est ainsi possible, en plongeant ces lambeaux
dans des solutions de potentiel osmotique variable, d'étudier les échanges d'eau entre les cellules
et le milieu extérieur, et, d'obtenir, sur la base d'observations microscopiques, des informations
sur le potentiel hydrique cellulaire.
Numération sur le rectangle
= 7 protoplastes
7


1. Mode opératoire

- Inciser délicatement, à l'aide d'un scalpel, un carré de 3 mm de côté environ, dans
l'épiderme intérieur d'une écaille d'un bulbe d'oignon.
- Détacher avec une paire de brucelles à pointes fines, le fragment épidermique ainsi
délimité en le saisissant par un des coins.
- Placer le lambeau (face déchirée vers le bas) entre lame et lamelle dans 1 mL d’une
solution de sorbitol (6 tubes). Ajouter 20µL de Vert de Méthyle et 20µL de Rouge
Neutre dans chaque tube eppendorf.
- Après 5 min., observez entre lame et lamelle au microscope.
- Dessinez les points extrêmes de turgescence et de plasmolyse, puis cherchez les points
encadrant l’isotonie.
Choisir au microscope une zone facilement observable.
Observez la cellule et ses différents compartiments puis évaluez le potentiel
hydrique cellulaire.
2. Evaluation du potentiel hydrique cellulaire
A l'isotonie, le potentiel hydrique de la cellule est égal au potentiel osmotique du
milieu extérieur.
On utilisera des solutions de sorbitol (substance qui ne pénètre pas ou peu dans les
cellules) à différentes concentrations (0 ; 2; 6; 8 ; 10 et 15 %).
En travaillant chaque fois avec un lambeau frais, noter la concentration C, pour
laquelle il y a une légère plasmolyse.

Déterminer la concentration molaire de sorbitol qui se rapproche le plus de
l'isotonie et déduire le potentiel hydrique cellulaire.














8

Annexes :

















9

Etude de la structure racinaire, caulinaire et du processus
d’ouverture stomatique (TP2)

Exécution et montage des coupes anatomiques
1. Exécution
Les échantillons de plante sont au préalable coupé et inclus dans de l’agar à 4 %. L'agar
sert pour les coupes au vibratome (Labonord 100 plus), mais pas vraiment pour protéger un
tissu pendant l'inclusion.

Gardez une dizaine de coupe de chaque échantillon de tige ou de racine, puis procédez aux
colorations de ces coupes.

2. Coloration
Respecter les indications de temps de traitement et de rinçage suivants :
Prendre une plaque multi-puits et ajoutez un volume de 5mL de chaque solution de
coloration ou d’eau distillée. Procédez aux colorations des coupes des échantillons
végétaux. Les transferts d’un milieu vers un autre se font à l’aide d’un tamis après chaque
temps de traitement.

1) eau de javel: 15 min 5) Coloration au rouge Congo: 10 min
2) rinçage abondant à l’eau 6) Rinçage sommaire
3) lavage rapide à l’acide acétique :
1-2 min 7) Coloration au Vert d'iode: 5 min
4) rinçage sommaire à l’eau 8) Rinçage soigneux et montage sur lame.

Résultat
Les tissus cellulosiques apparaissent en rouge; les tissus lignifiés et subérifiés
apparaissent en vert – (¨ ¨¨ ¨ Attention les colorations présentées en cours peuvent être
différentes).
3. Montage
Il est indispensable que lames et lamelles soient propres et sèches et que, par ailleurs, les
surfaces optiques du microscope, en particulier l'oculaire, soient essuyées avec un papier
Kim Wipes (risque de rayures).

Ne monter que 2 à 3 coupes sur une lame en choisissant de préférence les fragments de
coupes les moins colorés ; ce sont en principe les plus minces.

Placer suffisamment de liquide de montage sur la lame pour que toute la coupe soit immergée.
Placer doucement la lamelle sur la préparation en vous aidant d'une aiguille montée. Ne pas
appuyer sur la lamelle pour chasser d'éventuelles bulles d'air : la préparation serait
irrémédiablement inutilisable.

10


Si besoin, ajouter de l'eau en présentant à l’aide des comptes gouttes au bord de la lamelle,
sans la soulever (l'eau pénètre par capillarité), ou au contraire, éliminer les excès d'eau avec
un mouchoir de papier.
II. CONSEILS POUR LE DESSIN
1. Généralités
C Dessiner grand (2/3 d’une page), l'échelle du dessin étant choisie en fonction des
plus petits détails à reproduire (Endoderme ou pôles vasculaires, par exemple).

C Respecter les proportions relatives des différentes parties.

C Faire des traits fins, nets, réguliers, continus (crayon HB).

C Légendes: placées assez loin, brèves mais précises et complètes, écrites lisiblement
et horizontalement; traits de rappel à la règle, se terminant dans le dessin par un point
ou une flèche et ne se croisant pas.

C Le titre comprend le nom complet de la plante (genre, espèce et autres indications
taxonomiques en Latin), de l'organe ou du détail représenté, le sens de la coupe, le
grossissement, etc....
2. Dessin général
C Représenter le contour exact d'un quart de coupe (pas de compas: une coupe n’est
jamais parfaitement ronde) et les limites exactes des différents tissus en veillant
particulièrement aux proportions relatives. Utiliser un tiré pour montrer l'arrêt
"arbitraire" de la coupe.

C Les particularités de votre échantillon doivent être représentées : nombre exact de
faisceaux conducteurs, contours irréguliers d'une lacune, d'un cambium, position
précise d'un canal ou d'une fibre isolée, etc.
Ne pas représenter de cellules, sauf les très gros vaisseaux de métaxylème,
caractéristiques des Monocotylées (voir planche I).

C Utiliser les représentations conventionnelles des différents tissus (voir page
suivante).


A RENDRE pour le TP2, partie n°1 :

1- Pour le compte rendu, rendre une feuille A4 présentant les deux dessins
schématiques d’une structure racinaire et d’une structure caulinaire.

2- Présenter le principe expérimental et rendre un tableau synthétique présentant
les analogies et les différences entre ces deux tissus pour enfin conclure sur
la relation entre la structure et la fonction d’un organe végétal.
11

S SY YM MB BO OL LE ES S U UT TI IL LI IS SE ES S P PO OU UR R U UN N S SC CH HE EM MA A A AN NA AT TO OM MI IQ QU UE E ( (T TP P 2 2) )








Épiderme cutinisé
Suber (quadrillage à 90°
- ici 3 couches)
Exoderme, péricycle,
hypoderme, périderme,
phelloderme
(ici une assise)
Endoderme en 'U'
(Dessin non
schématique)
(Monocotylées)
Endoderme à cadre de
Caspary (Dessin non
schématique)
(Eudicotylédones)
Cambium et phellogène
(assise génératrice)
Collenchyme
Rhizoderme
(Représentation non
schématique des poils
absorbants)
Phloème (points non alignés)
Métaxylème avec gros vaisseaux des
Monocotylées (dessiner la forme exacte
des vaisseaux)
Liber (points alignés en lignes
concentriques vers le centre de
la coupe = rayons)
Xylème primaire ou
protoxylème (A noircir)
Bois homoxylé (Gymnospermes - lignes
concentriques vers le centre de la
coupe = rayons)
Bois hétéroxylé (Eudicotylédones -
lignes concentriques vers le centre de
la coupe = rayons)
Parenchymes (préciser le type)
Sclérenchyme (quadrillage fin
à 45°)
Parenchymes
sclérifiés
(quadrillage lâche à 45°)

12

E ET TU UD DE E D DE ES S P PR RO OC CE ES SS SU US S R RE EG GU UL LA AN NT T L L’ ’O OU UV VE ER RT TU UR RE E
S ST TO OM MA AT TI IQ QU UE E ( (T TP P2 2 S SU UI IT TE E) )
Epidermes isolés
Les études sur épidermes isolés sont réalisées sur des feuilles de plants âgés de trois à quatre
semaines (Arabidopsis thaliana, Commelina communis, Valerianella olitoria, Vicia faba). Les
jeunes feuilles sont prélevées avant l’éclairement du phytotron (les stomates sont fermés).

A l’aide d’une pince, on pelle la face inférieure de la feuille de façon à détacher la couche
épidermique. Chaque couche épidermique est collée, face inférieure sur une lamelle de verre
avec de l’adhésif silicone de type Hollister N°7730 (Medical adhesive) connu pour ne pas
endommager les cellules. Danger très important de fixation tissulaire (peau-organe).

Les lamelles sont ensuite déposées dans des petites boîtes de Pétri contenant 3 ml de milieu
tampon : KCl 10 mM, KOH 30 mM, MES 10 mM, pH ajusté à 6,5 avec de l’acide
iminodiacétique.
Puis les boîtes sont placées à l’obscurité (sous papier aluminium) à température ambiante
pendant quinze minutes, avant l’ajout de molécules pharmacologiques à tester, afin de
normaliser les valeurs d’ouverture stomatique entre les différentes expériences.
Ouverture stomatique

Les lamelles portant les épidermes végétaux seront soumises à quatre types de traitement :
C Traitement lumineux d’une heure sous lampe à lumière froide.
C Traitement obscurité d’une heure supplémentaire (Absence de lumière).
C Traitement lumineux en présence d’acide abscissique à 1µM de concentration finale.
C Traitement obscurité en présence de fusiccocine à 5 µM de concentration finale.
Après 1h de traitement, les épidermes montés sur une lame et sont observés au microscope.


13

Observation

Observer d'abord au faible grossissement du microscope pour centrer la coupe, puis utiliser le
grossissement moyen pour reconnaître les différents tissus et les zones où la
coupe est la meilleure.

Passer au fort grossissement (10x 60) puis régler l'intensité lumineuse en
agissant sur le rhéostat de l'éclairage, le condenseur de lumière et le diaphragme.
Excès ou défaut de lumière sont également nuisibles à une bonne observation.

Utiliser l’oculaire équipé d’une graduation et comparer vos observations avec la lame de calibration
gravée au centième de mm.
Mettre le microscope en position de calibration de facon à faire correspondre vos occulaires avec la
lame de calibration.

Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire et Y pour la lame de
calibration). Calculer la distance entre chaques lignes au niveau de
l’occulaire avec l’équation suivante :

Mesure entre 2 lignes = Y/X x 10 µm

Maintenant, vous êtes capables de mesurer la taille des cellules végétales
en µm grâce à votre calibration. Vous pouvez effectuer un comptage exhaustif des stomates ouvert ou
fermés suivant les conditions expérimentales.

La largeur de l’ostiole, représentative de l’ouverture stomatique, exprimée en micromètre sera
mesurée sous microscope photonique (grossissement 10x60).

Pour chaque traitement, l’ouverture moyenne de 20 stomates sera calculée ainsi que l’écart à
la moyenne ( = Ecart type/racine (n-1)) – Fournir le tableau de valeur avec le compte rendu.



A RENDRE pour le TP2 partie n°2 :

3- Pour le compte rendu, présenter après une courte introduction, les objectifs du
TP, l’Interprétation des observations chez Vicia faba et Commelina communis,
puis finir par une conclusion.

4- Rendre un tableau synthétique présentant les valeurs d’ouvertures des
ostioles pour chaque condition expérimentale et donner les évaluations
statistiques.

14

------------------------------------------------------------------------
Exemple de calcul de l'écart-type :
Voici quatre séries de 5 valeurs:
• Condition A : 10 ; 12 ; 14 ; 16 ; 8
• Condition B : 12 ; 12 ; 12 ; 12 ; 12
• Condition C : 12 ; 13 ; 12 ; 11; 12
• Condition D : 7 ; 17 ; 10 ; 13 ; 13

Calculer la moyenne de ces quatre conditions. Que constatez-vous ?

Quel est la variabilité des valeurs dans chacune de ces conditions ?
Pour les distinguer, on calcule un paramètre appelé écart type (σ)

Exemple de calcul :
σ
A
=


TP3 : ETUDE DE LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET DE
LA GLUTAMATE SYNTHASE DES RACINES DE MAIS

I - Principe
L’ammoniac (NH
3
) qui résulte de la réduction des nitrates ou de celle de l’azote atmosphérique est
immédiatement incorporé sous forme d’aminoacides ou d’amides. L’une de ces dernières, la glutamine, amide de
l’acide glutamique, est le précurseur ou le donneur du groupe aminé de nombreux produits du métabolisme
(tryptophane, histidine, CTP, AMP, ...). La glutamine est formé à partir de l’acide glutamique par action de la
glutamine synthétase:

NH
4
+ acide glutamique + ATP glutamine + ADP + Pi

+ La glutamine synthétase est une enzyme de structure complexe, isolée chez les procaryotes et les
eucaryotes, dont le poids moléculaire varie selon les espèces de 500 à 600 KkDa. Elle peut également
catalyser la formation de γ - glutamyl hydroxamate:

Ac. glutamique + ATP + NH
2
OH γ - glutamyl hydroxamate + ADP + Pi
Mg
2+

Mg
2+

15


C’est la présence de ce composé qui sera recherchée dans des mélanges réactionnels comprenant la glutamine
synthétase extraite de racines de maïs.

+ La glutamate synthase (glutamine : 2-oxoglutarate aminotransférase = GOGAT) catalyse la seconde étape
de l’assimilation de l’azote ammoniacal ; elle permet le transfert d’un groupement NH
2
de la fonction
amide de la glutamine vers l’acide 2-oxoglutarique pour former deux molécules de glutamate.

Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H
+
2 glutamate + NAD
+

Nous nous intéresserons donc au cours de ce TP à la glutamate synthase NADH-dépendante.


II - Préparation de l’extrait enzymatique
Les grains de maïs sont mis à germer pendant 72 h à 26°C en présence de (NH
4
)
2
SO
4
10 mM) et de KNO
3
(10
mM). Les racines (10 g) sont broyées dans un mortier en présence de 15 mL de tampon Tris-HC1 (50 mM) pH
7,4 contenant de 1’EDTA (10 mM), du MgC1
2
(10 mM) et du DTT (10 mM). Après filtration sur étamine, la
suspension obtenue est centrifugée à 14000 rpm pendant 30 minutes. Après élimination du culot, le surnageant
obtenu servira à déterminer l’activité enzymatique étudiée.

III - Activité de la glutamine synthétase

1 / Réalisation de la courbe étalon
La courbe étalon sera effectuée à l’aide de différentes concentrations de γ -glutamyl hydroxamate, les
hydroxamates forment en effet des complexes fortement colorés avec les ions ferriques.
- Introduire dans 7 tubes à essais:
0 - 0,1 - 0,15 - 0,2 - 0,25 - 0,3 et 0,4 mL d’une solution de γ -glutamyl hydroxamate 5 mM.
- Compléter à 1,6 ml avec du tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4. Rajouter dans chaque tube 0,4 mL du réactif
composé de :
- FeC1 6H à 10% dans HC1 0,2 N (1 vol.)
- Acide trichloracétique à 25% (1 vol.) (en préparer 12 ml)
-HCl 6N (l vol.)

Lire les densités optiques à 540 nm après 10 minutes.
16


2 / Détermination de l’activité enzymatique
Dans un tube à hémolyse, mélanger:
- 0,5 ml de tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4
- 0,2 ml de Na-glutamate (0,3 M)
- 0,2 ml d’ATP (30 mM)
-0,1 ml de MgSO
4
(0,5 M)
- 0,5 ml d’extrait enzymatique
- Incuber 5 minutes à 25°C. Ajouter alors 0,1 ml de NH
2
OH (1 vol. de NH
2
OH-HCl N + 1 vol. de NaOH N).
- Incuber 15 minutes à 25°C puis arrêter la réaction avec 0,4 ml du réactif décrit au III-A.
- Réaliser un essai témoin en remplaçant l’extrait enzymatique par du tampon.
- Centrifuger les essais à 5000 rpm pendant 10 minutes et lire les D.O. à 540 nm.
- Exprimer les résultats en nmoles de γ-glutamyl hydroxamate formées par minute et par mg de protéine.

IV - Etude de la glutamate synthase
La détermination de l’activité enzymatique sera effectuée en suivant au spectrophotomètre la diminution de D.O.
à 340 nm correspondant à l’oxydation du NADH.

1 / Réalisation de la courbe étalon
A partir de la solution de NADH 1 mM, préparer les solutions : 25, 50, 100, 150 et 200 tM (Vf= 2,4 mL).
Lire directement les D.O. à 340 nm.

2 / Détermination de l’activité enzymatique
La préparation des mélanges réactionnels 1, 2 et 3 s’effectuera directement dans une cuve de spectrophotomètre
de la manière suivante :

1 2 3
Tampon HEPES-KOH 200mM, pH8,6 renfermant 10
mM de DTT
1,7 mL 1,3 mL 1,6 mL
2-oxoglutarate 10 mM 0,2 mL 0,2 mL 0 mL
NADH 1 mM 0 mL 0,4 mL 0,4 mL
17

Glutamine 100 mM 0,1 mL 0,1 mL 0 mL
Extrait enzymatique 0,4 mL 0,4 mL 0,4 mL

La réaction démarre par l’addition du NADH. Suivre la variation de D.O. à 340 nm toutes les 30 secondes
pendant 5 minutes, du mélange 2 par rapport au mélange 1.
Effectuer la même opération en remplaçant 2 par 3.
Exprimer les résultats en nmoles de NADH oxydé par min et par mg de protéine.
Conclusions.

V - Dosage des protéines par la méthode de Bradford
Cette méthode repose sur la propriété du bleu de Coomassie à se lier, en milieu acide, aux protéines et de former
ainsi un complexe qui absorbe à 595 nm.

1 / Préparation de la gamme étalon
+ Préparation des solutions de BSA
A partir d’une solution de protéine d’albumine sérique bovine (BSA) concentrée à 20 mg.mL
-1
, préparer une
solution fille à 2 mg/ mL
-1
(V= 1 mL).
Préparer ensuite à l’aide de cette solution fille 6 tubes contenant 200 µL de solution de BSA à 0 - 0,25 - 0,5 – 1 -
1,5 et 2 mg. mL
-1
.

+ Dosage au réactif de Bradford
Mélanger 10 µL de chacune de vos solutions de BSA dans le réactif de Bradford dilué 5X dans H
2
O (Vf= 1 mL).
Incuber 5 minutes à température ambiante et mesurer les D.O. à 595 nm en utilisant le tube 0 de la gamme
comme 0 d’absorbance.
Tracer le graphe des D.O. obtenues à 595 nm en fonction de la concentration en BSA (µg.mL
-1
).

2 / Dosage de l’extrait enzymatique
Réaliser un dosage au réactif de Bradford des protéines contenues dans votre extrait après l’avoir dilué 10, 20 et
50 fois. Le mode opératoire sera le même que celui utilisé pour la réalisation de la gamme étalon.
Chaque dilution fera l’objet de 2 mesures.
Déterminer graphiquement la concentration en protéine de votre extrait enzymatique.

18

Préparation des Solutions et matériels, cultures et installation des
Salles : (Version 2011)

TP 1 - préparation des solutions :

Achat à Carrefour de Pomme de Terre (20kg), Mâche (2 paquets) et 2 sacs d’oignons
blancs.
14-18/Mars/2011 -
Solution de Sorbitol : MW 182.2 anhydre
Faire 250 mL d’une solution à 15% w/v de Sorbitol (15g/L) puis, diluer.

Faire des solutions de sorbitol à 1, 5, 10 et 15 % w/v - 50mL de chaque
Faire des fractions aliquotes pour 7x4 eppendorf de 1,5 mL.

Solution de Sucrose :
Solution stock de sucrose à 2M - MW 342.30
Faire 2L : Pour 500 mL à 2M ¬ ¬¬ ¬ 342,30g de sucre
Sera dilué. en TP de 0.1 à 0.8 M

Tampon MES pH6.15 100mM (100mL)
Peser 1.952 g de MES dans 90mL d’eau
Ajouter qqs gouttes de NaOH 10N
Ajuster à 100 mL

Solution TL : (Préparation en TP)
10% Sorbitol
Tampon MES pH 6.15 0.05 M
Ajouter extemporanément (en cours de TP):
50 % de sorbitol 20%
50 % de MES 100 mM
0.1 g de Cellulase Sigma (C-8546)
0.2 g de Pectinase Fluka (17389)

Rouge Neutre et Safranin O :
Diluer à 0.1 % w/v en solution TL sans enzymes (10mg pour 10mL)
Aliquoter en 7x4 eppendorf de 1,5 mL.

Préparation d’une solution de Vert de méthyle (100mL)
en solution aqueuse, acidifiée à l'acide acétique :
Eau bidistillée : 100 ml
Vert de méthyle : 5 g
acide acétique glacial 1 cc
Laisser durant 1 heure sur l'agitateur magnétique, et ensuite filtrer !










19

TP 2 - Préparation des solutions :

7-11/Mars/2011 - Attention, lancer les cultures pour le matériel biologique en avance (4semaines) :
Vicia faba - 7 pots x12 binômes = 84 pots.
Medicago sativa – 2 pots vermiculite x 12 binômes

Solutions à 5 µM fusicoccine et 1 µM ABA. (Risque toxicité).
La préparation des solutions se fait dans EtOH 100% et le stockage à -20°C.

Préparation bouteille Agar à 4% dans de l’eau (4x 100mL).

Préparation des Solutions tampons : (2000 mL)
KCl 10 mM, KOH 30 mM, MES 10 mM, pH ajusté à 6,5 avec de l’acide iminodiacétique.

Préparation des solutions de coloration :
Dilution dans 1000 mL d’eau distillée des solutions de coloration.
1- Vert d'iode à 2/1000
2- Rouge Congo à 2/1000 (Risque toxicité) ¬ A changer pour Carmin ou
Phloroglucinol.
3- Acide Acétique à 1% à partir d'acide acétique Glacial
4- Solution d'eau de javel à 12°
Remplir les comptes gouttes avec les diverses solutions et de l'eau distillée (Faire les
étiquettes si nécessaire).

Installation de la salle pour le TP1:

14 postes avec :
1 vortex pour 2 binômes
1 microscope pour chaque binôme
1 cellule de Malassez pour chaque binôme +
lamelle
4 Lames de microscope +lamelles
1 portoir orange pour tube falcon de 50mL
6 tubes falcon vide + 1 tube de saccharose 2M
1 portoir eppendorf avec :
Þ 4 solutions de sorbitol en eppendorf :
1%, 5%, 10% et 15 %
Þ 2 tubes eppendorf de 1.5 mL vide + 1
tube de 2 mL
1 portoir de pipette avec :
Þ 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL
Þ 1 propipette
1 éprouvette graduée de 50 mL - 100 mL
1 couteau court
1 pince
1 scalpel
1 pissette d’eau 500 mL
1 compte goutte d’eau distillée

1 pipetteman de 200µL
1 pipetteman de 1000 µL
20

1 lot de cône bleu
1 lot de cône jaune
1 sopalin
1 Poubelle de Table

Installation de la salle pour le TP2:
Installer la table orbitale et le Vibratome
Installer les lampes LED/Fluocompacte pour l’éclairage

7 postes avec :
1 lame de calibration 100µm
1 microscope pour chaque binôme
1 vortex par binômes
4 Lames de microscope +lamelles
1 portoir orange pour tube falcon de 50mL (Solution pour Stomate)
1 portoir eppendorf avec :
Þ 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%, 5%, 10% et 15 %
Þ 2 tubes eppendorfs de 1.5 mL vide + 1 tube de 2 mL
1 portoir de pipette avec :
Þ 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL
Þ 1 propipette
1 pince
1 scalpel
1 pissette d’eau 500 mL
1 compte goutte de Javel, Acide acétique, Vert
d’iode et Rouge congo
1 pipetteman de 10-20µL
1 pipetteman de 200µL
1 pipetteman de 1000 µL
1 lot de cône bleu
1 lot de cône jaune
1 sopalin
1Poubelle de Table
2 Supports nylon pour les coupes
2 Plaques 8 puits
1 marqueur





21



Les microscopes LEICA doivent
être équipés d’objectif gradué.
Réticule Leica gradué :






Inventaire des solutions 01/2010 :
Quantité Produit Référence Marque
1kg D-Sorbitol S1876-1kg Sigma
500g Iminodiacetic acid 220000 Aldrich
25g Carmine C1022-25g Sigma
5g MES M3671-50g Sigma
10g Pectinase 17389 Fluka
50g Pectinase 17389 Fluka
5kU Pectinase solution P4716-5kU Sigma
2.5kU Cellulase 2* C8546-2.5kU Sigma
25g Phloroglucinol P3502-25g Sigma













22

Solutions et matériels à préparer pour le TP3
"Etude de la glutamine synthétase (GS) et de la
glutamate synthase (GOGAT) des racines de maïs" version
2010-2011


● Matériel végétal commun pour tous les étudiants

- 2 L Milieu de germination des grains de maïs

(NH
4
)
2
SO
4
(10 mM) 1.32 g/l
KNO
3
(10 mM) 1.01 g/l
A conserver à RT (à préparer et à conserver au laboratoire INRA)

- 5 jours avant le TP
Des grains de maïs sont mis à germer dans des containers en plastique (à l’INRA) sur
2 épaisseurs de sopalin imbibé de milieu de germination. La germination a lieu
pendant 4 à 5 jours à l’étuve à 22°C.


• Solutions communes pour tous les étudiants

- Réactif de Bradford

A conserver à 4°C
Solution mère commune à tous les binômes

- HCl 0.2N

A conserver à RT

- NaOH 1N

A conserver à RT

- EDTA 10 mM

A conserver à RT
Peser 1.86 g pour 500 ml

- DTT 10 mM

Préparer 500 ml - à conserver à RT
Peser 770 mg pour 500 ml

- Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT 10 mM

A conserver à 4°C – ajuster le pH avec KOH

• Solutions à préparer et à aliquoter pour chaque binôme

- Nbr binôme * Bouteille 100 ml H
2
O milliQ ou aliquoter tubes 50ml

A conserver à RT


- Tampon de broyage

Préparer 500 ml - à conserver à 4°C - aliquoter en tubes 50 ml
23


Produit PM C finale
(mM)
pH C finale
(g/L)
A peser (g)
pour 500mL
Tris –HCl 121.1 50 pH=7.4 6.06 3.025
EDTA 372.2 10 3.72 1.862
MgCl
2
6H
2
O 203.3 10 2.03 1.015
DTT 154.3 10 1.54 0.771

- Tampon Tris-HCl 25mM (3.03 g/L) pH=7.4

Préparer 1 l - à conserver à RT - ajuster le pH avec HCl - aliquoter en tubes 50 ml

- FeCl
3
6H 10% dans HCl 0.2N

Préparer 50 ml - A conserver à RT - Aliquoter en tubes 15 ml
Peser 5 g pour 50 ml de HCl 0.2N

- Acide trichloroacétique 25 %

Préparer 50 ml - A conserver à RT - Aliquoter en tubes de 15 ml
Peser 12.5 g pour 50 ml

- HCl 6N

Préparer 50 ml - A conserver à RT- Aliquoter en tubes de 15 ml
Diluer 2 fois la solution commerciale 12 N : 25 ml solution HCl commerciale 12 N + 25 ml
H
2
O

- Na-glutamate (0.3 M)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml
Peser 1.12 g pour 20 ml

- ATP (30 mM)
Préparer 10 ml - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml
Peser 180 mg pour 10 ml

- MgSO
4
(0.5 M)
Préparer 20 ml - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml
Peser 2.46 g pour 20 ml

- NH
2
OH (hydroxylamine)
Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml
Peser 695 mg pour 10 ml H
2
O + 10 ml NaOH 1N
(à prendre au labo symbiose)

- 2-oxoglutarate (10 mM) = α αα α-cétoglutarate

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml
Peser 33.6 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT

- Glutamine (100mM)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml
Peser 293 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT
(à prendre au labo symbiose)

- BSA (20 mg/ml)

Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 2 ml
Peser 200 mg pour 20 ml

• Solutions à préparer extemporanément = au début de la séance
24


- NADH (1 mM)

Préparer 10 ml - A préparer extemporanément - A conserver à -20°C - Aliquoter en tubes
de 1.5 ml
Peser 7.5 mg pour 10 ml

- γ γγ γ-glutamyl hydroxamate (5mM)

Préparer 10 ml - A préparer extemporanément - A conserver dans la glace pendant la
manip - Aliquoter en tubes de 2 ml
Peser 8.1 mg pour 10 ml de Tris HCl 25 mM pH= 7.4

Installation Salle TP 3 :

• Matériels commun

- 1 centrifugeuse sigma 2K15 + rotor 12139 (salle SN II-4)
- 1 (ou 2, si possible) balance + papier alu
- 1 bain marie à 25°C + portoir pour tubes corning (13*100mm)
- 1 centrifugeuse de paillasse pou eppendorf 2ml
- pour 2 binômes : 1 spectrophotomètre multipasseur blanc
- parafilm
- des gants S/M/L

• Matériels à installer sur la paillasse pour chaque binôme
Quantité*Nbre binômes

- 1 mortier et 1 pilon (placard à côté sorbonne SN 0-4) à conserver au froid avant le
début de la manip
- 1 entonnoir (SN 0-4)
- 1 étamine=gaze pour filtrer l’extrait enzymatique (entrée placard SN 0-4)
- 1 couteau ou scalpel
- 1 tube spécial centri (environ 30 ml avec bouchon vissé) pour la centri sigma et
pour le rotor 12139 (Tiroir salle de prep 524)
- portoir tubes corning
- 14 tubes corning (13*100mm) en verre
- 1 spatule
- 1 vortex (tiroir SN II-4)
- 1 chronomètre (tiroir SN II-4)
- Des cônes jaunes 200µl + 1 pipetman P200
- Des cônes bleus 1000µl + 1 pipetman P1000
- 1 portoir eppendorf 1.5ml
- 8 tubes eppendorf 2ml
- 1 portoir à falcon 50 ml + 1 portoir à falcon 15 ml
- 1 tube falcon 15ml
- 1 bac à glace
- 1 poubelle de paillasse
- 1 pipette en verre de 2ml + 1 pipette en verre de 5ml + 1 pipette en verre de 10
ml+ 1 poire + portoir (salle SN 0-4)
- 1 pissette H
2
O
- 7 cuves spectro 3ml + 4 cuves spectro 1.5ml

RELATIONS STRUCTURES - FONCTIONS CHEZ LES VEGETAUX OSMOSE ET PERMEATION (TP1)

A. INTRODUCTION
A première vue, les expériences groupées dans cette manipulation et le matériel biologique employé peuvent paraître disparates. En fait, il ne sera question ici que de certains types d'échanges cellulaires (osmose : eau ; perméation : ions) établis entre le vivant et son milieu. Quant aux sujets d'analyse (tubercules, épidermes, protoplastes..), ils ont été choisis parce qu'ils permettaient des expériences simples et de courte durée. Le potentiel osmotique Le potentiel osmotique, désignée par le symbole Ψs, est fonction de la température, de la concentration de la substance dissoute, et de ses caractéristiques de dissociation.
Le potentiel hydrique

La notion de potentiel hydrique a été largement discutée au cours. Pour éclaircir des problèmes de terminologie, nous donnerons le tableau suivant : Milieu intérieur Iso-osmotique Hypo-osmotique Hyper-osmotique Milieu extérieur Isotonique Hypertonique Hypotonique ∆Ψ = Ψint - Ψext équilibre plasmolyse turgescence ∆Ψ= 0 ∆Ψ> 0 ∆Ψ < 0

B. Evaluation des paramètres osmotiques
A) Détermination de la potentiel de succion tissulaire

Les tubercules de pommes de terre sont constitués essentiellement de parenchyme de réserve. En mettant à profit la grande homogénéité de ce tissu, il est possible de réaliser un certain nombre d'expériences, telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur, sur des fragments de tubercule. 1. Préparation du matériel - Prendre trois pommes de terre, les éplucher et les placer dans un récipient plein d'eau. Découper les tubercules en parallélépipèdes de section carrée (env. 0,5 cm de côté). - Après les avoir lavés, conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide. - Ajuster alors les fragments de tissus à une longueur déterminée de 4cm, en supprimant les bords inférieurs et supérieurs. - Essuyer légèrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les répartir en lots de 4. - Déterminer rapidement, sur les balances, le poids frais (PF 0) de chaque lot (auquel on attribuera un numéro).

2

2. Mode opératoire - Préparer dans 6 tubes falcons de 50 mL des solutions de saccharose aux concentrations indiquées (ci-dessous), à partir d'une solution stock (2M).
bécher 1 2 3 4 5 6 7 8 Ψs (bars) expérimentale Concentration Calcul Ψs (bars) finale (M) Solution idéale

0 -1,3 -2,6 -5,2 -11 -25,2

0,00 0,05 0,10 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

- Incuber vos lots de fragments de pomme de terre dans chacun des tubes. - Après 1 heure d’incubation, mesurer pour chacun des lots, le poids frais PFf ainsi que la longueur moyenne Lf de chaque lot (légèrement essuyer les segments sur un papier sopalin).
On calculera alors :

Pression osmotique d’une solution idéale (formule de Van t’Hoff) : Π =RT/V.log aw ≈ i x CB x R x T x 1000 en Pa (1 bar = 101325 Pa) 3. Résultats Reporter sur un graphique, les courbes correspondant au ∆L et au ∆PF, en fonction de la concentration molaire (M) du saccharose. Pour chacune des courbes, déterminer la valeur de la concentration de saccharose correspondant à l'intersection avec l'abscisse. Calculer les valeurs théoriques idéale de Π pour les différentes solutions suivant la formulation de Van t’Hoff. Calculer à partir de cette valeur, le potentiel hydrique des tissus (ΨW = ΨS = -Π car ΨP = 0 au point d’intersection sur l’axe des abscisses). Exprimer alors ΨW en MPa et en Bar.
Rappels : 0 °C = 273,15 K ; R = 8,31 J/mol.K ; i = 1 pour le saccharose, 2 pour le NaCl ; CB = Concentration Molaire de la solution.

3

. Nous nous bornerons ici à observer la pénétration de deux types de colorants. il n'est stable que dans des conditions isotoniques (ou légèrement hypertoniques) et prend alors une forme sphérique. Les protoplastes permettent d'étudier un certain nombre de caractéristiques du plasmalemme (perméabilité.Filtrer la suspension de protoplastes à travers un filtre nylon (100 µ m).B) Quelques propriétés des protoplastes foliaires Le protoplaste est une cellule dont on a fait disparaître (mécaniquement ou enzymatiquement) la paroi.. Purification .1. pour éliminer les restes de feuilles non digérées.. Incubation enzymatique . 1. 5 min).5 mL.Déposer les fragments de feuilles (face pelée vers le bas) à la surface de la solution d'incubation.2. . à l'aide d'une brucelle à pointes fines. Travailler sur un papier filtre humide. Rincer le matériel après usage.Centrifuger 1. l'épiderme inférieur de 3-5 feuilles de mâche (Valerianella olitoria).Envelopper la boîte de Pétri d'une feuille d'aluminium et incuber à 20-30°C durant 30 minutes sur un agitateur orbital (50-100 tpm) . . 4 . 500 tpm. En l'absence des potentiels hydrostatiques (pressions) normalement exercées par la paroi sur le contenu cellulaire. 1.Pipeter dans une boîte de Pétri 2 ml d'une solution enzymatique déjà prête. Expliquer le rôle de ces divers composés. pour éviter le dessèchement. et découper le mésophylle en carrés de 1mm² environ. contenant des cellulases.(Attention à ne pas renverser la boîte). charges. des pectinases et du sorbitol. . . Isolement des protoplastes 1.5 mL de la suspension de protoplastes (tubes eppendorf de 1. pour lesquels le plasmalemme présente une perméabilité sélective.Peler délicatement.).

Le culot de protoplastes sera suspendu en tapotant sur le tube.. 5 . 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du quadrillage. Ne surtout pas vortexer. on trouve 25 rectangles qui sont divisés en 20 petits carrés afin de faciliter le comptage. • Observer ensuite à l’objectif x40 ou à x60 pour réaliser le comptage (Voir instructions).Eliminer le surnageant et laisser 100-150 µ L de solution.Conserver cette suspension de protoplastes dans son tube eppendorf et agiter doucement avant usage. comportant des rigoles et un quadrillage : Plate-forme centrale Profondeur de la chambre Lamelle planée Plateaux surélevés Rigoles Lame porte . soit 0. -la profondeur de la chambre. C’est une lame épaisse en verre. Observation et comptage des protoplastes Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de comptage de volume connu. 2. Régler le contraste et la lumière pour observer la grille et les protoplastes.objet Quadrillage Le volume de comptage est déterminé par : -la surface du quadrillage gravé sur la lame. → Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm3 = 1 µL → Chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible. . et vérifier l’homogénéité de la répartition des cellules à compter (si la répartition est mauvaise. • Compter les cellules contenues dans 4. recommencer). Parmi les 100 rectangles totaux. 10.01 mm3 = 10 nL Pour la Numération • Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage.

les détails morphologiques des protoplastes. en plongeant ces lambeaux dans des solutions de potentiel osmotique variable. . Il est ainsi possible. C) Observations microscopiques Les lambeaux épidermiques. le nombre de protoplasmes colorés (A compter sur 20 protoplastes sans a priori). d'étudier les échanges d'eau entre les cellules et le milieu extérieur. observez au microscope. déterminer.Prélever une goutte de suspension de protoplastes (env. 20µL. Observer en temps réel les phénomènes physiques sur les protoplastes. 6 . on choisit de prendre en compte les cellules chevauchant la ligne horizontale supérieure. Dessiner une cellule de protoplaste et déterminez la position des chloroplastes. respectivement. NE PAS LAISSER SECHER ! Pour les deux essais.Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage. permettent une observation microscopique aisée des cellules qui les composent. . des vacuoles etc... 20µL d'eau ou de sorbitol à 15% (Réalisez deux expériences).Recouvrir d’une lamelle et après 2 min. Commenter les résultats. II : Phénosafranine 0. Perméabilité sélective . . voir explication). constitués d'une assise cellulaire unique.Ajouter alors sur les bords d’une lamelle. .1 % v/v en solution TL. compter seulement celles qui chevauchent 2 arêtes du rectangle sur 4 (en pratique. sur la base d'observations microscopiques. des colorants suivants : I : Rouge neutre 0. 20µL) et la déposer sur la gouttière centrale de la cellule de comptage (Malassez. d'obtenir.Pipeter délicatement 20 µ L de la suspension de protoplastes. Numération sur le rectangle = 7 protoplastes . Estimer le nombre de protoplastes isolés et leur concentration (protoplastes/mL). 3.1 % v/v en solution TL. des informations sur le potentiel hydrique cellulaire.Observer alors. à un grossissement final de 400x-600x. Les vacuoles de ces tissus occupent la presque totalité de l'espace cellulaire. et la ligne verticale droite). et.Ajouter sur les lames 1 et 2.

Mode opératoire . Choisir au microscope une zone facilement observable.Détacher avec une paire de brucelles à pointes fines. . Observez la cellule et ses différents compartiments puis évaluez le potentiel hydrique cellulaire. noter la concentration C. Evaluation du potentiel hydrique cellulaire A l'isotonie.. à l'aide d'un scalpel. . Ajouter 20µL de Vert de Méthyle et 20µL de Rouge Neutre dans chaque tube eppendorf.Placer le lambeau (face déchirée vers le bas) entre lame et lamelle dans 1 mL d’une solution de sorbitol (6 tubes). Déterminer la concentration molaire de sorbitol qui se rapproche le plus de l'isotonie et déduire le potentiel hydrique cellulaire. . le fragment épidermique ainsi délimité en le saisissant par un des coins. . On utilisera des solutions de sorbitol (substance qui ne pénètre pas ou peu dans les cellules) à différentes concentrations (0 . le potentiel hydrique de la cellule est égal au potentiel osmotique du milieu extérieur. 7 . observez entre lame et lamelle au microscope.Après 5 min. 6.Inciser délicatement. un carré de 3 mm de côté environ. dans l'épiderme intérieur d'une écaille d'un bulbe d'oignon. 8 . En travaillant chaque fois avec un lambeau frais. 2.Dessinez les points extrêmes de turgescence et de plasmolyse. 2.1. 10 et 15 %). pour laquelle il y a une légère plasmolyse. puis cherchez les points encadrant l’isotonie.

Annexes : 8 .

Ne pas appuyer sur la lamelle pour chasser d'éventuelles bulles d'air : la préparation serait irrémédiablement inutilisable. 2. Coloration Respecter les indications de temps de traitement et de rinçage suivants : Prendre une plaque multi-puits et ajoutez un volume de 5mL de chaque solution de coloration ou d’eau distillée. Gardez une dizaine de coupe de chaque échantillon de tige ou de racine. mais pas vraiment pour protéger un tissu pendant l'inclusion. caulinaire et du processus d’ouverture stomatique (TP2) Exécution et montage des coupes anatomiques 1. Les transferts d’un milieu vers un autre se font à l’aide d’un tamis après chaque temps de traitement. les surfaces optiques du microscope. 1) eau de javel: 15 min 2) rinçage abondant à l’eau 3) lavage rapide à l’acide acétique : 1-2 min 4) rinçage sommaire à l’eau Résultat Les tissus cellulosiques apparaissent en rouge. Placer doucement la lamelle sur la préparation en vous aidant d'une aiguille montée.Etude de la structure racinaire. 3. Procédez aux colorations des coupes des échantillons végétaux. Ne monter que 2 à 3 coupes sur une lame en choisissant de préférence les fragments de coupes les moins colorés . L'agar sert pour les coupes au vibratome (Labonord 100 plus). 9 . Exécution Les échantillons de plante sont au préalable coupé et inclus dans de l’agar à 4 %. ce sont en principe les plus minces. puis procédez aux colorations de ces coupes. soient essuyées avec un papier Kim Wipes (risque de rayures). par ailleurs. en particulier l'oculaire. les tissus lignifiés et subérifiés apparaissent en vert – ( Attention les colorations présentées en cours peuvent être différentes). Il est indispensable que lames et lamelles soient propres et sèches et que. Placer suffisamment de liquide de montage sur la lame pour que toute la coupe soit immergée. Montage 5) Coloration au rouge Congo: 10 min 6) Rinçage sommaire 7) Coloration au Vert d'iode: 5 min 8) Rinçage soigneux et montage sur lame.

2. éliminer les excès d'eau avec un mouchoir de papier. le sens de la coupe. l'échelle du dessin étant choisie en fonction des plus petits détails à reproduire (Endoderme ou pôles vasculaires. ajouter de l'eau en présentant à l’aide des comptes gouttes au bord de la lamelle. 2. Utiliser un tiré pour montrer l'arrêt "arbitraire" de la coupe. brèves mais précises et complètes. CONSEILS POUR LE DESSIN 1. Légendes: placées assez loin. continus (crayon HB). de l'organe ou du détail représenté. sauf les très gros vaisseaux de métaxylème. caractéristiques des Monocotylées (voir planche I). A RENDRE pour le TP2. Le titre comprend le nom complet de la plante (genre. par exemple).Pour le compte rendu. nets. contours irréguliers d'une lacune. partie n° : 1 1. rendre une feuille A4 présentant les deux dessins schématiques d’une structure racinaire et d’une structure caulinaire.. etc. Utiliser les représentations conventionnelles des différents tissus (voir page suivante). écrites lisiblement et horizontalement. position précise d'un canal ou d'une fibre isolée.Présenter le principe expérimental et rendre un tableau synthétique présentant les analogies et les différences entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction d’un organe végétal. réguliers. etc. Dessin général Représenter le contour exact d'un quart de coupe (pas de compas: une coupe n’est jamais parfaitement ronde) et les limites exactes des différents tissus en veillant particulièrement aux proportions relatives. le grossissement. espèce et autres indications taxonomiques en Latin). 10 . Ne pas représenter de cellules.. II.. Faire des traits fins. Les particularités de votre échantillon doivent être représentées : nombre exact de faisceaux conducteurs. se terminant dans le dessin par un point ou une flèche et ne se croisant pas. traits de rappel à la règle. Respecter les proportions relatives des différentes parties. ou au contraire. d'un cambium. Généralités Dessiner grand (2/3 d’une page). sans la soulever (l'eau pénètre par capillarité).Si besoin.

hypoderme. phelloderme (ici une assise) Rhizoderme (Représentation non schématique des poils absorbants) Endoderme en 'U' (Dessin non schématique) (Monocotylées) Endoderme à cadre de Caspary (Dessin non schématique) (Eudicotylédones) Xylème primaire ou protoxylème (A noircir) Métaxylème avec gros vaisseaux des Monocotylées (dessiner la forme exacte des vaisseaux) Bois homoxylé (Gymnospermes .ici 3 couches) Liber (points alignés en lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Exoderme. péricycle.lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Bois hétéroxylé (Eudicotylédones lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Cambium et phellogène (assise génératrice) Parenchymes (préciser le type) Collenchyme Sclérenchyme (quadrillage fin à 45°) Parenchymes sclérifiés (quadrillage lâche à 45°) 11 .SYMBOLES UTILISES POUR UN SCHEMA ANATOMIQUE (TP 2) Épiderme cutinisé Phloème (points non alignés) Suber (quadrillage à 90° . périderme.

pH ajusté à 6. on pelle la face inférieure de la feuille de façon à détacher la couche épidermique. Traitement lumineux en présence d’acide abscissique à 1µM de concentration finale. Après 1h de traitement. Danger très important de fixation tissulaire (peau-organe). les épidermes montés sur une lame et sont observés au microscope. MES 10 mM. Traitement obscurité d’une heure supplémentaire (Absence de lumière). Chaque couche épidermique est collée. Les jeunes feuilles sont prélevées avant l’éclairement du phytotron (les stomates sont fermés). 12 . afin de normaliser les valeurs d’ouverture stomatique entre les différentes expériences. avant l’ajout de molécules pharmacologiques à tester. Traitement obscurité en présence de fusiccocine à 5 µM de concentration finale. A l’aide d’une pince. KOH 30 mM. Les lamelles sont ensuite déposées dans des petites boîtes de Pétri contenant 3 ml de milieu tampon : KCl 10 mM. Ouverture stomatique Les lamelles portant les épidermes végétaux seront soumises à quatre types de traitement : Traitement lumineux d’une heure sous lampe à lumière froide.5 avec de l’acide iminodiacétique. Commelina communis. Vicia faba).ETUDE DES PROCESSUS REGULANT L’OUVERTURE STOMATIQUE (TP2 SUITE) Epidermes isolés Les études sur épidermes isolés sont réalisées sur des feuilles de plants âgés de trois à quatre semaines (Arabidopsis thaliana. Valerianella olitoria. face inférieure sur une lamelle de verre avec de l’adhésif silicone de type Hollister N°7730 (Medical adhesive) connu pour ne pas endommager les cellules. Puis les boîtes sont placées à l’obscurité (sous papier aluminium) à température ambiante pendant quinze minutes.

Rendre un tableau synthétique présentant les valeurs d’ouvertures des ostioles pour chaque condition expérimentale et donner les évaluations statistiques. présenter après une courte introduction. puis utiliser le grossissement moyen pour reconnaître les différents tissus et les zones où la coupe est la meilleure. les objectifs du TP. exprimée en micromètre sera mesurée sous microscope photonique (grossissement 10x60). l’ouverture moyenne de 20 stomates sera calculée ainsi que l’écart à la moyenne ( = Ecart type/racine (n-1)) – Fournir le tableau de valeur avec le compte rendu. Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire et Y pour la lame de calibration). puis finir par une conclusion. le condenseur de lumière et le diaphragme. 13 . représentative de l’ouverture stomatique. A RENDRE pour le TP2 partie n° : 2 3. Calculer la distance entre chaques lignes au niveau de l’occulaire avec l’équation suivante : Mesure entre 2 lignes = Y/X x 10 µm Maintenant. l’Interprétation des observations chez Vicia faba et Commelina communis.Pour le compte rendu. La largeur de l’ostiole. Mettre le microscope en position de calibration de facon à faire correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. vous êtes capables de mesurer la taille des cellules végétales en µm grâce à votre calibration. Excès ou défaut de lumière sont également nuisibles à une bonne observation. Passer au fort grossissement (10x 60) puis régler l'intensité lumineuse en agissant sur le rhéostat de l'éclairage. Vous pouvez effectuer un comptage exhaustif des stomates ouvert ou fermés suivant les conditions expérimentales. 4. Utiliser l’oculaire équipé d’une graduation et comparer vos observations avec la lame de calibration gravée au centième de mm.Observation Observer d'abord au faible grossissement du microscope pour centrer la coupe. Pour chaque traitement.

Que constatez-vous ? Quel est la variabilité des valeurs dans chacune de ces conditions ? Pour les distinguer. 8 Condition B : 12 . AMP. 13 Calculer la moyenne de ces quatre conditions. on calcule un paramètre appelé écart type (σ) σA= Exemple de calcul : TP3 : ETUDE DE LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET DE LA GLUTAMATE SYNTHASE DES RACINES DE MAIS I . amide de l’acide glutamique. 11. 12 Condition C : 12 .). isolée chez les procaryotes et les eucaryotes. glutamique + ATP + NH2OH Mg2+ γ . 12 .glutamyl hydroxamate + ADP + Pi 14 . L’une de ces dernières. 13 . 12 .glutamyl hydroxamate: Ac. CTP. 13 . 16 .-----------------------------------------------------------------------Exemple de calcul de l'écart-type : Voici quatre séries de 5 valeurs: • • • • Condition A : 10 . 10 . histidine. 12 . est le précurseur ou le donneur du groupe aminé de nombreux produits du métabolisme (tryptophane.. 17 . 12 . . 12 . la glutamine. dont le poids moléculaire varie selon les espèces de 500 à 600 KkDa. 12 Condition D : 7 . Elle peut également catalyser la formation de γ .. La glutamine est formé à partir de l’acide glutamique par action de la glutamine synthétase: NH4 + acide glutamique + ATP Mg2+ glutamine + ADP + Pi La glutamine synthétase est une enzyme de structure complexe.Principe L’ammoniac (NH3) qui résulte de la réduction des nitrates ou de celle de l’azote atmosphérique est immédiatement incorporé sous forme d’aminoacides ou d’amides. 14 .

4. Rajouter dans chaque tube 0. elle permet le transfert d’un groupement NH2 de la fonction amide de la glutamine vers l’acide 2-oxoglutarique pour former deux molécules de glutamate.) -HCl 6N (l vol. La glutamate synthase (glutamine : 2-oxoglutarate aminotransférase = GOGAT) catalyse la seconde étape de l’assimilation de l’azote ammoniacal .FeC1 6H à 10% dans HC1 0.) (en préparer 12 ml) Lire les densités optiques à 540 nm après 10 minutes.15 . . Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H+ 2 glutamate + NAD+ Nous nous intéresserons donc au cours de ce TP à la glutamate synthase NADH-dépendante.0. .2 .Activité de la glutamine synthétase 1 / Réalisation de la courbe étalon La courbe étalon sera effectuée à l’aide de différentes concentrations de γ -glutamyl hydroxamate.Compléter à 1.1 . du MgC12 (10 mM) et du DTT (10 mM). Après élimination du culot.0. III .4 contenant de 1’EDTA (10 mM).25 .2 N (1 vol.3 et 0. 15 .Préparation de l’extrait enzymatique Les grains de maïs sont mis à germer pendant 72 h à 26°C en présence de (NH4)2SO4 10 mM) et de KNO3 (10 mM).Acide trichloracétique à 25% (1 vol.4 mL d’une solution de γ -glutamyl hydroxamate 5 mM. II .4 mL du réactif composé de : .) .0.6 ml avec du tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7.Introduire dans 7 tubes à essais: 0 . la suspension obtenue est centrifugée à 14000 rpm pendant 30 minutes. les hydroxamates forment en effet des complexes fortement colorés avec les ions ferriques. Après filtration sur étamine. Les racines (10 g) sont broyées dans un mortier en présence de 15 mL de tampon Tris-HC1 (50 mM) pH 7.C’est la présence de ce composé qui sera recherchée dans des mélanges réactionnels comprenant la glutamine synthétase extraite de racines de maïs.0. le surnageant obtenu servira à déterminer l’activité enzymatique étudiée.0.

4 mL 16 .3 mL 0.1 ml de MgSO4 (0.Etude de la glutamate synthase La détermination de l’activité enzymatique sera effectuée en suivant au spectrophotomètre la diminution de D. . 150 et 200 tM (Vf= 2.5 M) .6 renfermant 10 mM de DTT 2-oxoglutarate 10 mM NADH 1 mM 1. 2 / Détermination de l’activité enzymatique La préparation des mélanges réactionnels 1.6 mL 0 mL 0.Incuber 15 minutes à 25°C puis arrêter la réaction avec 0.1 ml de NH2OH (1 vol.2 ml d’ATP (30 mM) -0. 100.Centrifuger les essais à 5000 rpm pendant 10 minutes et lire les D.0.2 mL 0 mL 2 1. 1 / Réalisation de la courbe étalon A partir de la solution de NADH 1 mM. .0. Lire directement les D. IV .7 mL 0. 2 et 3 s’effectuera directement dans une cuve de spectrophotomètre de la manière suivante : 1 Tampon HEPES-KOH 200mM. Ajouter alors 0.5 ml de tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7.2 mL 0. à 540 nm.0.4 . de NH2OH-HCl N + 1 vol.4 mL 3 1.3 M) . à 340 nm correspondant à l’oxydation du NADH.2 ml de Na-glutamate (0. de NaOH N).4 mL).O. préparer les solutions : 25.Incuber 5 minutes à 25°C.Réaliser un essai témoin en remplaçant l’extrait enzymatique par du tampon.2 / Détermination de l’activité enzymatique Dans un tube à hémolyse. . à 340 nm.O.5 ml d’extrait enzymatique .4 ml du réactif décrit au III-A.O. .0. pH8. 50.Exprimer les résultats en nmoles de γ-glutamyl hydroxamate formées par minute et par mg de protéine. mélanger: .

Effectuer la même opération en remplaçant 2 par 3. préparer une solution fille à 2 mg/ mL-1 (V= 1 mL).0.5 – 1 1.mL-1). 17 .Glutamine 100 mM Extrait enzymatique 0. mL-1.4 mL 0 mL 0.4 mL La réaction démarre par l’addition du NADH.0.1 mL 0. Suivre la variation de D. Exprimer les résultats en nmoles de NADH oxydé par min et par mg de protéine. 2 / Dosage de l’extrait enzymatique Réaliser un dosage au réactif de Bradford des protéines contenues dans votre extrait après l’avoir dilué 10. 20 et 50 fois.Dosage des protéines par la méthode de Bradford Cette méthode repose sur la propriété du bleu de Coomassie à se lier. Déterminer graphiquement la concentration en protéine de votre extrait enzymatique. V . aux protéines et de former ainsi un complexe qui absorbe à 595 nm. Conclusions. Dosage au réactif de Bradford Mélanger 10 µL de chacune de vos solutions de BSA dans le réactif de Bradford dilué 5X dans H2O (Vf= 1 mL). à 595 nm en utilisant le tube 0 de la gamme comme 0 d’absorbance. Chaque dilution fera l’objet de 2 mesures. Le mode opératoire sera le même que celui utilisé pour la réalisation de la gamme étalon.4 mL 0. Incuber 5 minutes à température ambiante et mesurer les D. 1 / Préparation de la gamme étalon Préparation des solutions de BSA A partir d’une solution de protéine d’albumine sérique bovine (BSA) concentrée à 20 mg.25 .mL-1. obtenues à 595 nm en fonction de la concentration en BSA (µg. du mélange 2 par rapport au mélange 1. Préparer ensuite à l’aide de cette solution fille 6 tubes contenant 200 µL de solution de BSA à 0 .O.1 mL 0. à 340 nm toutes les 30 secondes pendant 5 minutes.5 et 2 mg.O. en milieu acide.O. Tracer le graphe des D.

1 à 0.50mL de chaque Faire des fractions aliquotes pour 7x4 eppendorf de 1. Faire des solutions de sorbitol à 1.30g de sucre Sera dilué. 10 et 15 % w/v .2 g de Pectinase Fluka (17389) Rouge Neutre et Safranin O : Diluer à 0.15 100mM (100mL) Peser 1. Mâche (2 paquets) et 2 sacs d’oignons blancs.5 mL. en TP de 0.MW 342.30 Faire 2L : Pour 500 mL à 2M 342.8 M Tampon MES pH6.5 mL.05 M Ajouter extemporanément (en cours de TP): 50 % de sorbitol 20% 50 % de MES 100 mM 0.2 anhydre Faire 250 mL d’une solution à 15% w/v de Sorbitol (15g/L) puis. 14-18/Mars/2011 Solution de Sorbitol : MW 182. Préparation d’une solution de Vert de méthyle (100mL) en solution aqueuse.15 0. diluer. Solution de Sucrose : Solution stock de sucrose à 2M .préparation des solutions : Achat à Carrefour de Pomme de Terre (20kg).1 % w/v en solution TL sans enzymes (10mg pour 10mL) Aliquoter en 7x4 eppendorf de 1. 5. et ensuite filtrer ! 100 ml 5g 1 cc 18 .Préparation des Solutions et matériels.952 g de MES dans 90mL d’eau Ajouter qqs gouttes de NaOH 10N Ajuster à 100 mL Solution TL : (Préparation en TP) 10% Sorbitol Tampon MES pH 6. acidifiée à l'acide acétique : Eau bidistillée : Vert de méthyle : acide acétique glacial Laisser durant 1 heure sur l'agitateur magnétique. cultures et installation des Salles : (Version 2011) TP 1 .1 g de Cellulase Sigma (C-8546) 0.

Acide Acétique à 1% à partir d'acide acétique Glacial 4. 1. Installation de la salle pour le TP1: 14 postes avec : 1 vortex pour 2 binômes 1 microscope pour chaque binôme 1 cellule de Malassez pour chaque binôme + lamelle 4 Lames de microscope +lamelles 1 portoir orange pour tube falcon de 50mL 6 tubes falcon vide + 1 tube de saccharose 2M 1 portoir eppendorf avec : 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%.Vert d'iode à 2/1000 2.100 mL 1 couteau court 1 pince 1 scalpel 1 pissette d’eau 500 mL 1 compte goutte d’eau distillée 1 pipetteman de 200µL 1 pipetteman de 1000 µL 19 . Medicago sativa – 2 pots vermiculite x 12 binômes Solutions à 5 µM fusicoccine et 1 µM ABA. MES 10 mM. La préparation des solutions se fait dans EtOH 100% et le stockage à -20°C.7 pots x12 binômes = 84 pots. Préparation des solutions de coloration : Dilution dans 1000 mL d’eau distillée des solutions de coloration. Préparation des Solutions tampons : (2000 mL) KCl 10 mM.TP 2 .5 avec de l’acide iminodiacétique.Préparation des solutions : 7-11/Mars/2011 . 10% et 15 % 2 tubes eppendorf de 1.Attention.5 mL vide + 1 tube de 2 mL 1 portoir de pipette avec : 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL 1 propipette 1 éprouvette graduée de 50 mL . pH ajusté à 6. Préparation bouteille Agar à 4% dans de l’eau (4x 100mL).Solution d'eau de javel à 12° Remplir les comptes gouttes avec les diverses solutions et de l'eau distillée (Faire les étiquettes si nécessaire). 5%. 3. (Risque toxicité). KOH 30 mM. lancer les cultures pour le matériel biologique en avance (4semaines) : Vicia faba .Rouge Congo à 2/1000 (Risque toxicité) A changer pour Carmin ou Phloroglucinol.

Acide acétique. 10% et 15 % 2 tubes eppendorfs de 1. Vert d’iode et Rouge congo 1 pipetteman de 10-20µL 1 pipetteman de 200µL 1 pipetteman de 1000 µL 1 lot de cône bleu 1 lot de cône jaune 1 sopalin 1Poubelle de Table 2 Supports nylon pour les coupes 2 Plaques 8 puits 1 marqueur 20 .5 mL vide + 1 tube de 2 mL 1 portoir de pipette avec : 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL 1 propipette 1 pince 1 scalpel 1 pissette d’eau 500 mL 1 compte goutte de Javel. 5%.1 lot de cône bleu 1 lot de cône jaune 1 sopalin 1 Poubelle de Table Installation de la salle pour le TP2: Installer la table orbitale et le Vibratome Installer les lampes LED/Fluocompacte pour l’éclairage 7 postes avec : 1 lame de calibration 100µm 1 microscope pour chaque binôme 1 vortex par binômes 4 Lames de microscope +lamelles 1 portoir orange pour tube falcon de 50mL (Solution pour Stomate) 1 portoir eppendorf avec : 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%.

Les microscopes LEICA doivent être équipés d’objectif gradué.5kU P3502-25g Marque Sigma Aldrich Sigma Sigma Fluka Fluka Sigma Sigma Sigma 21 . Réticule Leica gradué : Inventaire des solutions 01/2010 : Quantité 1kg 500g 25g 5g 10g 50g 5kU 2.5kU 25g Produit D-Sorbitol Iminodiacetic acid Carmine MES Pectinase Pectinase Pectinase solution Cellulase Phloroglucinol Référence S1876-1kg 220000 C1022-25g M3671-50g 17389 17389 P4716-5kU 2* C8546-2.

2N A conserver à RT NaOH 1N A conserver à RT EDTA 10 mM A conserver à RT Peser 1.Solutions et matériels à préparer pour le TP3 "Etude de la glutamine synthétase (GS) et de la glutamate synthase (GOGAT) des racines de maïs" version 2010-2011 ● Matériel végétal commun pour tous les étudiants 2 L Milieu de germination des grains de maïs (NH4)2SO4 (10 mM) 1.6 + DTT 10 mM A conserver à 4° – ajuster le pH avec KOH C • Solutions à préparer et à aliquoter pour chaque binôme Nbr binôme * Bouteille 100 ml H2O milliQ ou aliquoter tubes 50ml A conserver à RT - Tampon de broyage Préparer 500 ml .32 g/l KNO3 (10 mM) 1. • Solutions communes pour tous les étudiants Réactif de Bradford A conserver à 4° C Solution mère commune à tous les binômes HCl 0.à conserver à 4° .86 g pour 500 ml - DTT 10 mM Préparer 500 ml . La germination a lieu pendant 4 à 5 jours à l’étuve à 22° C.à conserver à RT Peser 770 mg pour 500 ml - Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.01 g/l A conserver à RT (à préparer et à conserver au laboratoire INRA) 5 jours avant le TP Des grains de maïs sont mis à germer dans des containers en plastique (à l’INRA) sur 2 épaisseurs de sopalin imbibé de milieu de germination.aliquoter en tubes 50 ml C 22 .

Produit Tris –HCl EDTA MgCl2 6H2O DTT
-

PM 121.1 372.2 203.3 154.3

C finale (mM) 50 10 10 10

pH pH=7.4

C finale (g/L) 6.06 3.72 2.03 1.54

A peser (g) pour 500mL 3.025 1.862 1.015 0.771

Tampon Tris-HCl 25mM (3.03 g/L) pH=7.4 Préparer 1 l - à conserver à RT - ajuster le pH avec HCl - aliquoter en tubes 50 ml

-

FeCl3 6H 10% dans HCl 0.2N Préparer 50 ml - A conserver à RT - Aliquoter en tubes 15 ml Peser 5 g pour 50 ml de HCl 0.2N

-

Acide trichloroacétique 25 % Préparer 50 ml - A conserver à RT - Aliquoter en tubes de 15 ml Peser 12.5 g pour 50 ml

-

HCl 6N Préparer 50 ml - A conserver à RT- Aliquoter en tubes de 15 ml Diluer 2 fois la solution commerciale 12 N : 25 ml solution HCl commerciale 12 N + 25 ml H2O

-

Na-glutamate (0.3 M) Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en tubes de 1.5 ml Peser 1.12 g pour 20 ml

-

ATP (30 mM) Préparer 10 ml - A conserver à -20° - Aliquoter en tubes de 1.5 ml C Peser 180 mg pour 10 ml MgSO4 (0.5 M) Préparer 20 ml - A conserver à -20° - Aliquoter en tubes de 1.5 ml C Peser 2.46 g pour 20 ml NH2OH (hydroxylamine) Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml Peser 695 mg pour 10 ml H2O + 10 ml NaOH 1N (à prendre au labo symbiose) 2-oxoglutarate (10 mM) = α-cétoglutarate Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml Peser 33.6 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT

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-

-

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Glutamine (100mM) Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 1.5 ml Peser 293 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT (à prendre au labo symbiose)

-

BSA (20 mg/ml) Préparer 20 ml - A conserver à 4°C - Aliquoter en t ubes de 2 ml Peser 200 mg pour 20 ml

• Solutions à préparer extemporanément = au début de la séance
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-

NADH (1 mM) Préparer 10 ml - A préparer extemporanément - A conserver à -20° - Aliquoter en tubes C de 1.5 ml Peser 7.5 mg pour 10 ml

-

γ-glutamyl hydroxamate (5mM) Préparer 10 ml - A préparer extemporanément - A conserver dans la glace pendant la manip - Aliquoter en tubes de 2 ml Peser 8.1 mg pour 10 ml de Tris HCl 25 mM pH= 7.4

Installation Salle TP 3 :
• Matériels commun
1 centrifugeuse sigma 2K15 + rotor 12139 (salle SN II-4) 1 (ou 2, si possible) balance + papier alu 1 bain marie à 25°C + portoir pour tubes corning (13*100mm) 1 centrifugeuse de paillasse pou eppendorf 2ml pour 2 binômes : 1 spectrophotomètre multipasseur blanc parafilm des gants S/M/L

• Matériels à installer sur la paillasse pour chaque binôme Quantité*Nbre binômes
1 mortier et 1 pilon (placard à côté sorbonne SN 0-4) à conserver au froid avant le début de la manip 1 entonnoir (SN 0-4) 1 étamine=gaze pour filtrer l’extrait enzymatique (entrée placard SN 0-4) 1 couteau ou scalpel 1 tube spécial centri (environ 30 ml avec bouchon vissé) pour la centri sigma et pour le rotor 12139 (Tiroir salle de prep 524) portoir tubes corning 14 tubes corning (13*100mm) en verre 1 spatule 1 vortex (tiroir SN II-4) 1 chronomètre (tiroir SN II-4) Des cônes jaunes 200µl + 1 pipetman P200 Des cônes bleus 1000µl + 1 pipetman P1000 1 portoir eppendorf 1.5ml 8 tubes eppendorf 2ml 1 portoir à falcon 50 ml + 1 portoir à falcon 15 ml 1 tube falcon 15ml 1 bac à glace 1 poubelle de paillasse 1 pipette en verre de 2ml + 1 pipette en verre de 5ml + 1 pipette en verre de 10 ml+ 1 poire + portoir (salle SN 0-4) 1 pissette H2O 7 cuves spectro 3ml + 4 cuves spectro 1.5ml 24

TRAVAUX PRATIQUES de PNV
LSV2 2013

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désignée par le symbole Ψs. 0. INTRODUCTION A première vue. en supprimant les bords inférieurs et supérieurs. il ne sera question ici que de certains types d'échanges cellulaires (osmose : eau . En mettant à profit la grande homogénéité de ce tissu.Ajuster alors les fragments de tissus à une longueur déterminée de 4cm.Déterminer rapidement. nous donnerons le tableau suivant : Milieu intérieur Iso-osmotique Hypo-osmotique Hyper-osmotique Milieu extérieur Isotonique Hypertonique Hypotonique ∆Ψ = Ψint . Le potentiel osmotique Le potentiel osmotique. perméation : ions) établis entre le vivant et son milieu. les expériences groupées dans cette manipulation et le matériel biologique employé peuvent paraître disparates. Pour éclaircir des problèmes de terminologie. est fonction de la température. conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide. il est possible de réaliser un certain nombre d'expériences. Le potentiel hydrique La notion de potentiel hydrique a été largement discutée au cours. telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur. . Découper les tubercules en parallélépipèdes de section carrée (env. de la concentration de la substance dissoute. ils ont été choisis parce qu'ils permettaient des expériences simples et de courte durée. épidermes. et de ses caractéristiques de dissociation. Préparation du matériel . Quant aux sujets d'analyse (tubercules.5 cm de côté). .Prendre trois pommes de terre.Essuyer légèrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les répartir en lots de 4. . protoplastes..FONCTIONS CHEZ LES VEGETAUX OSMOSE ET PERMEATION (TP1) A. Evaluation des paramètres osmotiques A) Détermination de la potentiel de succion tissulaire Les tubercules de pommes de terre sont constitués essentiellement de parenchyme de réserve. 1. .Ψext équilibre plasmolyse turgescence ∆Ψ= 0 ∆Ψ> 0 ∆Ψ < 0 B. le poids frais (PF 0) de chaque lot (auquel on attribuera un numéro).RELATIONS STRUCTURES . sur les balances.).Après les avoir lavés. 2 . sur des fragments de tubercule. les éplucher et les placer dans un récipient plein d'eau. En fait.

le poids frais PFf ainsi que la longueur moyenne Lf de chaque lot (légèrement essuyer les segments sur un papier sopalin). .log aw ≈ i x CB x R x T x 1000 en Pa (1 bar = 101325 Pa) 3.10 0. Calculer les valeurs théoriques idéale de Π pour les différentes solutions suivant la formulation de Van t’Hoff. bécher 1 2 3 4 5 6 7 8 Ψs (bars) expérimentale Concentration Calcul Ψs (bars) finale (M) Solution idéale 0 -1.2 -11 -25. Exprimer alors ΨW en MPa et en Bar. Calculer à partir de cette valeur.15 K . à partir d'une solution stock (2M).00 0. i = 1 pour le saccharose.40 0. mesurer pour chacun des lots.Préparer dans 6 tubes falcons de 50 mL des solutions de saccharose aux concentrations indiquées (ci-dessous). Rappels : 0 °C = 273.K . 3 .2 0. CB = Concentration Molaire de la solution. le potentiel hydrique des tissus (ΨW = ΨS = -Π car ΨP = 0 au point d’intersection sur l’axe des abscisses). en fonction de la concentration molaire (M) du saccharose. On calculera alors : Pression osmotique d’une solution idéale (formule de Van t’Hoff) : Π =RT/V.00 .2.31 J/mol. R = 8. déterminer la valeur de la concentration de saccharose correspondant à l'intersection avec l'abscisse.6 -5. Résultats Reporter sur un graphique.60 0. 2 pour le NaCl . Mode opératoire .3 -2.05 0.20 0.80 1.Après 1 heure d’incubation.Incuber vos lots de fragments de pomme de terre dans chacun des tubes. Pour chacune des courbes. les courbes correspondant au ∆L et au ∆PF.

et découper le mésophylle en carrés de 1mm² environ. Incubation enzymatique .1. il n'est stable que dans des conditions isotoniques (ou légèrement hypertoniques) et prend alors une forme sphérique. pour lesquels le plasmalemme présente une perméabilité sélective. 1. Expliquer le rôle de ces divers composés.(Attention à ne pas renverser la boîte). . .). l'épiderme inférieur de 3-5 feuilles de mâche (Valerianella olitoria).B) Quelques propriétés des protoplastes foliaires Le protoplaste est une cellule dont on a fait disparaître (mécaniquement ou enzymatiquement) la paroi.Pipeter dans une boîte de Pétri 2 ml d'une solution enzymatique déjà prête. à l'aide d'une brucelle à pointes fines.. Les protoplastes permettent d'étudier un certain nombre de caractéristiques du plasmalemme (perméabilité.2.Centrifuger 1. Isolement des protoplastes 1. contenant des cellulases. pour éviter le dessèchement. pour éliminer les restes de feuilles non digérées. . des pectinases et du sorbitol. . 500 tpm. 1. .5 mL. Nous nous bornerons ici à observer la pénétration de deux types de colorants.Envelopper la boîte de Pétri d'une feuille d'aluminium et incuber à 20-30°C durant 30 minutes sur un agitateur orbital (50-100 tpm) . 4 .Peler délicatement. En l'absence des potentiels hydrostatiques (pressions) normalement exercées par la paroi sur le contenu cellulaire. Rincer le matériel après usage. Travailler sur un papier filtre humide. Purification .5 mL de la suspension de protoplastes (tubes eppendorf de 1..Filtrer la suspension de protoplastes à travers un filtre nylon (100 µ m).Déposer les fragments de feuilles (face pelée vers le bas) à la surface de la solution d'incubation. charges. 5 min).

01 mm3 = 10 nL Pour la Numération • Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage.objet Quadrillage Le volume de comptage est déterminé par : -la surface du quadrillage gravé sur la lame. • Compter les cellules contenues dans 4. Le culot de protoplastes sera suspendu en tapotant sur le tube. -la profondeur de la chambre. Régler le contraste et la lumière pour observer la grille et les protoplastes. on trouve 25 rectangles qui sont divisés en 20 petits carrés afin de faciliter le comptage. soit 0. . Parmi les 100 rectangles totaux. comportant des rigoles et un quadrillage : Plate-forme centrale Profondeur de la chambre Lamelle planée Plateaux surélevés Rigoles Lame porte .Eliminer le surnageant et laisser 100-150 µ L de solution. 5 . et vérifier l’homogénéité de la répartition des cellules à compter (si la répartition est mauvaise. C’est une lame épaisse en verre. recommencer). 10.Conserver cette suspension de protoplastes dans son tube eppendorf et agiter doucement avant usage. Ne surtout pas vortexer. 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du quadrillage. → Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm3 = 1 µL → Chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible. • Observer ensuite à l’objectif x40 ou à x60 pour réaliser le comptage (Voir instructions).. 2. Observation et comptage des protoplastes Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de comptage de volume connu.

20µL) et la déposer sur la gouttière centrale de la cellule de comptage (Malassez.1 % v/v en solution TL.Prélever une goutte de suspension de protoplastes (env.Ajouter sur les lames 1 et 2. en plongeant ces lambeaux dans des solutions de potentiel osmotique variable.Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage. . d'obtenir. permettent une observation microscopique aisée des cellules qui les composent.. voir explication). les détails morphologiques des protoplastes. constitués d'une assise cellulaire unique. Perméabilité sélective . Il est ainsi possible. à un grossissement final de 400x-600x.1 % v/v en solution TL. compter seulement celles qui chevauchent 2 arêtes du rectangle sur 4 (en pratique. des informations sur le potentiel hydrique cellulaire.Ajouter alors sur les bords d’une lamelle. 6 . on choisit de prendre en compte les cellules chevauchant la ligne horizontale supérieure.Recouvrir d’une lamelle et après 2 min. et la ligne verticale droite).. Commenter les résultats.Observer alors. C) Observations microscopiques Les lambeaux épidermiques. Observer en temps réel les phénomènes physiques sur les protoplastes. Estimer le nombre de protoplastes isolés et leur concentration (protoplastes/mL). sur la base d'observations microscopiques. 20µL d'eau ou de sorbitol à 15% (Réalisez deux expériences). Les vacuoles de ces tissus occupent la presque totalité de l'espace cellulaire. déterminer.Pipeter délicatement 20 µ L de la suspension de protoplastes. et. des vacuoles etc. 3. d'étudier les échanges d'eau entre les cellules et le milieu extérieur. le nombre de protoplasmes colorés (A compter sur 20 protoplastes sans a priori). des colorants suivants : I : Rouge neutre 0. Numération sur le rectangle = 7 protoplastes . . 20µL. Dessiner une cellule de protoplaste et déterminez la position des chloroplastes. NE PAS LAISSER SECHER ! Pour les deux essais. . respectivement. . observez au microscope. II : Phénosafranine 0.

le fragment épidermique ainsi délimité en le saisissant par un des coins. Déterminer la concentration molaire de sorbitol qui se rapproche le plus de l'isotonie et déduire le potentiel hydrique cellulaire. 2. le potentiel hydrique de la cellule est égal au potentiel osmotique du milieu extérieur.Inciser délicatement. dans l'épiderme intérieur d'une écaille d'un bulbe d'oignon.Dessinez les points extrêmes de turgescence et de plasmolyse. .. Observez la cellule et ses différents compartiments puis évaluez le potentiel hydrique cellulaire. à l'aide d'un scalpel.Après 5 min. observez entre lame et lamelle au microscope. 10 et 15 %).Placer le lambeau (face déchirée vers le bas) entre lame et lamelle dans 1 mL d’une solution de sorbitol (6 tubes). noter la concentration C. 8 . . 2. pour laquelle il y a une légère plasmolyse.Détacher avec une paire de brucelles à pointes fines. puis cherchez les points encadrant l’isotonie. . Ajouter 20µL de Vert de Méthyle et 20µL de Rouge Neutre dans chaque tube eppendorf.1. Choisir au microscope une zone facilement observable. 6. Mode opératoire . . En travaillant chaque fois avec un lambeau frais. un carré de 3 mm de côté environ. On utilisera des solutions de sorbitol (substance qui ne pénètre pas ou peu dans les cellules) à différentes concentrations (0 . Evaluation du potentiel hydrique cellulaire A l'isotonie. 7 .

Annexes : 8 .

Placer doucement la lamelle sur la préparation en vous aidant d'une aiguille montée. Les transferts d’un milieu vers un autre se font à l’aide d’un tamis après chaque temps de traitement. les tissus lignifiés et subérifiés apparaissent en vert – ( Attention les colorations présentées en cours peuvent être différentes). Montage 5) Coloration au rouge Congo: 10 min 6) Rinçage sommaire 7) Coloration au Vert d'iode: 5 min 8) Rinçage soigneux et montage sur lame. Ne monter que 2 à 3 coupes sur une lame en choisissant de préférence les fragments de coupes les moins colorés . 2. les surfaces optiques du microscope. Exécution Les échantillons de plante sont au préalable coupé et inclus dans de l’agar à 4 %. caulinaire et du processus d’ouverture stomatique (TP2) Exécution et montage des coupes anatomiques 1.Etude de la structure racinaire. Procédez aux colorations des coupes des échantillons végétaux. Coloration Respecter les indications de temps de traitement et de rinçage suivants : Prendre une plaque multi-puits et ajoutez un volume de 5mL de chaque solution de coloration ou d’eau distillée. mais pas vraiment pour protéger un tissu pendant l'inclusion. en particulier l'oculaire. puis procédez aux colorations de ces coupes. 9 . Il est indispensable que lames et lamelles soient propres et sèches et que. Gardez une dizaine de coupe de chaque échantillon de tige ou de racine. 3. Placer suffisamment de liquide de montage sur la lame pour que toute la coupe soit immergée. par ailleurs. soient essuyées avec un papier Kim Wipes (risque de rayures). 1) eau de javel: 15 min 2) rinçage abondant à l’eau 3) lavage rapide à l’acide acétique : 1-2 min 4) rinçage sommaire à l’eau Résultat Les tissus cellulosiques apparaissent en rouge. Ne pas appuyer sur la lamelle pour chasser d'éventuelles bulles d'air : la préparation serait irrémédiablement inutilisable. ce sont en principe les plus minces. L'agar sert pour les coupes au vibratome (Labonord 100 plus).

réguliers. le grossissement. Respecter les proportions relatives des différentes parties.. Légendes: placées assez loin. se terminant dans le dessin par un point ou une flèche et ne se croisant pas. Dessin général Représenter le contour exact d'un quart de coupe (pas de compas: une coupe n’est jamais parfaitement ronde) et les limites exactes des différents tissus en veillant particulièrement aux proportions relatives. sans la soulever (l'eau pénètre par capillarité). 2. ou au contraire. éliminer les excès d'eau avec un mouchoir de papier. Utiliser les représentations conventionnelles des différents tissus (voir page suivante). par exemple).Présenter le principe expérimental et rendre un tableau synthétique présentant les analogies et les différences entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction d’un organe végétal. etc. partie n° : 1 1. d'un cambium.. le sens de la coupe. contours irréguliers d'une lacune. II.. continus (crayon HB). écrites lisiblement et horizontalement. l'échelle du dessin étant choisie en fonction des plus petits détails à reproduire (Endoderme ou pôles vasculaires. nets.Pour le compte rendu.Si besoin. ajouter de l'eau en présentant à l’aide des comptes gouttes au bord de la lamelle. brèves mais précises et complètes. Utiliser un tiré pour montrer l'arrêt "arbitraire" de la coupe. CONSEILS POUR LE DESSIN 1. position précise d'un canal ou d'une fibre isolée. Généralités Dessiner grand (2/3 d’une page). Faire des traits fins. Les particularités de votre échantillon doivent être représentées : nombre exact de faisceaux conducteurs. espèce et autres indications taxonomiques en Latin). A RENDRE pour le TP2. sauf les très gros vaisseaux de métaxylème. 2. rendre une feuille A4 présentant les deux dessins schématiques d’une structure racinaire et d’une structure caulinaire. 10 . Le titre comprend le nom complet de la plante (genre. Ne pas représenter de cellules. de l'organe ou du détail représenté. etc. traits de rappel à la règle. caractéristiques des Monocotylées (voir planche I).

SYMBOLES UTILISES POUR UN SCHEMA ANATOMIQUE (TP 2) Épiderme cutinisé Phloème (points non alignés) Suber (quadrillage à 90° .ici 3 couches) Liber (points alignés en lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Exoderme. hypoderme. péricycle. phelloderme (ici une assise) Rhizoderme (Représentation non schématique des poils absorbants) Endoderme en 'U' (Dessin non schématique) (Monocotylées) Endoderme à cadre de Caspary (Dessin non schématique) (Eudicotylédones) Xylème primaire ou protoxylème (A noircir) Métaxylème avec gros vaisseaux des Monocotylées (dessiner la forme exacte des vaisseaux) Bois homoxylé (Gymnospermes .lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Bois hétéroxylé (Eudicotylédones lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Cambium et phellogène (assise génératrice) Parenchymes (préciser le type) Collenchyme Sclérenchyme (quadrillage fin à 45°) Parenchymes sclérifiés (quadrillage lâche à 45°) 11 . périderme.

Traitement obscurité d’une heure supplémentaire (Absence de lumière). pH ajusté à 6. Puis les boîtes sont placées à l’obscurité (sous papier aluminium) à température ambiante pendant quinze minutes. les épidermes montés sur une lame et sont observés au microscope. Commelina communis. MES 10 mM. Ouverture stomatique Les lamelles portant les épidermes végétaux seront soumises à quatre types de traitement : Traitement lumineux d’une heure sous lampe à lumière froide. afin de normaliser les valeurs d’ouverture stomatique entre les différentes expériences. face inférieure sur une lamelle de verre avec de l’adhésif silicone de type Hollister N°7730 (Medical adhesive) connu pour ne pas endommager les cellules.5 avec de l’acide iminodiacétique. on pelle la face inférieure de la feuille de façon à détacher la couche épidermique. Traitement lumineux en présence d’acide abscissique à 1µM de concentration finale. A l’aide d’une pince. Vicia faba). Danger très important de fixation tissulaire (peau-organe). avant l’ajout de molécules pharmacologiques à tester. KOH 30 mM. Traitement obscurité en présence de fusiccocine à 5 µM de concentration finale. Chaque couche épidermique est collée. Après 1h de traitement. 12 . Les jeunes feuilles sont prélevées avant l’éclairement du phytotron (les stomates sont fermés). Valerianella olitoria.ETUDE DES PROCESSUS REGULANT L’OUVERTURE STOMATIQUE (TP2 SUITE) Epidermes isolés Les études sur épidermes isolés sont réalisées sur des feuilles de plants âgés de trois à quatre semaines (Arabidopsis thaliana. Les lamelles sont ensuite déposées dans des petites boîtes de Pétri contenant 3 ml de milieu tampon : KCl 10 mM.

exprimée en micromètre sera mesurée sous microscope photonique (grossissement 10x60). 4. La largeur de l’ostiole. puis finir par une conclusion. représentative de l’ouverture stomatique. Mettre le microscope en position de calibration de facon à faire correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. l’ouverture moyenne de 20 stomates sera calculée ainsi que l’écart à la moyenne ( = Ecart type/racine (n-1)) – Fournir le tableau de valeur avec le compte rendu. vous êtes capables de mesurer la taille des cellules végétales en µm grâce à votre calibration. Utiliser l’oculaire équipé d’une graduation et comparer vos observations avec la lame de calibration gravée au centième de mm.Pour le compte rendu.Rendre un tableau synthétique présentant les valeurs d’ouvertures des ostioles pour chaque condition expérimentale et donner les évaluations statistiques. Excès ou défaut de lumière sont également nuisibles à une bonne observation. Calculer la distance entre chaques lignes au niveau de l’occulaire avec l’équation suivante : Mesure entre 2 lignes = Y/X x 10 µm Maintenant. l’Interprétation des observations chez Vicia faba et Commelina communis. 13 . A RENDRE pour le TP2 partie n° : 2 3. le condenseur de lumière et le diaphragme. puis utiliser le grossissement moyen pour reconnaître les différents tissus et les zones où la coupe est la meilleure. Vous pouvez effectuer un comptage exhaustif des stomates ouvert ou fermés suivant les conditions expérimentales. Passer au fort grossissement (10x 60) puis régler l'intensité lumineuse en agissant sur le rhéostat de l'éclairage. les objectifs du TP. présenter après une courte introduction.Observation Observer d'abord au faible grossissement du microscope pour centrer la coupe. Pour chaque traitement. Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire et Y pour la lame de calibration).

12 . 10 . La glutamine est formé à partir de l’acide glutamique par action de la glutamine synthétase: NH4 + acide glutamique + ATP Mg2+ glutamine + ADP + Pi La glutamine synthétase est une enzyme de structure complexe. Elle peut également catalyser la formation de γ . AMP. isolée chez les procaryotes et les eucaryotes.).. 13 Calculer la moyenne de ces quatre conditions. 14 . dont le poids moléculaire varie selon les espèces de 500 à 600 KkDa. 11. 12 . 13 .. histidine. 12 . 12 . 12 Condition D : 7 . 8 Condition B : 12 . la glutamine. 12 Condition C : 12 .-----------------------------------------------------------------------Exemple de calcul de l'écart-type : Voici quatre séries de 5 valeurs: • • • • Condition A : 10 . est le précurseur ou le donneur du groupe aminé de nombreux produits du métabolisme (tryptophane.Principe L’ammoniac (NH3) qui résulte de la réduction des nitrates ou de celle de l’azote atmosphérique est immédiatement incorporé sous forme d’aminoacides ou d’amides. 12 . L’une de ces dernières. Que constatez-vous ? Quel est la variabilité des valeurs dans chacune de ces conditions ? Pour les distinguer. . amide de l’acide glutamique. 16 . CTP.glutamyl hydroxamate: Ac. 13 .glutamyl hydroxamate + ADP + Pi 14 . 17 . glutamique + ATP + NH2OH Mg2+ γ . on calcule un paramètre appelé écart type (σ) σA= Exemple de calcul : TP3 : ETUDE DE LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET DE LA GLUTAMATE SYNTHASE DES RACINES DE MAIS I .

les hydroxamates forment en effet des complexes fortement colorés avec les ions ferriques.6 ml avec du tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7. III .4 mL du réactif composé de : .15 . Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H+ 2 glutamate + NAD+ Nous nous intéresserons donc au cours de ce TP à la glutamate synthase NADH-dépendante. le surnageant obtenu servira à déterminer l’activité enzymatique étudiée.2 N (1 vol.) .3 et 0.Acide trichloracétique à 25% (1 vol. .25 .) -HCl 6N (l vol. 15 .4 contenant de 1’EDTA (10 mM).) (en préparer 12 ml) Lire les densités optiques à 540 nm après 10 minutes.Préparation de l’extrait enzymatique Les grains de maïs sont mis à germer pendant 72 h à 26°C en présence de (NH4)2SO4 10 mM) et de KNO3 (10 mM).Compléter à 1. .0.FeC1 6H à 10% dans HC1 0.2 .Activité de la glutamine synthétase 1 / Réalisation de la courbe étalon La courbe étalon sera effectuée à l’aide de différentes concentrations de γ -glutamyl hydroxamate.0. II . Rajouter dans chaque tube 0.0.4 mL d’une solution de γ -glutamyl hydroxamate 5 mM. La glutamate synthase (glutamine : 2-oxoglutarate aminotransférase = GOGAT) catalyse la seconde étape de l’assimilation de l’azote ammoniacal . Après élimination du culot. Après filtration sur étamine. la suspension obtenue est centrifugée à 14000 rpm pendant 30 minutes. Les racines (10 g) sont broyées dans un mortier en présence de 15 mL de tampon Tris-HC1 (50 mM) pH 7.C’est la présence de ce composé qui sera recherchée dans des mélanges réactionnels comprenant la glutamine synthétase extraite de racines de maïs.4. du MgC12 (10 mM) et du DTT (10 mM). elle permet le transfert d’un groupement NH2 de la fonction amide de la glutamine vers l’acide 2-oxoglutarique pour former deux molécules de glutamate.0.Introduire dans 7 tubes à essais: 0 .1 .0.

Centrifuger les essais à 5000 rpm pendant 10 minutes et lire les D.6 renfermant 10 mM de DTT 2-oxoglutarate 10 mM NADH 1 mM 1.2 mL 0.Incuber 15 minutes à 25°C puis arrêter la réaction avec 0.Réaliser un essai témoin en remplaçant l’extrait enzymatique par du tampon. .Exprimer les résultats en nmoles de γ-glutamyl hydroxamate formées par minute et par mg de protéine.7 mL 0. 50. Lire directement les D.O.4 mL).5 ml de tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7.4 mL 16 . 2 / Détermination de l’activité enzymatique La préparation des mélanges réactionnels 1. de NaOH N). . à 540 nm.0.4 ml du réactif décrit au III-A. .O.4 .3 M) .6 mL 0 mL 0.0.0. IV .1 ml de MgSO4 (0. pH8. à 340 nm. préparer les solutions : 25. à 340 nm correspondant à l’oxydation du NADH. 100.2 ml de Na-glutamate (0.2 / Détermination de l’activité enzymatique Dans un tube à hémolyse.3 mL 0.Etude de la glutamate synthase La détermination de l’activité enzymatique sera effectuée en suivant au spectrophotomètre la diminution de D.5 ml d’extrait enzymatique .0.Incuber 5 minutes à 25°C. de NH2OH-HCl N + 1 vol. Ajouter alors 0.O. 2 et 3 s’effectuera directement dans une cuve de spectrophotomètre de la manière suivante : 1 Tampon HEPES-KOH 200mM.5 M) . 150 et 200 tM (Vf= 2. 1 / Réalisation de la courbe étalon A partir de la solution de NADH 1 mM.2 ml d’ATP (30 mM) -0. mélanger: .1 ml de NH2OH (1 vol. .2 mL 0 mL 2 1.4 mL 3 1.

V . en milieu acide.0. Dosage au réactif de Bradford Mélanger 10 µL de chacune de vos solutions de BSA dans le réactif de Bradford dilué 5X dans H2O (Vf= 1 mL). Effectuer la même opération en remplaçant 2 par 3.1 mL 0. 2 / Dosage de l’extrait enzymatique Réaliser un dosage au réactif de Bradford des protéines contenues dans votre extrait après l’avoir dilué 10. 20 et 50 fois. du mélange 2 par rapport au mélange 1.mL-1. 17 . Exprimer les résultats en nmoles de NADH oxydé par min et par mg de protéine. 1 / Préparation de la gamme étalon Préparation des solutions de BSA A partir d’une solution de protéine d’albumine sérique bovine (BSA) concentrée à 20 mg. Tracer le graphe des D. aux protéines et de former ainsi un complexe qui absorbe à 595 nm. Incuber 5 minutes à température ambiante et mesurer les D.5 – 1 1. Le mode opératoire sera le même que celui utilisé pour la réalisation de la gamme étalon. préparer une solution fille à 2 mg/ mL-1 (V= 1 mL).4 mL La réaction démarre par l’addition du NADH. Préparer ensuite à l’aide de cette solution fille 6 tubes contenant 200 µL de solution de BSA à 0 .O. à 595 nm en utilisant le tube 0 de la gamme comme 0 d’absorbance.O.Glutamine 100 mM Extrait enzymatique 0.4 mL 0 mL 0. Chaque dilution fera l’objet de 2 mesures. obtenues à 595 nm en fonction de la concentration en BSA (µg. à 340 nm toutes les 30 secondes pendant 5 minutes.O.Dosage des protéines par la méthode de Bradford Cette méthode repose sur la propriété du bleu de Coomassie à se lier.25 .4 mL 0. Suivre la variation de D.mL-1).1 mL 0.0. Déterminer graphiquement la concentration en protéine de votre extrait enzymatique. Conclusions.5 et 2 mg. mL-1.

5 mL. en TP de 0.2 g de Pectinase Fluka (17389) Rouge Neutre et Safranin O : Diluer à 0.1 à 0. Préparation d’une solution de Vert de méthyle (100mL) en solution aqueuse.1 g de Cellulase Sigma (C-8546) 0.2 anhydre Faire 250 mL d’une solution à 15% w/v de Sorbitol (15g/L) puis. cultures et installation des Salles : (Version 2011) TP 1 . Faire des solutions de sorbitol à 1.15 100mM (100mL) Peser 1. Mâche (2 paquets) et 2 sacs d’oignons blancs. et ensuite filtrer ! 100 ml 5g 1 cc 18 . diluer. 10 et 15 % w/v .05 M Ajouter extemporanément (en cours de TP): 50 % de sorbitol 20% 50 % de MES 100 mM 0. 5.50mL de chaque Faire des fractions aliquotes pour 7x4 eppendorf de 1.1 % w/v en solution TL sans enzymes (10mg pour 10mL) Aliquoter en 7x4 eppendorf de 1. 14-18/Mars/2011 Solution de Sorbitol : MW 182.8 M Tampon MES pH6. acidifiée à l'acide acétique : Eau bidistillée : Vert de méthyle : acide acétique glacial Laisser durant 1 heure sur l'agitateur magnétique.Préparation des Solutions et matériels.15 0.30 Faire 2L : Pour 500 mL à 2M 342. Solution de Sucrose : Solution stock de sucrose à 2M .30g de sucre Sera dilué.préparation des solutions : Achat à Carrefour de Pomme de Terre (20kg).5 mL.952 g de MES dans 90mL d’eau Ajouter qqs gouttes de NaOH 10N Ajuster à 100 mL Solution TL : (Préparation en TP) 10% Sorbitol Tampon MES pH 6.MW 342.

MES 10 mM. 5%. 3. KOH 30 mM.5 mL vide + 1 tube de 2 mL 1 portoir de pipette avec : 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL 1 propipette 1 éprouvette graduée de 50 mL . pH ajusté à 6.Solution d'eau de javel à 12° Remplir les comptes gouttes avec les diverses solutions et de l'eau distillée (Faire les étiquettes si nécessaire).TP 2 .Préparation des solutions : 7-11/Mars/2011 . Préparation bouteille Agar à 4% dans de l’eau (4x 100mL). La préparation des solutions se fait dans EtOH 100% et le stockage à -20°C. Préparation des solutions de coloration : Dilution dans 1000 mL d’eau distillée des solutions de coloration.100 mL 1 couteau court 1 pince 1 scalpel 1 pissette d’eau 500 mL 1 compte goutte d’eau distillée 1 pipetteman de 200µL 1 pipetteman de 1000 µL 19 . Préparation des Solutions tampons : (2000 mL) KCl 10 mM. 1.5 avec de l’acide iminodiacétique.7 pots x12 binômes = 84 pots. (Risque toxicité). lancer les cultures pour le matériel biologique en avance (4semaines) : Vicia faba .Acide Acétique à 1% à partir d'acide acétique Glacial 4. Installation de la salle pour le TP1: 14 postes avec : 1 vortex pour 2 binômes 1 microscope pour chaque binôme 1 cellule de Malassez pour chaque binôme + lamelle 4 Lames de microscope +lamelles 1 portoir orange pour tube falcon de 50mL 6 tubes falcon vide + 1 tube de saccharose 2M 1 portoir eppendorf avec : 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%.Attention.Vert d'iode à 2/1000 2. Medicago sativa – 2 pots vermiculite x 12 binômes Solutions à 5 µM fusicoccine et 1 µM ABA.Rouge Congo à 2/1000 (Risque toxicité) A changer pour Carmin ou Phloroglucinol. 10% et 15 % 2 tubes eppendorf de 1.

10% et 15 % 2 tubes eppendorfs de 1. 5%.5 mL vide + 1 tube de 2 mL 1 portoir de pipette avec : 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL 1 propipette 1 pince 1 scalpel 1 pissette d’eau 500 mL 1 compte goutte de Javel. Acide acétique. Vert d’iode et Rouge congo 1 pipetteman de 10-20µL 1 pipetteman de 200µL 1 pipetteman de 1000 µL 1 lot de cône bleu 1 lot de cône jaune 1 sopalin 1Poubelle de Table 2 Supports nylon pour les coupes 2 Plaques 8 puits 1 marqueur 20 .1 lot de cône bleu 1 lot de cône jaune 1 sopalin 1 Poubelle de Table Installation de la salle pour le TP2: Installer la table orbitale et le Vibratome Installer les lampes LED/Fluocompacte pour l’éclairage 7 postes avec : 1 lame de calibration 100µm 1 microscope pour chaque binôme 1 vortex par binômes 4 Lames de microscope +lamelles 1 portoir orange pour tube falcon de 50mL (Solution pour Stomate) 1 portoir eppendorf avec : 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%.

5kU 25g Produit D-Sorbitol Iminodiacetic acid Carmine MES Pectinase Pectinase Pectinase solution Cellulase Phloroglucinol Référence S1876-1kg 220000 C1022-25g M3671-50g 17389 17389 P4716-5kU 2* C8546-2.Les microscopes LEICA doivent être équipés d’objectif gradué. Réticule Leica gradué : Inventaire des solutions 01/2010 : Quantité 1kg 500g 25g 5g 10g 50g 5kU 2.5kU P3502-25g Marque Sigma Aldrich Sigma Sigma Fluka Fluka Sigma Sigma Sigma 21 .

à conserver à RT Peser 770 mg pour 500 ml - Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.à conserver à 4° .6 + DTT 10 mM A conserver à 4° – ajuster le pH avec KOH C • Solutions à préparer et à aliquoter pour chaque binôme Nbr binôme * Bouteille 100 ml H2O milliQ ou aliquoter tubes 50ml A conserver à RT - Tampon de broyage Préparer 500 ml .86 g pour 500 ml - DTT 10 mM Préparer 500 ml .Solutions et matériels à préparer pour le TP3 "Etude de la glutamine synthétase (GS) et de la glutamate synthase (GOGAT) des racines de maïs" version 2010-2011 ● Matériel végétal commun pour tous les étudiants 2 L Milieu de germination des grains de maïs (NH4)2SO4 (10 mM) 1. La germination a lieu pendant 4 à 5 jours à l’étuve à 22° C.2N A conserver à RT NaOH 1N A conserver à RT EDTA 10 mM A conserver à RT Peser 1.01 g/l A conserver à RT (à préparer et à conserver au laboratoire INRA) 5 jours avant le TP Des grains de maïs sont mis à germer dans des containers en plastique (à l’INRA) sur 2 épaisseurs de sopalin imbibé de milieu de germination.32 g/l KNO3 (10 mM) 1. • Solutions communes pour tous les étudiants Réactif de Bradford A conserver à 4° C Solution mère commune à tous les binômes HCl 0.aliquoter en tubes 50 ml C 22 .

Aliquoter en t ubes de 1.Aliquoter en tubes 15 ml Peser 5 g pour 50 ml de HCl 0.Aliquoter en t ubes de 1.2N Préparer 50 ml .5 ml Peser 1.A conserver à 4°C .4 Préparer 1 l .2N - Acide trichloroacétique 25 % Préparer 50 ml .1 372.015 0.Aliquoter en t ubes de 1.06 3.46 g pour 20 ml NH2OH (hydroxylamine) Préparer 20 ml .5 ml Peser 695 mg pour 10 ml H2O + 10 ml NaOH 1N (à prendre au labo symbiose) 2-oxoglutarate (10 mM) = α-cétoglutarate Préparer 20 ml .862 1.5 ml Peser 293 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.A conserver à -20° .6 + DTT (à prendre au labo symbiose) - BSA (20 mg/ml) Préparer 20 ml .Produit Tris –HCl EDTA MgCl2 6H2O DTT - PM 121.A conserver à RT .025 1.à conserver à RT .A conserver à 4°C .5 M) Préparer 20 ml .3 M) Préparer 20 ml .A conserver à 4°C .03 g/L) pH=7.Aliquoter en tubes de 1.Aliquoter en t ubes de 2 ml Peser 200 mg pour 20 ml • Solutions à préparer extemporanément = au début de la séance 23 .3 C finale (mM) 50 10 10 10 pH pH=7.72 2.Aliquoter en tubes de 1.54 A peser (g) pour 500mL 3.Aliquoter en tubes de 1.A conserver à RT .A conserver à RT.03 1.aliquoter en tubes 50 ml - FeCl3 6H 10% dans HCl 0.5 ml Peser 33.A conserver à 4°C .4 C finale (g/L) 6.3 154.Aliquoter en tubes de 15 ml Peser 12.5 ml C Peser 2.771 Tampon Tris-HCl 25mM (3.Aliquoter en tubes de 15 ml Diluer 2 fois la solution commerciale 12 N : 25 ml solution HCl commerciale 12 N + 25 ml H2O - Na-glutamate (0.A conserver à 4°C .6 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.ajuster le pH avec HCl .5 g pour 50 ml - HCl 6N Préparer 50 ml .2 203.12 g pour 20 ml - ATP (30 mM) Préparer 10 ml .A conserver à -20° .5 ml C Peser 180 mg pour 10 ml MgSO4 (0.6 + DTT - - - - Glutamine (100mM) Préparer 20 ml .

A préparer extemporanément .5 ml Peser 7.A conserver à -20° .- NADH (1 mM) Préparer 10 ml .Aliquoter en tubes de 2 ml Peser 8.Aliquoter en tubes C de 1.1 mg pour 10 ml de Tris HCl 25 mM pH= 7.5ml 24 .5 mg pour 10 ml - γ-glutamyl hydroxamate (5mM) Préparer 10 ml .4 Installation Salle TP 3 : • Matériels commun 1 centrifugeuse sigma 2K15 + rotor 12139 (salle SN II-4) 1 (ou 2.A préparer extemporanément .5ml 8 tubes eppendorf 2ml 1 portoir à falcon 50 ml + 1 portoir à falcon 15 ml 1 tube falcon 15ml 1 bac à glace 1 poubelle de paillasse 1 pipette en verre de 2ml + 1 pipette en verre de 5ml + 1 pipette en verre de 10 ml+ 1 poire + portoir (salle SN 0-4) 1 pissette H2O 7 cuves spectro 3ml + 4 cuves spectro 1.A conserver dans la glace pendant la manip . si possible) balance + papier alu 1 bain marie à 25°C + portoir pour tubes corning (13*100mm) 1 centrifugeuse de paillasse pou eppendorf 2ml pour 2 binômes : 1 spectrophotomètre multipasseur blanc parafilm des gants S/M/L • Matériels à installer sur la paillasse pour chaque binôme Quantité*Nbre binômes 1 mortier et 1 pilon (placard à côté sorbonne SN 0-4) à conserver au froid avant le début de la manip 1 entonnoir (SN 0-4) 1 étamine=gaze pour filtrer l’extrait enzymatique (entrée placard SN 0-4) 1 couteau ou scalpel 1 tube spécial centri (environ 30 ml avec bouchon vissé) pour la centri sigma et pour le rotor 12139 (Tiroir salle de prep 524) portoir tubes corning 14 tubes corning (13*100mm) en verre 1 spatule 1 vortex (tiroir SN II-4) 1 chronomètre (tiroir SN II-4) Des cônes jaunes 200µl + 1 pipetman P200 Des cônes bleus 1000µl + 1 pipetman P1000 1 portoir eppendorf 1.

TRAVAUX PRATIQUES de PNV LSV2 2013 1 .

2 .RELATIONS STRUCTURES .Ajuster alors les fragments de tissus à une longueur déterminée de 4cm. désignée par le symbole Ψs. Préparation du matériel . de la concentration de la substance dissoute. En mettant à profit la grande homogénéité de ce tissu.Ψext équilibre plasmolyse turgescence ∆Ψ= 0 ∆Ψ> 0 ∆Ψ < 0 B.Après les avoir lavés.Déterminer rapidement. sur les balances. telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur. . épidermes. conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide.FONCTIONS CHEZ LES VEGETAUX OSMOSE ET PERMEATION (TP1) A. perméation : ions) établis entre le vivant et son milieu. sur des fragments de tubercule. nous donnerons le tableau suivant : Milieu intérieur Iso-osmotique Hypo-osmotique Hyper-osmotique Milieu extérieur Isotonique Hypertonique Hypotonique ∆Ψ = Ψint . les éplucher et les placer dans un récipient plein d'eau. il est possible de réaliser un certain nombre d'expériences. en supprimant les bords inférieurs et supérieurs. Le potentiel hydrique La notion de potentiel hydrique a été largement discutée au cours.). Découper les tubercules en parallélépipèdes de section carrée (env.Essuyer légèrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les répartir en lots de 4. INTRODUCTION A première vue. le poids frais (PF 0) de chaque lot (auquel on attribuera un numéro). Evaluation des paramètres osmotiques A) Détermination de la potentiel de succion tissulaire Les tubercules de pommes de terre sont constitués essentiellement de parenchyme de réserve. Quant aux sujets d'analyse (tubercules. Pour éclaircir des problèmes de terminologie. les expériences groupées dans cette manipulation et le matériel biologique employé peuvent paraître disparates. . En fait. et de ses caractéristiques de dissociation. 0..5 cm de côté). 1. Le potentiel osmotique Le potentiel osmotique. . il ne sera question ici que de certains types d'échanges cellulaires (osmose : eau . ils ont été choisis parce qu'ils permettaient des expériences simples et de courte durée. . est fonction de la température.Prendre trois pommes de terre. protoplastes.

15 K . Calculer à partir de cette valeur.Préparer dans 6 tubes falcons de 50 mL des solutions de saccharose aux concentrations indiquées (ci-dessous).Après 1 heure d’incubation.80 1. Calculer les valeurs théoriques idéale de Π pour les différentes solutions suivant la formulation de Van t’Hoff. déterminer la valeur de la concentration de saccharose correspondant à l'intersection avec l'abscisse. le poids frais PFf ainsi que la longueur moyenne Lf de chaque lot (légèrement essuyer les segments sur un papier sopalin).00 . 2 pour le NaCl . Exprimer alors ΨW en MPa et en Bar.6 -5. Rappels : 0 °C = 273.3 -2.60 0.00 0. les courbes correspondant au ∆L et au ∆PF. bécher 1 2 3 4 5 6 7 8 Ψs (bars) expérimentale Concentration Calcul Ψs (bars) finale (M) Solution idéale 0 -1. i = 1 pour le saccharose. On calculera alors : Pression osmotique d’une solution idéale (formule de Van t’Hoff) : Π =RT/V.10 0. CB = Concentration Molaire de la solution.Incuber vos lots de fragments de pomme de terre dans chacun des tubes.40 0. R = 8. à partir d'une solution stock (2M).log aw ≈ i x CB x R x T x 1000 en Pa (1 bar = 101325 Pa) 3.K .2 0.05 0. .20 0. le potentiel hydrique des tissus (ΨW = ΨS = -Π car ΨP = 0 au point d’intersection sur l’axe des abscisses).31 J/mol. Résultats Reporter sur un graphique.2 -11 -25. Mode opératoire . 3 . en fonction de la concentration molaire (M) du saccharose. Pour chacune des courbes. mesurer pour chacun des lots.2.

. .1. 500 tpm. pour lesquels le plasmalemme présente une perméabilité sélective. Les protoplastes permettent d'étudier un certain nombre de caractéristiques du plasmalemme (perméabilité. l'épiderme inférieur de 3-5 feuilles de mâche (Valerianella olitoria). Rincer le matériel après usage. il n'est stable que dans des conditions isotoniques (ou légèrement hypertoniques) et prend alors une forme sphérique.Envelopper la boîte de Pétri d'une feuille d'aluminium et incuber à 20-30°C durant 30 minutes sur un agitateur orbital (50-100 tpm) . pour éviter le dessèchement. . Purification .B) Quelques propriétés des protoplastes foliaires Le protoplaste est une cellule dont on a fait disparaître (mécaniquement ou enzymatiquement) la paroi. Nous nous bornerons ici à observer la pénétration de deux types de colorants.Peler délicatement.Filtrer la suspension de protoplastes à travers un filtre nylon (100 µ m).).. . Expliquer le rôle de ces divers composés. . 4 .Déposer les fragments de feuilles (face pelée vers le bas) à la surface de la solution d'incubation.Centrifuger 1.(Attention à ne pas renverser la boîte). 1. et découper le mésophylle en carrés de 1mm² environ. 1. Isolement des protoplastes 1. des pectinases et du sorbitol. En l'absence des potentiels hydrostatiques (pressions) normalement exercées par la paroi sur le contenu cellulaire. charges. à l'aide d'une brucelle à pointes fines.5 mL de la suspension de protoplastes (tubes eppendorf de 1.5 mL. . Incubation enzymatique .2. 5 min). contenant des cellulases.Pipeter dans une boîte de Pétri 2 ml d'une solution enzymatique déjà prête. Travailler sur un papier filtre humide. pour éliminer les restes de feuilles non digérées.

Conserver cette suspension de protoplastes dans son tube eppendorf et agiter doucement avant usage. et vérifier l’homogénéité de la répartition des cellules à compter (si la répartition est mauvaise.objet Quadrillage Le volume de comptage est déterminé par : -la surface du quadrillage gravé sur la lame. comportant des rigoles et un quadrillage : Plate-forme centrale Profondeur de la chambre Lamelle planée Plateaux surélevés Rigoles Lame porte . 2. .. Observation et comptage des protoplastes Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de comptage de volume connu. Régler le contraste et la lumière pour observer la grille et les protoplastes. -la profondeur de la chambre. Le culot de protoplastes sera suspendu en tapotant sur le tube. C’est une lame épaisse en verre. • Observer ensuite à l’objectif x40 ou à x60 pour réaliser le comptage (Voir instructions).01 mm3 = 10 nL Pour la Numération • Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage. • Compter les cellules contenues dans 4. on trouve 25 rectangles qui sont divisés en 20 petits carrés afin de faciliter le comptage. 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du quadrillage. Parmi les 100 rectangles totaux. soit 0. → Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm3 = 1 µL → Chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible. recommencer).Eliminer le surnageant et laisser 100-150 µ L de solution. Ne surtout pas vortexer. 10. 5 .

3.Prélever une goutte de suspension de protoplastes (env. d'obtenir. C) Observations microscopiques Les lambeaux épidermiques. Observer en temps réel les phénomènes physiques sur les protoplastes.. sur la base d'observations microscopiques. des colorants suivants : I : Rouge neutre 0. Numération sur le rectangle = 7 protoplastes . Estimer le nombre de protoplastes isolés et leur concentration (protoplastes/mL). le nombre de protoplasmes colorés (A compter sur 20 protoplastes sans a priori). 20µL) et la déposer sur la gouttière centrale de la cellule de comptage (Malassez. .Pipeter délicatement 20 µ L de la suspension de protoplastes. compter seulement celles qui chevauchent 2 arêtes du rectangle sur 4 (en pratique. II : Phénosafranine 0. à un grossissement final de 400x-600x. et. . Les vacuoles de ces tissus occupent la presque totalité de l'espace cellulaire. Dessiner une cellule de protoplaste et déterminez la position des chloroplastes. Commenter les résultats. Perméabilité sélective . des informations sur le potentiel hydrique cellulaire. 6 .Ajouter sur les lames 1 et 2. en plongeant ces lambeaux dans des solutions de potentiel osmotique variable. . Il est ainsi possible. d'étudier les échanges d'eau entre les cellules et le milieu extérieur. et la ligne verticale droite). les détails morphologiques des protoplastes. 20µL. permettent une observation microscopique aisée des cellules qui les composent. NE PAS LAISSER SECHER ! Pour les deux essais.Observer alors.1 % v/v en solution TL. des vacuoles etc.1 % v/v en solution TL. respectivement.Recouvrir d’une lamelle et après 2 min. 20µL d'eau ou de sorbitol à 15% (Réalisez deux expériences). déterminer. voir explication). . observez au microscope.Ajouter alors sur les bords d’une lamelle. on choisit de prendre en compte les cellules chevauchant la ligne horizontale supérieure.. constitués d'une assise cellulaire unique.Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage.

Mode opératoire .. . noter la concentration C. observez entre lame et lamelle au microscope.1. En travaillant chaque fois avec un lambeau frais. puis cherchez les points encadrant l’isotonie.Placer le lambeau (face déchirée vers le bas) entre lame et lamelle dans 1 mL d’une solution de sorbitol (6 tubes). 6. Evaluation du potentiel hydrique cellulaire A l'isotonie.Détacher avec une paire de brucelles à pointes fines. Ajouter 20µL de Vert de Méthyle et 20µL de Rouge Neutre dans chaque tube eppendorf. 7 . le fragment épidermique ainsi délimité en le saisissant par un des coins. 2. On utilisera des solutions de sorbitol (substance qui ne pénètre pas ou peu dans les cellules) à différentes concentrations (0 . le potentiel hydrique de la cellule est égal au potentiel osmotique du milieu extérieur.Dessinez les points extrêmes de turgescence et de plasmolyse. 2. Observez la cellule et ses différents compartiments puis évaluez le potentiel hydrique cellulaire. . Déterminer la concentration molaire de sorbitol qui se rapproche le plus de l'isotonie et déduire le potentiel hydrique cellulaire. un carré de 3 mm de côté environ.Inciser délicatement. dans l'épiderme intérieur d'une écaille d'un bulbe d'oignon. 10 et 15 %). pour laquelle il y a une légère plasmolyse. Choisir au microscope une zone facilement observable. . à l'aide d'un scalpel. . 8 .Après 5 min.

Annexes : 8 .

puis procédez aux colorations de ces coupes. Placer suffisamment de liquide de montage sur la lame pour que toute la coupe soit immergée. mais pas vraiment pour protéger un tissu pendant l'inclusion. les surfaces optiques du microscope. 3. caulinaire et du processus d’ouverture stomatique (TP2) Exécution et montage des coupes anatomiques 1. Ne monter que 2 à 3 coupes sur une lame en choisissant de préférence les fragments de coupes les moins colorés .Etude de la structure racinaire. Procédez aux colorations des coupes des échantillons végétaux. Gardez une dizaine de coupe de chaque échantillon de tige ou de racine. Les transferts d’un milieu vers un autre se font à l’aide d’un tamis après chaque temps de traitement. 9 . en particulier l'oculaire. L'agar sert pour les coupes au vibratome (Labonord 100 plus). 2. Ne pas appuyer sur la lamelle pour chasser d'éventuelles bulles d'air : la préparation serait irrémédiablement inutilisable. 1) eau de javel: 15 min 2) rinçage abondant à l’eau 3) lavage rapide à l’acide acétique : 1-2 min 4) rinçage sommaire à l’eau Résultat Les tissus cellulosiques apparaissent en rouge. Exécution Les échantillons de plante sont au préalable coupé et inclus dans de l’agar à 4 %. ce sont en principe les plus minces. soient essuyées avec un papier Kim Wipes (risque de rayures). Il est indispensable que lames et lamelles soient propres et sèches et que. par ailleurs. les tissus lignifiés et subérifiés apparaissent en vert – ( Attention les colorations présentées en cours peuvent être différentes). Placer doucement la lamelle sur la préparation en vous aidant d'une aiguille montée. Montage 5) Coloration au rouge Congo: 10 min 6) Rinçage sommaire 7) Coloration au Vert d'iode: 5 min 8) Rinçage soigneux et montage sur lame. Coloration Respecter les indications de temps de traitement et de rinçage suivants : Prendre une plaque multi-puits et ajoutez un volume de 5mL de chaque solution de coloration ou d’eau distillée.

Dessin général Représenter le contour exact d'un quart de coupe (pas de compas: une coupe n’est jamais parfaitement ronde) et les limites exactes des différents tissus en veillant particulièrement aux proportions relatives. brèves mais précises et complètes. ajouter de l'eau en présentant à l’aide des comptes gouttes au bord de la lamelle. réguliers. etc. contours irréguliers d'une lacune. le sens de la coupe. Les particularités de votre échantillon doivent être représentées : nombre exact de faisceaux conducteurs. par exemple). 10 . Le titre comprend le nom complet de la plante (genre..Si besoin. sans la soulever (l'eau pénètre par capillarité). Utiliser un tiré pour montrer l'arrêt "arbitraire" de la coupe. II. le grossissement. traits de rappel à la règle. éliminer les excès d'eau avec un mouchoir de papier. CONSEILS POUR LE DESSIN 1.. Respecter les proportions relatives des différentes parties. A RENDRE pour le TP2. d'un cambium. etc. sauf les très gros vaisseaux de métaxylème. Ne pas représenter de cellules. Généralités Dessiner grand (2/3 d’une page). Utiliser les représentations conventionnelles des différents tissus (voir page suivante). 2.Pour le compte rendu. continus (crayon HB). espèce et autres indications taxonomiques en Latin). caractéristiques des Monocotylées (voir planche I). de l'organe ou du détail représenté.Présenter le principe expérimental et rendre un tableau synthétique présentant les analogies et les différences entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction d’un organe végétal. Faire des traits fins. position précise d'un canal ou d'une fibre isolée. Légendes: placées assez loin. ou au contraire. 2. rendre une feuille A4 présentant les deux dessins schématiques d’une structure racinaire et d’une structure caulinaire. nets. partie n° : 1 1.. écrites lisiblement et horizontalement. se terminant dans le dessin par un point ou une flèche et ne se croisant pas. l'échelle du dessin étant choisie en fonction des plus petits détails à reproduire (Endoderme ou pôles vasculaires.

lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Bois hétéroxylé (Eudicotylédones lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Cambium et phellogène (assise génératrice) Parenchymes (préciser le type) Collenchyme Sclérenchyme (quadrillage fin à 45°) Parenchymes sclérifiés (quadrillage lâche à 45°) 11 . phelloderme (ici une assise) Rhizoderme (Représentation non schématique des poils absorbants) Endoderme en 'U' (Dessin non schématique) (Monocotylées) Endoderme à cadre de Caspary (Dessin non schématique) (Eudicotylédones) Xylème primaire ou protoxylème (A noircir) Métaxylème avec gros vaisseaux des Monocotylées (dessiner la forme exacte des vaisseaux) Bois homoxylé (Gymnospermes . périderme.SYMBOLES UTILISES POUR UN SCHEMA ANATOMIQUE (TP 2) Épiderme cutinisé Phloème (points non alignés) Suber (quadrillage à 90° . péricycle.ici 3 couches) Liber (points alignés en lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Exoderme. hypoderme.

face inférieure sur une lamelle de verre avec de l’adhésif silicone de type Hollister N°7730 (Medical adhesive) connu pour ne pas endommager les cellules. Danger très important de fixation tissulaire (peau-organe). pH ajusté à 6. Chaque couche épidermique est collée. KOH 30 mM. Traitement lumineux en présence d’acide abscissique à 1µM de concentration finale.ETUDE DES PROCESSUS REGULANT L’OUVERTURE STOMATIQUE (TP2 SUITE) Epidermes isolés Les études sur épidermes isolés sont réalisées sur des feuilles de plants âgés de trois à quatre semaines (Arabidopsis thaliana. Vicia faba). MES 10 mM. Ouverture stomatique Les lamelles portant les épidermes végétaux seront soumises à quatre types de traitement : Traitement lumineux d’une heure sous lampe à lumière froide. A l’aide d’une pince. Traitement obscurité en présence de fusiccocine à 5 µM de concentration finale. 12 .5 avec de l’acide iminodiacétique. Valerianella olitoria. avant l’ajout de molécules pharmacologiques à tester. Traitement obscurité d’une heure supplémentaire (Absence de lumière). Puis les boîtes sont placées à l’obscurité (sous papier aluminium) à température ambiante pendant quinze minutes. Après 1h de traitement. Commelina communis. les épidermes montés sur une lame et sont observés au microscope. Les jeunes feuilles sont prélevées avant l’éclairement du phytotron (les stomates sont fermés). Les lamelles sont ensuite déposées dans des petites boîtes de Pétri contenant 3 ml de milieu tampon : KCl 10 mM. afin de normaliser les valeurs d’ouverture stomatique entre les différentes expériences. on pelle la face inférieure de la feuille de façon à détacher la couche épidermique.

Excès ou défaut de lumière sont également nuisibles à une bonne observation. l’ouverture moyenne de 20 stomates sera calculée ainsi que l’écart à la moyenne ( = Ecart type/racine (n-1)) – Fournir le tableau de valeur avec le compte rendu. vous êtes capables de mesurer la taille des cellules végétales en µm grâce à votre calibration. puis utiliser le grossissement moyen pour reconnaître les différents tissus et les zones où la coupe est la meilleure.Rendre un tableau synthétique présentant les valeurs d’ouvertures des ostioles pour chaque condition expérimentale et donner les évaluations statistiques. 4. Passer au fort grossissement (10x 60) puis régler l'intensité lumineuse en agissant sur le rhéostat de l'éclairage.Observation Observer d'abord au faible grossissement du microscope pour centrer la coupe.Pour le compte rendu. A RENDRE pour le TP2 partie n° : 2 3. Utiliser l’oculaire équipé d’une graduation et comparer vos observations avec la lame de calibration gravée au centième de mm. présenter après une courte introduction. les objectifs du TP. l’Interprétation des observations chez Vicia faba et Commelina communis. 13 . Compter le nombre de lignes (X pour l’occulaire et Y pour la lame de calibration). puis finir par une conclusion. exprimée en micromètre sera mesurée sous microscope photonique (grossissement 10x60). représentative de l’ouverture stomatique. Pour chaque traitement. Mettre le microscope en position de calibration de facon à faire correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. le condenseur de lumière et le diaphragme. Calculer la distance entre chaques lignes au niveau de l’occulaire avec l’équation suivante : Mesure entre 2 lignes = Y/X x 10 µm Maintenant. La largeur de l’ostiole. Vous pouvez effectuer un comptage exhaustif des stomates ouvert ou fermés suivant les conditions expérimentales.

16 . la glutamine. La glutamine est formé à partir de l’acide glutamique par action de la glutamine synthétase: NH4 + acide glutamique + ATP Mg2+ glutamine + ADP + Pi La glutamine synthétase est une enzyme de structure complexe. 11.).-----------------------------------------------------------------------Exemple de calcul de l'écart-type : Voici quatre séries de 5 valeurs: • • • • Condition A : 10 . on calcule un paramètre appelé écart type (σ) σA= Exemple de calcul : TP3 : ETUDE DE LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET DE LA GLUTAMATE SYNTHASE DES RACINES DE MAIS I . 12 .. 12 . 8 Condition B : 12 . glutamique + ATP + NH2OH Mg2+ γ . L’une de ces dernières. 10 ..glutamyl hydroxamate + ADP + Pi 14 . . est le précurseur ou le donneur du groupe aminé de nombreux produits du métabolisme (tryptophane. Que constatez-vous ? Quel est la variabilité des valeurs dans chacune de ces conditions ? Pour les distinguer. AMP. amide de l’acide glutamique. CTP. 12 . histidine. 12 . isolée chez les procaryotes et les eucaryotes. 12 Condition C : 12 . dont le poids moléculaire varie selon les espèces de 500 à 600 KkDa.Principe L’ammoniac (NH3) qui résulte de la réduction des nitrates ou de celle de l’azote atmosphérique est immédiatement incorporé sous forme d’aminoacides ou d’amides. 12 Condition D : 7 .glutamyl hydroxamate: Ac. 13 . 13 Calculer la moyenne de ces quatre conditions. 14 . 17 . 13 . Elle peut également catalyser la formation de γ . 12 .

III . Rajouter dans chaque tube 0.2 . 15 .Acide trichloracétique à 25% (1 vol.15 .Introduire dans 7 tubes à essais: 0 . . Les racines (10 g) sont broyées dans un mortier en présence de 15 mL de tampon Tris-HC1 (50 mM) pH 7. Après élimination du culot.) (en préparer 12 ml) Lire les densités optiques à 540 nm après 10 minutes.) .) -HCl 6N (l vol.6 ml avec du tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7. elle permet le transfert d’un groupement NH2 de la fonction amide de la glutamine vers l’acide 2-oxoglutarique pour former deux molécules de glutamate. les hydroxamates forment en effet des complexes fortement colorés avec les ions ferriques.4 mL du réactif composé de : .4 contenant de 1’EDTA (10 mM). La glutamate synthase (glutamine : 2-oxoglutarate aminotransférase = GOGAT) catalyse la seconde étape de l’assimilation de l’azote ammoniacal .FeC1 6H à 10% dans HC1 0.0. Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H+ 2 glutamate + NAD+ Nous nous intéresserons donc au cours de ce TP à la glutamate synthase NADH-dépendante.4.0. la suspension obtenue est centrifugée à 14000 rpm pendant 30 minutes.Préparation de l’extrait enzymatique Les grains de maïs sont mis à germer pendant 72 h à 26°C en présence de (NH4)2SO4 10 mM) et de KNO3 (10 mM).Activité de la glutamine synthétase 1 / Réalisation de la courbe étalon La courbe étalon sera effectuée à l’aide de différentes concentrations de γ -glutamyl hydroxamate. du MgC12 (10 mM) et du DTT (10 mM).4 mL d’une solution de γ -glutamyl hydroxamate 5 mM.0.3 et 0. . Après filtration sur étamine. II .25 .Compléter à 1.2 N (1 vol. le surnageant obtenu servira à déterminer l’activité enzymatique étudiée.1 .C’est la présence de ce composé qui sera recherchée dans des mélanges réactionnels comprenant la glutamine synthétase extraite de racines de maïs.0.0.

0. 100. . à 340 nm.6 mL 0 mL 0.5 ml de tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7.6 renfermant 10 mM de DTT 2-oxoglutarate 10 mM NADH 1 mM 1.3 mL 0.7 mL 0. à 340 nm correspondant à l’oxydation du NADH. mélanger: .0.5 M) . pH8. 1 / Réalisation de la courbe étalon A partir de la solution de NADH 1 mM. Lire directement les D.1 ml de NH2OH (1 vol.4 ml du réactif décrit au III-A.2 ml de Na-glutamate (0.O. .4 mL 16 .2 ml d’ATP (30 mM) -0.2 mL 0. .0. à 540 nm.O.4 mL 3 1. . 150 et 200 tM (Vf= 2.1 ml de MgSO4 (0. Ajouter alors 0. préparer les solutions : 25. de NH2OH-HCl N + 1 vol. 2 / Détermination de l’activité enzymatique La préparation des mélanges réactionnels 1.5 ml d’extrait enzymatique .Incuber 5 minutes à 25°C. IV .3 M) .4 .O.Incuber 15 minutes à 25°C puis arrêter la réaction avec 0. de NaOH N).Etude de la glutamate synthase La détermination de l’activité enzymatique sera effectuée en suivant au spectrophotomètre la diminution de D.Centrifuger les essais à 5000 rpm pendant 10 minutes et lire les D.Réaliser un essai témoin en remplaçant l’extrait enzymatique par du tampon. 2 et 3 s’effectuera directement dans une cuve de spectrophotomètre de la manière suivante : 1 Tampon HEPES-KOH 200mM.0.4 mL). 50.Exprimer les résultats en nmoles de γ-glutamyl hydroxamate formées par minute et par mg de protéine.2 mL 0 mL 2 1.2 / Détermination de l’activité enzymatique Dans un tube à hémolyse.

O. 20 et 50 fois. Incuber 5 minutes à température ambiante et mesurer les D. 1 / Préparation de la gamme étalon Préparation des solutions de BSA A partir d’une solution de protéine d’albumine sérique bovine (BSA) concentrée à 20 mg. Déterminer graphiquement la concentration en protéine de votre extrait enzymatique. préparer une solution fille à 2 mg/ mL-1 (V= 1 mL). à 340 nm toutes les 30 secondes pendant 5 minutes. Effectuer la même opération en remplaçant 2 par 3. obtenues à 595 nm en fonction de la concentration en BSA (µg.5 et 2 mg. Dosage au réactif de Bradford Mélanger 10 µL de chacune de vos solutions de BSA dans le réactif de Bradford dilué 5X dans H2O (Vf= 1 mL). Suivre la variation de D. V .Glutamine 100 mM Extrait enzymatique 0. Tracer le graphe des D. du mélange 2 par rapport au mélange 1.O.1 mL 0.0. Conclusions. 2 / Dosage de l’extrait enzymatique Réaliser un dosage au réactif de Bradford des protéines contenues dans votre extrait après l’avoir dilué 10. Chaque dilution fera l’objet de 2 mesures. à 595 nm en utilisant le tube 0 de la gamme comme 0 d’absorbance. aux protéines et de former ainsi un complexe qui absorbe à 595 nm.mL-1).1 mL 0. en milieu acide.mL-1.0. Le mode opératoire sera le même que celui utilisé pour la réalisation de la gamme étalon. Préparer ensuite à l’aide de cette solution fille 6 tubes contenant 200 µL de solution de BSA à 0 .4 mL 0 mL 0. mL-1.4 mL 0.Dosage des protéines par la méthode de Bradford Cette méthode repose sur la propriété du bleu de Coomassie à se lier.O. 17 .5 – 1 1.4 mL La réaction démarre par l’addition du NADH. Exprimer les résultats en nmoles de NADH oxydé par min et par mg de protéine.25 .

Faire des solutions de sorbitol à 1.2 g de Pectinase Fluka (17389) Rouge Neutre et Safranin O : Diluer à 0. Mâche (2 paquets) et 2 sacs d’oignons blancs. 10 et 15 % w/v .30g de sucre Sera dilué. en TP de 0.8 M Tampon MES pH6. acidifiée à l'acide acétique : Eau bidistillée : Vert de méthyle : acide acétique glacial Laisser durant 1 heure sur l'agitateur magnétique.1 g de Cellulase Sigma (C-8546) 0.5 mL. Préparation d’une solution de Vert de méthyle (100mL) en solution aqueuse.MW 342.30 Faire 2L : Pour 500 mL à 2M 342.1 à 0. cultures et installation des Salles : (Version 2011) TP 1 . et ensuite filtrer ! 100 ml 5g 1 cc 18 .1 % w/v en solution TL sans enzymes (10mg pour 10mL) Aliquoter en 7x4 eppendorf de 1. 5.50mL de chaque Faire des fractions aliquotes pour 7x4 eppendorf de 1.15 0.15 100mM (100mL) Peser 1.5 mL.Préparation des Solutions et matériels.préparation des solutions : Achat à Carrefour de Pomme de Terre (20kg).952 g de MES dans 90mL d’eau Ajouter qqs gouttes de NaOH 10N Ajuster à 100 mL Solution TL : (Préparation en TP) 10% Sorbitol Tampon MES pH 6.2 anhydre Faire 250 mL d’une solution à 15% w/v de Sorbitol (15g/L) puis.05 M Ajouter extemporanément (en cours de TP): 50 % de sorbitol 20% 50 % de MES 100 mM 0. diluer. Solution de Sucrose : Solution stock de sucrose à 2M . 14-18/Mars/2011 Solution de Sorbitol : MW 182.

3. Medicago sativa – 2 pots vermiculite x 12 binômes Solutions à 5 µM fusicoccine et 1 µM ABA.7 pots x12 binômes = 84 pots. (Risque toxicité).Attention. Préparation des Solutions tampons : (2000 mL) KCl 10 mM.Acide Acétique à 1% à partir d'acide acétique Glacial 4. 1.Préparation des solutions : 7-11/Mars/2011 . La préparation des solutions se fait dans EtOH 100% et le stockage à -20°C.5 avec de l’acide iminodiacétique. MES 10 mM.100 mL 1 couteau court 1 pince 1 scalpel 1 pissette d’eau 500 mL 1 compte goutte d’eau distillée 1 pipetteman de 200µL 1 pipetteman de 1000 µL 19 . 5%.Solution d'eau de javel à 12° Remplir les comptes gouttes avec les diverses solutions et de l'eau distillée (Faire les étiquettes si nécessaire). Préparation des solutions de coloration : Dilution dans 1000 mL d’eau distillée des solutions de coloration. Installation de la salle pour le TP1: 14 postes avec : 1 vortex pour 2 binômes 1 microscope pour chaque binôme 1 cellule de Malassez pour chaque binôme + lamelle 4 Lames de microscope +lamelles 1 portoir orange pour tube falcon de 50mL 6 tubes falcon vide + 1 tube de saccharose 2M 1 portoir eppendorf avec : 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%.Vert d'iode à 2/1000 2. pH ajusté à 6. lancer les cultures pour le matériel biologique en avance (4semaines) : Vicia faba . KOH 30 mM.5 mL vide + 1 tube de 2 mL 1 portoir de pipette avec : 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL 1 propipette 1 éprouvette graduée de 50 mL . Préparation bouteille Agar à 4% dans de l’eau (4x 100mL).Rouge Congo à 2/1000 (Risque toxicité) A changer pour Carmin ou Phloroglucinol. 10% et 15 % 2 tubes eppendorf de 1.TP 2 .

5 mL vide + 1 tube de 2 mL 1 portoir de pipette avec : 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL 1 propipette 1 pince 1 scalpel 1 pissette d’eau 500 mL 1 compte goutte de Javel. 5%. Vert d’iode et Rouge congo 1 pipetteman de 10-20µL 1 pipetteman de 200µL 1 pipetteman de 1000 µL 1 lot de cône bleu 1 lot de cône jaune 1 sopalin 1Poubelle de Table 2 Supports nylon pour les coupes 2 Plaques 8 puits 1 marqueur 20 . Acide acétique. 10% et 15 % 2 tubes eppendorfs de 1.1 lot de cône bleu 1 lot de cône jaune 1 sopalin 1 Poubelle de Table Installation de la salle pour le TP2: Installer la table orbitale et le Vibratome Installer les lampes LED/Fluocompacte pour l’éclairage 7 postes avec : 1 lame de calibration 100µm 1 microscope pour chaque binôme 1 vortex par binômes 4 Lames de microscope +lamelles 1 portoir orange pour tube falcon de 50mL (Solution pour Stomate) 1 portoir eppendorf avec : 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%.

5kU 25g Produit D-Sorbitol Iminodiacetic acid Carmine MES Pectinase Pectinase Pectinase solution Cellulase Phloroglucinol Référence S1876-1kg 220000 C1022-25g M3671-50g 17389 17389 P4716-5kU 2* C8546-2. Réticule Leica gradué : Inventaire des solutions 01/2010 : Quantité 1kg 500g 25g 5g 10g 50g 5kU 2.5kU P3502-25g Marque Sigma Aldrich Sigma Sigma Fluka Fluka Sigma Sigma Sigma 21 .Les microscopes LEICA doivent être équipés d’objectif gradué.

01 g/l A conserver à RT (à préparer et à conserver au laboratoire INRA) 5 jours avant le TP Des grains de maïs sont mis à germer dans des containers en plastique (à l’INRA) sur 2 épaisseurs de sopalin imbibé de milieu de germination.6 + DTT 10 mM A conserver à 4° – ajuster le pH avec KOH C • Solutions à préparer et à aliquoter pour chaque binôme Nbr binôme * Bouteille 100 ml H2O milliQ ou aliquoter tubes 50ml A conserver à RT - Tampon de broyage Préparer 500 ml .32 g/l KNO3 (10 mM) 1. • Solutions communes pour tous les étudiants Réactif de Bradford A conserver à 4° C Solution mère commune à tous les binômes HCl 0. La germination a lieu pendant 4 à 5 jours à l’étuve à 22° C.86 g pour 500 ml - DTT 10 mM Préparer 500 ml .aliquoter en tubes 50 ml C 22 .à conserver à RT Peser 770 mg pour 500 ml - Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.2N A conserver à RT NaOH 1N A conserver à RT EDTA 10 mM A conserver à RT Peser 1.à conserver à 4° .Solutions et matériels à préparer pour le TP3 "Etude de la glutamine synthétase (GS) et de la glutamate synthase (GOGAT) des racines de maïs" version 2010-2011 ● Matériel végétal commun pour tous les étudiants 2 L Milieu de germination des grains de maïs (NH4)2SO4 (10 mM) 1.

ajuster le pH avec HCl .6 + DTT - - - - Glutamine (100mM) Préparer 20 ml .A conserver à -20° .A conserver à RT.5 ml Peser 33.4 Préparer 1 l .5 ml C Peser 2.06 3.771 Tampon Tris-HCl 25mM (3.5 ml C Peser 180 mg pour 10 ml MgSO4 (0.5 M) Préparer 20 ml .12 g pour 20 ml - ATP (30 mM) Préparer 10 ml .46 g pour 20 ml NH2OH (hydroxylamine) Préparer 20 ml .2N Préparer 50 ml .Aliquoter en tubes de 1.Produit Tris –HCl EDTA MgCl2 6H2O DTT - PM 121.Aliquoter en t ubes de 1.015 0.025 1.Aliquoter en tubes 15 ml Peser 5 g pour 50 ml de HCl 0.Aliquoter en tubes de 15 ml Diluer 2 fois la solution commerciale 12 N : 25 ml solution HCl commerciale 12 N + 25 ml H2O - Na-glutamate (0.03 1.A conserver à 4°C .2N - Acide trichloroacétique 25 % Préparer 50 ml .1 372.Aliquoter en t ubes de 2 ml Peser 200 mg pour 20 ml • Solutions à préparer extemporanément = au début de la séance 23 .A conserver à 4°C .A conserver à RT .5 ml Peser 695 mg pour 10 ml H2O + 10 ml NaOH 1N (à prendre au labo symbiose) 2-oxoglutarate (10 mM) = α-cétoglutarate Préparer 20 ml .03 g/L) pH=7.Aliquoter en t ubes de 1.5 g pour 50 ml - HCl 6N Préparer 50 ml .6 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.72 2.A conserver à 4°C .862 1.A conserver à -20° .A conserver à 4°C .5 ml Peser 1.Aliquoter en t ubes de 1.6 + DTT (à prendre au labo symbiose) - BSA (20 mg/ml) Préparer 20 ml .Aliquoter en tubes de 15 ml Peser 12.Aliquoter en tubes de 1.5 ml Peser 293 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.3 154.3 M) Préparer 20 ml .Aliquoter en tubes de 1.aliquoter en tubes 50 ml - FeCl3 6H 10% dans HCl 0.2 203.A conserver à RT .A conserver à 4°C .à conserver à RT .54 A peser (g) pour 500mL 3.3 C finale (mM) 50 10 10 10 pH pH=7.4 C finale (g/L) 6.

5ml 24 .Aliquoter en tubes C de 1.A conserver à -20° .Aliquoter en tubes de 2 ml Peser 8.A préparer extemporanément .- NADH (1 mM) Préparer 10 ml .1 mg pour 10 ml de Tris HCl 25 mM pH= 7.5 ml Peser 7.A préparer extemporanément .5ml 8 tubes eppendorf 2ml 1 portoir à falcon 50 ml + 1 portoir à falcon 15 ml 1 tube falcon 15ml 1 bac à glace 1 poubelle de paillasse 1 pipette en verre de 2ml + 1 pipette en verre de 5ml + 1 pipette en verre de 10 ml+ 1 poire + portoir (salle SN 0-4) 1 pissette H2O 7 cuves spectro 3ml + 4 cuves spectro 1.4 Installation Salle TP 3 : • Matériels commun 1 centrifugeuse sigma 2K15 + rotor 12139 (salle SN II-4) 1 (ou 2.A conserver dans la glace pendant la manip .5 mg pour 10 ml - γ-glutamyl hydroxamate (5mM) Préparer 10 ml . si possible) balance + papier alu 1 bain marie à 25°C + portoir pour tubes corning (13*100mm) 1 centrifugeuse de paillasse pou eppendorf 2ml pour 2 binômes : 1 spectrophotomètre multipasseur blanc parafilm des gants S/M/L • Matériels à installer sur la paillasse pour chaque binôme Quantité*Nbre binômes 1 mortier et 1 pilon (placard à côté sorbonne SN 0-4) à conserver au froid avant le début de la manip 1 entonnoir (SN 0-4) 1 étamine=gaze pour filtrer l’extrait enzymatique (entrée placard SN 0-4) 1 couteau ou scalpel 1 tube spécial centri (environ 30 ml avec bouchon vissé) pour la centri sigma et pour le rotor 12139 (Tiroir salle de prep 524) portoir tubes corning 14 tubes corning (13*100mm) en verre 1 spatule 1 vortex (tiroir SN II-4) 1 chronomètre (tiroir SN II-4) Des cônes jaunes 200µl + 1 pipetman P200 Des cônes bleus 1000µl + 1 pipetman P1000 1 portoir eppendorf 1.

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