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Informe Técnico: La Fermentación Maloláctica

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Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación Bodegas Codorníu Bodegas Julián Chivite Bodegas La Rioja Alta, S.A. Bodegas Vega Sicilia Vinos de los Herederos del Marqués de Riscal

INFORME TÉCNICO Fermentación maloláctica (FML) Edita FUNDACIÓN PARA LA CULTURA DEL VINO Plaza del Perú, 1.- Esc. Izda. 1ºA Tel.: 91 343 07 08 - Fax: 91 343 07 09 fundacion@culturadelvino.org www.culturadelvino.org Presidente: Magín Raventós Vicepresidente: Guillermo de Aranzábal Gerente: Emilio Castro Medina Todos los derechos reservados: © Fundación para la Cultura del Vino Traducción: Teresa Sans Morales Diseño: Unaluna Publicidad Madrid 2006

Fermentación

Maloláctica

Índice

7 31 53
53 55 59 69 77 7 9 19 23 31 33 41 47

I. Introducción a la fermentación maloláctica (FML): las bacteria lácticas y su mecanismo. 1. Historia de la bacteria maloláctica en el vino 2. La práctica de la fermentación maloláctica 3. Bacterias lácticas y fermentación maloláctica II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica 1. Necesidades nutricionales 2. Factores medioambientales 3. Guía para resolver problemas -aplicación prácticaIII. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica 1. Estudios sobre la pérdida de color 2. Percepción del consumidor de defectos organolépticos del vino por una fermentación maloláctica sin control 3. Efectos de los contaminantes microbiológicos inducidos por la fermentación maloláctica descontrolada en el vino 4. Incidencia cualitativa de la siembra de bacteria en los vinos tintos IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica 1. Los tipos de vino y el momento óptimo para la inoculación. Cómo controlar el proceso. 2. Fermentación maloláctica en barrica. 3. Fermentación maloláctica: cuándo y cómo V. La Microoxigenación 1. Microoxigenación y fermentación maloláctica

85 125
85 87 97 117 125 127

I. Introducción a la fermentación maloláctica (FML): las bacterias lácticas y su mecanismo.
Índice

I

9 19 23
19 23

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I.1. Historia de la bacteria maloláctica en el vino
Sybille Krieger Lallemand

I.2. La práctica de la fermentación maloláctica
Didier Theodore Lallemand

I.3. Bacterias lácticas y fermentación maloláctica
Aline Lonvaud-Funel Faculte d´enologie. Universite Victor Segalen Bordeaux 2

H

I.1. Historia de la bacteria maloláctica en el vino

Dra. Sibylle KRIEGER
Lallemand
1.1 Taxonomía de las bacterias lácticas del vino 1.2 Ecología y desarrollo de las bacterias lácticas 1.3 Factores que influyen en la supervivencia y desarrollo de las bacterias lácticas en el vino 1.4 Influencia de la fermentación maloláctica en la composición del vino 1.5 Alteración del vino por las bacterias lácticas 1.6 Control de la fermentación maloláctica

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I.1. Historia de la bacteria maloláctica en el vino

n 1837, en su libro titulado “A Short Education on Suitable Treatments of Vinificated Juices,” 1 Freiherr von Babo describió el fenómeno de una “segunda” fermentación en los vinos jóvenes, que comenzaba con un incremento de las temperaturas al final de la primavera (normalmente cuando florecían las viñas). Esta “segunda” fermentación liberaba CO2 y originaba una turbidez renovada en los vinos nuevos. Von Babo relacionó esta actividad con la “fusión de la grasa” de la fermentación alcohólica. Recomendó un trasiego inmediato a una barrica nueva, con adición de SO2, clarificación y reducción de la temperatura, seguido de un segundo trasiego y estabilización con otra adición de SO2.

E

Durante los estudios sobre las alteraciones del vino que llevó a cabo en 1866, Louis Pasteur aisló las primeras bacterias del vino e inició sus “Études sur le vin”2. También se le puede atribuir la autoría de la opinión general de que todas las bacterias presentes en el vino son organismos perjudiciales. La reducción de ácidos observada en el vino se seguía relacionando con la precipitación del ácido tártrico, aunque en 1891, Hermann Müller-Thurgau3 ya había postulado que la reducción de ácidos podía ser resultante de la actividad bacteriana. Koch4 y Seiffert5 confirmaron su teoría en 1898 y 1901 respectivamente. En 1913, con su histórica investigación sobre la bacteria del ácido láctico (bacterias lácticas) en el vino6, Müller-Thurgau y Osterwalder, explicaron la degradación bacteriana del ácido málico en ácido láctico y CO2 mediante la fórmula:

C4H6O5 = C3H6O3 + CO2
Bautizaron el fenómeno con el nombre de “desacidificación biológica” o “fermentación maloláctica,” y atribuyeron la responsabilidad del mismo a la Bacterium gracile. En la década de 1950, la aplicación de nuevos métodos enzimáticos ayudó a explicar las reacciones enzimáticas que se producen durante la degradación del ácido málico7. La aplicación de métodos analíticos más perfeccionados por Radler8, Peynaud9, Beelman10 y Kunkee11 permitió comprender mejor las complejas demandas de nutrientes de las bacterias lácticas del vino, pues la degradación de ácido málico por sí sola sólo proporciona una ventaja energética menor a las cepas bacterianas12.

9

I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.

1.1 Taxonomía de las bacterias lácticas del vino
Desde estos primeros hallazgos, la investigación sobre las bacterias lácticas ha mejorado. Se ha revisado el nombre de Bacterium gracile, que hace tiempo se utilizaba a menudo como nombre del organismo que causaba la fermentación maloláctica. Los resultados alcanzados por Vaughn13 y Radler8 han demostrado que las bacterias lácticas presentes en el mosto de uva y en el vino pertenecen al género de Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y, más recientemente, Oenococcus14. Muchas bacterias lácticas distintas pasaban al mosto y al vino desde la superficie de las bayas, los vástagos, las hojas, el suelo y el material de bodega. No obstante, debido al medio sumamente selectivo que constituyen los diversos mostos y vinos, sólo unos pocos tipos de bacterias lácticas son capaces de desarrollarse en el vino15, 16, 17. La descripción general siguiente es válida para todas las bacterias lácticas del vino: • • • • Gram-positiva; No móvil y no esporulada; Anaerobios facultativos; Metabolismo quimioorganotrófico - Necesitan un medio rico y azúcares fermentables; • Temperatura óptima para su desarrollo comprendida entre 20° y 30°C.

Además de sus formas coccideas (redondas) o cilíndricas, el metabolismo homo o heterofermentativo del azúcar constituye un criterio decisivo para su clasificación. Las bacterias homofermentativas producen ácido láctico a partir de la glucosa y/o fructosa. Las bacterias lácticas heterofermentativas producen dióxido de carbono, etanol y ácido acético, así como ácido láctico, a partir de los mismos hidratos de carbono. Los lactobacilos pueden poseer ambos tipos de metabolismo de los hidratos de carbono, y se dividen en tres grupos: Grupo 1: Homofermentativos estrictos – Este grupo nunca se ha detectado en el vino. Grupo 2: Heterofermentativos facultativos – Una molécula de glucosa se convierte en dos moléculas de ácido láctico. Las pentosas fermentan en ácido láctico y ácido acético. Grupo 3: Heterofermentativos estrictos – Fermentan la glucosa en ácido láctico, ácido acético, etanol y CO2. Las pentosas fermentan en ácido acético y ácido láctico. En la tabla siguiente se resume el metabolismo de los hidratos de carbono de las bacterias lácticas corrientes en el mosto y el vino.

Tabla 1.
Metabolismo de hidratos de carbono de las bacterias lácticas
Grupo Fermentación Azucar Heterofermentativa facultativa Grupo 2 Lactobacilli (células forma ovalada) Heterofermentativa estricta Grupo 3 Especies

Lactobacillus casei Lactobacillus plantarum

Lactobacillus brevis Lactobacillus hilgardii

Homofermentativa Cocci (células redondas) Heterofermentativa

Pediococcus damnosus Pediococcus pentosaceus

Leuconostoc oenos Oenococcus oeni)

Esta clasificación está sujeta a modificaciones debido a los progresos de la identificación de nuevos aislamientos bacterianos a partir del vino, así como a los avances de las técnicas de biología molecular utilizadas para identificar los aislamientos. Por ejemplo, en 1995 Dicks et al.14 han demostrado que la Leuconostoc oenos se diferenciaba de otra especie de Leuconostoc no sólo por su crecimiento en medios ácidos, su necesidad de un factor de crecimiento de zumo de tomate y su esquema de fermentación de los hidratos de carbono, sino también por la
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hibridación ADN/ADN y por los análisis digitales de los esquemas proteínicos celulares solubles. Los estudios filogenéticos, en especial los que incluyen secuencias 16S y 23S ARNr, han permitido identificar un sublinaje diferenciado, Leuconostoc oenos, que es independiente y distinto de otras especies de Leuconostoc así como de otras bacterias lácticas en general. Este sublinaje es genotípicamente homogéneo y constituye un grupo diferenciado de Leuconostoc oenos. Por consiguiente, se le ha asignado un nuevo género llamado Oenococcus oeni.

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esta fase figuran Lactobacillus plantarum y Lactobacillus casei, y, en menor medida, Leuconostoc oenos [Oenococus oeni] y Pediococcus cerevisiae. Por lo general, estas especies no se multiplican, y desaparecen durante la fermentación alcohólica, aunque en contadas ocasiones (alto pH los vinos) se puede producir una ligera proliferación de algunas especies indeseables en su mayoría. La sensibilidad al etanol puede explicar este declive de la viabilidad celular. Después de un intervalo de estancamiento, cuya duración depende en buena medida de las propiedades del vino, las células supervivientes empiezan a multiplicarse y, una vez que han alcanzado la biomasa crítica, se inicia la degradación del ácido málico. La supervivencia de las bacterias malolácticas después de terminar la FML depende en buena medida de las condiciones del vino y del tratamiento aplicado al mismo. El aporte de dióxido de azufre induce una pérdida progresiva de viabilidad de estas bacterias, aunque también es muy importante el pH del vino. Con un pH bajo, las bacterias lácticas del vino mueren progresivamente, mientras que con un pH superior a 3.5, la población de bacterias lácticas puede seguir aumentando. No sólo la Oenococcus oeni, sino también bacterias perjudiciales para el vino, como Pediococcus y Lactobacillus se pueden multiplicar hasta alcanzar concentraciones de nada menos que de 106 a 108 CFU/mL, y por ende, deteriorar el vino. Así pues, en condiciones de pH elevado, se recomienda una estabilización temprana del vino.

1.2 Ecología y desarrollo de las bacterias lácticas
Como se ha mencionado más arriba, en las uvas18 se encuentran recuentos reducidos (inferiores a 100 células/g) de bacterias lácticas; en cambio, los recuentos de bacterias acéticas y de levaduras son mucho más altos. Las bacterias lácticas aparecen en las hojas y en los tallos de los racimos de la vid, y también se pueden encontrar en el material de bodega. Estudios realizados en varios países indican que la Oenococcus oeni es la especie predominante en la realización de la fermentación maloláctica en el vino, aunque la composición de las bacterias lácticas presentes en el mosto de uva al principio de la fermentación alcohólica está dominada por cepas de Lactobacillus. La Pediococcus se encuentra principalmente después de la fermentación maloláctica (FML) así como en los vinos con un pH más alto. Normalmente, los vinos con un pH inferior a 3.5 sólo contienen cepas de Oenococcus oeni, mientras que los vinos con un pH superior a 3.5 pueden contener diversas especies de Pediococcus así como cepas heterofermentativas de Lactobacillus. El estudio de Wibowo et al.17 identificó diversas fases de la de vinificación (Fig. 1) en las que pueden aparecer y desarrollarse distintas especies de bacterias lácticas. Textualmente, dice así, “Después de la trituración, por lo general los mostos contienen poblaciones de bacterias lácticas de 103 a 104 CFU/mL; entre las principales especies presentes en

Figura 1.
Ciclo de desarrollo de las bacterias lácticas en el vino durante la vinificación y crianza

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I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.

1.3 Factores que influyen en la supervivencia y desarrollo de las bacterias lácticas en el vino
Los factores que influyen en la supervivencia y multiplicación de las bacterias lácticas en el vino se pueden dividir en las tres categorías siguientes: • La composición física y química del vino; • Los factores asociados a la vinificación; • Las interacciones microbianas entre las bacterias lácticas y otros microorganismos presentes en el vino. Comentaremos detalladamente los factores específicos, pero por lo que se refiere a la composición del vino, el pH es uno de los parámetros más importantes en la determinación del comportamiento de las bacterias lácticas en el vino, y también ejerce una acción selectiva sobre las cepas de bacterias lácticas que estarán presentes en el mismo. El pH del vino contribuye a determinar qué especie bacteriana proliferará, su viabilidad y la tasa de crecimiento de las bacterias lácticas, la velocidad de degradación del ácido málico, y el comportamiento metabólico de las especies bacterianas. El pH crítico en el vino es 3.5, pues por debajo de ese umbral resulta más fácil controlar la microbiología del vino. Aunque es más difícil inducir la FML con un pH más bajo, sólo las especies de bacterias lácticas menos perjudiciales son capaces de desarrollarse y de llevar a cabo la FML a esos niveles de pH. El dióxido de azufre (SO2) inhibe fuertemente el desarrollo de las bacterias lácticas, si bien la sensibilidad de las bacterias lácticas al SO2 varía. El dióxido de azufre es más inhibitorio con un pH bajo. El crecimiento y la realización de la FML por bacterias lácticas se inhiben progresivamente a concentraciones de alcohol superiores al 6%, siendo el 14% (v/v) el límite superior tolerado por la mayor parte de las cepas. Las bacterias lácticas del vino son mesofílicas, y la temperatura óptima para su crecimiento está comprendida entre 15° y 30°C. Las temperaturas bajas inhiben fuertemente tanto la tasa de crecimiento bacteriano como la velocidad de la FML. Por lo que se refiere a las prácticas de vinificación, la clarificación del mosto y del vino puede eliminar gran parte de las bacterias lácticas y reducir asimismo la incidencia del desarrollo bacteriano y su efecto sobre la calidad del vino19. Durante la clarificación, se suprimen algunos nutrientes y partículas en suspensión que estimulan el desarrollo bacteriano. Se ha comunicado que los vinos elaborados por termovinificación son menos aptos a la fermentación maloláctica. El momento de la inoculación de las bacterias malolácticas (bacterias lácticas) también influye en la cinética de la FML. Por lo que se refiere a las interacciones con otros organismos del vino, los cultivos mixtos de microorganismos introducen la posibilidad de relaciones antagónicas y sinérgicas, aunque en algunos casos menores pueden carecer de efecto. En la vinifi12

cación, existe la posibilidad de una interacción de las bacterias lácticas con levaduras, hongos, bacterias acéticas y bacteriófagos, así como interacciones entre especies y cepas de BAL20. El efecto antagónico de la levadura se ha explicado por la competencia por los nutrientes y la producción de sustancias que inhiben el desarrollo bacteriano, como SO2 o ácidos grasos de cadena media. Por otra parte, la levadura puede ayudar al desarrollo de las bacterias lácticas en el vino y estimular la FML. Durante el contacto prolongado de las lías con el vino, el proceso de autolisis de la levadura libera vitaminas y aminoácidos en el vino. Esto induce un enriquecimiento en nutrientes, con la subsiguiente estimulación de la fermentación maloláctica. No obstante, Costello21 ha comunicado que el desarrollo de Pediococcus ssp se ve facilitado por la rápida muerte celular de Oenococcus oeni, y en condiciones de pH alto, el desarrollo temprano del Lactobacillus brevis inhibe completamente el desarrollo de Oenococcus oeni. Recientemente, Gerbaux31 ha demostrado que las condiciones del vino que estimulan la FML pueden ser capaces de inhibir el desarrollo de la levadura Brettanomyces tan perjudicial para el vino.

© Aaron Kohr - FOTOLIA

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hecho, combinado con los cambios de sabor positivos asociados al desarrollo de bacterias lácticas en el vino, hace de la FML un proceso deseable para casi todos los vinos tintos y para ciertos tipos de blancos. Ahora bien, el desarrollo de bacterias lácticas en el vino debe estar rigurosamente controlado para garantizar que se desarrollen bacterias lácticas deseables que no produzcan sabores desagradables ni compuestos que encierren peligro para la salud humana. En la mayor parte de los casos, es importante lograr que la FML concluya rápidamente, para ahorrar tiempo de proceso y conseguir una estabilidad temprana del vino. En ningún caso se debería confiar en las cepas indígenas de bacterias lácticas para realizar la FML. Aparte de producir ácido láctico como principal producto final del catabolismo del azúcar23, se sabe que las bacterias lácticas producen otros compuestos con incidencia aromática, entre ellos el acetaldehído, el ácido acético, el diacetilo, la acetoína, y el 2,3-butanodiol. El diacetilo, la acetoína y el 2,3-butanodiol son producto del consumo bacteriano de ácido cítrico, y tienen una incidencia considerable en el perfil aromático del vino. A bajas concentraciones, estos compuestos parecen aportar complejidad al aroma del vino. A concentraciones superiores a 5 mg/L, el diacetilo puede resultar dominante, y conferir al vino un claro sabor a mantequilla/avellana. Dependiendo del pH y de la oxidación-reducción potencial del vino, el ácido acético puede ser otro metabolito producido a partir de la degradación de ácido cítrico por bacterias lácticas. También se han comunicado mayores concentraciones de esteres volátiles, de etilactato, y graduaciones alcohólicas más altas en los vinos sometidos a la FML24. Henick-Kling25 ha descrito las contribuciones aromáticas de las cepas individuales de bacterias malolácticas.

1.4 Influencia de la fermentación maloláctica en la composición del vino
La FML no consiste en una mera descarboxilación del ácido málico en ácido láctico y CO2. Utilizando el vino como sustrato de crecimiento, las bacterias malolácticas eliminan algunos componentes del vino y producen otras a resultas de su metabolismo. La actividad metabólica de las bacterias lácticas no sólo influye en los componentes aromáticos del vino derivados del fruto y de la fermentación alcohólica22, sino que además confiere estabilidad biológica al producto final. Por norma general, se fomenta el desarrollo de bacterias lácticas cuando se necesita la FML para reducir la acidez del vino. La reducción de la acidez es beneficiosa para la calidad del vino elaborado en regiones vitícolas frías, porque las bayas presentan naturalmente altas concentraciones de ácidos orgánicos. Las preferencias actuales de los consumidores de todo el mundo se inclinan por los vinos afrutados de acidez moderada, lo cual conlleva que la reducción de los ácidos se ha convertido en un aspecto importante para la producción de vinos en los climas más fríos. Este

1.5 Alteración del vino por las bacterias lácticas
La FML no siempre es beneficiosa, y puede causar alteraciones indeseables en las propiedades organolépticas del vino. Como se ha mencionado más arriba, son varias las especies de bacterias lácticas que pueden realizar la FML. Cuando la FML se produce con un nivel de pH inferior 3.5, la suele inducir la bacteria Oenococcus oeni y es menos probable que genere olores indeseables, aunque algunas cepas indígenas tienen la capacidad de hacerlo. Los olores indeseables a mantequilla, leche, queso, metal y tierra, así como cantidades excesivas de ácido acético suelen ir asociados a fermentaciones malolácticas desarrolladas en vinos con un pH superior a 3.5 y realizadas por pediococci o lactobacilos. Las bacterias lácticas producen aminas biógenas mediante la descarboxilación de aminoácidos. Se cree que la histamina, derivada de la descarboxilación de la histidina, provoca una reacción en individuos sensibles si el vino tiene una concentración superior a 0.1 mg/L. Se considera que, de
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I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.

las diversas bacterias lácticas, Pediococcus sp. y Lactobacillus brevis son las que más histamina producen26. Estos dos géneros se suelen hallar en vinos con un pH superior a 3.5. Por consiguiente, la síntesis de aminas biógenas parece ser importante únicamente en los vinos con un pH elevado. Si sabe que hay presentes cepas bacterianas capaces de producir aminas biógenas, el productor de vino debe inocular un cultivo maloláctico iniciador seleccionado por su capacidad de sustituir a las bacterias lácticas indígenas. Las bacterias tienen una ligera capacidad de formar histaminas, y sólo durante su fase de crecimiento activo. No obstante, se ha demostrado26 que incluso una flora bacteriana no proliferante puede desarrollar cantidades considerables de histamina. Por lo tanto, se debe eliminar la población bacteriana de un vino mediante la adición de SO2 seguida de una clarificación nada más terminar la FML; esto es especialmente importante en los vinos con un pH alto. También se pueden producir alteraciones organolépticas indeseables a raíz del metabolismo de bacterias lácticas indígenas, como por ejemplo coloraciones parduscas, cambios de color y viscosidad.

1.6 Control de la fermentación maloláctica Impedir la FML:
Si no se desea la FML, hay que impedir el desarrollo de bacterias lácticas en el mosto y en el vino mediante la eliminación o desactivación de las bacterias presentes en dichos medios. Aunque en ocasiones puede resultar difícil inducir la FML, impedir el desarrollo de bacterias lácticas es igualmente difícil. Dependiendo del pH, la adición de 50-100 mg/L de SO2 debería destruir más del 90% de las bacterias viables presentes. El efecto del SO2 depende de la acidez del vino: el SO2 es más eficaz con los niveles de pH más bajos. Por consiguiente, en vinos con un alto pH, hay que considerar la utilización de una combinación de SO2 con lisozimas o la utilización de lisozimas solas. Para la inhibición de la FML se puede utilizar todos los factores contrarios a los empleados para favorecer su desarrollo. Por lo tanto, los parámetros que permiten inhibir la FML son los siguientes: • • • • Maceración mínima; pH bajo; Bajas temperaturas; Trasiego y clarificación precoz.

Inducción de la FML:
Los análisis químicos y sensoriales han demostrado que las bacterias lácticas influyen en la calidad del vino no sólo a través de la propia FML, sino también a través de otras actividades metabólicas. Si se desea la FML y la producción bacteriana de compuestos aromáticos, el productor de vino puede propiciar el crecimiento de bacterias lácticas manteniendo condicio14

nes favorables al desarrollo y la supervivencia de las bacterias, como temperaturas más cálidas, adición mínima o nula de SO2, y retraso del trasiego. También se puede llevar a cabo una inoculación cruzada con vinos que ya están experimentando la FML. No obstante, los métodos más eficaces y recomendables son o bien la inoculación en el vino de cepas de bacterias malolácticas preparadas en laboratorio o adquiridas en el comercio, o el paso del vino sobre bacterias malolácticas activas inmovilizadas. Las bacterias lácticas más recomendables para realizar la FML son las cepas de Oenococcus oeni, porque pueden crecer en vinos con pH bajo y pueden degradar el ácido málico sin producir sabores y olores indeseables ni metabolitos peligrosos. Además, no degradan los componentes del vino necesarios para la calidad y estabilidad del mismo, como son el ácido tartárico, el etanol o el glicerol19. El crecimiento de la Oenococcus oeni será lento en los vinos con un pH inferior a 3.1 y, dependiendo de otros factores inhibidoress del desarrollo así como de la densidad celular inicial, el inicio y la culminación de la FML se puede retrasar considerablemente. En las condiciones de crecimiento más elevadas, es decir con un alto pH, las especies Lactobacillus y Pediococcus pueden realizar la FML. La opinión de que dichas especies producen vinos menos aceptables que aquellos en los que se ha desarrollado la Oenococcus oeni está generalmente aceptada27. En algunos vinos, se puede provocar el fracaso de la FML por la inoculación de un vino que ya está experimentando la FML. Las principales desventajas de este planteamiento son que hay que disponer de un vino adecuado, y que las bacterias contenidas en el vino inóculo pueden no ser adecuadas para su desarrollo en el vino en donde se inoculan. Y lo que es más importante, no se conocen bien las características de dichas bacterias. El reconocimiento creciente de la influencia de la FML en la calidad del vino ha llevado a los productores de vino a buscar un mayor control sobre la intervención y el resultado de la FML. La inoculación de cultivos iniciadores definidos, cuidadosamente seleccionados en la naturaleza, reduce el potencial de alteración por otras bacterias lácticas y/o bacteriófagos, garantizando con ello el rápido inicio de la FML, un mayor control de la producción de compuestos aromáticos, sabores y olores en el vino28. Se han desarrollado cultivos iniciadores a base de

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fase de rehidratación consiste en conseguir una mejor distribución de las bacterias al añadirlas al vino. Las bacterias malolácticas se pueden inocular en las fases siguientes de la fermentación alcohólica: • • • • Simultáneamente a la inoculación de levadura; Durante la fermentación alcohólica; Hacia el final de la fermentación alcohólica; Después de la fermentación alcohólica.

diversas bacterias lácticas, y en su mayor parte se comercializan en forma liofilizada o congelada, aunque también se venden algunos cultivos líquidos. Estas cepas se han seleccionado a partir de la FML espontánea por su buena cinética fermentativa, sus resultados en condiciones restrictivas en el vino, y sus propiedades organolépticas deseables. Estas cepas toleran las difíciles condiciones de crecimiento y supervivencia imperantes en el vino y no producen metabolitos peligrosos. No producen compuestos aromáticos que puedan incidir negativamente en la calidad del vino, sino que, por el contrario, aportan contribuciones organolépticas positivas al sabor del vino. Hasta hace poco, la mayor parte de estos cultivos iniciadores requerían una fase de aclimatación o reactivación en condiciones controladas29. Normalmente, su reactivación se llevaba a cabo en mosto de uva sin SO2, que se diluía en una proporción de 1:1 con agua y/o vino. Se ajustaba el pH del mosto diluido a un nivel de 3.6 o superior, y se añadían nutrientes bacterianos a una concentración de 0.05% w/v. Por lo general, la reactivación llevaba al menos 24 horas, y se evitaba el choque térmico mediante el desarrollo de las células a una temperatura que no difiriera en más de 10°C de la temperatura del vino al que se iba a añadir el iniciador. Desde hace poco se comercializan asimismo cultivos iniciadores para la inoculación directa de las bacterias en el vino. Estos cultivos iniciadores se han preaclimatado durante su proceso de producción para que sobrevivan a su incorporación a un medio hostil en el vino sin que disminuya el recuento de células viables ni se produzca la subsiguiente pérdida de actividad maloláctica. Estas preparaciones de bacterias malolácticas se pueden añadir directamente al vino, o se pueden rehidratar en agua durante un breve periodo de tiempo antes de su adición al vino. El objeto de la

El mejor momento para la inoculación de bacterias lácticas sigue siendo objeto de discusión. En Burdeos (Francia) la opinión consiste en recomendar la inoculación de bacterias lácticas nada más terminar la fermentación alcohólica, para evitar el riesgo de producir ácido acético y D-ácido láctico, la llamada “piqûre lactique”(picado láctico)30. En ocasiones, la FML que se produce durante la fermentación alcohólica puede provocar una interrupción de la fermentación alcohólica. La investigación no ha confirmado unánimemente los resultados franceses referentes al desarrollo de una alta concentración de ácido acético, al antagonismo con la levadura o a la interrupción de la fermentación alcohólica que se han asociado al desarrollo precoz de bacterias lácticas. Se ha abogado por la inoculación de la levadura junto con bacterias lácticas porque se creía que las bacterias tenían más posibilidades de crecer y aclimatarse en ausencia de etanol. Para controlar con éxito el proceso de vinificación, es importante comprender los mecanismos reguladores que rigen el desarrollo y el metabolismo de las bacterias malolácticas en el vino. Es importante seleccionar la cepa más adecuada, elegir el momento más favorable para la inoculación, garantizar que la cepa de bacterias lácticas correcta domine la FML y que la FML culmine en un plazo de tiempo predecible (Fig. 2).

Figura 2.
FML controlada

15

I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.

Referencias
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Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica
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I.2. La práctica de la fermentación maloláctica

Didier THEODORE
Lallemand
2.1 Gestión de la fermentación maloláctica en bodega 2.2 Determinación del momento de la inoculación 2.3 Problemas potenciales 2.4 Procedimientos analíticos

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Fermentación Maloláctica

I.2. La práctica de la fermentación maloláctica

enococcus oeni, es la bacteria láctica identificada como la especie responsable de llevar a cabo la fermentación maloláctica (FML) en el vino y de hacer importantes aportaciones a la mejora de la calidad de éste. Incluso en condiciones ideales, la FML presenta fastidiosas exigencias nutricionales, y se desarrolla muy lentamente. Por ello no resulta sorprendente que las condiciones desfavorables para su desarrollo que presenta el vino puedan hacer sumamente difícil que se inicie y complete la FML. Para que se inicie la FML, las poblaciones bacterianas deben alcanzar una concentración mínima de 106 CFU/mL, y las condiciones físicas del vino hacen difícil que se cumpla este requisito.

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2.1 Gestión de la fermentación maloláctica en bodega
Los factores más importantes que influyen en el desarrollo bacteriano en el vino son el alcohol, el SO2, la temperatura y el pH. Las bacterias empiezan a presentar signos de inhibición del desarrollo con una concentración de alcohol del 10% aproximadamente. La concentración de SO2 libre se debe mantener lo más baja posible, para evitar que inhiba aún más el desarrollo y la supervivencia de las bacterias lácticas. Las bacterias lácticas se multiplican a temperaturas comprendidas entre 18° y 20°C, pero su crecimiento se ve fuertemente restringido a temperaturas inferiores. Las bacterias se desarrollan en una horquilla de pH de 3 a 4, observándose un crecimiento más abundante con un pH de 4 que con un pH de 3. La FML se produce más fácilmente con un pH más alto que con un pH más bajo, si bien la presencia de un pH más alto puede favorecer el desarrollo de cepas de bacterias lácticas que pueden tener un fuerte impacto negativo en la calidad del vino. Es necesario relacionar el efecto de cada uno de estos parámetros en la FML con el de los parámetros restantes, pues no ejercen su influencia individualmente, sino que ésta depende de la suma de todos los factores. Por consiguiente, se puede estimar que el vino no es un medio conducente sin esfuerzo al desarrollo de microorganismos. Para superar las tensiones naturales del medio que es el vino, con objeto de garantizar el desarrollo de las bacterias lácticas y una FML completa en éste, se recomienda añadir un cultivo bacteriano iniciador. La bacteria Oenococcus oeni es el organismo de elección, y es preferible añadir una cantidad concentrada de dicho organismo. Cuando se añade dicho organismo en cantidades suficientemente importantes, éste se ve obligado a crecer y multiplicarse en las condiciones del vino, lo cual significa que la FML comenzará sin tener que esperar a que se desarrolle un número
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I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.

de células suficientemente importante. Existen cultivos comerciales de bacterias lácticas aptos para su inoculación en el vino. Estos cultivos están disponibles en estado líquido, congelado, o deshidratado por congelación. Algunos de los cultivos deshidratados por congelación han sido adaptados biofísicamente para resistir los rigores del medio del vino, y se pueden añadir directamente al vino sin necesidad de pasar por una fase de activación. Los demás tipos de cultivo iniciador requieren fases de activación y multiplicación previas a su introducción en el vino. Este proceso exige pasar por varias etapas planificadas, y conlleva mucho trabajo. Si se realiza correctamente, normalmente garantiza una FML completa, incluso en los vinos más difíciles, pues los cultivos lácticos iniciadores han sido seleccionados por su resistencia a las condiciones adversas del vino. Cuando se utilizan cultivos que se pueden inocular directamente en el vino, o que sólo requieren una fase de desarrollo, la intención es inocular una población bacteriana mínima de 106 CFU/mL sin depender del desarrollo de las bacterias lácticas del propio vino para alcanzar dicha concentración. La investigación ha permitido conocer mejor la nutrición bacteriana y la influencia del vino en el desarrollo de bacterias lácticas y la nutrición de las levaduras durante la fermentación alcohólica. Se ha demostrado que las levaduras con grandes necesidades nutricionales durante la fermentación alcohólica agotan rápidamente los factores de crecimiento del mosto necesarios para el desarrollo de la bacteria láctica justo cuando se desea la FML. El fenómeno se puede producir en todos los mostos de uva, pero resulta especialmente problemático en las uvas de varietales con un contenido de nutrientes naturalmente bajo. Esta investigación ha desembocado en la recomendación de añadir nutrientes bacterianos después de la fermentación alcohólica con objeto de ayudar a la iniciación y culminación de la FML. Es imprescindible garantizar una nutrición adecuada y suficiente de los hongos de fermentación así como de las bacterias lácticas.

La investigación ha demostrado que cuando se comprenden las interacciones entre la levadura de fermentación y la bacterias lácticas, la inoculación de un cultivo maloláctico iniciador en diversos momentos de la fermentación alcohólica puede dar buenos resultados. Ahora bien, dependiendo de los procesos de vinificación utilizados – microoxigenación, termovinificación o maceración prolongada – la FML se puede retrasar hasta el final de la fermentación alcohólica. En esos casos, los responsables pueden ser la adición de SO2, la clarificación del vino y los regímenes de refrigeración. En presencia de vinos con un elevado pH, puede resultar beneficioso una adición precoz de lisozima, una enzima específicamente dirigida a las bacterias Gram+. Si se controla estrictamente el momento del aporte, la adición ulterior del cultivo maloláctico iniciador deseado se puede llevar a cabo más tarde. La introducción de iniciadores de cultivo maloláctico comerciales ha permitido a los vinificadores integrar mejor sus procesos de vinificación gracias a la gestión de la FML.

2.2 Determinación del momento de la inoculación
Es imperativo inocular el vino con un cultivo maloláctico iniciador que presente una concentración de población de 106 CFU/mL para garantizar una presencia de células bacterianas suficiente para degradar el ácido málico. Si la fermentación alcohólica se inicia y concluye rápidamente, la degradación del ácido málico por la bacterias lácticas no suele provocar una acidez volátil (AV) extrema. Cuando se observan cantidades excesivas de AV, éstas suelen ser consecuencia de la presencia y crecimiento de bacterias indígenas, con toda probabilidad introducidas en el vino debido a una combinación de condiciones sanitarias deficientes y elevado pH del vino. Estas bacterias indígenas se desarrollan en el vino utilizando el azúcar como fuente de energía, y produciendo ácido acético.
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© Aaron Kohr - FOTOLIA

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Fermentación Maloláctica
ganismos indeseados puede generar compuestos secundarios, entre ellos, alergenos tales como aminas biógenas (histamina, putrescina y cadaverina), y compuestos potencialmente cancerígenos como el carbamato de etilo y la ocratoxina A.

2.3 Problemas potenciales
A veces, en lugar de mejorar el vino, las bacterias lácticas pueden provocar cambios indeseables. Durante la FML ocurrida naturalmente y sin control, realizada por cepas indígenas de Lactobacillus y Pediococcus, se puede producir una alteración de las propiedades organolépticas del producto. Concretamente, se puede formar un exceso de AV o de diacetilo. Además de velar los sabores afrutados primarios del vino, estos compuestos también pueden aportar caracteres indeseables a su aroma. Por ejemplo, los AV son irritantes para la nariz y provocan un sabor agrio. El diacetilo puede aportar un sabor almendrado o características que pueden evocar el caramelo, la levadura e incluso el pelo de animal mojado. Los aromas y sabores indeseados generados por el desarrollo de organismos de putrefacción pueden producir características similares al yogur ácido, la mantequilla rancia y el sudor. En los vinos tintos, los fenoles volátiles pueden producir olores a establo, y en los blancos, los mismos componentes pueden provocar la aparición de olores a antiséptico. Esos olores pueden ir acompañados de amargor y de taninos metálicos en el paladar. La proliferación incontrolada de microor-

2.4 Procedimientos analíticos
La acción más obvia de la FML es la descaboxilación del ácido málico del vino, y siempre provoca una disminución de la acidez total y un incremento del pH. La forma más fácil de seguir el avance de la FML consiste en realizar análisis químicos para detectar la desaparición del ácido málico. A continuación se describen algunos de los métodos más utilizados.

• Cromatografía en papel
Es una técnica cromatográfica cuantitativa utilizada para realizar un seguimiento visual de la desaparición del ácido málico. No es precisa, pero sí fácil de utilizar en bodega.

• Técnicas enzimáticas
Esta técnica es más compleja y costosa, pero resulta muy precisa. Utiliza el análisis químico para determinar la concentración absoluta de cualquier ácido orgánico en el mosto. Durante la FML, el L-ácido málico se convierte específicamente en L-ácido láctico, de modo que se puede utilizar la medición de la concentración de L-ácido láctico como indicador del inicio de la FML. Por lo general, cuando la concentración de L-ácido láctico alcanza 200-300 mg/L, se puede suponer con seguridad que se ha iniciado la FML. Normalmente, se considera que la FML ha concluido cuando la concentración de ácido málico baja a valores de entre 100 y 200 mg/L.

• Recuentos microbiológicos
Esta técnica aísla y cuenta el número de bacterias lácticas presentes en el vino. Su tasa de crecimiento es muy lenta, de modo que puede llevar hasta siete días determinar el número de Oenococcus oeni viables. La tasa de crecimiento de bacterias indeseables, como Lactobacillus y Pediococcus, es más alta, de modo que el recuento de estos organismos se puede obtener en un plazo de dos días.

• Observación microscópica
Este método se basa en la observación directa de un vino mediante un microscopio de buena calidad. No es cuantitativo, pero si lo aplica un técnico con experiencia, proporciona una evaluación rápida y valiosa de la microflora presente en el vino.

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B

I.3. Bacterias lácticas y fermentación maloláctica

Aline LONVAUD-FUNEL
Faculté d’enologie. Université victor segalen bordeaux 2
3.1 Las bacterias lácticas: generalidades 3.2 Principales metabolismos en el vino 3.3 Vías de utilización de ciertos aminoácidos 3.4 Metabolismos de alteración 3.5 Lugar de las bacterias lácticas en el ecosistema microbiano de la uvavino 3.6 Conclusión

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3.1 las bacterias lácticas: generalidades
as bacterias lácticas (BL) son microorganismos comunes en numerosos entornos. Están presentes en gran número de vegetales y en la leche, y participan en la elaboración de todo tipo de productos fermentados, bebidas y alimentos. Las BL del vino son muy parecidas a las de la sidra, con las que presentan grandes similitudes en cuanto a materia prima y proceso de elaboración. Por lo tanto, la especie Oenococcus oeni desempeña el mismo papel en sendos medios. En otras bebidas o verduras fermentadas, hay mayor presencia de lactobacilos, lactococos y estreptococos, que son los encargados de realizar las transformaciones.

I.3. Bacterias lácticas y fermentación maloláctica

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- Definición
Las BL son bacterias de coloración Gram positiva. Esta sencilla prueba de color permite distinguirlas rápidamente de las bacterias acéticas, Gram negativas, que también están siempre presentes en el mosto y en el vino. Todas las BL producen ácido láctico a partir de los azúcares. Cultivadas en un medio que contenga glucosa y todos los demás nutrientes imprescindibles para su desarrollo, se multiplican en el mismo acidificándolo intensamente.

- Clasificación
La forma de las células es bien visible tras una prueba de coloración Gram. Es redondeada en el caso de los cocos y alargada en el de los bacilos. En el entorno enológico, existen cocos y bacilos. La vía metabólica de fermentación del azúcar es el criterio que permite clasificar a las BL como bacterias homofermentativas y heterofermentativas. Las primeras producen exclusivamente ácido láctico a partir de la glucosa, y las otras forman asimismo ácido acético, etanol y CO2 como principales metabolitos. Algunas BL se comportan como homofermentativas en condiciones de cultivo óptimas, pero como heterofermentativas en otras condiciones. Esas bacterias, a diferencia de las homofermentativas estrictas, fermentan las pentosas por la misma vía que las heterofermentativas. Son heterofermentativas "facultativas". Hasta ahora, no se ha descrito en el vino ningún lactobacilo homofermentativo estricto. Las especies identificadas se clasifican entre los cocos y bacilos heterofermentativos, y los cocos homofermentativos.

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I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.

Figura 1.
Fotografias de bacterias aisladas del vino, tomadas al microscopio electrónico

Oenococcus oeni

Pediococcus damnosus

Lactobacillus brevis

Especies más comunes de bacterias lácticas del vino Lactobacilos Lactobacilos Cocos Cocos Heterofermentativo facultativo Heterofermentativo Homofermentativo Heterofermentativo

Lactobacillus plantarum -L. casei L. brevis, L hilgardii Pediococcus parvulus, P. damnosus L. mesenteroides, O. oeni

- Identificación
Los métodos clásicos de identificación se basan en la observación de varios caracteres (denominados caracteres fenotípicos). La clasificación de una cepa se determina en función del parecido de esos caracteres con los de las cepas tipo. Las pruebas de identificación se realizan sobre aislamientos puros, es decir sobre bacterias aisladas tras su cultivo en medio nutritivo gelificado. Las colonias aisladas se vuelven a poner en cultivo con glucosa como único azúcar para determinar el tipo fermentativo (heterofermentación/homofermentación). Después, en las mismas condiciones, se sustituye la glucosa por otros azúcares diversos, hexosas, pentosas y “osas” varias, que permiten obtener el perfil bioquímico. En función de su capacidad de metabolizar tales o cuales azúcares, las bacterias se clasificarán dentro de una u otra especie. El método más cómodo de clasificación consiste en utilizar las galerías "API 50CH" en las cuales se miniaturiza una cuarentena de pruebas en una misma placa. La identificación se lleva a cabo cotejando el resultado de todas las pruebas con las claves facilitadas en el manual de clasificación de Bergeys. Aunque el método sea sencillo, lleva mucho tiempo, pero lo peor es que a veces los resultados son ambiguos. En lo sucesivo la identificación se basa en el análisis del ADN, es decir en el verdadero patrimonio genético de la célula, y no en su reflejo a través de caracteres fenotípicos más o menos fáciles de poner en evidencia. Existen varios métodos disponibles, el más seguro consiste en secuenciar una parte del genoma
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muy característico de la especie, correspondiente a los genes que codifican el ribosoma esencial de la célula, es decir el ARN 16S. Esta región contiene partes muy conservadas en todas las bacterias de una misma especie, así como otras variables en función de las cepas. Basándose en este principio, el método de PCR permite identificar un aislamiento considerando la región conservada en la especie. Consiste en estudiar esa región por amplificación genética, eligiendo "inicios" cuya la secuencia es específica de la especie. La identificación también se puede llevar a cabo mediante hibridación del ADN con una sonda específica. Por último, a nivel de la cepa, el método más seguro consiste en analizar el perfil genético generado por la hidrólisis del cromosoma bacteriano. Todos estos métodos se utilizan para identificar cepas aisladas por cultivo en un medio nutritivo, aunque también se puede hacer inventario de las bacterias presentes en una mezcla como el vino o el mosto de uva, sin cultivo previo. El método (PCR-DGGE) se basa en la diferencia de migración de ADN 16S en función de las especies.

Figura 2.
Hibridación de colonias con la sonda de ADN genómico Oenococcus oeni

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Fermentación Maloláctica
dentes en la fermentación alcohólica, si la competencia entre levaduras y bacterias se inclina a favor de estas últimas, o si la fermentación se desacelera o se interrumpe por otros motivos. En esa situación, se fermentan varios gramos de hexosas por litro, y la acidez volátil aumenta sensiblemente. Es el llamado picado láctico. Este incidente es especialmente de temer cuando tanto el pH de la vendimia como la concentración de los azúcares son muy altos.

Figura 3.
Perfil genómico de cepas de O. oeni aisladas en una cuba durante la FML

- Transformación del ácido málico
Es la reacción principal de la FML. Químicamente, consiste en la mera descarboxilación del ácido L-málico del vino en ácido L-láctico. Bioquímicamente, es el resultado de la actividad de la enzima maloláctica, característica de las BL. Esta transformación tiene un doble efecto. Por una parte, desacidifica el vino, es decir eleva el pH, tanto más cuanta más alta fuera la cantidad inicial de ácido málico. Por otra parte, también suaviza el vino, al hacer desaparecer el sabor ácido y duro del ácido málico y sustituirlo por el sabor más suave del ácido láctico. Esta es la reacción principal que hace que la FML modifique muy sensiblemente los caracteres organolépticos del vino, y el motivo por el cual la segunda fermentación resulta especialmente recomendable para la mayor parte de los vinos tintos y muchos blancos. La duración de la transformación del ácido málico depende de la cantidad inicial de ácido éste y del nivel de población total de la bacteria que haya conseguido multiplicarse en el vino. Sin embargo, para una misma biomasa formada, se puede desacelerar como consecuencia de ciertos inhibidores del vino, que de momento todavía no están bien identificados. El pH, el grado alcohólico, la temperatura y la concentración de dióxido de azufre son los principales parámetros que controlan el crecimiento y el nivel de la población total.

3.2 Principales metabolismos en el vino - Fermentación de los azúcares
Los azúcares son las principales fuentes de energía para el crecimiento de las bacterias. Dependiendo de las especies de lactobacilos y de cocos, se fermentan bien por vía de la glicolisis (homofermentación) bien por la vía de las pentosas (heterofermentación); sin embargo, sólo esta última genera el ácido acético que incrementa la acidez volátil del vino. No obstante, en una vinificación normal, sin incidentes, cuando se multiplican las BL, en el medio sólo persisten los azúcares sin fermentar por las levaduras. Por lo general, se trata de algunas centenas de mg/l de glucosa y de fructosa, y de las pentosas del zumo de uva (arabinosa, xilosa).

Figura 4.
Distintas vías de fermentación de los azúcares por las BL

- Degradación del ácido cítrico
Mientras que, antes de la FML, el vino contiene varios g/l de ácido L-málico, por lo general sólo contiene entre 200 y 300 mg/l de ácido cítrico. Ahora bien, aunque su concentración sea baja, el ácido cítrico tiene una gran importancia, pues su vía metabólica conduce por una parte a ácido acético, es decir a un aumento de la acidez volátil, y por otra parte a las moléculas acetoínicas, la más importante de las cuales es el diacetilo. Este compuesto aromático, que tiene un olor a mantequilla, se detecta fácilmente en la cata desde concentraciones relativamente bajas, del orden de 56 mg/l en los vinos blancos y 8-9 mg/l en los vinos tintos. Por debajo de ese umbral, el diacetilo contribuye al bouquet del vino y a su complejidad. Por encima, puede llegar a resultar francamente desagradable. No obstante, para algunos vinos sí que se busca esa nota mantecosa.
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Los azúcares residuales son suficientes para suministrar la energía necesaria para el crecimiento de las BL y permitir la formación de la biomasa que posteriormente lleva a cabo la fermentación maloláctica (FML). La producción de acidez volátil es siempre muy limitada, y sólo llega a cobrar importancia en caso de inci-

I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.

Figura 5.
Vía de degradación del ácido cítrico por las bacterias lácticas

fuente principal de carbamato de etilo sigue siendo la urea producida por la levadura durante la fermentación alcohólica.

- Descarboxilación de ciertos aminoácidos
Las BL pueden producir aminas biógenas por la mera reacción de descarboxilación de los aminoácidos correspondientes. La histamina y la tiramina son las principales aminas cuya concentración aumenta durante y después de la FML. Se forman a partir de la histidina y de la tirosina respectivamente. Las enzimas descarboxilasas necesarias para esas transformaciones se han purificado y estudiado en bacterias lácticas del vino. Son muy frecuentes en los lactobacilos heterofermentativos (L. brevis y L. hilgardii), si bien también se han aislado cepas de O. oeni productoras de histamina. Los genes que codifican la histidina y la tirosina descarboxilasas han sido secuenciados y bien localizados dentro de un conjunto de genes que también incluyen los que codifican las proteínas de transporte que intercambian el aminoácido y la amina al nivel de la membrana celular. La capacidad de producir aminas biógenas es totalmente dependiente de la presencia de dichos genes. Por lo tanto, si se detectan esos genes en la población, eso significa que el riesgo de producción de amina biógena es alto, en caso de que se multipliquen esas bacterias en concreto.

El diacetilo se puede reducir a acetoína debido a las actividades enzimáticas de las bacterias, y también de las levaduras, de manera que si se prolonga el contacto del vino con las lías, disminuye su concentración. Esa puede ser una buena manera de suprimir un exceso. Por el contrario, el trasiego precoz permite conservarlo. La degradación del ácido cítrico es un carácter muy común de las bacterias del vino, si bien es más lenta que la del ácido málico. Por ello, a veces al final de la FML el vino todavía contiene la mayor parte del ácido cítrico inicial. No obstante, la observación general es que incluso después de la adición de azufre, la actividad bacteriana continúa y la concentración final del vino acaba por ser nula. El aumento del ácido acético observado durante y en ocasiones después de la FML se debe a esta degradación.

3.3 Vías de utilización de ciertos aminoácidos Figura 6. - Degradación de la arginina
La mayor parte de los lactobacilos del vino y numerosas cepas de O. oeni catabolizan la arginina del vino. Es uno de los aminoácidos más importantes, y en el vino, después de la FA, procede sobre todo del metabolismo de las levaduras y de su autolisis. La vía de degradación es la de la arginina deiminasa. Consta de tres etapas, catalizadas por tres enzimas cuyos genes se han caracterizado en la O. oeni. El análisis de un gran número de cepas de esta especie permite concluir que estos genes están situados en una región del cromosoma presente o ausente en su totalidad, dependiendo de las cepas. Incluye asimismo los genes que codifican las proteínas de transporte de la arginina. Como esta vía metabólica suministra energía a las bacterias, las cepas que poseen todos los genes tienen una ventaja sobre las demás, algo que puede resultar importante para su supervivencia o su crecimiento. A nivel enológico, la consecuencia es la formación de citrulina, precursor del carbamato de etilo. Sin embargo, las concentraciones formadas son débiles, y la
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Esquemas de los sistemas de producción de histamina y tiramina por las BL del vino.

Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica Figura 7.
Detección por PCR de las bacterias productoras de amargor en el vino

A partir de esta observación, se ha desarrollado una prueba basada en la amplificación de estos genes por PCR. Si la prueba da positivo antes de la FML, constituye una buena indicación para la utilización de levaduras malolácticas. En efecto, aunque no se pueda eliminar las bacterias indeseables, se puede frenar su crecimiento mediante una siembra masiva de O. oeni seleccionadas. Luego, desde el momento en que se haya degradado el ácido málico, se puede realizar un sulfitado adecuado que permitirá reducir aún más su población, y por ende su actividad. Si la prueba de detección de las bacterias productoras de aminas biógenas da positivo después de la FML, indica la necesidad de sulfitar rápidamente y lo más eficazmente posible, pero también de evitar el contacto prolongado con las lías. Durante la crianza de estos vinos, será necesario vigilar la microflora láctica.

-Producción de glucano
Durante la FML, las BL forman exopolisacáridos en el vino. De momento, todavía no se conocen bien, y probablemente participan en reacciones con los demás compuestos del vino. Sin embargo, algunas sintetizan un glucano muy particular, que tiene la propiedad de incrementar considerablemente la viscosidad del vino, incluso a una concentración relativamente débil. Es la enfermedad de la “grasa” o de los vinos “ahilados” que en ocasiones sobreviene en cuba o en barrica, pero también con gran frecuencia en botella. Hasta ahora, las bacterias aisladas más a menudo en estos vinos alterados se han identificado como Pediococcus parvulus o P. damnosus, pero sólo se trata de cepas concretas de estas especies, bien adaptadas para crecer en el vino. Esas cepas poseen un gen particular que codifica una enzima implicada en la síntesis del glucano. Se pueden detectar con la prueba PCR apropiada.

- Metabolismo de los aminoácidos azufrados
La cisteína y la metionina son metabolizadas por las bacterias que forman compuestos azufrados diversos, entre ellos el hidrógeno sulfurado y el metano-tiol, poco apreciados. El metabolismo de la metionina está mejor estudiado, y conduce, además del metanotiol y del sulfuro de dimetilo, a moléculas más complejas de probada incidencia organoléptica. Las bacterias lácticas del vino producen estos compuestos, metionol y ácido metil3-sulfanilo propiónico pero la O. oeni es la que los produce en mayores cantidades. Su concentración aumenta durante la FML, y podrían figurar entre las numerosas moléculas aromáticas que participan en el cambio complejo del aroma de los vinos por influencia de las BL.

Figura 8.
Detección por hibridación ADN/ADN de bacterias de la enfermedad de la grasa. (Izda. Todas las colonias cultivadas a partir de una muestra de vino. Drcha. Sólo se revelan las colonias de la enfermedad de la grasa)

3.4 Metabolismos de alteración - Degradación del glicerol
El glicerol es un componente fundamental del vino, formado por las levaduras. La mayoría de las veces no queda metabolizado después de la fermentación alcohólica. Sin embargo, algunas cepas de lactobacilos disponen de una vía especial que conduce al 1,3 propanodiol. La primera etapa la cataliza la gliceroldeshidratasa, y produce 3 hidroxi propionaldehído, que se reduce inmediatamente a 1,3 propanodiol. Sin embargo, una cantidad muy reducida del aldehído escapa a la reducción, y forma acroleína, con una doble incidencia en la calidad del vino: por una parte desaparece el glicerol, a veces completamente, y por otra parte, la acroleína, incluso en reducidas cantidades, se combina con los polifenoles del vino y forma moléculas de sabor amargo. Es la enfermedad del “amargor”.

Los vinos afectados por la enfermedad de la grasa no tienen por qué presentar más defecto que su viscosidad. En ese caso, se pueden tratar para recuperarlos. Una acción mecánica por batido o fragmentación del vino que permite recobrar una viscosidad adecuada. Después, la estabilización debe recurrir a procedimientos muy eficaces, como el tratamiento térmico y la filtración esterilizante, con un sulfitado adecuado para suprimir cualquier riesgo de desarrollo ulterior de las bacterias perjudiciales.

27

I. Introducción a la fermentación maloláctica: las bacterias lácticas y su mecanismo.

3.5 Lugar de las bacterias lácticas en el ecosistema microbiano de la uva-vino
En el mosto de uva, las BL forman parte del complejo sistema de múltiples especies de levaduras y bacterias. Inicialmente, están presentes en la superficie de la baya, aunque muchas veces son difíciles de aislar en la viña. En la vendimia recién recogida, prensada y encubada, la población de BL es del orden de 102 a 104 UFC/mL. Varía en función de las condiciones meteorológicas durante los últimos días de la maduración. En realidad, depende de las innumerables interacciones entre las decenas de especies de otros microorganismos que colonizan el medio, en la superficie de la uva, y después en la uva reventada por el prensado. En las condiciones habituales de vinificación, que la mayor parte de las veces suponen un sulfitado de la vendimia, la población de BL deja muy rápidamente paso a las levaduras que desencadenan la fermentación alcohólica (FA). En un medio cuya composición química cambia constantemente y donde todos los microorganismos luchan por desarrollarse, generalmente las BL consiguen multiplicarse de forma muy transitoria, tras lo cual entran en regresión hasta el final de la FA. En ese momento, su población es mucho más reducida que las de las levaduras, y su nivel depende en buena medida del pH y del grado alcohólico del vino. En condiciones difíciles, de pH relativamente ácido (pH <3,4) y fuerte graduación alcohólica ( > 13 %) muchas veces la población es inferior a 102 UFC/mL. Por el contrario, puede rebasar 104 UFC/mL en las condiciones opuestas, sobre todo si el pH es > 3,5. Esta es la población que deberá multiplicarse para iniciar la FML. Un fenómeno muy importante que se desarrolla durante la FA, es la selección de las bacterias de la especie O. oeni. En la gran mayoría de los casos, las bacterias de esta especie son las únicas que invaden el medio después de la FA para realizar la FML. La selección natural operada entre una mezcla muy variada de especies de BL presentes en el mosto se

lleva a cabo por efecto del cambio de composición del medio. Inicialmente se identifican lactobacilos y cocos pertenecientes a una decena de especies distintas. Luego, muchos de ellos desaparecen progresivamente, o al menos se vuelven muy minoritarios, dejando que la O. oeni colonice el medio. No se conocen con precisión los mecanismos de esta selección. Sean cuales fueren, el hecho es que la O. oeni se adapta mejor que las demás especies al cambio del entorno. Además de la acidez del medio, estas bacterias soportan mejor que las demás las posibles carencias nutritivas y la toxicidad creciente resultante del metabolismo de las levaduras. Cuando ha cesado por completo la actividad de las levaduras o a veces incluso antes, la población de BL, compuesta principalmente de O. oeni prosigue su adaptación al medio, y, dependiendo de los factores limitativos con que se enfrente, desencadena un verdadero crecimiento, que puede ser muy rápido, cuestión de días o semanas. Finalmente, esta biomasa cobra entidad suficiente para que se observe la degradación del ácido málico. Ese es el verdadero comienzo de la FML. Mientras quede ácido málico por degradar, continúa la actividad, y la biomasa se mantiene elevada. Cuando todo se ha transformado, la biomasa se elimina por el sulfitado, que pone punto final al proceso de vinificación. Entonces hay que estabilizar el vino de cara a cualquier desarrollo microbiano, pues va a empezar la crianza, que en principio no representa más que transformaciones de tipo fisicoquímico. La mayoría de las veces, el sulfitado elimina masivamente la población de O. oeni que ha llevado a cabo la FML pero no consigue librar totalmente al vino de todas las bacterias. En ese momento, la microflora puede ser de nuevo totalmente mixta, y compuesta de diversas especies de lactobacilos y de pediococos además de O. oeni. El sulfitado reduce la población total, pero algunas cepas especialmente resistentes a las condiciones cada vez más hostiles se seleccionan espontáneamente, pudiendo originar alteraciones bacterianas.

Tabla 1. Recuento de BL durante la vinificación de Cabernet Sauvignon
Recuento de bacterias lácticas durante la vinificación de Cabernet Sauvignon (UFC ml-1) Especies Œnococcus œni Leuconostoc mesenteroides Pedicoccus damnosus Lactobacillus hilgardi Lactobacillus brevis Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Total
Nd: non détécte

Días 0 Nd 2.9x10
2

3 Nd 1.7x10 8.0x10 2.0x10 2.0x10
4

6 Nd 9.6x10 4.0x10
4

10 4.3x10 3.2x10 4.4x10 Nd Nd Nd 1.8x104
3 3

18 3.4x106 Nd Nd Nd Nd Nd Nd 3.4x106

6.0x102 1.1x10 Nd 7.5x10 7.7x10
3

3.8x104
4

3.7x104
4

4.9x103
3

2.0x104
4 4

1 1

4.5x104 Nd Nd 1.5x105

2.5x103

1.7x105

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Fermentación Maloláctica
levaduras propuestas ha mejorado mucho durante los últimos años, aunque siguen produciéndose algunos fracasos. El segundo problema, si bien de menor importancia, es la falta de control sobre el impacto organoléptico de las cepas implantadas. Si bien es cierto que las cepas de O. oeni pueden tener una incidencia significativa en los caracteres sensoriales del vino, muchas veces también resulta imprevisible, y parece depender mucho del propio vino. El interés de los productores de vino, de los enólogos, de los industriales de la fermentación y de los científicos por las BL no deja de acrecentarse. Los progresos alcanzados tanto en materia de vinificación espontánea como de vinificación controlada por levaduras malolácticas son buena prueba de ello. Los conocimientos y herramientas de investigación se afinan, y se aplican a una mejor utilización de la diversidad natural de la especie O. oeni.

3.6 Conclusión
La vinificación es el resultado de fenómenos espontáneos ligados al crecimiento de las levaduras y bacterias en el vino. Sin embargo, el productor de vino desea controlar cada vez más completamente los procesos fermentativos. Elige no sólo el momento de inicio de las fermentaciones alcohólica y malolácticas, sino también el tipo de microorganismos encargados de llevarlas a cabo. Por ello se practica cada vez más la siembra de levaduras, con un objetivo no sólo de rapidez y exhaustividad de fermentación de los azúcares, sino también de aporte o de refuerzo de notas aromáticas concretas en ciertos vinos. Para la FML, la demanda es idéntica, si bien persisten dificultades de control del fenómeno. El primer problema es la débil tasa de supervivencia de las BL en el vino, o incluso en el mosto en caso de inoculaciones precoces ("inoculación conjunta" con las levaduras). La eficacia de las

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II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica
Índice

R

33 41 47
41 47

33

II.1. Necesidades nutricionales
Dr. Sibylle Krieger Lallemand

II.2. Fermentación maloláctica en barrica.
Piet Loubser Lallemand

II.3. Guía para resolver problemas -aplicación prácticaAnnamarie kyne Lallemand Sigrid Gertsen-Briand Scott Laboratories

N

II.1. Necesidades nutricionales de la bacteria maloláctica

Dr. Sibylle KRIEGER
Lallemand
1.1 Hidratos de carbono 1.2 Compuestos nitrogenados 1.3 Vitaminas, minerales y otros factores de crecimiento 1.4 Ácidos orgánicos 1.5 Disponibilidad de nutrientes determinada por las prácticas de vinificación 1.6 Formulación de nutrientes malolácticos

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II.1. Necesidades nutricionales de la bacteria maloláctica

urante mucho tiempo se creyó que la degradación del ácido málico en ácido láctico era la fuente de energía que permitía el desarrollo de la bacteria maloláctica (BML) en el vino1. Radler2 refutó esa teoría, al demostrar que en un medio sintético, la proliferación de las bacterias lácticas (BL) depende de la presencia de hidratos de carbono fermentables. Por lo general, las BL del vino son conocidas como microorganismos especialmente fastidiosos por sus complejas necesidades nutricionales. El apartado siguiente presenta las diversas necesidades nutricionales de las BL del vino en general, y de la Oenococcus oeni en particular.

D

1.1 Hidratos de carbono
Las condiciones de desarrollo durante la fermentación maloláctica (FML) del vino son muy difíciles para las BL. Durante la FML, se degradan de 0,4 a 0,8 g/L de azúcares, consistentes en su mayor parte en glucosa y fructosa, que son las principales fuentes de energía para el desarrollo bacteriano3. Radler4 ha calculado que para la degradación de 1 g/L de ácido málico son necesarios aproximadamente 0,01 gramos de bacterias, y que 0,1 g de glucosa suministra energía suficiente para producir esta cantidad de biomasa. Prácticamente todos los vinos contienen estos azúcares en cantidad suficiente para alimentar un desarrollo bacteriano que alcance para garantizar una FML completa, pero se ha demostrado que la FML se puede inhibir en los vinos cuyas concentraciones de glucosa y fructosa suman un nivel inferior a 0,2 g/L5. La Oenococcus oeni es heterofermentativa y convierte la glucosa en idénticas cantidades de D-ácido láctico, CO2 y ácido acético (o etanol). Casi todas las cepas de BML fermentan la glucosa y fructosa, y la mayor parte de ellas prefiere la fructosa a la glucosa, es decir que son fructofílicas. Cuando se desarrollan a partir de la fructosa como única fuente de carbono, parte de este azúcar se convierte en manitol, que produce un mol adicional de ATP, y débiles concentraciones de ácido acético. No obstante, si hay un exceso de manitol presente en el vino, se puede producir un problema denominado alteración por manitol. Se caracteriza por un incremento de la producción de ácido acético y la aparición de un sabor agridulce. Este fenómeno se aborda más detalladamente en el capítulo titulado “Defectos organolépticos causados por una FML descontrolada.”

33

II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica

La mayor parte de las BL del vino son capaces de degradar las pentosas – arabinosa y xilosa – durante su crecimiento6. Los compuestos glicósidos presentes en el vino pueden ser todos ellos substratos para el desarrollo de BL, y Rosi et al.8 han demostrado el efecto positivo de los polisacáridos producidos por levaduras (manoproteínas) en el inicio y la aceleración de la FML. La mayor parte de las cepas de la FML deseada, Oenococcus oeni, son capaces de producir -glicosidasas7 y se pueden distinguir de otras cepas de BL por su incapacidad de fermentar la sacarosa, la lactosa y maltosa.

medios no sintéticos de cultivo de la BML deben suministrar extractos de levadura o autolisado de levadura a los organismos16. Para utilizar estos tipos complejos de fuente de nitrógeno para su crecimiento, las bacterias tienen que ser capaces de hidrolizarlos a sus subunidades, y de transportarlos a la célula. Los estudios de secuenciación del genoma de la Oenococcus oeni realizados por el grupo de Guzzo’s y la Genome Express Company han revelado la presencia de genes con una capacidad potencial de codificación de proteasas y peptidasas, así como de transportadores de aminoácidos y péptidos. Recientemente, Remize et al.17 han demostrado que dos fuentes distintas de nitrógeno derivado de la levadura tienen un impacto distinto, aunque dependiente de la cepa, en el crecimiento de la Oenococcus oeni.

1.2 Compuestos nitrogenados
Las BL requieren un suplemento extensivo de aminoácidos, purinas, pirimidinas, vitaminas y minerales9, lo cual significa que el contenido de nitrógeno del vino puede variar significativamente durante la FML10. Las necesidades de aminoácidos específicos difieren de una cepa de BL a otra. La Oenococcus oeni y la Pediococcus pentosaceus aisladas en el vino pueden necesitar hasta 16 aminoácidos distintos11, pero no pueden utilizar fuentes de nitrógeno inorgánicas, como el fosfato diamonio. La Oenococcus oeni, como demostraron Fourcassie et al.13, presenta una necesidad absoluta de los aminoácidos arginina, ácido glutámico, triptófano e isoleucina, y necesita otros seis aminoácidos para su desarrollo óptimo. Lallemand ha estudiado las necesidades de nitrógeno de cuatro cepas comerciales de BL y de una cepa de laboratorio de las BL Oenococcus oeni en colaboración con el grupo de Jean Guzzo, y comparó los resultados con otros dos estudios descritos en la literatura13. De un total de 13 aminoácidos, siete eran imprescindibles para el desarrollo. El ácido glutámico era imprescindible para todas las cepas de los tres estudios, y la metionina, serina, fenilamina y tirosina resultaron vitales para la mayor parte de las cepas. La alanina, glicina y prolina ejercen un efecto menor en el crecimiento de la Oenococcus oeni, mientras que la valina, leucina, triptófano, isoleucina, histidina y arginina se pueden describir como en cierta medida imprescindibles, pues resultan necesarios para la mayor parte de las cepas de Oenococcus oeni y son necesarios, pero no imprescindibles, para las demás14. Se han confirmado las necesidades cuantitativas de cada aminoácido, y es suficiente una concentración inferior a 2 mg N/L para garantizar el desarrollo de las BL. Durante la proliferación de la bacteria en el vino, puede disminuir fuertemente la concentración de varios aminoácidos, mientras que puede aumentar la de otros5. No se ha comprobado que la disponibilidad de aminoácidos pueda ser limitadora del desarrollo2, pues las proteínas y péptidos presentes en el vino también se pueden utilizar como fuente de aminoácidos15. Se ha demostrado que el desarrollo bacteriano y la FML se ven estimulados por la presencia de compuestos nitrogenados derivados de levaduras, como los péptidos y manoproteínas de la pared celular. Todos los
34

1.3 Vitaminas, minerales y otros factores de crecimiento
Además del amino nitrógeno, las BL del vino necesita un suministro de purinas y pirimidinas o sus derivados. La adenina, xantina, guanina y uracilo tienen un efecto estimulante sobre el desarrollo de las BL. Varias vitaminas del grupo B son imprescindibles para el crecimiento, y aparentemente todas las cepas necesitan ácido fólico y ácido nicotínico2. La necesidad de biotina, riboflavina, ácido pantoténico y piridoxina depende de la cepa. Durante la producción comercial de cepas de Oenococcus oeni, se puede incrementar el rendimiento de biomasa añadiendo pantotenato de calcio, tiamina y piridoxina, a razón de 1 mg/L de cada sustancia. 18. El descubrimiento de la contaminación bacteriana de la salsa de tomate indujo la utilización del zumo e tomate como nutriente en la formulación de medios de cultivo de la BL19. Amachi20 ha descrito un “factor zumo de tomate” como un derivado del ácido pantoténico, y ha demostrado que es estimulador del crecimiento de la Leuconostoc oenos [Oenococcus oeni]. Zickler21 ha demostrado que el desarrollo de la BML denominada Bacterium gracile

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crecimiento inducido por el ácido málico. Aunque hasta hace poco se consideraba que la conversión de L-ácido málico en L-ácido láctico y CO2 no produce energía26, la investigación reciente indica que las células intactas de Oenococcus oeni generan más ATP cuando se han desarrollado en presencia de L-ácido málico27.

requiere potasio, sodio, magnesio y concentraciones relativamente altas de iones de manganeso. El manganeso también desempeña un papel vital en calidad de coadyuvante en la enzimología de la FML realizada por BL. Por lo general, las concentraciones de todos estos iones son suficientes para permitir el crecimiento y metabolismo de las BL.

1.4 Ácidos orgánicos
Aunque el ácido málico es el ácido más importante metabolizado por las BL en el vino, ésta también metaboliza otros ácidos orgánicos, comentados a continuación.

• Ácido cítrico
El ácido cítrico es un componente fundamental del mosto de uva y del vino, y se puede encontrar en concentraciones comprendidas entre 0,1 y 0,7 g/L. El metabolismo del ácido cítrico por Oenococcus oeni se ha correlacionado con la síntesis del ácido acético, el diacetilo y la acetoína28. La Oenococcus oeni no es capaz de desarrollarse a partir del ácido cítrico como única fuente de carbono y energía. Pero en presencia de una fuente de energía como la glucosa, mejoran tanto la tasa de crecimiento específica como la producción de biomasa de la Oenococcus oeni29. La mejora del crecimiento en presencia de ácido cítrico se debe, en parte, a un incremento de la producción de ATP derivada de la fosforilación durante el cometabolismo de la glucosa con el ácido cítrico30. El ácido cítrico queda completamente metabolizado en algunos vinos, y en menor medida en otros. Mayores concentraciones de ácido cítrico31 estimulan la producción de diacetilo y acetoína por la Oenococcus oeni, y la máxima concentración de diacetilo se observa al terminar la degradación del ácido málico32. Durante la FML, la degradación del ácido cítrico se retrasa con respecto a la degradación de ácido málico.

• Ácido tartárico
A veces se observan pequeñas reducciones de la concentración de ácido tartárico durante la FML. Lo más probable es que estas variaciones se deban a modificaciones de la solubilidad del ácido tartárico más que a una degradación microbiana real16. Sólo se ha comprobado que degraden el ácido tartárico algunas cepas de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis y Lactobacillus arabinosus22. La degradación del ácido tartárico siempre va asociada al picado del vino.

• Ácido málico
Los ácidos tartárico y málico son los dos principales ácidos orgánicos del vino, en especial de los vinos de climas fríos. El ácido málico está naturalmente presente en su forma L. El D-ácido málico no está naturalmente presente en el mosto de uva, y no lo metaboliza las BL del vino. Varios estudios han demostrado que el L-ácido málico estimula el crecimiento y la producción de biomasa de Oenococcus oeni23, 24. Durante el crecimiento con pH bajo, la bacteria degrada ácido málico a gran velocidad, mientras que los hidratos de carbono se degradan a poca velocidad. Este fenómeno induce un aumento global del pH, que por sí mismo permite un incremento de la utilización de los hidratos de carbono, lo cual explica la observación de

1.5 Disponibilidad de nutrientes determinada por las prácticas de vinificación
La clarificación de mostos y vinos no sólo puede eliminar físicamente una amplia porción de las BL, sino que además puede reducir el desarrollo bacteriano potencial, lo cual incide en la calidad del vino19. Además, la clarificación elimina nutrientes y partículas en suspensión que estimulan el desarrollo bacteriano, con lo cual inciden aún más en la FML. De forma similar, se ha comunicado que los vinos elaborados utilizando el proceso de termovinificación tienen menor capacidad de permitir la FML. La determinación del momento de la inoculación de la BL (tratada en otro capítulo) también influirá en la cinética de la FML. La disponibilidad resulta afectada por las interacciones entre los microorganismos del vino. Es corriente esperar que la mezcla de cultivos de microorganismos introduzca la posibilidad de relaciones antagónicas y sinérgicas, si bien, en algunos casos menores, los distintos microorganismos ejercen poca o ninguna influencia mutua. En la vinificación, siempre existe la posibilidad de que se produzcan interacciones entre las BL y las levaduras, hongos, bacterias acéticas e
35

II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica

incluso bacteriófagos. Es más, también se pueden producir interacciones entre diversas especies y cepas de BL20. El efecto antagónico de la levadura sobre las BL se ha explicado por la competencia por los nutrientes así como la producción de sustancias que inhiben el desarrollo bacteriano, como el SO2 o los ácidos grasos de cadena media. A la inversa, la levadura puede sostener el desarrollo de las BL en el vino y estimular el avance de la FML. Durante el proceso de autolisis de la levadura, se liberan vitaminas y aminoácidos en el vino, y el mayor contacto con las lías asociado al proceso enriquece el vino con micronutrientes que estimulan la FML. Costello21 ha comunicado que una rápida mortandad de células de Oenococcus oeni sostiene el crecimiento de Pediococcus ssp. En condiciones de alto pH, el desarrollo precoz de la Lactobacillus brevis inhibe totalmente el desarrollo de Oenococcus oeni. Recientemente, Gerbaux (comunicación personal) ha demostrado que las condiciones del vino que estimulan la FML pueden inhibir el desarrollo de la levadura Brettanomyces nociva para el vino.

BL. En esas condiciones, es necesario añadir un nutriente bacteriano33. De forma similar, el aporte de un nutriente bacteriano es vital en los mostos cuyas concentraciones de nutrientes son naturalmente bajas, pues un poco de levadura puede producir niveles excesivos de SO2, que inhiben fuertemente el desarrollo de BL. Baste decir que siempre es fundamental una nutrición adecuada tanto de la levadura como de las BL. En las difíciles condiciones de pH, SO2, alcohol y nitrógeno que se dan en el vino, la utilización de suplementos nutritivos permitirá que la Oenococcus oeni sobreviva y se multiplique. Una cuidadosa preparación de cultivos de inicio malolácticos y un uso adecuado de las preparaciones de nutrientes diseñadas para esos cultivos garantizará el rápido inicio de la FML. Esto se ilustra en la Figura 1, que presenta los resultados obtenidos a partir de la inoculación de un cultivo iniciador ML en un vino Chardonnay en presencia o ausencia de una preparación de nutrientes ML. La cinética de la degradación del ácido málico correspondiente a cada uno de los tres cultivos iniciadores es mucho más rápida cuando se utiliza el nutriente, mientras que sólo se degradó un máximo de 1 g/L de ácido málico cuando se añadieron bacterias en ausencia de suplemento nutricional. Se recomienda un buen suplemento nutricional de los cultivos iniciadores ML, y existe un recomendación similar en relación con la levadura. La nutrición de las BL es distinta de la de la levadura, y exige un riguroso control. En casos de escasez de nutrientes en el vino, la alimentación adecuada del cultivo iniciador ML puede ser determinante para el éxito de la FML. En palabras del inmortal Shakespeare, “Ser, o no ser…” Figura 1.

1.6 Formulación de nutrientes malolácticos
La investigación extensiva ha contribuido a un mejor conocimiento de las necesidades nutricionales de los cultivos iniciadores malolácticos, las interacciones de las levaduras con dichos cultivos, y el impacto del medio del vino en el desarrollo bacteriano y la nutrición de las levaduras durante la fermentación alcohólica. Por ejemplo, se sabe que si una levadura con elevadas necesidades de nutrientes realiza la fermentación alcohólica, en el mosto se agotan rápidamente los factores necesarios para permitir el desarrollo de

Tiempo (días) Alcohol 14,1% v/v, SO2 total 14 ppm, pH 3,38 Inoculación directa con cultivos iniciadores de ML con (+) y sin (-) adición de nutrientes

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Fermentación Maloláctica
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II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica

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Fermentación Maloláctica

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F

II.2. Factores medioambientales que afectan a la fermentación maloláctica

Piet LOUBSER
Lallemand
2.1. Factores bien conocidos 2.2. Factores menos conocidos

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Fermentación Maloláctica

II.2. Factores medioambientales que afectan a la fermentación maloláctica

e suele considerar que la fermentación maloláctica (FML) consiste simplemente en la descomposición del ácido málico presente en los vinos tintos y en algunos blancos, con la emisión de CO2 que la acompaña, en la formación de ácido láctico y en una reducción del contenido ácido total del vino. De hecho, eso es exactamente lo que ocurre, pero aunque eso fuera todo lo que sucede durante la misma, esta descripción sería una simplificación excesiva del proceso. La descomposición del ácido málico en ácido láctico confiere estabilidad microbiológica, y al mismo tiempo, la formación de diversos componentes también produce un impacto organoléptico. Es posible asimismo que la reducción global de ácidos, junto con el incremento del pH que la acompaña, dé como resultado mejores vinos, más “suaves” y “redondos”, con más cuerpo.2, 4, 9, 10, 15, 19

S

En el pasado la FML corría a cargo, en buena medida, de las poblaciones bacterianas indígenas no siempre con los resultados deseados. Durante los últimos años, los vinificadores han pasado a disponer de cultivos bacterianos comerciales muy fiables para inducir la FML. Estos cultivos no sólo frecen una FML más fiable y con menores riesgos, sino que también aportan una tremenda contribución al aspecto organoléptico de los vinos. Estos cultivos bacterianos comerciales se seleccionan en función de criterios muy estrictos, y son capaces de funcionar en condiciones sumamente adversas. Tiene un impacto positivo en el perfil organoléptico de los vinos, y contribuyen a incrementar su plenitud y complejidad.2, 4, 7, 9, 15, 19 En el buen desarrollo de la FML intervienen diversos factores, algunos de ellos bien conocidos, y otros menos. Vamos a comentarlos detalladamente para comprender mejor el proceso y la gestión de la FML.

2.1 Factores bien conocidos que afectan a la fermentación maloláctica
Entre los factores que determinan una buena FML, los que mejor se comprenden son el SO2, el pH, el alcohol y la temperatura. Para que se produzca una buena FML, los valores de estos parámetros químicos deben coincidir con los niveles que permiten el buen funcionamiento de los cultivos bacterianos. Es importante recordar que estos factores funcionan de forma sinérgica, es decir que el efecto total de su acción conjunta es superior a la suma de sus acciones individuales. Además, la concentración favorable de un componente puede compensar la concentración desfavorable de otro u otros componentes. Aunque resulta difícil asignar valores exactos a cada compo41

II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica

nente, para garantizar una buena FML, es imperativo atenerse a los parámetros definidos por cada productor de cultivos.2, 4, 17, 18 El cumplimiento de esta regla quizá sea la consideración más importante para garantizar el éxito de la FML. En algunos casos, puede resultar muy difícil producir un vino cuya analítica cumpla dichos parámetros generales. Los vinos tintos del Nuevo Mundo cosechados con un alto grado de madurez, y por consiguiente con altos niveles de alcohol son un ejemplo típico. En esos casos, es importante seleccionar la cepa de levadura adecuada para producir el vino, así como la cepa bacteriana adecuada para realizar la FML. Incluso cuando todos los factores químicos cumplen los parámetros deseados, en ocasiones el desarrollo de la FML resulta problemático.13 A continuación pasamos a comentar las posibles causas de estas anomalías.

alcohólica interactúan mejor con ciertas bacterias para lograr una buena culminación de la FML. En condiciones específicas, algunas cepas de levaduras pueden producir elevadas concentraciones de SO2, que influyen negativamente en la proliferación y la supervivencia de las bacterias malolácticas. De forma similar, las cepas de levadura que presentan una necesidad desmedida de nutrientes pueden agotar el medio hasta el punto de eliminar las reservas de nutrientes disponibles para las bacterias. La aplicación de una estrategia de nutrición específica para una bacteria concreta durante las primeras fases de la fermentación alcohólica puede solventar holgadamente este problema.10, 13, 16, 17

Varios factores menos conocidos pueden influir en el desarrollo de la FML. El hecho de que sean menos conocidos no significa que su impacto sea menos significativo. Entre dichos factores figuran los siguientes:

• Taninos • Déficits de nutrientes
La investigación reciente ha demostrado que ciertos taninos de la uva pueden ejercer una influencia negativa en la bacteria maloláctica, y por consiguiente en el desarrollo de la FML. De hecho, algunas investigaciones han indicado que ciertos varietales de tinto, como el Merlot, pueden presentar una gran dificultad en experimentar una buena FML.12, 18 Los resultados más recientes de Lallemand indican que los ácidos fenólicos influyen en la proliferación de ciertas cepas bacterianas en medios de cultivo en laboratorio. El efecto sobre la estimulación del desarrollo puede ser positivo o negativo, dependiendo de la especie bacteriana, del ácido fenólico concreto utilizado y de su concentración. Por ejemplo, el ácido cafeico a 50 mg/L y 100 mg/L provocaba un efecto positivo sobre la proliferación bacteriana y la degradación del ácido málico. Por otra parte, el ácido ferúlico puede afectar negativamente al desarrollo bacteriano y a la degradación del ácido málico, si bien depende de la cepa. El efecto inhibitorio más acusado es el del ácido p-cumárico, y se incrementa con la concentración. Básicamente, estos resultados coinciden con los comunicados por otros investigadores.9, 10. En estas circunstancias limitadoras, conviene considerar un nutriente que ayude al proceso de la FML. Para que la FML culmine con éxito, es de la máxima importancia que las bacterias dispongan de una nutrición suficiente. El ejemplo siguiente ilustra la función crítica de la nutrición para la FML: se inoculó en un mosto de Pinotage, el conocido varietal sudafricano, un cultivo maloláctico comercial tras finalizar la fermentación alcohólica; a los 110 días, sólo se había metabolizado un 40% de la concentración inicial de ácido málico. Se examinó el “estado de salud” del vino mediante un análisis microscópico, y se determinó su acidez volátil. Se halló población de Oenococcus oeni correcta y saludable, lo cual, de hecho, constituía una confirmación del cultivo inicial inoculado. Los niveles de acidez volátil también eran razonablemente bajos. Basándose en estos análisis, se añadieron nutrientes específicos de la bacteria maloláctica. A los once días, había terminado la FML.11, 14 El concepto de la adición de nutrientes no es sencillo. La importancia de las buenas prácticas de higiene y la adición de cultivos malolácticos seleccionados están estrechamente vinculadas y son vitales para suministrar nutrientes vitales a las bacterias inoculadas. Es importante garantizar que la FML se produzca siempre en condiciones higiénicas y con una presencia de SO2 en el vino suficiente para controlar las poblaciones bacterianas indígenas. Igualmente importante resulta garantizar que se inocule en el

• Selección de la cepa de levadura
Hace algún tiempo que se sabe que ciertas cepas de levadura seleccionadas para conducir la fermentación
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2.2 Factores menos conocidos que afectan a la fermentación maloláctica

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Fermentación Maloláctica
vado que a pesar de que el oxígeno puede influir negativamente en la FML incluso a concentraciones reducidas, la micro-oxigenación puede tener un efecto positivo sobre la FML debido a la leve acción de agitación asociada al propio proceso de micro-oxigenación.8, 17

vino el nivel recomendado de un cultivo comercial definido, con objeto de contar la presencia de suficientes bacterias “buenas” para que la FML culmine con éxito cuando se añada el nutriente. En realidad, nunca se recomienda la adición de nutrientes cuando se confía en las poblaciones de bacterias malolácticas espontáneas, surgidas naturalmente, para llevar a cabo la FML. Para mayor información sírvase consultar el capítulo “Necesidades nutricionales.”

• Residuos de fungicidas
Algunos residuos de fungicidas y pesticidas, y en especial de los primeros, pueden tener un efecto negativo sobre el funcionamiento de la bacteria maloláctica. Los más perjudiciales son los residuos de los compuestos sistémicos utilizados con frecuencia en años húmedos para controlar el hongo de la botritis. En años con una fuerte incidencia de contaminación por botritis hay que tomar precauciones concienzudas. Los vinificadores deben conocer los programas y productos de pulverización utilizados, y deben ceñirse a los periodos de descanso prescritos para los diversos productos fungicidas.2, 3

• Compactación de lías
A resultas de la presión hidrostática, las lías presentes en el fondo de una cuba se pueden compactar hasta

• Concentración inicial de ácido málico
Las concentraciones de ácido málico difieren de un viñedo a otro, y también pueden diferir de un año para otro en un mismo viñedo. Por ese motivo, junto con otros factores, la duración de una FML puede diferir de un año para otro.13, 14 Resulta especialmente difícil inducir una FML en los vinos con concentraciones de ácido málico inferiores a 0.8 g/L.8, 10, 13, 14 En estos casos, se recomienda utilizar cultivos ML iniciadores con una fuerte actividad de malato-permeasa.

tal punto que las levaduras, las bacterias y los nutrientes quedan “atrapados” y no pueden funcionar correctamente. Se ha observado recientemente que las cubas de grandes dimensiones pueden estar correlacionadas con un mayor retardo de la iniciación de la FML. La inhibición del comienzo de la FML en las cubas más grandes se puede solventar bombeando el día de la inoculación o el segundo día tras la inoculación de las bacterias.8 La recomendación general consistiría en agitar periódicamente las lías (al menos una vez por semana) para asegurar que las bacterias y nutrientes se mantengan en suspensión.8, 14

• Ácidos grasos
Una buena FML depende en gran medida de la capacidad del cultivo maloláctico iniciador de alcanzar y mantener una alta viabilidad celular en el vino. Para garantizar que así sea, es necesaria la presencia en el medio de niveles suficientes de ácido oleico. En realidad, en el éxito de la FML influye la capacidad de asimilación del ácido oleico que tienen las cepas bacterianas. Ciertas prácticas, como la clarificación de los mostos, pueden dar lugar a un vino con carencia de ácido oleico. En esos casos, el éxito de la FML dependerá en buena medida de las concentraciones de ácido oleico (C18:19) y de lactobacilo acidófilo cíclico (C19:C9) presente en la propia cepa bacteriana. Si se ha inducido la FML utilizando recuentos celulares muy altos, puede que no se observe este fenómeno.2 Los ácidos grasos de cadena media pueden tener un impacto negativo en el desarrollo de la FML. Alexandre et al. (2004) y Edwards et al. (1990) han indicado que el antagonismo observado entre las levaduras y las bacterias lácticas se podría explicar por la producción de ciertos ácidos grasos de cadena media (C6 a C12) derivados del metabolismo de las levaduras.1, 6
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• Actividad residual de las lisozimas
Si se utilizan lisozimas durante la vinificación, los niveles residuales de esta enzima pueden influir en el tiempo necesario para el desencadenamiento de la FML. Hay que seguir con atención las recomendaciones del proveedor relativas al momento de adición de la lisozima y de inoculación del cultivo comercial para la FML.10 En la mayoría de los casos se recomienda eliminar las lías más gruesas por trasiego.

• Niveles excesivos de oxígeno
Se ha demostrado que la bacteria maloláctica es sensible a los niveles excesivos de oxígeno. Esto significa que hay que evitar la exposición de las bacterias a cantidades indebidas de oxígeno tras la terminación de la fermentación alcohólica. También se ha obser-

II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica

Referencias
1. Alexandre, H., P. J. Costello, F. Remize, J. Guzzo, and M. Guilloux-Benatier. 2004. Saccharomyces cerevisiaeOenococcus oeni interactions in wine: Current knowledge and perspectives. Int. J. Food Microbiol. 93:141-154. 2. Bauer, R., and L. M. T. Dicks. 2004. Control of malolactic fermentation in wine: A review. S. Afr. J. Enol. Vitic. Vol. 25/2:74-88. 3. Bordons, A., M. Carme Masque, and M. Vidal. 1998. Isolation and selection of malolactic bacteria and effect of pesticides. En: The Management of Malolactic Fermentation and Quality of Wine, Lallemand Technical Meeting, Verona, Italia, 16-17 Abril 1998. 51-56. 4. Davis. C., D. Wibowo, R. Eschenbruch, T. H. Lee, y G. H. Fleet. 1985. Practical implications of malolactic fermentation: A review. Am. J. Enol. Vitic. 36:290 – 301. 5. Delteil, D., 2005. Comunicación personal. (El Sr. Delteil es consultor del sector del vino.) 6. Edwards, C. G., R. B. Beelman, C. E. Bartey, y A. L. McConnell. 1990. Production of decanoic acid and other volatile compounds and the growth of yeast and malolactic bacteria during vinifi cation. Am. J. Enol. Vitic. 41:48-56. 7. Henick-Kling, T., y T. E. Acree. 1998. Modification of wine flavor by malolactic fermentation. In: The Management of Malolactic Fermentation and Quality of Wine, Lallemand Technical Meeting, Verona, Italia, 16-17 Abril 1998. 17-22. 8. Krieger, S. 2005. Comunicación personal. (El Dr. Krieger es Jefe de Investigacio´n y Desarrollo de Lallemand Inc.). 9. Kunkee, R. E. 1967. Malolactic fermentation. Adv. Appl. Microbiol. 9:235-279. 10. Lallemand Research and Development Reports, 1999-2004.

11. Lallemand Winemaking Update. 2004. Bacteria Nutrition – The Key to Successful Malolactic Fermentation. 2:1-2. 12. Lonvaud-Funel, A. 2001. Interactions between lactic acid bacteria of wine and phenolic compounds. En: Nutritional Aspects II, Synergy between Yeast and Bacteria, Reunión Técnica de Lallemand, Perugia, Italia, 27-30 Abril 2001. 27-32. 13. Loubser, P. A. 2004. Familiarise yourself with Malolactic Fermentation. Wynboer Technical Yearbook (a Wineland publication).2004/5:32-33. 14. Loubser, P. A. Trabajo experimental propio, 19932004. 15. Rankine, B. 1990. Malolactic fermentation is more complex than it appears. The Australian Grapegrower and Winemaker. 14. 16. Rauhut, D. 2001. Influence of the time of inoculation on the malolactic fermentation and the interactions between yeast and bacteria. In: Nutritional Aspects II, Synergy between Yeast and Bacteria, Reunión Técnica de Lallemand, Perugia, Italia, 27-30 Abril 2001. 39-47. 17. Ribéreau-Gayon, P., D. Dubourdieu, B. Doneche, and A. Lonvaud. 1998. Handbook of Enology, Volume 1, The Microbiology of Wine and Vinifi cations. John Wiley and Sons Ltd. 18. Vivas, N., M. Augustin, y A. Lonvaud-Funel. 2000. Influence of oak wood and grape tannins on the lactic acid bacterium Oenococcus oeni (Leuconostoc Oenos, 8413). Journal of the Science of Food and Agriculture. 80:1675-1678. 19. Wibowo, D., R. Eschenbruch, C. R. Davis, G. H. Fleet, and T. H. Lee. 1985. Occurrence and growth of lactic acid bacteria in wines. A review. Am. J. Enol. Vitic. 36:302–313.

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Fermentación Maloláctica

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G

II.3. Guía para resolver problemas -aplicación práctica-

Annamarie KYNE
Lallemand

Sigrid GERTSEN-BRIAND
Scott Laboratories
3.1 Si desea la fermentación maloláctica 3.2 La fermentación maloláctica se está desarrollando 3.3 Si no se desea la fermentación maloláctica

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Fermentación Maloláctica

II.3. Guía para resolver problemas -aplicación práctica-

l plantearse la realización de la fermentación maloláctica (FML), es necesario tomar en cuenta numerosos parámetros físicos y medioambientales. De todos ellos, los más importantes son los Cuatro Grandes, a saber el pH, el alcohol, la temperatura y el SO2. Es importante tener presentes estas cuatro condiciones a la hora de preparar la inoculación de bacterias malolácticas, pues actúan sinérgicamente. Por ejemplo, si en el momento de la inoculación la concentración de alcohol es alta y el pH es bajo, el efecto combinado resultará en unas condiciones que pueden ser inadecuadas para permitir el crecimiento y el metabolismo de las bacterias inoculadas. Por norma general, si las condiciones siguientes se dan simultáneamente en el vino, normalmente la FML se producirá con relativa facilidad:

A

• • • •

pH superior a 3.2; SO2 libre inferior a 10 ppm1; Temperatura superior a 18°C; Alcohol inferior a 13% (v/v).

La Figura 1. ilustra los efectos interrelacionados de los Cuatro Grandes parámetros en la facilidad (o dificultad) de la FML. Es importante tomar en cuenta todos estos factores para decidir el momento del aporte de bacterias, la cepa de bacterias lácticas que se va a utilizar, y el tipo de cultivo (multiplicación o inóculo directo) que se va a utilizar. La comprensión del efecto del entorno total en las bacterias permitirá tomar decisiones informadas con respecto a estas variables.

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II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica

La guía de resolución de problemas de la FML que se incluye a continuación ayudará a disipar los misterios la FML en los diversos casos prácticos de vinificación. La guía detalla todas las consideraciones necesarias asociadas a la realización de la FML. También pretende ayudar a diagnosticar y, en su caso, rectificar fermentaciones malolácticas difíciles de controlar. Se presenta en formato de árbol binario (Sí / No). Por ejemplo, si desea iniciar una FML, parta de A y prosiga a partir de ahí siguiendo las instrucciones. Si la FML ya está en curso, pero surgen problemas, parta de B, y si no desea una FML, parta de C.

6. Controle la temperatura — el intervalo óptimo es de 18-22°C — y evite los picos de calor durante la fermentación, porque a medida que aumenta la temperatura, el alcohol resulta cada vez más tóxico para las bacterias. A temperaturas muy bajas, se retrasan tanto la fermentación alcohólica como la FML. 7. Controle las modificaciones del perfil aromático del vino durante la FML mediante análisis sensoriales rutinarios. Si se interrumpe la fermentación alcohólica o si se permite el desarrollo de bacterias o levaduras indeseadas, se pueden modificar los aromas, y pueden aparecer malos sabores. 8. Controle el azúcar, el L-ácido málico y la acidez volátil porque si el pH es alto, si se agota el ácido málico la Oenococcus oeni puede producir ácidos volátiles a partir de los azúcares. En ese caso, es preferible el control analítico al control sensorial. ii. A la mitad de la fermentación alcohólica

RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS DE LA FERMENTACION MALOLACTICA 3.1 Si desea la fermentación maloláctica y
a. Desea controlar la FML por inoculación i. Al principio de la fermentación alcohólica 1. Utilice una cepa de levadura compatible con la bacteria láctica. 2. Elija un cultivo bacteriano de proliferación o un cultivo de inoculación directa, en función de las condiciones ilustradas en la Figura 1. 3. Considere la conveniencia de añadir de un complejo nutritivo para la levadura, con objeto de reducir el riesgo de que se interrumpa la fermentación alcohólica. 4. Tenga en cuenta que la cantidad de SO2 añadida en la trituradora determinará el momento del aporte del iniciador bacteriano: • Inferior a 50 mg/L — Inocule las bacterias inmediatamente después de inocular la levadura • 50 - 65 mg/L — Espere 12 horas después de añadir la levadura para añadir las bacterias • Superior a 65 mg/L — No se recomienda la inoculación conjunta de levadura y bacterias. Mida el contenido de SO2 libre, pero controle también el SO2 total porque la Oenococcus oeni es capaz de liberar SO2 libre del SO2. 5. Tenga en cuenta el pH — recuerde que el pH superior a 3.5 induce el desarrollo de organismos que alteran el vino; por debajo de este pH, la Oenococcus oeni pasa a ser dominante.

1. No se recomienda añadir bacterias lácticas en esta fase de la fermentación. La fermentación alcohólica activa sometería a las bacterias a un estrés excesivo.

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Fermentación Maloláctica
ma es de 18-22°C. En climas más fríos, las bajas temperaturas pueden inhibir eficientemente la FML. 4. Controle el SO2 libre después de la fermentación alcohólica y asegúrese de que sea inferior a 10 ppm. Después de la fermentación alcohólica, puede aumentar la concentración de SO2 libre si la levadura es capaz de producir SO2. 5. Determine el grado alcohólico del vino. A mayor grado alcohólico mayor toxicidad, por lo que puede resultar necesaria una adaptación de las bacterias mediante la utilización de un cultivo de proliferación en vez de un cultivo de inoculación directa. b. La FML corre a cargo de bacterias indígenas — ¡NO SE RECOMIENDA! i. Controle la población bacteriana al menos una vez por semana, por microscopio o mediante técnicas de cultivo en placas viables. Es de suma importancia prevenir la proliferación de bacterias lácticas perjudiciales. ii. Mantenga una temperatura ideal de 1822°C. Esto incrementará la posibilidad de que la FML la realicen bacterias indígenas favorables. iii. Ajuste y mantenga un pH inferior a 3.5. Los valores superiores a éste incrementan el riesgo de que se desarrollen organismos perjudiciales para el vino. iv. Controle el azúcar, el L-ácido málico y la acidez volátil. Con un pH alto, la Oenococcus oeni may puede producir ácidos volátiles a partir de los azúcares. En ese caso, es preferible el control analítico al control organoléptico. v. Realice un control organoléptico semanal para detectar los cambios del perfil aromático del vino y cualquier mal sabor que pudiera desarrollarse.

iii. Al final de la fermentación alcohólica 1. Tenga en cuenta el tipo de vino que pretende elaborar, pues su carácter determinará el momento de inducción de la FML: • Carácter afrutado sin notas mantecosas: Lógrelo mediante la inoculación simultánea de las bacterias con la levadura, o añadiendo las bacterias nada más terminar la primera fermentación, cuando existe una gran población de levadura disponible para degradar todo el diacetilo que pudiera producirse. • Si desea obtener notas de diacetilo y de mantequilla: Estabilice el vino por filtración o aporte de SO2 justo al final de la FML, en el momento en que se agota el ácido málico, o espere unas semanas después de la primera fermentación, para dejar morir las células de levadura y evitar que las células de levadura vivas consuman el diacetilo producido. 2. Elija una cepa de bacterias capaz de tolerar el grado alcohólico, el SO2, y pH del vino que se va a inocular. 3. Tenga en cuenta que la temperatura ópti-

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II. Requerimientos y factores de la fermentación maloláctica

3.2 La fermentación maloláctica se está desarrollando
a. Lentamente. i. Determine si algún cambio introducido previamente en las prácticas de cultivo, como modificaciones de los tipos o concentraciones de caldos de pulverización aplicados al viñedo, podrían estar afectando a la FML. Las pulverizaciones sistémicas aplicadas al final de la temporada de crecimiento resultan específicamente tóxicas para la Oenococcus oeni. ii. Recuerde que el varietal de uva y las técnicas de vinificación aplicadas pueden incidir en la FML. A menudo resulta difícil completar una FML en los vinos de Chardonnay, Merlot y Tannat, y también resulta difícil en los mostos muy clarificados. iii. Tenga en cuenta los Cuatro Grandes parámetros ilustrados en la Figura 1. ¿Han interactuado y creado un medio difícil para las bacterias? Si es así, elija una cepa bacteriana adecuada que pueda resistir esas condiciones. iv. Considere la adición de un suplemento nutritivo, ya que puede ser vital y necesaria. Si la FML se ha iniciado, pero luego se ha frenado o interrumpido, la situación puede estar indicando una escasez de nutrientes. A menudo, la carencia de uno o varios nutrientes concretos impide la buena implantación de las bacterias en el vino, causando una reducción de la viabilidad bacteriana. v. Puede haber ácidos grasos de cadena media presentes en el vino, que pueden estar inhibiendo el desarrollo de las bacterias inoculadas. Si se añade un paquete nutritivo completo, se ayuda a reducir el efecto tóxico de estos ácidos grasos de cadena media. b. Se ha iniciado, pero no ha culminado i. Compruebe que no han variado los parámetros críticos de vinificación, tales como la temperatura, la acidez volátil y el SO2. ii. Controle analíticamente las concentraciones de azúcares residuales, acidez volátil y ácido málico, así como el grado de viabilidad bacteriana. iii. Compruebe que ha inoculado las bacterias en las concentraciones recomendadas por el fabricante.
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iv. Confirme el método preparación del iniciador bacteriano. 1. Proliferación estándar de células en crecimiento • Asegúrese de que ha preparado correctamente el inóculo. Sea objetivo, y cerciórese de que ha han seguido todos los procesos y procedimientos necesarios. • Determine el material utilizado en la preparación del iniciador. No utilice concentrado de uva, pues puede contener concentraciones excesivas de SO2 libre que provocan una inhibición de las bacterias. 2. Inoculación directa • Compruebe si las bolsitas que contienen las bacterias estaban almacenadas correctamente. Si las bolsitas han estado expuestas a una temperatura excesiva, puede que las bacterias hayan muerto. • Cerciórese de que el paquete utilizado ha permanecido cerrado herméticamente y sólo se ha abierto justo antes de ser utilizado. • Compruebe que en la inoculación se ha utilizado la cantidad correcta de células. Si no se han añadido suficientes bacterias para alcanzar la dosificación correcta, añada más. v. Determine si un bacteriófago, es decir un virus que elimina las bacterias, podría ser responsable de que la FML no haya terminado. El cultivo microbiológico en placas ayudará a determinar si ha sido el caso.

3.3 No se desea la fermentación maloláctica
i. Mantenga el vino a una temperatura de 10°C. ii. Añada lisozimas, a una concentración de 300-500 ppm. Las lisozimas son enzimas que se desarrollan naturalmente y resultan tóxicas para la mayoría de las bacterias lácticas, si bien algunas cepas no son sensibles a las mismas. iii. Añada 30-50 ppm de SO2. La cantidad real que hay que añadir depende del pH del vino. iv. Elimine las bacterias mediante una filtración por membrana. La filtración con membranas de 0.45μ retira las bacterias.

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Fermentación Maloláctica

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III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica
55 59
59 55
III.1. Estudios sobre la pérdida de color durante el proceso maloláctico. Cosecha de Tempranillo de Rioja 2004
Manuel Ruiz Ingeniero Técnico en Industrias de Fermentación

I

69 77
77

69

III.3. Efectos de los contaminantes microbiológicos inducidos por la fermentación maloláctica descontrolada en vino
Jürg Gafner Astrid Bachmann, Andrea Frei Francis Hesford Naomi Porret Katharina Schneider Agroscope

III.2. Percepción del consumidor bien informado de defectos organolépticos del vino provocados por fermentación maloláctica sin control
Antonio Palacios Carlos Suárez Sibylle Krieger Didier Theodore Luis Otaño Francisco Peña Dr. Ingeniero Agrónomo y Enólogo

III.4. Incidencia cualitativa de la siembra de bacteria en los vinos tintos
Vincent Gerbaux ITV Francia

E

III.1. Estudios sobre la pérdida de color durante el proceso maloláctico. Cosecha de Tempranillo de Rioja 2004

Manuel RUIZ
Ingeniero técnico en industrias de fermentación La Semana Vitivinícola, Nº 3050 (22 enero 2005)

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Fermentación Maloláctica

III.1. Estudios sobre la pérdida de color durante el proceso maloláctico. Cosecha de Tempranillo de Rioja 2004

L

a demanda de calidad en los vinos tintos incide en el alto contenido de color y sensaciones suaves. El proceso maloláctico contribuye a definir una sensación de suavidad en la boca pero tienen un tributo en color. Este tributo en color se estima en un 20-30% como intensidad colorante y en torno al 5% en valor Índice de Polifenoles totales. Es intención de los enólogos conseguir la suavidad sin perder color y tal es la intención también de este estudio.

Circunstancia interesante de la cosecha 2004 de Tempranillo en Rioja es la diversidad de contenidos de ácido málico en la uva. Mientras una cosecha estándar oscila entre 3 y 4 gramos por litro de mosto, en la del año 2004 nos hemos encontrado con variaciones desde 1,8 hasta 5,5 grs/l. Ante esta situación los técnicos nos hemos preguntado con temor si la pérdida de color puede ser proporcional al ácido málico degradado por las bacterias, lo cual nos haría suponer peligrosamente que en vinos de buen color con 13º de alcohol pero con 5 grs/l. de ácido málico el proceso de color podría ser desastroso. Para discernirlo hemos planteado una experiencia de laboratorio a partir de un vino tinto de Labastida que no había desarrollado aún el proceso maloláctico. Sus características son: Grado Azúcares Ácido málico pH Acidez volátil Acidez total Intensidad colorante IPT IP 13,49 1,84 grs/l. 2,3 grs/l. 3,53 3,53 7,89 grs/l. 13,5 66 1,6
Agente sembrado: Oenococcus oeni (“Vitilactic F.” Martín Vialatte a través de Dolmar)

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III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica

Se sembró con bacterias para DML en vino y se distribuyó en cuatro fracciones en erlenmeyer:

Resultados Muestra Testigo sin DML Málico 2,3 Málico 3,0 Málico 4,0 Málico 5,0
IC= Intensidad Colorante. IPT= Índice de Polifenoles Totales.

T. Inducción 12 días 5 días 5 días 8 días

IC 13,5 12,8 13,2 12,8 12,9

IPT 66 63 63 64 63

IP 1,6 1,5 1,4 1,5 1,5

A. Málico 2,3 0,1 0,1 0,1 0,2

IP= Índice Polimerización. Tiempo de Inducción= Nº de días que tarda en iniciar desaparición del ácido málico.

1.- Testigo con 2,3 grs/l. de málico. 2.- Adición de L(-) málico hasta 3 grs/l. 3.- Adición de L(-) málico hasta 4 grs/l. 4.- Adición de L(-) málico hasta 5 grs/l.

Y la otra derivación se observa al entender que en bodega no logramos caídas de IC en el proceso DML inferiores al 18% y en este ensayo lo hemos conseguido apenas del 5% . Lo diferente es el volumen de estudio. En bodega de 30.000 litros y en erlenmeyer de 200 cc. Como no vemos razón directa en volúmenes se nos ocurrió pensar que volumen diferente tiene relación con aireación diferente por relación de superficie libre del líquido muy diferente. Entonces pensamos en la influencia redox sobre la pérdida de color en el proceso DML. Para ello planteamos sobre un vino tinto del 2004 de San Asensio con 3,6 grs/l. de ácido málico un estudio DML/redox. Una muestra tal cual con siembra y otra con siembra pero corregida con aportación de 100 mgs/l. de ácido ascórbico. El proceso DML en estufa y matraces erlenmeyer con 300cc. de contenido arrojaron la misma velocidad de fermentación DML pero los resultados finales fueron:

Se situó en estufa a 22ºC. y se siguió el proceso DML, retirando las muestras cuando concluyó el málico y pasándolas a situación de 10ºC. La incógnita de planteamiento queda resuelta. La pérdida de color durante el proceso DML no es proporcional a la cantidad del ácido málico desdoblado. Pero existen dos derivaciones interesantes. Una, como conclusión, que expresa que la DML se desarrolla muy bien a nivel de 3-4 grs/l. de ácido málico y mal para valores inferiores. Que a su vez tendría otra subderivación. ¿Por qué la DML se dificulta con tan sólo 2 grs/l. de málico y el vino en botella es inestable con 0,7 grs/l. de málico?

IC Vino Testigo sin DML Desarrollada DML Desarrollada DML Vit. C. 17 15,4 11,2

IPT 71 69 63

IP 1,5 1,4 0,9

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Fermentación Maloláctica Conclusiones
La pérdida de color durante el proceso DML de los vinos tintos no esta relacionada con la cantidad de ácido málico de la uva. El periodo de inducción del proceso DML es corto en contenidos de 3 a 4 grs/l. de ácido málico y se dilata para contenidos diferentes. La pérdida de color en el proceso maloláctico es proporcional al nivel de reducción del vino.

Los resultados son muy ostensibles. Cuando el vino está reducido el tributo en color de la DML es muy fuerte. Esto explica que en la práctica la pérdida de color en el proceso maloláctico sea inferior cuando se hace en barrica o cuando se retrasa, ya que estas acciones suponen atenuar el valor reductor resultante en el vino después de la fermentación tumultuosa. Y como subderivación de todo esto intentamos en estudios posteriores, determinar el nivel de oxigenación o redox en milivoltios para desarrollar una DML sin tributo de color o mínimo y también conocer si esta desaparición es inicial o final del proceso DML.

Bibliografía
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III.2. Percepción del consumidor bien informado de defectos organolépticos del vino provocados por fermentación maloláctica sin control

Antonio PALACIOS* Carlos SUAREZ* Sibylle KRIEGER* Didier THEODORE* Luis OTAÑO** Francisco PEÑA***
* Lallemand Península Ibérica ** Universidad de la Rioja, Dto. Agricultura y Alimentación ***Catador experto ciego absoluto
2.1 Las bacterias en el vino, los peligros 2.2 Las alteraciones 2.3 Las bacterias en el vino, las contribuciones positivas 2.4 Impacto organoléptico de la fermentación maloláctica 2.5 Metabolismo de la fermentación maloláctica 2.6 Materiales y métodos utilizados 2.7 Resultados obtenidos 2.8 Conclusiones

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Fermentación Maloláctica

III.2. Percepción del consumidor bien informado de defectos organolépticos del vino provocados por fermentación maloláctica sin control

l vino es uno de los productos más antiguos donde los procesos microbiológicos hacen una contribución importante en la calidad final del producto. La elaboración del vino es un proceso bien conocido desde hace siglos, no obstante nuevos desarrollos, especialmente tratamientos biológicos, son cada vez mas aceptados y utilizados en las bodegas. Principalmente porque cada vez mas a menudo, se hace necesario dar una respuesta a la demanda específica en el mercado de vinos, especialmente de calidad. Para ello es necesario cumplir unos requisitos:

E

• Limitación de los elementos químicos en el perfil organoléptico: lo que supone desarrollar una optimización de las dosis de SO2 a utilizar y prestar atención a la fase de latencia de la FML de los vinos. • Limitación de compuestos con riesgo sobre la salud: la obtención de vinos higiénicos para el consumidor, lo que supone que el vino esté libre o con mínimas concentraciones en aminas biógenas (especialmente histamina) y de carbamato de etilo. • Desarrollo y estabilización de la calidad general del producto a lo largo de su vida comercial. Lo que supone una estabilización de la calidad aromática y de la expresión polifenólica, tanto la parte responsable del color como el constituyente tánico del vino. Otro aspecto interesante del mercado de vinos, es que los productos con éxito son muy cambiantes en el tiempo. R. Klein, por ejemplo, citó en 1997: “el gusto de los consumidores ha cambiado a través de los tiempos, la mayoría de los consumidores prefieren un vino blanco afrutado con una acidez moderada”, refiriéndose especialmente a los vinos blancos de moda actualmente. Por lo que el control de la FML se hace cada vez más necesario en un mayor tipo de vinos.

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III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica

2.1 Las bacterias en el vino, los peligros
Uno de los principales problemas que pueden provocar las bacterias en el vino es el aumento de la acidez volátil. Aunque también un exceso en diacetilo puede causar la desaparición del afrutado. Ciertas cepas de bacterias lácticas también pueden hacer aparecer aromas y gustos indeseables. Otro de los riesgos de la FML sin control, es la pérdida significativa del color, bien por actividad enzimática de las bacterias y por el aumento del pH. También la producción de histamina y carbamato de etilo, que son nocivos para la salud humana, están fuertemente influenciados por esta fermentación. Los agentes causantes de estos problemas son algunas cepas del género Oenococcus y muchas cepas de los géneros Lactobacillus y Pediococcus.

por ejemplo el metabolismo de la arginina por parte de las bacterias, que da como resultado la producción de citrulina y carbamil-fosfato. Si este compuesto reacciona con la urea producida por algunas levaduras durante la fermentación alcohólica, puede dar lugar a carbamato de etilo, compuesto tóxico para la salud humana y para el que existe un límite legal distinto según los países donde se vaya a vender el vino. La descarboxilación de determinados aminoácidos da como resultado la presencia en el vino de diversas aminas biógenas (histamina, putrescina, cadaverina, etc.), que al igual que sucede con el carbamato de etilo, pueden resultar tóxicas para la salud humana.

2.3 Las bacterias en el vino, las contribuciones positivas
La contribución positiva más evidente es la disminución de la acidez total del vino, especialmente del ácido málico. Pero también la producción equilibrada de etil-lactato, diacetilo y otros compuestos aromáticos es positiva, ya que dan mayor complejidad aromática. El incremento de los aromas varietales, como se ha demostrado ya por algunos autores, (Gerland, C., 1999). La reducción de notas vegetativas y la disminución de la astringencia y el amargor final en boca, es a veces muy notable. En algunos casos, también aumenta la redondez en boca y la suavidad de los taninos. Debido al consumo de acetaldehído, que puede ser muy intenso para algunas cepas (R. Mira de Orduña, 2001), se reduce la combinación del SO2, lo que permite rebajar su dosis. Los agentes positivos son algunas cepas de bacterias lácticas del género Oenococcus. Por esta razón es tan importante continuar realizando selección de bacterias naturales que sirvan de inóculos para la obtención de vino de calidad con un mayor control de los procesos biológicos.

2.2 Las alteraciones que pueden aparecer en los vinos como resultado del metabolismo de bacterias lácticas son de forma general las siguientes:
• Picado láctico: aparece en condiciones favorables para el desarrollo de bacterias (fermentaciones ralentizadas o paradas) cuando todavía hay azúcar en el mosto. Se transforman los azúcares de seis átomos de carbono en etanol, carbónico y ácido acético. En el medio aparece el isómero D del ácido láctico, mientras que el Lláctico se origina en la FML. Este fenómeno es provocado por bacterias lácticas. • Amargor: degradación del glicerol generando acroleína. Por la combinación de ésta con los taninos, aparecen sabores amargos muy desagradables en el final de boca. • Producción de fenoles volátiles: que en el caso de los vinos tintos son el 4-vinilfenol, 4vinilguayacol, 4-etilfenol y 4-etilguayacol, responsables de “olores a cuadra”, a “sudor de caballo”, etc. La aparición de estos compuestos se asocia a la acción de algunas cepas de Pediococcus y Lactobacillus, aunque los microorganismos máximos responsables de estos defectos organolépticos son levaduras contaminantes del género Brettanomyces y Dekkera. • Producción de bases heterocíclicas aromáticas, por parte de algunas cepas de las especies Lactobacillus heterofermentativos y Oenococcus oeni, asociadas a aromas desagradables identificados como “gusto a ratón”. Al igual que el caso anterior, estos defectos también pueden deberse a la acción de levaduras del género Brettanomyces/Dekkera. • Por último, se pueden producir alteraciones que afectan a la calidad sanitaria del vino. Como es
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2.4 Impacto organoléptico de la fermentación maloláctica
Los vinos que han realizado la FML suelen tener una valoración común en cata, encontrándose descriptores positivos; como la mantequilla, nueces, toques de levadura, miel, vainilla, cuero, tonos vegetativos, especiados, tierra, tostados, más cuerpo y redondez, con taninos dulces y mayor persistencia en boca. Pero con FML mal controlada, se puede también terminar con la aparición de descriptores negativos; como aromas lácticos intensos, yogurt ácido, aromas de sudor, tonos mantecosos, presencia de acetatos, amargor intenso final y el gusto animal en retronasal. El impacto del diacetilo en el perfil aromático del vino es muy variable. Dependiendo de la concentración alcanzada, los aromas aportados pueden ser muy diferentes. Así con una concentración de 5-14 mg/l, los aromas dominantes son los de mantequilla, mien-

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ción del ácido málico, tampoco hay degradación del ácido cítrico y hay alta producción de ácido acético. 2. Fase estacionaria I: no hay utilización del azúcar por parte de la bacteria, es cuando el ácido málico se transforma en ácido láctico. No hay degradación de ácido cítrico, ni producción de ácido acético. 3. Fase estacionaria II: no existe degradación del azúcar, no hay catabolismo del malato, pero la bacteria aprovecha el ácido cítrico, produciendo ácido acético y diacteilo en exceso. Esta es la fase que hay que evitar en vinificación mediante tratamientos con SO2 y lisozima.

tras que con una concentración de 2-4 mg/l, los aromas presentes son de nueces, caramelo, levadura y piel mojada. El umbral de percepción es superior en los vinos tintos que en los blancos, por eso los vinos tintos soportan mayores concentraciones de diacetilo. Entonces dependiendo del objetivo de vino, interesa o no evitar el consumo del ácido cítrico como fuente de diacetilo.

2.5 Metabolismo de la fermentación maloláctica
La evolución de las bacterias en el vino durante la FML está marcada por tres fases bien diferenciadas metabólicamente (Figura 1). 1. Crecimiento celular: utilización del azúcar del medio para obtener energía. No hay degrada-

Figura 1.
Evolución de diferentes metabolitos durante la FML Crecimiento celular
azúcar

Fase estacionaria I

Fase estacionaria II
biomasa

ac. málico

ac. láctico

ac. cítrico ac. acético ac. acético Tiempo

2.6 Materiales y métodos utilizados
Se cataron 22 vinos en total: dos testigos y 20 vinos modificados por adición de distintas concentraciones de diacetilo (vino blanco: 0,1 ppm, 5 ppm, 10 ppm y en el vino tinto: 0,1 ppm, 10 ppm, 30 ppm), aminas biógenas volátiles (putrescina y cadaverina en vino tinto en concentraciones de 1 ppm, 10 ppm, 50 ppm y 100 ppm) y etilfenoles (2-etil-fenol y 2-etil-guayacol en vino tinto en concentraciones de 425 μg/l, 800 μg/l y 1000 μg/l), agrupados en 6 series en función de estos compuestos, (DB: diacetilo en vino blanco,

DT: diacetilo en vino tinto, P: putrescina, C: cadaverina, EF: etilfenol y EG: etilguayacol). Dichas muestras se sometieron a un panel de cata formado por 24 consumidores informados previamente de los riesgos en vinificación de contaminaciones microbianas que pueden provocar la aparición de defectos organolépticos mediante un curso breve de 30 minutos. Los resultados se evaluaron mediante un cuestionario (Figura 2). Estos datos se contrastaron con la opinión de un catador profesional ciego absoluto.

Figura 2.
Cuestionario utilizado durante la cata

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III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica

2.7 Resultados obtenidos
Los catadores encontraron con una alta frecuencia defectos que ellos identificaron mediante descriptores definidos de forma diferente y elegidos libremente por ellos mismos. Lo hicieron de forma más evidente según la concentración del producto añadido

aumentaba, especialmente en los casos de los etilfenoles y el diacetilo, tanto en vino blanco como el tinto y de forma menos clara cuando los vinos tenían adiciones de aminas biogénicas (Figura 3). Los defectos más fáciles de identificar fueron los provocados por las adiciones de etilfenoles y el diacetilo en el vino blanco.

Figura 3.
Frecuencia de detección de defectos por los catadores

Los defectos encontrados en los vinos con adiciones de diacetilo son diferentes según se trate de vino blanco o tinto, también la frecuencia de detección de defectos identificados cambia. En el vino blanco un 31% de los catadores identificaron un defecto pero no supieron definirlo. El defecto más frecuente fue

descrito con los descriptores de aromas a mantequilla, queso y cierta tendencia a la oxidación, como si se tratase de un vino evolucionado. En vinos tintos, la frecuencia de no identificación aumenta hasta el 43% y dentro de los identificados, los más comunes son de mantequilla y tonos almendrados (Figuras 4 y 5).

Figura 4.
Descriptores en el vino blanco con diacetilo.

Figura 5.
Descriptores en el vino tinto con diacetilo.

7% 13%

2% 2%

3% 31%
8%

5%

3%

3%

3%

3% 43%

8%

15% 27%
N o id e n t if ic a d o O x i d a c ió n Ques o J ab ó n M a n t e q u il la F e r m e n ta c ió n E v o lu c ió n V a i n i lla

8% 16%
N o id e n tif ic a d o A c e ito s o C ue ro A g u a s u c ia M a n te q u il la V a in il la R e d u c c ió n A lm e n d r a a m a r g a C orcho Jabón

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Respecto a los etilfenoles, hay que destacar que la identificación de problemas resulta mucho más fácil para los catadores. Existiendo una estrecha relación entre concentración y aumento de identificación y descripción del defecto. En el caso del 2-etil-fenol, tan solo un 7% no encontró adjetivos para describir el problema. Los más utilizados fueron los de cuadra, cuero, aromas animales, boñiga, caballo y betún (Figura 8).

Cuando el vino tinto fue modificado con las adiciones crecientes de putrescina, no hubo relación entre la concentración adicionada y mayor identificación de defectos. Un 30% de los catadores encontraron defecto sin saber identificarlo. Los descriptores más utilizados para describir el defecto fueron de fruta podrida y sensación de fermentación, aromas rancios y suciedad (Figura 6).

Figura 6.
Descriptores en vino tinto con putrescina

Figura 8.
Descriptores en vino tinto con 2-etil-fenol
2% 2% 2%

2% 5% 7%

2% 2% 2% 2% 2%

2% 2%

5%

4%

7% 35%

30%

12%

12% 19%

9% 12%
N o i d e n t if ic a d o R a n c io Q u í m ic o C á r n ic o A g u a s u c ia F r u t a p o d r id a L ac a V ó m it o E v o l u c ió n J ab ó n

21%
F e r m e n ta c ió n M a d e r a p o d r id a M e d ic a m e n to A n im a l

N o id e n ti f ic a d o B o ñ ig a M a d e r a m o ja d a

C uadra C a b a l lo B r e tt

C ue ro B e tú n

A n im a l L aca

En el caso del 2-etil-guayacol, la frecuencia para encontrar un defecto aunque sin descripción aumenta hasta el 31%. Los descriptores más utilizados para identificar el problema fueron de moho, medicamento, aromas a quemado (Figura 9).

Cuando la amina biógena adicionada fue la cadaverina, existe una tendencia a aumentar la identificación del defecto según aumenta su concentración en el vino. Un 36 % encontró defecto sin saber identificarlo. Los descriptores más utilizados por los consumidores están en relación con aromas cárnicos y avinagrados, con ciertos tonos sucios (Figura 7).
5%

Figura 9.
Descriptores en vino tinto con 2-etil-guayacol

4% 5% 5%

2% 2% 2% 2%

31%

Figura 7.
Descriptores en vino tinto con cadaverina

7% 17% 18%
M e d ic a m e n t o O x i d a c ió n T ie r r a m o ja d a Que m ado Yodo Ques o

4% 4% 4%

4% 2%

2% 2% 2% 2% 36%
N o id e n ti f i c a d o M o s ta z a V e rdura M oho Form ol P in tu r a

8% 30%
N o id e n tif ic a d o F e r m e n ta c io n R e d u c c ió n G u is o d e c a r n e M e d ic in a Hu m e d ad V in a g r e C aza A n im a l F r u ta p o d r id a M a n t e q u il la F ó s fo r o

En la tabla 1 se presentan vino a vino la frecuencia de detección de defectos y la intensidad con la que puntuaron los vinos cada uno de los catadores, además de los adjetivos elegidos por ellos de forma libre. Dependiendo de la intensidad descrita, se valoró de forma distinta la frecuencia de detección del defecto. La intensidad baja puntuó de forma unitaría, la intensidad media 2 veces y la intensidad alta puntuó 3 veces.
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III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica

Tabla 1.
Tipos de defectos encontrados y grado de intensidad otorgada por los catadores Muestra 1DB 2DB 3DB 1DT 2DT 3DT 1P 2P 3P 4P 1C 2C 3C 4C 1EF 2EF 3EF 1EG 2EG 3EG
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Tipo de defecto Queso III; Oxidado; No identificado II; Jabón; Mantequilla

Intensidad Baja Media ****** *** * Alta

No defecto ************ **

Defecto 13 37 35 9 22 36 16 20 14 13 13 16 18 24 24 57 65 30 42 49

No Defecto 14 7 5 17 11 7 13 11 15 14 16 12 10 9 11 3 0 10 3 2

No identificado III; Oxidado I; Mantequilla III; ***** **** Evolucionado; Levadura; Queso II; Detergente I

****** ******* **

Lácteo I, No identificado IIIII; Gasolina; ****** ****** ***** ***** Evolucionado III; Mantequilla; Queso III; Vainilla ** No identificado III; Aceite; Almendra amarga; Jabón No identificado IIIIII; Aceite; Corcho; Mantequilla; Almendra amarga; Vainilla; Cuero ***** ** ***** ****** * * ************ ***** ***********

No identificado IIII; Aceite; Corcho; Mantequilla IIII; **** Reducido; Agua sucia; Almendra amarga; Vainilla I No identificado III; Químico; Podrido; Fruta podrida I; Vómito; Laca I

****** ****** ******* * * ************ ** *********** ************ *** ************ ** ************ **** ** * ************ ********** ********* ***********

***** ****

No identificado IIII; Rancio; Madera húmeda; Podrido; ****** ***** * * Fruta podrida; Quitaesmalte; Fermentación I Rancio I; Fermentación II; Medicamento; Cárnico; Barniz; No identificado ***** *** *

Evolución; Madera húmeda; No evolucionado; Caballo; ****** *** Agua sucia; Podrido; Fruta podrida I; Jabón; No identificado * No identificado II; Humedad III; Guiso No identificado I; Humedad III; Guiso; Esmalte; Fósforo; Fermentación I; Mantequilla No identificado IIIII; Humedad III; Reducción; Fruta pasada; Vinagre *** *****

****** *** * ****** ** *****

No identificado III; Humedad I; Caza I; Vinagre II; ****** ****** * * * Medicina; Fruta pasada; Queso Tronco; No identificado III; Cuero; Animal I; Cuadra II; Laca; Sudor ***** ***** *** ****

Cuadra IIIIIII; Betún I; Cuero III; Sudor de caballo; * Animal II; Boñiga I Cuadra IIIIIIII; Cuero IIIII; Sudor de caballo; Boñiga III; Animal I; Brett No identificado II; Oxidado; Medicina II; Quemado; Queso; Formol; Moho I; Yodo * ***

****** ****** *** ****

****** ***** ****** ****** ****** ***** **********

No identificado IIIIIII; Oxidado; Medicina I; ****** ****** ****** *** * * Quemado; Moho II; Verdura; Mostaza II; Formol * No identificado IIII; Oxidado; Medicina IIII; Quemado I; Moho IIII; Pintura; Tierra; Formol **** ****** ****** ** *** ***

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• 3TD: Aromas de leche hirviendo a copa parada y de yogurt natural y cuajada con miel. Los aromas lácteos son muy dominantes y tapan todo lo demás. Boca con dominancia del lácteo que recuerda la cuajada. Final de boca a café con leche, moca de café y cacao. • 1P: Aromas florales y de fresa, carácter especiado con recuerdos de humami. Tonos cárnicos de sangre con recuerdo a la morcilla, tierra húmeda y de lombriz. Aromas de salinidad, salitre, recuerdo de cangrejo de playa y marisco, también de pez fresco vivo recién pescado. En boca resulta un vino marinero y con dominancia del carácter humami. Percepción de arroz, paella de marisco de bivalvos. • 2P: A copa parada intenso melocotón muy maduro y fruta en almíbar, regaliz rojo, corteza de árbol. Jersey de lana y algodón. Aromas de bacalao ahumado y salado, piel de bacalao. Escamas de pez. En la boca aparecen de nuevo aromas de arroz pasado. Recuerdo de flor de levadura muy desagradable, arroz quemado de paella. Vegetales en putrefacción vía retronasal. • 3P: Muy especiado al principio, pero se convierte luego en un vino con aromas muy desagradables de aguas fecales y de desecho. Muy desflecado en sus sensaciones gustativas, vomitivo en boca, retronasal fétida. • 4P: Intenso y especiado a copa parada. Pétalos de flor de geranio, yeso húmedo, escayola. Aromas de corteza de alcornoque húmeda con moho. Aguas fecales, a cubo de basura, pañal de niño. En boca recuerda a abono orgánico de origen animal, a purín de establo de vaca. • 1C: Nariz con aromas cárnicos y especiados, aromas de sudor humano, axila, cabello recién cortado. Recuerdos de pizarra en la familia de los minerales, canto rodado. Aromas de pétalo de rosa muerto, en putrefacción. Recuerda a cucaracha con sensación de blátido al final de la evolución olfativa. En boca muy modificado, muy cárnico, guiso de ternera con guisantes. Retronasal de insecticida. • 2C: Aromas de yeso o cemento húmedo recién preparado en agua. Aromas de peluquería, con laca y acetona. Aromas de pozo y agua estancada, sótano húmedo con hongos. Trapo de cocina sucio, parecen mercaptanos por los tonos azufrados. Boca muy agresiva por la carnosidad percibida. Retronasal muy pronunciada en hongos y ceniza, muy quemado.

Para corroborar los datos de cata manifestados por el panel de catadores formados por consumidores informados de la posible contaminación microbiana durante la elaboración del vino, se dieron a catar los mismos vinos a un catador experto. Dicho catador es un profesional dedicado a la enología ciego absoluto. Se eligió dicho catador dada su especial habilidad para la detección de problemas organolépticos en vinos. Las descripciones organolépticas determinadas por este catador se encuentran a continuación: • 1BD: Aromas primarios en nariz, mentolados muy agradables, caramelo de naranja y fresa. Aromas almibarados. Tonos lácteos de mantequilla dulce y queso fresco y notas de leche, también de almendra. Un poco graso a la nariz, pero agradable por los matices almibarados. Boca agraz, afrutado, con retronasal de mantequilla. • 2BD: Aromas nítidos de vainilla y queso semicurado, con percepción de ajo y mantequilla rancia, calzado usado. Por debajo se aprecian las notas de tomillo y el carácter primario del vino. Boca más densa y con sensación más dulce que el anterior. El carácter lácteo vía retronasal es tan evidente como en nariz, revelándose como de leche hirviendo y queso de cabra, un poco sucio. • 3BD: Nariz intensa con dominancia de la mantequilla, aromas de levadura, miga de pan de molde, bollo de leche, corteza de pan y grasa de mantequilla. Tonos de trigo y aromas de oxidación con sensación olfativa de laca. En boca mantecoso, con recuerdo de tocino, torrezno. Retronasal muy láctea. • 1TD: Aromas de sudor a copa parada, queso fresco, trapo húmedo sucio, leche caliente, nata fresca de leche grasa. Frutos secos del tipo piñón y también especiados. En boca untuoso, con recuerdos a tostado y pan quemado. Retronasal con crema, resulta licoroso, crema de whisky. • 2TD: Aromas de yogurt de frambuesa y vainilla a la nariz. También madera quemada, parece que tiene crianza en madera. Aromas de regaliz rojo, leche hirviendo, crema catalana, azúcar flameada y aromas melosos al mover la copa que se hacen dominantes. Boca con buena evolución, retronasal muy láctea y de yogurt natural. Dominan los lácteos en toda la evolución en boca.

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III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica

• 3C: Yeso seco en nariz. Aromas muy cocineros, garbanzo cocido. Carne pasada, mucha humedad, polvo de barrer, suciedad. Sensación de agua sucia en boca, con tanicidad terrosa y agresiva. La intensidad del problema se percibe cada vez más en boca. Retronasal de laca y fijador de pelo. • 4C: Aroma a pelo humano dominante, peluquín, pelo quemado. Aromas perrunos y de escoba sucia. Percepción grasa de la acidez volátil. Pescado encurtido, boquerón en vinagre. En boca muy agresivo, con recuerdo a polvo de barrer y productos de peluquería. En retronasal sale el recuerdo al encurtido con vinagre, conejo o perdiz escabechada. • 1EF: Aromas de caramelo de fresa a copa parada, sensaciones dulces almibaradas, tonos de hierba y menta. Recuerdos de levadura descompuesta en mal estado, levadura rancia y de grasa rancia. Aromas metálicos de clavo de carpintería. Aromas de tierra y agua sucia de alcantarilla y de establo. Boca con taninos muy agresivos, metálicos, recuerdos de hierro mojado, clavo oxidado. Trapo de fregar. • 2EF: Aromas de pintura plástica, barniz, papel de calco, cartón húmedo, butano, plástico sintético, aromas de vacuno, piel de vaca, cuero de vaca, establo y de boñiga de caballo. Boca con taninos rebeldes acerados y de hierro muy oxidado, lima. Recuerdos de hojalata y silla de montar a caballo, piel de zapato y betún. • 3EF: Sudor de caballo, dominancia de los aromas animales y de betún de zapatos. Sudor humano, axila humana, muy desagradable. En boca recuerda a la boñiga de caballo y a hormiguero. Muy agrio, de ácido fórmico, recuerdo a hormiga. • 1EG: Aromas afrutados de plátano muy maduro, cáscara de plátano ya casi descompuesto. Aromas de yodo, moho, hongo. Aromas de mercromina, anestesia de dentista. Especiado en boca, clavo y laurel. Muy amargo, con aromas de almendra amarga.

• 2EG: Aromas muy especiados a copa parada, mucho clavo y laurel, licor de plátano. Aromas de anestesia líquida intensos, farmacéuticos y de medicamento, serie empireumática, jarabe, aspirina efervescente, éter. Champiñón y moho, paja mojada y heno verde. Tonos de yodo. Muy medicinal en boca con gusto a jarabe. Retrogusto de caucho, de corcho descompuesto, corteza de árbol podrida. • 3EG: A copa parada impresión especiada muy intensa acompañada de aromas a micelio de hongo y moho verde. Aromas de ceniza y tierra mojada. Tonos ahumados, neumático caliente, goma de coche después de frenar. Gusto a moho muy perceptible, recuerda al amargor de flor de levadura asociado con yodo muy dominante.

2.8 Conclusiones
1. Un consumidor bien informado acerca de posibles problemas fermentativos en la vinificación, es capaz de detectar defectos organolépticos presentes en el vino asociados a ciertos compuestos químicos originados por una fermentación maloláctica sin control. Los descriptores empleados y elegidos de forma libre para definir los defectos encontrados en los vinos fueron similares y concordantes a los empleados por un catador profesional que analizó las mismas muestras de vino aromática y gustativamente, aunque con menor agudeza sensorial y con menor frecuencia de detección. 2. Entonces los consumidores habituales de vino, cuando son sometidos a una disciplina de cata concentrándose en las sensaciones olfativas percibidas, son capaces de discriminar y distinguir entre vinos correctos y vinos defectuosos, con aromas impropios causados por problemas microbianos. 3. Estos defectos organolépticos se pueden evitar ejerciendo un control de la FML del vino, inoculando una bacteria seleccionada que evite presencia de contaminantes y manteniendo unas condiciones higiénico sanitarias adecuadas en bodega durante la elaboración del vino.

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67

E

III.3. Efectos de los contaminantes microbiológicos inducidos por la fermentación maloláctica descontrolada en vino

Jürg GAFNER* Astrid BACHMANN Andrea FREI Francis HESFORD Naomi PORRET Katharina SCHNEIDER
Agroscope ACW Wdenswil, Swiss Federal Research Station for horticulture, po box 185, 8820 Wädenswil, Suiza
*Autor corresponsal: juerg.gafner@faw.admin.ch

3.1 Resumen 3.2 Introducción 3.3 Trastornos por intolerancia a la histamina 3.4 Prevención de la formación de aminas biógenas en el vino 3.5 Garantizar la seguridad microbiológica y la calidad del vino 3.6 Resumen de resultados

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Fermentación Maloláctica

3.1 Resumen

III.3. Efectos de los contaminantes microbiológicos inducidos por la fermentación maloláctica descontrolada en vino

Las aminas biogénicas que se encuentran en el vino y en otros alimentos constituyen siempre una indicación de la presencia de microorganismos indeseables con una gran actividad descarboxilasa, como por ejemplo las bacterias lácticas de las especies Pediococcus (Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus) y Lactobacillus (Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii). La detección de microorganismos durante la vinificación se suele hacer al microscopio. Con este método se puede detectar la aparición de microorganismos indeseables y prevenir que sigan desarrollándose. Sin embargo, a menudo esta forma de detección sencilla, relativamente barata y eficaz no resulta suficientemente sensible, pues se pueden formar metabolitos indeseables a partir de concentraciones de microorganismos inferiores al umbral de detección de un microscopio (que ronda las 104 células/ml). La utilización de un sistema de detección basado en PCR cuantitativo, desarrollado por nuestro grupo, permite detectar la presencia de levaduras y bacterias por debajo de un umbral de detección de 100 células/ml, e indicar así el riesgo potencial de bacterias que forman aminas biogénicas. Durante la vinificación, la adición de cultivos iniciadores de bacterias Oenococcus oeni impide o retrasa el desarrollo de Pediococcus ssp. y Lactobacillus ssp. y por lo tanto la formación de aminas biogénicas.

3.2 Introducción
La descarboxilación del aminoácido histidina tiene como resultado la formación de histamina, una de las llamadas aminas biogénicas. De entre todas las aminas biogénicas, la histamina es la más importante en medicina. Normalmente, esta sustancia se degrada sin problemas tras la ingesta de alimentos, pero el número de personas que reaccionan a pequeñas cantidades de aminas biogénicas en los alimentos con síntomas radicales aumenta constantemente. Este tipo de patología se llama “Intolerancia a la histamina”. Las personas aquejadas de esta enfermedad tienen que observar dietas bajas en histamina. La histamina se forma durante la biosíntesis normal de las proteínas por los seres humanos, pero también a consecuencia de la actividad bacteriana. En el vino, la histamina es un contaminante indeseable. Se forman aminas sobre todo durante la fermentación y maduración de alimentos como el queso, las verduras, los embutidos y el pescado. Un alto contenido de histamina en la comida también está correlacionado con la alteración de la misma; la concentración de histamina en la comida es, en efecto, signo de frescura y calidad.
69

III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica

Durante el tratamiento de la comida, también es frecuente la formación de aminas biogénicas distintas de la histamina, como la putrescina, la tiramina, la

cadaverina etc. La presencia concurrente de estas aminas biogénicas incrementa la toxicidad de la histamina 1 y 5.

Tabla 1.
Contenido de histamina de los alimentos con mayor contenido de histamina 2. Queso (mg/kg) Emmental Bergkaese Parmesano Gouda, Edam, Stangenkaese Tilsiter, Geheimratskaese, Butterkaese Quesos azules austriacos Camembert, Brie Schlosskaese, Romadur Quargel (queso ácido curado) Queso fresco, de Burgos Bebidas alcohólicas (μg/kg) Vino tinto Vinos tintos austriacos Vinos blancos austriacos Vino espumoso Cava 670 Cerveza Weizenbier Cerveza sin alcohol Embutido (mg/kg) Salami <10-280 Otras salchichas curadas Osso collo, jamón Westfaeler Carne fresca Pescado y derivados (mg/kg) Pescado fresco Pescado fresco, estropeado Productos ultracongelados Conservas (p.e. atún en lata) Verduras (mg/kg) Tomates (ketchup) Espinacas Aguacates Berenjenas Col fermentada Vinagre (μg/kg) Vinagre de vino tinto
70

contenido (max) <10-500 (2’500) <10-1’200 <10-580 <10-200 (900) <10-60 <10-80 <10-300 (600) <10-100 <10-50 (390) 0

hasta 3’800 60-600 (1’100) 10-120 15-80 20-50 120-300 15-40

<10-100 <10-300 <1

0 hasta 13’000 0-5 (>50) 0-15 (300)

22 30-60 23 26 10-200

4’000

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Fermentación Maloláctica
rancia de histamina en diversos productos alimentarios. En el caso del vino, el umbral de tolerancia es de 10 mg/L. Para ser considerado sin histamina, un vino no debe tener una concentración de histamina superior a 0.5 mg/L. Se sabe que, entre las especies de bacterias lácticas, existen cepas capaces de no formar prácticamente aminas biogénicas, o al menos no niveles elevados. Más concretamente, las cepas de Pediococcus ssp.. y Lactobacillus ssp. son capaces de producir mayores cantidades de histamina en el vino. La industria alimentaria y la industria del vino han empezado a utilizar cultivos bacteriológicos iniciadores con propiedades definidas también con respecto a la formación de aminas biogénicas. La inoculación de especies y cepas de bacterias lácticas con poca o ninguna capacidad de formación de aminas biogénicas reduce su incidencia en los alimentos procesados. Las aminas biogénicas (histaminas) no deberían aparecer en absoluto en los vinos. Sin embargo, durante la vinificación pueden estar presentes tanto microorganismos indeseables como deseables. Los productores de vino deben asegurarse de que los microorganismos indeseables no tengan ninguna oportunidad. Mediante la adecuada inoculación de levaduras Saccharomyces cerevisiae para las fermentaciones alcohólicas y de bacterias Oenococcus oeni para las fermentaciones malolácticas, se puede avanzar mucho hacia la producción de un vino de buena calidad 1 y 5. En los cultivos iniciadores, se ha controlado meticulosamente la presencia de sustancias metabólicas indeseables.

3.3 Trastornos por intolerancia a la histamina
En la actualidad ya se sabe mucho sobre los efectos médicos de la histamina. La mayor parte de las personas con intolerancia no tienen suficiente actividad de diamina-oxidasa (DAO), una enzima que normalmente está presente en el organismo. Esta enzima convierte las aminas biogénicas como la histamina en productos inocuos. Los trastornos comienzan después de ingerir un alimento rico en histamina. Los síntomas más importantes son el enrojecimiento de la piel junto con picores, dolor de cabeza, náuseas, trastornos digestivos, diarrea y trastornos respiratorios. También aparecen signos típicos de alergia, como ojos enrojecidos y “goteo nasal”. La capacidad de degradar la histamina presente en los nutrientes se reduce drásticamente en los seres humanos al consumir alcohol, y también como efecto secundario de ciertos fármacos. Ambos inhiben la actividad de la enzima diamina oxidasa que está presente en el intestino. Por ese motivo, hay que evitar el consumo conjunto de bebidas alcohólicas (cerveza, vino, espumosos, destilados etc.) y alimentos con altas concentraciones de aminas biogénicas.

3.4 Prevención de la formación de aminas biogénicas en vino
El motivo más frecuente del incremento de la cantidad de aminas biogénicas presentes en los alimentos son las bacterias de alteración que pueden formar aminas biogénicas como las histaminas durante el tratamiento, la maduración o el almacenamiento de comida deficientemente controlado1 y 5. Las normas de alimentación suizas estipulan los umbrales de tole-

Tabla 2.
Contenido de aminas biogénicas de los vinos del este de Suiza (1984) 3, 5 Valores medios en mg/L Aminas biogénicas Histamina Tiramina 2- Feniltilamina Putrescina Isoamilamina Cadaverina 151 vinos tintos / 51 vinos blancos (valores máximos) 2.0 (20) / 1.5 (10) 2.8 (24.6) / 7.5 (43.8) 1.7 (9.4) / 1.7 (8.5) 21.4 (200) / 11.1 (>100) 8.2 (38.8) / 6.3 (17) 0.3 (1.2) / 0.1 (0.8)

Los valores mínimos y medios se han observado en los vinos con procesos controlados. La vinificación sin control microbiano origina los valores máximos 71

III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica

Las investigaciones realizadas durante varios años han demostrado que la inoculación adecuada de

cepas de Oenococcus oeni durante la vinificación previene la formación de aminas biogénicas.

Tabla 3.
Contenido de histamina en los vinos sometidos a FML – impacto de los cultivos iniciadores en la mejora de la calidad del vino 4, 5 Cultivos iniciadores de O. oeni utilizados Bitec EQ 54 Viniflora oenos “espontáneo” Contenido de Histamina del vino (mg/L) <1 <1 <1 <1

Las demás aminas biogénicas detectadas en el vino presentan concentraciones inferiores a <1 mg/L

3.5 Garantizar la seguridad microbiológica y la calidad en el vino
Durante la vinificación, es fundamental conocer la composición microbiana del mosto y el vino para garantizar la calidad del producto final. Existen levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y bacterias (Oenococcus oeni) deseables, así como levaduras (Hanseniaspora uvarum y Brettanomyces bruxellensis) y bacterias (Pediococcus ssp. y Lactobacillus ssp.) indeseables. Nuestro sistema de detección, basado en PCR cuantitativo, permite diferenciar entre las especies mencionadas más arriba, y también entre

microorganismos vivos o muertos. Hemos optado por mantener los genes de levaduras y bacterias. Los hemos secuenciado, y hemos definido los cebadores y sondas para PCR. Con nuestro sistema hemos podido diferenciar entre las diversas especies. En los vinos con mayores concentraciones de aminas biogénicas hemos encontrado Pediococcus ssp. y Lactobacillus ssp. No obstante, la concentración de aminas biogénicas formadas y los recuentos celulares determinados no son correlativos. Las aminas biogénicas analizadas en el vino son: histamina, tiramina, putrescina, cadaverina, 2-feniletilamina, espermina, triptamina e isopentilamina.

Tabla 4.
Contenido de aminas biogénicas en los vinos (2005, datos inéditos) Histamina: 8 vinos con >10mg/l, hasta 26.1 mg/l Tiramina: 11 vinos con >10mg/l, hasta 22.7 mg/l Putrescina: 18 vinos con >10mg/l, hasta 500 mg/l Isopentilamina: 6 vinos con 10mg/l, hasta 39.7 mg/l Cadaverina: n.d. – 7.2 mg/l Triptamina: n.d. – 11.6 mg/l 2-PE-amina: n.d. – 17.7 mg/l Espermina: n.d. – 0.9 mg/l

En muchas muestras con bacterias Pediococcus ssp., también se encuentran levaduras Brettanomyces bruxellensis. Ya habíamos observado esta incidencia conjunta en estudios anteriores. No obstante, no sabemos cómo interactúan estos dos microorganismos. En las muestras de vino que contienen ambos micro72

organismos, hemos detectado mayores cantidades de aminas biogénicas (a partir de Pediococcus ssp.) así como el sabor desagradable producido por Brettanomyces, los etilfenoles (a partir de Brettanomyces bruxellensis). Como los vinos se filtraron antes de su embotellado,

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Fermentación Maloláctica Tabla 5.

Contenido de aminas biogénicas y etilfenoles en vinos con sabor a moho generado por Brettanomyces (2005, datos inéditos) 2-Feniletilamina1 Isopentilamina1

4-Etilguayacol2

573 574 575 576

2003 2002 2000 1998

3.3 7.7 10.5 11.6

2.4 6.3 8.8 10.5

n.d n.d. n.d. n.d.

0.4 0.8 0.4 0.7

0.4 1.0 0.5 0.6

6.4 11.4 15.6 17.4

1.0 1.3 1.1 1.3

n.d. n.d. 0.1 0.1

607.4 1351.3 1180.3 1346.8

186.8 243.9 198.5 227.2

69.6 226.0 183.4 213.6

Umbral sensorial
1 en mg/L; 2 en Ìg/L

300-600

50

no se pudieron detectar levaduras Brettanomyces ni bacterias lácticas (Lactobacillus ssp y Pediococcus ssp.). Los catadores a menudo describen este sabor desagradable (“a moho”) como medicinal, animal, a calcetín sudado, a establo, a humo, metálico, a tirita y especiado. Mediante la determinación de 4-etilguayacol, 4-etilfenol y 4-etilcatecol, las tres principales sustancias del sabor a “moho” presentes en nuestras muestras, hemos podido observar una buena correlación entre su concentración y el recuento celular determinado: a mayor número de células, más cantidad de dichas sustancias se forma. En nuestra bodega hemos observado un incremento de la alteración del “moho” desde finales de julio de 2002 hasta finales de septiembre de 2002. Este efecto sensorial está correlacionado con la concentración de las tres sustancias principales, así como con el incremento del recuento celular en algunos casos a razón de al menos cinco veces (no se presentan los datos).

suficiente de precursores de la formación de aminas biogénicas, es decir los aminoácidos. Hemos desarrollado un sistema basado en la técnica de PCR cuantitativo para determinar las levaduras y bacterias presentes en el vino6. Con este sistema, tenemos la posibilidad de medir la cantidad de bacterias lácticas productoras de aminas biogénicas presente, antes de que empiecen a producir sustancias indeseables. Este método no incluye un sistema de enriquecimiento previo. Hemos analizado al menos un centenar de vinos para comprobar la presencia de aminas biogénicas en los mismos, y hemos determinado las especies y recuentos de bacterias lácticas presentes. Los resultados se pueden resumir brevemente como sigue: Todas y cada una de las cinco bacterias lácticas pueden ser responsables de la producción de aminas biogénicas. Existe poca o ninguna correlación entre el recuento celular de bacterias lácticas y la concentración de aminas biogénicas. Hemos observado que, en algunos casos, un recuento de 106 células/ml no desemboca en la formación de aminas biogénicas. No obstante, a veces bastan 103 células/ml para producir importantes concentraciones de aminas biogénicas. Normalmente, son suficientes 103 células/ml para la formación de aminas biogénicas. La formación de aminas biogénicas parece ser específica de cada cepa, como ya se había observado en otros estudios. Además, la formación de aminas biogénicas específicas no se puede correlacionar con una especie concreta de bacterias lácticas (por ejemplo, la putrescina la forma Pediococcus damnosus).
73

3.6 Resumen de nuestros resultados sobre las aminas biogénicas en el vino
La producción de aminas biogénicas en el vino acompaña la presencia de bacterias lácticas de las especies: Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus brevis y Lactobacillus hilgardii. Tanto P. damnosus como P. pentosaceus prefieren las regiones vitícolas de clima frío, mientras que L. brevis, L. hilgardii y P. parvulus son más frecuentes en las regiones vitícolas cálidas. Durante la vinificación hay presencia de una cantidad

4-Etilcatecol2 50

Cadaverina1

Triptamina1

Espermina1

Putrescina1

4-Etilfenol2

Histamina1

Tiramina1

Vino No.

Añada

III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica

En el futuro, esperamos transferir nuestro conocimiento del mecanismo de las aminas biogénicas a

otros productos alimentarios que también pueden presentar mayores cantidades de aminas biogénicas.

Tabla 6:
Alimentos que más a menudo causan efectos adversos relacionados con las aminas biogénicas2 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Bebidas alcohólicas (en especial los vinos tintos) Queso (en especial los quesos duros, como el Emmental) Chocolate Salami y otros embutidos Frutos secos Tomates Fresas, cítricos y otros liberadores de histamina Col fermentada (chucrut) Espinacas Pescado

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74

Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica

75

I

III.4. Incidencia cualitativa de la siembra de bacteria en los vinos tintos
Vincent GERBAUX
ITV Francia, Unidad de Beaune 4.1 Control de la fermentación maloláctica mediante la siembra bacteriana de los vinos 4.2 Inoculación conjunta levaduras / bacterias lácticas aplicada a los tintos “jóvenes” 4.3 Influencia de la siembra bacteriana en el color de los vinos dePinot Noir. 4.4 La lisozima, posible alternativa para estabilizar los vinos después de la FML 4.5 Influencia directa de la siembra bacteriana en las cualidades sensoriales de los vinos tintos 4.6 Siembra bacteriana y prevención de los vinos fenolazos 4.7 Siembra bacteriana y control de los contenidos de aminas biogénicas. 4.8 Conclusiones

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Fermentación Maloláctica

III.4. Incidencia cualitativa de la siembra de bacteria en los vinos tintos

L
Figura 1.

a fermentación maloláctica (FML) influye en la calidad organoléptica de los vinos, en especial en la de los tintos. Las modificaciones cualitativas van mucho más allá de una mera disminución de la acidez asociada a la transformación del ácido málico en ácido láctico. En el caso de los vinos de Pinot Noir, la FML aumenta la calidad y complejidad olfativas, en especial las vinculadas a los aromas frutales. En boca, la FML atenúa los sabores astringente, ácido, amargo y alcohólico (Figura 1).

Modificaciones gustativas vinculadas a la realización de la FML en un vino de Pinot Noir.
(La línea de base corresponde al mismo vino, sin realización de la FML)

Astringencia

Acidez

Alcohol

Amargor

Consistencia

Afrutado

Caramelizado

El control de la FML constituye un problema complejo. Cuando el vino es desfavorable al crecimiento de las bacterias lácticas, la FML sólo se inicia al cabo de un plazo de tiempo más o menos largo y aleatorio. A la inversa, la FML se puede producir rápidamente cuando el vino es favorable, pero ese tipo de vino también permite el desarrollo de diversos microorganismos, algunos de los cuales pueden originar alteraciones más o menos graves.

4.1 Control de la fermentación maloláctica mediante la siembra bacteriana de los vinos
La siembra bacteriana de los vinos permite paliar una flora deficiente o garantizar la presencia de una población controlada. Esta técnica ha evolucionado considerablemente desde sus comienzos, hace unos veinte años. Inicialmente, no se podía inocular las biomasas en el vino sin haberlas sometido a una reactivación previa. A principios de los años 1990, las inves77

Fr. Rojas

Vegetal

III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica

tigaciones sobre la adaptación de las bacterias lácticas a las condiciones hostiles han permitido preparar biomasas de siembra directa. En comparación con el de las biomasas "clásicas", el proceso de fabricación incluye operaciones específicas que permiten una adaptación previa de las bacterias a las condiciones que prevalecen en el vino. Gracias a dicha adaptación, las bacterias lácticas se vuelven tan fáciles de utilizar como las levaduras secas activas. El número de preparaciones bacterianas comercializadas aumenta constantemente. Las nuevas biomasas tienen que presentar una mayor eficacia o un interés especial. El ITV de Francia participa activa-

mente en la selección de cepas de bacterias lácticas y en el desarrollo de nuevas biomasas, como por ejemplo: Enoferm Alpha, Lalvin 31 y FML Expertise S. Ha desarrollado estas bacterias lácticas en colaboración con la sociedad Lallemand. Los numerosos experimentos realizados en Borgoña sobre vinos del varietal Pinot Noir, así como en otras regiones vitícolas francesas, han permitido comprobar las aptitudes enológicas de estas biomasas. Así pues, la FML de un vino de Pinot Noir se puede llevar a cabo en unos 15 días a una temperatura de 18° C, y en menos de un mes a 14°C de temperatura. Este segundo resultado permite prescindir de la calefacción (Figura 2).

Figura 2.
Influencia de la temperatura en la actividad de las bacterias lácticas en un vino tinto.

150 Realización de la FML (días) 120 90 60 30 0 Testigo Lalvin 31 Enoferm Alpha FML Expertise S
FML no iniciada al día 220. 75% de la FML a 130 días

11°C 14°C 18°C

4.2 Inoculación conjunta levaduras / bacterias lácticas aplicada a los tintos “jóvenes”
Normalmente, el inicio de la fermentación maloláctica sólo es deseable después de que finalice la fermentación alcohólica. Lógicamente, se aconseja pues proceder a la siembra bacteriana en esa etapa. No obstante, también puede ser interesante una siembra bacteriana más precoz, al principio o en el transcurso de la fermentación alcohólica, principalmente por los motivos siguientes: - Reducir el tiempo de elaboración de los vinos destinados a ser consumidos jóvenes, - Evitar la proliferación de bacterias lácticas indeseables procedentes de la flora indígena. Esta técnica requiere un buen seguimiento enológico para evitar el riesgo principal, que es el del picado lác78

tico. Este riesgo depende de diversos parámetros, en muy especialmente del nivel de pH (el riesgo es mayor cuanto más alto es el nivel de pH). En la práctica, el picado láctico no se puede desencadenar hasta que se ha agotado el ácido málico. El ITV Francia ya ha trabajado sobre esta técnica hace una decena de años, con resultados interesantes. El objetivo principal consistía en simplificar la utilización de las bacterias lácticas, que por entonces requería una fastidiosa reactivación antes de su uso. En la actualidad, esta técnica se aplica con las biomasas bacterianas de siembra directa. Los trabajos acometidos hace ya varios años persiguen un mejor conocimiento de los crecimientos y actividades metabólicos respectivos de las levaduras y las bacterias lácticas. Los experimentos realizados con Gamay en Beaujolais (fermentación de vendimia entera) demuestran que la inoculación conjunta de levaduras y bacterias permite que la FML se lleve a

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Fermentación Maloláctica
mine la fermentación alcohólica. En esa situación, el riesgo de picado láctico es real. Para permitir un mayor control de esta técnica, el ITV Francia ha trabajado en una nueva formulación de biomasa bacteriana adaptada a la inoculación conjunta de los vinos tipo “joven” poco o nada sulfitados. El objetivo consiste en hacer coincidir la duración de la FML con la duración de la fermentación alcohólica (Figura 3).

cabo en un plazo de tiempo acusadamente más breve que el registrado en los lotes testigo sin siembra. Ahora bien, la utilización de biomasas bacterianas inicialmente destinadas a su siembra directa en los vinos una vez finalizada la fermentación alcohólica puede inducir un desarrollo demasiado rápido de la FML. Ésta se puede producir en cuestión de días tan sólo, y por lo tanto culminar mucho antes de que ter-

Figura 3.
Optimizacón de la inoculación conjunta en los vinos tintos de tipo "jóvenes".

Testigo 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0

Co-inoculation Lev. / BL

BL fin FA

ac málico(g/l)

Trasiego

Fin de la FA

7

14

tiempo (días) 21

28

35

Esta nueva formulación “especial inoculación conjunta” saldrá al mercado enológico probablemente en 2006, a un precio reducido comparado con el de las biomasas destinadas a la siembra directa de los vinos. Los trabajos demuestran que los vinos acabados elaborados mediante inoculación conjunta no presentan ninguna anomalía analítica. El nivel de acidez volátil, el color o la concentración de polifenoles son similares a los obtenidos con la técnica de referencia.

4.3 Influencia de la siembra bacteriana en el color de los vinos de Pinot Noir
Tradicionalmente, los vinos de Pinot Noir de Borgoña requieren plazos de tiempo considerables para la realización de la FML. La frescura de las bodegas, la alta graduación alcohólica así como el nivel de pH, que puede ser relativamente bajo, explican este fenómeno. El recurso a la siembra bacteriana permite reducir el plazo de obtención de la FML. En un vino de pinot noir, sembrado de bacterias lácticas al final de la FA y mantenido a unos 18°C, la FML culmina rápidamente (15 días, frente a más de dos meses para el vino sin sembrar). Paralelamente, se observa una pérdida de

intensidad colorante de un 10 a un 15% con respecto a un vino testigo sin sembrar. El tono de color y los polifenoles no se modifican, y en las catas analíticas, los jurados no diferencian significativamente los lotes sembrados de los lotes testigo por lo que a la calidad visual se refiere. De todas formas sería interesante buscar soluciones que permitan reducir esa pérdida de color observada analíticamente. Los trabajos han tratado principalmente sobre la temperatura de realización de la FML. La temperatura influye en el crecimiento y la actividad de las bacterias lácticas. Cuanto más baja es la temperatura (entre 10 y 20°C), más lenta será la culminación de la FML. A 18°C, los lotes sembrados de bacterias lácticas pierden más color a raíz de la FML que los lotes expuestos a una temperatura más baja. A 14°C, y más aún a 11°C, el color aumenta durante el periodo de latencia más o menos prolongado previo a la puesta en marcha de la FML. Sólo disminuirá después de que haya terminado la FML. El sulfitado de final de la FML aplicado más tardíamente tiene una incidencia más limitada sobre la pérdida de color que un sulfitado precoz (Figura 4). Una siembra bacteriana retrasada con respecto al final de la FA puede provocar el mismo fenómeno. En
79

III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica

Figura 4.
Influencia de la temperatura ambiente en bodega en la evolución del color de un vino de Pinot Noir.
(claridad: inversamente proporcional a la intensidad colorante)

32 color (claridad) 28 24 20 16 0 30 60 90 120 tiempo (días) 150 180 fin FML + SO2

11°C 18°C

la evolución del color de los vinos tintos durante la crianza intervienen fenómenos químicos lentos. En efecto, los resultados demuestran que el color de los vinos de Pinot Noir evoluciona en tres fases: - intensificación entre el trasiego y la puesta en marcha de la FML, - estabilización durante la realización de la FML, - disminución después del sulfitado del final de la FML y de los siguientes. Una temperatura fresca en bodega permite prolongar la primera fase, con lo cual se mantiene intacto el interés de la siembra bacteriana para garantizar un desarrollo lento pero controlado de la FML.

4.4 La lisozima, posible alternativa para estabilizar los vinos después de la fermentación maloláctica
Si no se les aplica un tratamiento de estabilización, en los vinos tintos la población de bacterias lácticas se mantiene elevada durante varios meses después de la terminación de la FML. Por ello, se recomienda estabilizar los vinos sin tardanza. La utilización de SO2 es la solución habitual. Sin embargo, aunque el efecto del SO2 sobre las bacterias lácticas es incuestionable, lo cierto es que este producto no es neutro para el vino. Ya hemos expuesto más arriba sus consecuencias sobre el color. El SO2 también puede engendrar pérdidas olfativas y gustativas, pérdida de caracteres fruta-

les, merma de la armonía, incremento del carácter desecante. En esos casos, la lisozima (proteína extraída de la clara de huevo) puede ser una solución interesante para tratar los vinos al final de la FML con el propósito de retrasar o reducir la utilización de SO2. La adición de 250 mg/l de lisozima permite una reducción de la flora bacteriana equivalente a la de un sulfitado a razón de 50 mg/l. También resulta interesante una dosis de lisozima de 125 mg/l (equivalente a un sulfitado a unos 30 mg/l). En esas condiciones, se estabiliza la acidez volátil, mientras que en los lotes sin tratar, ésta aumenta durante las semanas siguientes a la FML. La lisozima ejerce una acción específica sobre las bacterias lácticas, contrariamente al SO2, que tiene un amplio espectro de actividad. Por lo tanto, en caso de utilización de lisozima, conviene vigilar el desarrollo siempre posible de levaduras Brettanomyces, contra las cuales sigue siendo aconsejable el sulfitado. Pero a la inversa, la utilización de lisozima puede resultar preferible al sulfitado en caso de conclusión difícil de la fermentación alcohólica, cuando la FML, en cambio, ha terminado. Se ha ensayado la adición de lisozima después de la FML (200 mg/l) en varios casos, comparándola con un sulfitado (30 mg/l). Los análisis sensoriales realizados sobre los vinos acabados demuestran que los lotes estabilizados con lisozima y que presentan contenidos reducidos de SO2 tienen niveles cualitativos equivalentes o superiores a los sulfitados (Figura 5). Las aplicaciones prácticas realizadas en Borgoña en vinos de Pinot Noir criados en barrica de roble confirman estos resultados.

80

Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica Figura 5.

Influencia comparada de la utilización de lisozima y de SO2 después de la FML en la calidad de los vinos tintos

SO2 : 30 mg/l 14 calidad global (sobre 20) 12 10 8 6 Bourgogne Pinot Noir Touraine Cabernet Franc

Lyso.: 200 mg/l

Bordeaux Merlot

Bordeaux Cabernet Sauv.

4.5 Influencia directa de la siembra bacteriana en las cualidades sensoriales de los vinos tintos
Las bacterias lácticas son microorganismos que presentan numerosas actividades metabólicas. Ya se ha demostrado que algunas de esas actividades afectan a moléculas aromáticas. Por ejemplo, el metabolismo del ácido cítrico desemboca en la producción de diacetilo, un compuesto con olor a mantequilla. No obs-

tante, en el medio, que es el vino, la actividad de las bacterias lácticas se “diluye”en la complejidad del producto. El seguimiento organoléptico de vinos obtenidos en condiciones experimentales demuestra que, en general, no existe ninguna diferencia significativa entre los vinos testigo y los vinos sembrados de bacterias lácticas (Figura 6).

Figura 6.
Influencia de la siembra bacteriana en las cualidades sensoriales de los vinos tintos

Testigo 4

Lalvin L31

Enoferm Alpha

puntuaciones de 1 a 5

3,5 3 2,5 2 Calidad visual Calidad olfativa Calidad gustativa Calidad global

81

III. Incidencias organolépticas, color y efectos al realizar la fermentación maloláctica

Las condiciones muy controladas favorecen la obtención de vinos testigo (no sembrados) sin defectos, si bien esto no siempre es así en condiciones prácticas.

4.6 Siembra bacteriana y prevención de los vinos fenolados
El control de la FML mediante siembra bacteriana también puede contribuir a preservar el nivel cualitativo de los vinos tintos evitando el desarrollo de Brettanomyces, la levadura de alteración directamente responsable del carácter fenólico de los vinos. La siembra bacteriana induce una ejecución más rápida y homogénea de la FML, lo cual permite plantearse una estabilización precoz del vino. En esas condicio-

nes, se minimiza el tiempo de que dispondrá Brettanomyces para desarrollarse y expresar su metabolismo. Esta competencia temporal es decisiva, pues además, las floras de bacterias lácticas y de Brettanomyces no desarrollan interacciones sensibles entre sí. Los resultados obtenidos en Pinot Noir demuestran que los vinos elaborados aplicando una siembra bacteriana adecuada tienen un contenido débil o nulo de fenoles volátiles (niveles siempre muy inferiores al umbral de percepción). Por otro lado, los vinos elaborados sin siembra de bacterias lácticas presentan contenidos de fenoles volátiles más o menos altos, según de qué vino se trate. Estos resultados se han obtenido en laboratorio, con contaminaciones por Brettanomyces provocadas, y en bodegas con contaminaciones espontáneas (Figura 7).

Figura 7.
Interés de la siembra bacteriana para la prevención de la aparición de gustos fenolados.

Testigo no sembrado
cata (puntuaciones de 1 a 5)

Siembra bacteriana Fenoles volátiles:

4

3

1100 µg/l 30 µg/l

2

1 Calidad olfativa Calidad gustativa Calidad global Nota animal

El análisis sensorial de los vinos contaminados por esta vía demuestra que el perjuicio cualitativo asociado a Brettanomyces es significativo. Los vinos sin sembrar presentan notas animales desarrolladas, mientras que los vinos sembrados de bacterias lácticas presentan un nivel cualitativo global superior. Si la temperatura de bodega es fresca, la técnica sigue resultando interesante. El metabolismo bacteriano se desacelera, la FML es más lenta, pero también se desaceleran el crecimiento y la actividad de Brettanomyces. La siembra bacteriana de los vinos tintos constituye pues una herramienta interesante para reducir el riesgo de aparición del carácter fenólico.

4.7 Siembra bacteriana y control de los contenidos de aminas biogénicas
Ciertas aminas biogénicas están directamente vinculadas a la actividad de las bacterias lácticas en los vinos. La histamina, la tiramina y la putrescina son las tres aminas biogénicas que pueden evolucionar sig82

nificativamente durante y después del desarrollo de la FML. A la histamina y la tiramina se les imputa la responsabilidad de ciertos casos de alergias alimentarias. En comparación con otros productos alimentarios expuestos a bacterias lácticas, en los vinos estas moléculas sólo llegan a alcanzar concentraciones bajas, en principio carentes de efectos sobre la salud. De todas formas, la presencia excesiva de aminas biogénicas en un vino puede constituir un obstáculo para su comercialización. El control de los contenidos de aminas biogénicas en los vinos está estrechamente vinculado al control de las bacterias lácticas. La siembra con biomasas seleccionadas hace posible ese control. Los vinos cuya FML se ha controlado mediante siembra bacteriana presentan contenidos reducidos de histamina, tiramina y putrescina en comparación con los vinos testigo con flora indígena. Las biomasas bacterianas comercializadas en el mercado enológico deben pues incluir ese criterio en sus pruebas de selección (Figura 8).

Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica Figura 8.

Influencia comparada de la utilización de lisozima y de SO2 después de la FML en la calidad de los vinos tintos

Enoferm Alpha 10 contenidos en µg/l 8 6 4 2 0 histamina

Lalvin 31

FML Expertise S

tiramina

putrescina

Ahora bien, hay que recordar que la población de bacterias lácticas se mantiene a un nivel elevado después de la culminación de la FML, sobre todo en los vinos tintos. Para los vinos de Pinot Noir, naturalmente ricos en aminoácidos, ese periodo es crítico en relación con la producción de aminas biogénicas. Por lo tanto se aconseja proceder a una estabilización microbiológica inmediatamente después de terminar la FML (sulfitado clásico o utilización de lisozimas).

ter fenólico. Ciertas cepas de bacterias lácticas producen demasiadas aminas biogénicas. Para restringir la actividad de los microorganismos perjudiciales, la solución obvia consiste en la estabilización microbiológica precoz. Para conciliar estas dos necesidades opuestas, en especial en los vinos de crianza, la siembra bacteriana constituye una respuesta interesante. En efecto, permite asegurar la realización de la FML en un plazo que se podrá modular jugando principalmente con la temperatura de la bodega. Las biomasas propuestas en la actualidad soportan temperaturas frescas. En el caso de los vinos destinados a ser consumidos jóvenes, se puede acelerar el control de la FML utilizando la inoculación conjunta. En ese caso, la FML se realiza al mismo tiempo que la fermentación alcohólica. Por último, la estabilización microbiológica de los vinos después de la FML se puede regular en función del riesgo afrontado. Si es necesario, se puede combinar un sulfitado clásico con la utilización de lisozima para crear mejores condiciones al principio de la crianza, si bien, en ese caso, no se inhibirán las Brettanomyces ni las bacterias acéticas. En ese caso, un control microbiológico deberá concretar ese riesgo. En la actualidad, el enólogo dispone de numerosas bazas para controlar la FML y la estabilización microbiológica de los vinos. Estas se deben adecuar a las situaciones enológicas para aprovechar al máximo sus efectos beneficiosos.

4.8 Conclusiones
El interés de la FML para la calidad de los vinos tintos está bien reconocido. Por lo general, esta operación se realiza al principio de la crianza, a la vez que se inician fenómenos químicos y biológicos más o menos controlados y más o menos interesantes para la calidad del vino. Obviamente, durante esta etapa el vino no está estabilizado. El color y los compuestos fenólicos evolucionan debido sobre todo a las aireaciones (trasiego, crianza en barricas…). El sulfitado aconsejado al final de la FML tiende a bloquear o a desacelerar esta evolución. Por lo tanto, puede resultar interesante prolongar la duración de la FML, por ejemplo rebajando la temperatura de la bodega (en torno a 14°C), para prolongar ese tiempo de crianza sin SO2. Sin embargo, la prolongación del plazo de realización de la FML plantea o puede plantear un problema de tipo microbiológico. Es corriente que la flora indígena de los mostos y los vinos contenga microorganismos perjudiciales. A menudo está presente Brettanomyces, levadura directamente implicada en el carác-

83

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica
Índice

I

87 97 117
97 117

87

IV.1. Los tipos de vino y el momento óptimo para la inoculación. Cómo controlar el proceso.
Dra. Sybille Krieger Lallemand

IV.2. Fermentación maloláctica en barrica.
José Hidalgo Togores Dr. Ingeniero Agrónomo y Enólogo

IV.3. Fermentación maloláctica: cuándo y cómo
Antonio Palacios Carlos Suárez José María Heras Sibylle Krieger Lallemand

L

IV.1 Los tipos de vino y el momento óptimo para la inoculación. Cómo controlar el proceso

Dra. Sybille KRIEGER
Lallemand Alemania
1.1 Inoculación simultánea de levadura y bacterias 1.2 Producción de acidez volátil 1.3 Inoculación de cultivos lácticos iniciadores durante la fermentación alcohólica 1.4 Inoculación de cultivos lácticos iniciadores después de la fermentación alcohólica 1.5 Demora en la inducción de la fermentación maloláctica

Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica

IV.1. Los tipos de vino y el momento óptimo para la inoculación. Cómo controlar el proceso

a fermentación maloláctica (FML) se produce en el vino a resultas de la actividad metabólica de ciertas cepas de bacterias lácticas adaptadas. Frecuentemente se considera que la reducción de la acidez y la modificación del aroma del vino a raíz de esta segunda fermentación bacteriana son favorables a la calidad del vino. La inducción de la FML mediante la inoculación de cepas seleccionadas de bacterias lácticas presenta dos ventajas: en primer lugar, permite un mayor control sobre el momento y la velocidad de la conversión del ácido láctico, y en segundo lugar influye positivamente en el sabor y la calidad del vino. Los estudios sensoriales demuestran que los compuestos aromáticos producidos por las bacterias lácticas introducen cambios sensibles en las características aromáticas del vino1. Varios estudios demuestran que diversas cepas de bacterias malolácticas producen efectos sensoriales en los vinos1,2,3,4,5, si bien todavía no se entiende perfectamente la influencia del momento de la adición bacteriana y del nivel de inoculación.

L

1.1 Inoculación simultánea de levadura y bacterias
La opinión generalizada en la región francesa de Burdeos consiste en recomendar la inoculación de bacterias lácticas una vez terminada la fermentación alcohólica, con objeto de evitar la posible producción de ácido acético y D-ácido láctico, una situación a menudo denominada “piqûre lactique” (picado láctico)6. En efecto, la FML que se desarrolla durante la fermentación alcohólica puede provocar ocasionalmente la interrupción de la fermentación alcohólica. La experiencia americana no ha confirmado los resultados franceses que constatan un incremento de la producción de ácido acético, del antagonismo de la levadura, o la interrupción de la fermentación alcohólica cuando interviene un desarrollo temprano de bacterias lácticas. Se ha abogado por la inoculación de bacterias lácticas porque se entendía que de ese modo, las bacterias tenían más posibilidad de desarrollarse y aclimatarse en ausencia de etanol. De ese modo las bacterias no sufren escasez de nutrientes, ni se ven expuestas a los efectos tóxicos del alcohol. Beelman y Kunkee7 han demostrado que, en presencia de azúcares fermentables, la FML no provoca necesariamente una producción de cantidades excesivas de ácido acético por las bacterias, a condición de que la fermentación de la levadura se inicie y concluya rápidamente1. En cambio, King y Beelman8 han sugerido que el desarrollo de Oenococcus oeni (anteriormente denominada Leuconostoc oenos) PSU-1 durante la fermentación alcohólica en un sistema de mosto modelo se puede retrasar a consecuencia de la producción de
87

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

compuestos tóxicos derivados de la levadura distintos del etanol y del dióxido de azufre. Al comparar las curvas de desarrollo bacteriano en cultivo puro y en cultivo mixto con levadura, han observado que la presencia de levadura de crecimiento rápido es antagónica del desarrollo bacteriano (Figura 1). Han atribuido la inhibición del crecimiento bacteriano a la presencia de metabolitos de la levadura y/o a la eliminación por la levadura de sustancias importantes para la nutrición bacteriana. Los datos ilustrados en la Figura 1, indican que en el cultivo mixto con levadura, el punto de transición de las bacterias de la fase estacionaria a la fase

de crecimiento logarítmico coincide con la fase de mortandad del ciclo de desarrollo de la levadura. Este fenómeno puede ser resultado del retorno al sistema de nutrientes imprescindibles para las bacterias, a resultas de la muerte y la autolisis de la levadura. Mediante la comparación de las curvas de crecimiento de la levadura en cultivo puro y en cultivo mixto, han podido demostrar que la presencia de bacterias no afecta al desarrollo de la levadura durante la fase estacionaria. Por el contrario, han observado una tasa de mortalidad acelerada en la levadura en cultivo mixto en presencia de un rápido desarrollo bacteriano.

Figura 1.
Desarrollo de la levadura y las bacterias en el vino, en cultivo puro y mixto

9

8

7 Recuentos de células viables(cfu/ml)

6

5 levadura (cultivo puro) levadura (cultivo mixto) bacteria (cultivo puro) bacteria (cultivo mixto )

4

3

2

1

0 0 2 3 5 8 10 15 20 30 35 40 50

tiempo (días)

Sistema de Mosto/Vino 20 0B8

1.2 Producción de acidez volátil
Un intenso crecimiento bacteriano puede inhibir el desarrollo de la levadura, lo cual, a su vez, induce la producción de niveles excesivos de acidez volátil9. En la Figura 2, Radler22 comunica un consumo de azúcar de 0.2-2g durante las tres fases de crecimiento ilustradas más abajo. Durante la Fase de crecimiento I, se pueden producir pequeñas cantidades de ácido acético y D-ácido láctico. Cuando se alcanzan recuentos celulares de más de 5x106 cfu/ml en la Fase II, comien88

za la degradación del ácido málico, si bien durante dicha degradación del ácido málico no se produce ácido acético. La Fase III se caracteriza por la degradación de ácido cítrico y azúcares, acompañada de un incremento del ácido acético. No obstante, las bacterias sólo empezarán a consumir azúcares cuando haya terminado la degradación de ácidos orgánicos. El ácido málico será el primero en consumirse, seguido del cítrico, el fumárico y otros10. En ese punto, la degradación de azúcares induce un incremento significativo de la acidez volátil.

Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica Figura 2.

Metabolismo de azúcares y ácidos orgánicos durante la FML en el vino

azúcares (fructosa)

biomasa

malato

lactato

citrato acetato

CRECIMIENTO CELULAR Catabolismo de azúcares No hay catabolismo de malatos No hay catabolismo de citrato Ligera producción de acetato Ligera producción de lactato

Fase Estacionaria I No hay catabolismo de azúcares Catabolismo de malato No hay catabolismo de citrato No hay producción de acetato Producción de lactato

Fase Estacionaria II No hay catabolismo de azúcares No hay catabolismo de malato Catabolismo de citrato Producción de acetato No hay producción de lactato

Experimentos realizados por el grupo de investigación de Lallemand han confirmado que durante el desarrollo de las bacterias lácticas y la FML activa no se produce ácido acético. En esos experimentos, sólo se ha observado una producción de ácido acético cuando ya se ha degradado la mitad del ácido málico y las bacterias empiezan a utilizar el ácido cítrico. Los ensayos realizados mediante la inoculación simultánea de bacterias y levadura y su comparación con la inoculación de bacterias una vez terminada la fermentación alcohólica no han arrojado diferencias de concentración final de ácido acético, aunque sí han demostrado en cambio la existencia de una relación directa entre la degradación de ácido cítrico y un incremento de la concentración de ácido acético11. Dependiendo de la disponibilidad de oxígeno y del potencial de oxidación-reducción del medio, el ácido cítrico o bien puede ser utilizado como un aceptor de electrones, con el resultado de una producción de ácido acético, o se puede degradar en diacetilo. La subsiguiente reducción de diacetilo en acetoína y 2,3butanodiol también depende del potencial de oxidación-reducción del vino. Se considera que el diacetilo es un compuesto aromático importante, y que a concentraciones comprendidas entre 0.02 y 2 mg/l, puede conferir al vino un claro aroma de mantequilla. El umbral gustativo de la acetoína y del 2,3-butano-

diol es muy superior a las concentraciones que suelen presentar en el vino. Por lo tanto, no contribuyen al sabor del vino. Hacen falta nuevos estudios que permitan definir con mayor precisión el efecto del oxígeno y del potencial de oxidación-reducción sobre las concentraciones finales de final diacetilo y ácido acético en el vino. La FML en presencia de lías siempre resulta en bajos niveles de diacetilo, debido a que el poder reductor de la levadura viable transforma el diacetilo en componentes menos aromáticos. Por consiguiente, la inoculación conjunta de levaduras y bacterias en el vino resulta en una menor presencia de sabores lácticos y de mantequilla, es decir en tipos de vino con una mayor carga frutal. Lallemand, en collaboración con la Massey University de Nueva Zelanda, ha elaborado vino utilizando una cepa de levadura compatible con las bacterias lácticas (CY3079), y dos cepas de bacterias lácticas, Lalvin EQ54 y Enoferm ALPHA. Para cada combinación de levadura/bacteria, se inocularon bacterias malolácticas conjuntamente con la levadura (FA/FML simultánea) o después de terminar la fermentación alcohólica (FA/FML secuencial). El vino se elaboró con uvas Chardonnay procedentes de un viñedo comercial en la comarca de Fernhill de la región de Hawke's Bay de Nueva Zelanda. Se prensó la uva, no se añadió SO2 y
89

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

el vino se estabilizó en frío a 4°C durante 24 horas, tras lo cual se añadió 300 mg/l de fosfato diamónico. Se realizaron las vinificaciones por triplicado en garrafones de 25 litros, y el mosto presentaba la analítica inicial siguiente: - 20.70B, pH 3.28 y 10 g/l acidez total cal-

culada como ácido tartárico. Los resultados resumidos en la Tabla 1 demuestran que la FA/FML secuencial siempre producía el resultado de una fermentación maloláctica prolongada comparada con la FA/FML simultánea.

Tabla 1.
Prolongación de la FML en función de la secuencia de inoculación
FA/FML Simultánea Cultivo láctico iniciador EQ54 Cultivo láctico iniciador ALPHA 26 días 19.5 días FA/FML secuencial 74 días (quedaba ácido málico) 68 días

El ácido málico, con una concentración inicial de 5 g/l, se degradó en unas tes semanas, un lapso idéntico al periodo necesario para la conversión del azúcar en alcohol durante la FA/FML simultánea. Si se inoculaban las bacterias lácticas después de la fermentación alcohólica, la FML resultaba difícil y tardaba bastante más tiempo en concluir. El tratamiento secuencial utilizando un cultivo láctico iniciador A, resultaba en una FML incompleta, y quedaba 100 mg/l de ácido málico en el vino (Tabla 1). Durante las dos primeras semanas del experimento, no se apreciaron diferencias significativas en la degradación de glucosa y fructosa al comparar las inoculaciones FA/FML simultánea y secuencial. Sin embargo, a los, 20 días de terminar la FA/FML simultánea, no quedaba ni glucosa ni fructosa detectables en el pro-

tocolo de inoculación conjunta, mientras que en las inoculaciones secuenciales permanecía una concentración global de glucosa y fructosa de 700 mg/L. Dado que la glucosa y la fructosa pueden servir de fuentes de carbono y energía para muchos microorganismos, la total ausencia de estos dos azúcares mejora la estabilidad microbiológica. La degradación de ácido cítrico difería en los tratamientos mediante inoculaciones FA/FML simultáneas o secuenciales. En los tratamientos simultáneos, el ácido cítrico se degradaba más deprisa, y se producía una cantidad de ácido acético ligeramente superior. No obstante, las diferencias de concentraciones finales de ácido acético eran reducidas y estadísticamente significativas.

Tabla 2.
Producción de ácido acético (g/L) en función del protocolo de inoculación
FA/FML Simultánea Cultivo láctico iniciador EQ54 Cultivo láctico iniciador ALPHA 0.195 0.187 FA/FML secuencial 0.147 0.168

El análisis sensorial de los vinos producidos en este experimento puso de manifiesto diferencias entre los vinos elaborados con secuencias de inoculación distintas, si bien poca o ninguna diferencia se podía atribuir a la cepa de bacterias lácticas utilizada. Los vinos elaborados con inoculación conjunta eran más afrutados que los vinos realizados con inoculación simultánea. En colaboración con las estaciones de investigación alemanas sitas en Neustadt y Trier, Lallemand investi90

gó la inoculación simultánea de levadura y bacterias en vino Riesling. Este experimento estaba concebido para determinar el impacto de la adición simultánea de levadura y bacterias lácticas en los aromas del varietal, así como la producción bacteriana de un exceso de ácido acético. Los resultados presentados en la Figura 3, demuestran que la inoculación simultánea de levadura y bacterias no influye en la fermentación de la levadura, y no se forma ácido acético.

Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica Figura 3.

Adición simultánea de levadura y bacterias en función de la fermentación alcohólica

200

160 Simultánea CY3079 Después de la fermentación alcohólica CY3079 Simultánea EC1118 Después de la fermentación alcohólica EC1118

Azúcares totales (g/l)

120

80

40

0 0 2 6 10 14 17 21 24 28 31 35 Días a partir de la inoculación

La inoculación temprana de un cultivo láctico iniciador tenía por resultado una FML mucho más rápida, y el ácido málico se degradaba en 23 días, comparado con más de 50 días si la inoculación se realizaba después de la FA Figura 4. El momento de la inoculación tuvo un impacto importante en el perfil sensorial del vino. En el caso de la inoculación simultánea, el rápido inicio de la FML permitía una degradación del ácido málico en las condiciones reductoras genera-

das por las células de levadura todavía activas. En el experimento de inoculación conjunta, este medio reductor impedía la formación de aromas lácticos o de mantequilla, y el vino conservaba los sabores y aromas típicos de la uva Riesling. Los vinos inoculados después de la fermentación presentaban los sabores a mantequilla y nuez típicos de una fermentación maloláctica, y estaban ausentes los sabores y aromas de la uva Riesling.

Figura 4.
Adición simultánea de levadura y bacterias en función de la fermentación alcohólica
4 Inoculación después de la fermentación alcohólica

3

2

CY3079 sim AF/MLF EC1118 sim AF/MLF CY3079 post AF EC1118 post AF

Ácido málico (g/l)

1

0 0 10 20 30 Días 40 50 60

91

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

Estos resultados demuestran que la inducción simultánea de FA/FML da lugar a vinos que terminan antes la fermentación maloláctica. Los vinos elaborados con este método tendrán una mayor estabilidad microbiológica porque el dióxido de azufre se puede añadir en una fase más precoz de la elaboración y además están ausentes los azúcares glucosa y fructosa. Esta técnica de inducción simultánea de la FA y la FML ha resultado muy satisfactoria en los mostos blancos de pH bajo. Recientemente, la literatura francesa ha mencionado la posibilidad de inoculación simultánea12 de la levadura y las bacterias en el mosto de uva. En la región de Champagne se ha aplicado una variación de esta técnica para aclimatar los cultivos lácticos “normales” durante las primeras fases del proceso “pie de cuba”. El procedimiento utilizado en esta región consta de dos fases, y consiste en una adición de levadura para evitar la contaminación por Lactobacillus durante la aclimatación de las bacterias lácticas deseadas. Los cultivos bacterianos utilizados en la región de Champagne no se aclimatan durante su producción, y por lo tanto no son aptos para su inoculación directa en el vino. Durante el proceso de aclimatación en dos etapas, la fase 1 de reactivación va seguida de la fase 2 “pie de cuba maloláctico” durante la cual las bacterias lácticas se aclimatan lentamente a las difíciles condiciones del vino. El único inconveniente del procedimiento “pie de cuba maloláctico” es su dificultad y el tiempo que lleva, pero la primera fase se tiene que llevar a cabo en el laboratorio. En 1993 Michel Valade et al.13 han propuesto un protocolo de reactivación bacteriana de aplicación más sencilla. Han adaptado las bacterias a concentraciones crecientes cultivándolas en mosto de uva diluido y enriquecido con nutrientes de bacteria láctica y levadura seca activa, y manteniendo el pH controlado en una horquilla de 3.2-3.5. Este procedimiento ha sido una simplificación muy de agradecer de la fase del “pie de cuba maloláctico”. Los autores no han observado una producción excesiva de ácido acético y láctico (“picado láctico”), aunque han advertido que este procedimiento de reactivación no es comparable con la inoculación conjunta del vino. En la actualidad, los investigadores franceses reconocen las ventajas de la inoculación simultánea de bacterias y levadura para la producción de vinos jóvenes diseñados para ser consumidos a los dos meses de la ven-

dimia. Este proceso permite a las bacterias lácticas adquirir tolerancia al alcohol durante la fermentación alcohólica, a la vez que permite que se inicie la FML durante el último tercio de la fermentación alcohólica14 y que termine rápidamente al final de la fermentación alcohólica. La utilización de este método favorece una estabilización temprana de los vinos, los hace aptos para el consumo desde fechas anteriores, además de reducir la posibilidad de que se desarrollen organismos perjudiciales, como bacterias acéticas y hongos Brettanomyces. Esta técnica, combinada con una nutrición satisfactoria de la levadura, garantiza una fermentación de levadura sana con una buena cinética y permite utilizar una cepa de levadura que ayude a la FML. Es fundamental controlar el pH del mosto, manteniéndolo a un nivel de 3.5 aproximadamente, pues si se rebasa este techo, los azúcares se degradan más fácilmente. No obstante, hay que recordar que la Oenococcus oeni no degradará los azúcares hasta que no se haya consumido la totalidad del ácido málico.

1.3 Inoculación de cultivos lácticos iniciadores durante la fermentación alcohólica
La ventaja de inocular las bacterias durante la fermentación alcohólica se puede explicar por el hecho de que en esa etapa, la mayor parte del SO2 libre está ligado por compuestos de carbonilo que se produjeron durante el crecimiento de la levadura, mientras que la concentración alcohólica aún no ha alcanzado niveles tóxicos. Sin embargo, en esta etapa es cuando se pueden dar los niveles más altos de antagonismo por metabolitos -como el ácido decanoico- inducido por la levadura15. Rosi et al16 han comunicado una reducción de la viabilidad bacteriana cuando la inoculación se lleva a cabo a la mitad de la fermentación alcohólica. Han atribuido dicha reducción a factores como el agotamiento de nutrientes, la producción de etanol y una caída del pH provocada por la producción de ácidos. Estos resultados indican además que si se realiza la inoculación en este momento, la fermentación someterá a las bacterias a un fuerte antagonismo con la levadura, que puede resultar insuperable. La investigación realizada en Lallemand ha confirmado estas observaciones, y ha confirmado la conclusión de que la inoculación a la mitad de la fermentación alcohólica resulta siempre en una acusada reducción de la viabilidad y actividad bacterianas. (Figura 5).

92

Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica Figura 5.

Supervivencia de las bacterias lácticas después de la inoculación en distintas fases de la FA
1. 00E+ 08 1. 00E+ 07 Recuento de células viables (cfu/ml) 1. 00E+ 06 1. 00E+ 05 1. 00E+ 04 1. 00E+ 03 1. 00E+ 02 1. 00E+ 01 1. 00E+ 00 0 20 40 60 80 Días 100 120 140 160 inoculación simultánea (1g/hl) inoculación a la mitad de FA (1g/hl) inoculación despues de la FA (1g/hl)

1999 Última vendimia Rieslaner Blanco. pH 3.3, Alcohol 12.5% v/v, 130C

1.4 Inoculación de cultivos lácticos iniciadores después de la fermentación alcohólica
La inoculación al final de la fermentación alcohólica no plantea el riesgo de descomposición bacteriana heterofermentativa de los azúcares con el resultante incremento de la acidez volátil. Este tipo de inoculación tardía evita buena parte de la toxicidad de los ácidos carboxílicos producidos, pues su concentración disminuye después de la fermentación alcohólica17. El mérito de la inoculación al final de la fermentación alcohólica también se puede relacionar con la disponibilidad de nutrientes bacterianos originados por la muerte de la levadura y su autolisis subsiguiente18. No obstante, la exposición a los altos niveles de etanol presentes en el momento de la inoculación tardía puede causar un retraso de la FML, en especial en los vinos producidos en climas cálidos. Normalmente, las bacterias añadidas después de la fermentación alcohólica son capaces de alcanzar concentraciones celulares comparables a las de las bacterias inoculadas en el mosto, siempre que las condiciones del vino no sean restrictivas. En caso de limitación de nutrientes (véase el capítulo sobre Necesidades Nutricionales) o cuando los parámetros químicos del vino son limitadores, la adición de un sistema nutriente bacteriano ayuda a la FML. En los casos en que el grado alcohólico supera un 15.5% v/v, es necesario aclimatar los cultivos bacterianos iniciadores antes de

su inoculación en el vino. El capítulo práctico de esta publicación presenta protocolos de aclimatación especializados.

1.5 Demora en la inducción de la fermentación maloláctica
Durante los últimos 15 años ha mejorado espectacularmente la calidad de los cultivos iniciadores malolácticos. Los cultivos iniciadores disponibles para su inoculación directa en el vino son fáciles de manejar y permiten controlar mejor la fermentación maloláctica. La utilización de estos cultivos lácticos iniciadores de nueva generación permite tanto un inicio temprano como una rápida terminación de la fermentación maloláctica. En la región francesa de Burdeos, o en otras regiones vitícolas que producen principalmente vinos de Pinot Noir, el desarrollo rápido de la FML es contrario a las técnicas de vinificación tradicionales, que siempre han confiado en una FML espontánea en primavera. La utilización creciente de cultivos iniciadores lácticos de inoculación directa ha inducido una FML más rápida, pero también ha tenido como resultado una reducción significativa de la pigmentación. Gerbaux19 ha ilustrado la influencia del inicio temprano y la rápida culminación de la FML en la claridad y la intensidad del color en los vinos de uva Pinot Noir los vinos en Figura 6.
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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

Figura 6.
Influencia de la cinética de la FML en el color del vino de Pinot Noir

30 28

3,5

3 26 _ _ _ _Ácido málico(g/l) 24 _____ Claridad (L*) 22 20 18 16 14 0,5 12 10 0 30 60 90 Tiempo (días) 120 150 180 0 1,5 2,5

2

1

Gerbaux, Enoforum Piacenza, 2005

Ha podido conseguir una mayor estabilización del color cuando se dan las condiciones siguientes: 1. Aumento del tiempo transcurrido entre el trasiego, o eliminación de las lías de fermentación, y el comienzo de la FML 2. Reducción de la velocidad de la FML 3. Retraso de la adición de SO2 hasta después de terminar la FML Por norma general, las técnicas de vinificación que inhiben o retrasan la FML- niveles de SO2 más altos, temperaturas por debajo de 10° C, o la adición de lisozima en cualquier etapa de la vinificación- ayudará a estabilizar la pérdida de color en los vinos de pigmentación ligera como Pinot Noir o Sangiovese. Los consumidores de vino de todo el mundo piden vinos con un color estable, lo cual ha inducido un uso creciente de la técnica de microoxigenación en la vinificación. La microoxigenación provoca la formación de pequeñas cantidades de etanal (acetaldehído), lo cual mejora la polimerización de los polifenoles, resultando en una estabilización del color. Por consiguiente, al terminar la micro-oxigenación, el
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color del vino tinto se estabiliza, lo cual reduce la pérdida de color achacada a la FML. Se sabe que la microoxigenación retrasará el inicio de la FML, lo cual significa que no se debe intentar la inoculación de bacterias lácticas hasta que haya terminado la microoxigenación. Las bacterias lácticas Oenococcus oeni consumirán acetaldehído, por lo cual serán capaces de rescatar en el vino cantidades residuales de este compuesto. Por ello, la inducción de la FML después de la microoxigenación tendrá la ventaja adicional de reducir la concentración de acetaldehído. Cuando se utiliza la microoxidación en climas cálidos para producir vinos tintos de alto pH, se recomienda retrasar la inducción de la FML. Para conseguirlo, se recomienda utilizar lisozimas20 o una combinación de lisozima y SO2. En conclusión, probablemente no exista un planteamiento universal para la inducción de la FML por inoculación. Como han indicado Silver y Madej21, el momento más deseable para la inoculación depende de todo un abanico de factores de vinificación, los más importantes de los cuales son la composición del mosto, la cepa de levadura utilizada para elaborar el vino, y las técnicas de vinificación.

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Fermentación Maloláctica
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IV.2. Fermentación maloláctica en barrica

José HIDALGO TOGORES
Dr. Ingeniero Agrónomo y Enólogo
2.1 Efectos de la fermentación maloláctica en los vinos. 2.2 Acumulación de polisacáridos de origen microbiano. 2.3 Pérdidas de color en los vinos tintos. 2.4 Modificación de los aromas en los vinos. 2.5 Práctica de la fermentación maloláctica en barrica. 2.6 Crianza de vinos sobre lías en depósito.

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Fermentación Maloláctica

IV.2. Fermentación maloláctica en barrica

e todos es conocido los efectos que sobre los vinos produce la fermentación maloláctica (FML), pudiendo ser beneficiosos en algunos casos, como por ejemplo en los vinos tintos que se destinan a crianza, donde es imprescindible lograr una buena estabilidad biológica, que garantice su conservación en el tiempo; o bien para otros vinos, donde la acidez málica puede ser tan elevada, que la desacidificación biológica es prácticamente la única solución posible. En otros casos, este proceso puede suponer un inconveniente, como por ejemplo en los vinos destinados a consumo rápido, donde la presencia de ácido málico puede ser interesante conservar, pues en concentraciones pequeñas, su existencia contribuye a mejorar las sensaciones gustativas, así como también a mantener un nivel adecuado de acidez y frescura en los mismos.

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2.1. Efectos de la fermentación maloláctica en los vinos.
Las consecuencias positivas o negativas, que la FML ocasiona en los vinos se resumen en los siguientes aspectos: • Importante disminución de la acidez total de los vinos, que realizada de forma natural mediante un proceso biológico, en ocasiones puede superar una desacidificación superior al 50 por 100 de la acidez inicial, producida no solo por la eliminación total o parcial del ácido málico, si no también por una mayor insolubilización del ácido tartárico contenido en el vino. Además, las propiedades gustativas de los vinos, mejoran notablemente no solamente por la caída de la acidez, sino también por la desaparición de un ácido áspero y astringente como es el málico, y surgiendo el ácido láctico de gusto más suave y vinoso. • Aumento de la acidez volátil en los vinos, en valores normales de 0,1 a 0,2 gramos/litro, debido a una posible degradación de los azúcares residuales, o también cuando intervienen bacterias heterolácticas en el proceso, pero sobre todo, cuando se produce la metabolización del ácido cítrico natural de la vendimia, generalmente durante la etapa final de la FML y prácticamente cuando ya no existe ácido málico en el medio, así como también de otros compuestos existentes en el vino, tales como: ácido tartárico, glicerina, ácido sórbico, etc.
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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

• Disminución de la intensidad de color en los vinos tintos, explicada en parte por una importante modificación de su pH, que puede implicar una modificación molecular de los antocianos, aunque sobre todo se debe a una destrucción de estas sustancias, debido posiblemente a la hidrólisis de las moléculas de antocianos, producida por el complejo enzimático de las bacterias en la búsqueda de la parte azucarada de estas sustancias. • Mayor estabilidad biológica de los vinos, debido en parte a un empobrecimiento en nutrientes o factores de crecimiento en el medio, así como también a una mayor presencia en el medio de inhibidores microbianos formados por las bacterias lácticas, sustancias conocidas como “bacteriocinas”, que comunican al vino una cierta inmunidad frente a otras posibles alteraciones microbianas. Las bacteriocinas son compuestos de naturaleza peptídica o proteica, habiéndose descubierto recientemente algunas, tales como: brevicina, caseicina, nisina, pediocina y leucocina, proponiendo su uso, bien individualizadas o bien asociadas a otros bactericidas, para la estabilización biológica de los vinos frente a las bacterias lácticas.

• Modificación de aromas en los vinos, debido en parte a una disminución de los aromas varietales, por otra parte a una atenuación o desaparición de algunas sustancias aromáticas formadas durante la fermentación alcohólica, y por último, a la formación de diferentes ésteres y alcoholes superiores responsables de olores no siempre agradables. • Acumulación de polisacáridos en los vinos, procedentes de las levaduras en autolisis, así como de las propias bacterias lácticas, que por si solas o bien polimerizadas con los taninos, comunican al vino una agradable sensación untuosa y de volumen. • Degradación de los aminoácidos de los vinos mediante su descarboxilación, produciéndose unas sustancias tóxicas denominadas “aminas biógenas”, tales como: la histamina que es una sustancia alérgena derivada de la histidina, o bien la ornitina y el carbamato de etilo derivados de la arginina, siendo la primera un inhibidor microbiano y la segunda una sustancia de supuestas propiedades cancerígenas, o también el 2-acetil tetrahidropiridina de característico “olor a ratón” producido a partir de la lisina, o

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Fermentación Maloláctica
propia célula, pues a través de ella se producen todos los intercambios de nutrientes, asimilación y salida de sustancias de desecho, así como otras funciones reproductoras, siendo sede de moléculas responsables de interacciones celulares, como las de carácter floculante, “killer”, etc., así como conteniendo numerosas enzimas, generalmente hidrolasas, asociadas a la pared celular o alojadas en el espacio periplasmático. La pared celular confiere a la levadura su forma característica, generalmente de aspecto redondeado elíptico.

algunas sustancias más derivadas de otros aminoácidos: alanina, tirosina, etc. La existencia en el vino de estas sustancias perjudiciales para la salud humana, ha supuesto en los últimos años el desarrollo de una tecnología suficiente para impedir su formación en los vinos durante la FML. • Eventual formación de polisacáridos exocelula res, producto de determinadas bacterias lácticas, tales como: Pediococcus damnosus y Lactobacillus brevis, que se recubren de una sustancia viscosa de glucano derivada de la glucosa, confiriendo a los vinos un aspecto denso y viscoso, conocido vulgarmente como “ahilado” o “enfermedad de la grasa”, de consecuencias desagradables pero poco graves. El desarrollo de la FML en barrica, frente a su ejecución en depósitos de mayor capacidad, no supone una novedad, pues esta técnica se ha venido realizando desde tiempo inmemorial en determinadas zonas productoras, pero los conocimientos que hoy día se tienen sobre la misma, así como las ventajas que de ella se derivan, hacen que sea una práctica de gran interés para la elaboración de vinos tintos y blancos de elevada calidad. La FML realizada en barrica, mejora especialmente los siguientes efectos: mayor acumulación de polisacáridos, menor pérdida de materia colorante, y mejora o modificación del aroma de los vinos, que de forma ordenada y sin tener en cuenta su importancia se desarrollan a continuación.

2.2. Acumulación de polisacáridos de origen microbiano.
Las manoproteínas son unos polisacáridos parietales de los microorganismos, existentes sobre todo en las levaduras vínicas, cuya presencia en los vinos, les comunica una serie de importantes mejoras sensoriales, así como también en lo referente a su estabilización. Antes de estudiar estos importantes efectos en los vinos, para entender mejor la naturaleza de estos compuestos, es importante conocer su localización en las paredes celulares de las levaduras, así como también las funciones que ellas desempeñan.

Durante el desarrollo de una fermentación alcohólica, la población normal de levaduras que se puede alcanzar es del orden de 100 x 106 células por ml de mosto, que suponiendo fueran todas Saccharomyces cerevisiae de forma elíptica y con unas dimensiones aproximadas de 5 x 10 Ìm, representaría una superficie del orden de 18 m2 por litro de mosto; siendo este dato conocido como “superficie de reacción”, a través de la cual se producen todos los fenómenos vitales de las células, y que también tiene una gran importancia en la lisis de las levaduras, así como en la cesión de polisacáridos al medio.

2.2.1. Estructura de la pared celular de las levaduras.
La pared celular externa de las levaduras representa el 15 a 25 por 100 de su peso seco, siendo una envuelta de carácter rígido ligeramente elástico, teniendo por misión asegurar la protección de los elementos que contiene la célula, principalmente por regulación de la presión osmótica con el medio exterior, siendo además un órgano dinámico multifuncional, donde se desarrollan una serie de fenómenos vitales para la
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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

La pared celular está formada por una pared externa, así como de una pared interna o membrana plasmática, estando ambas separadas por un espacio periplásmico. La pared celular externa se compone principalmente de polisacáridos, destacando en un 60 por 100 los glucanos, principalmente por β-1,3 glucano de aspecto fibroso, encontrándose éste siempre asociado a la quitina, y teniendo por misión la de mantener la forma y rigidez de la célula. Existe un segundo β1,3 glucano de tipo amorfo, que se asocia a las manoproteínas, que asegura la elasticidad celular, y por fin un tercero β-1,6 glucano, cuya misión es unir los diferentes elementos que forman la pared celular, como si de un cemento o cola se tratase. Las manoproteínas se encuentran en la pared celular externa, representando el 20 a 50 por 100 del peso seco de la pared, estando formadas por moléculas de alto peso molecular, desde 20.000 hasta 450.000 Dalton, conteniendo aproximadamente un 90 por 100 de manosa y el 10 por 100 restante de péptidos. Estructuralmente se encuentran unidas a los glucanos amorfos antes citados, pudiendo ser separados de éstos por hidrólisis enzimática con β-glucanasas. Por último, también se encuentra la quitina que, de forma minoritaria ocupa el 1 a 2 por 100 de la pared celular externa, encontrándose asociada a los glucanos a los que les comunica rigidez, localizándose en mayor concentración en los “cráteres” o cicatrices externas de gemación de las levaduras, donde asegura un cierre perfecto para la pared celular.

En consecuencia, la pared celular externa presenta en su cara exterior una capa de manoproteínas asociadas a una matriz de β-1,3 glucanos amorfos, así como en su cara interna, otra capa de β-1,3 glucanos fibrosos asociados a pequeñas cantidades de quitina, quedando unidas ambas capas por medio de los β-1,6 glucanos. La rigidez y la forma de la pared celular depende de los glucanos, mientras que su porosidad es determinada por las manoproteínas. La composición de la pared celular depende de las condiciones nutritivas del medio, así como también de la edad de las células. El glucano de la pared celular aumenta con la riqueza en azúcares del mosto, así como también con la edad de las levaduras, siendo del mismo modo, más rica en quitina y más pobre en manoproteínas. La carencia en mesoinositol eleva la proporción de glucanos respecto de las manoproteínas.

El espacio periplásmico se sitúa entre la pared celular externa y la membrana plasmática, donde se encuentran algunas enzimas vitales para las células, destacando la invertasa capaz de desdoblar la sacarosa en glucosa y fructosa, u otras diversas enzimas (β-glucosidasa, α-galactosidasa, melibiasa, aminopeptidasa, esterasa, etc.), así como enzimas importantes para el crecimiento de las levaduras o su gemación: ‚-glucanasas del tipo 1,3 y 1,6 cuya máxima concentración se encuentran en la fase de crecimiento exponencial de las levaduras, y que enológicamente tienen un gran interés por ser responsables de la autolisis de las paredes de las levaduras cuando permanece un vino sobre sus lías, conservando esta actividad algo más atenuada meses después de terminar la fermentación alcohólica.

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Fermentación Maloláctica

Por último, la membrana plasmática situada hacia en interior de las células, constituye una barrera selectiva que controla los intercambios entre la levadura y el medio exterior, siendo por tanto un órgano esencial para la vida de éstas. Contiene aproximadamente un 40 por 100 de lípidos y un 50 por 100 de proteínas, mientras que las manoproteínas y los glucanos tan solo suponen un 5 por 100.

Los principales fosfolípidos de estas membranas son: la fosfatidil-etanolamina (FE), el fosfatidil-colina (FC) y el fosfatidil-inositol (FI), que representan un 70 a 85 por 100 del total, existiendo además otros como: la fosfatidil-serina (FS) y el difosfatidil-glicerol o cardiolipina (FG). Los fosfolípidos son compuestos de 1,2-diacilglicerol y un enlace fosfodiéster que une el esqueleto del glicerol a algunas bases, como colina, inositol, serina y etanolamina. Los ácidos grasos situados en la posicón 1 del glicerol son mayoritariamente saturados, mientras que los situados en la posición 2 son insaturados; teniendo siempre un número par de átomos de carbono en su molécula, siendo los de 16 a 18 los más abundantes, pudiendo estar saturados como el ácido palmítico y el ácido esteárico, o bien insaturados como el ácido oleico y el ácido linoleico. Según las condiciones ambientales (oxígeno, temperatura, etanol, etc.) predominantes en el medio de crecimiento, las levaduras pueden sintetizar ácidos grasos de cadena mediana (C6 a C12) o de cadena larga (C14 a C18) saturados o insaturados. Todos los fosfolípidos poseen una parte polar o hidrófila de alcohol fosforilado, y otra no polar o hidrófoba formada por dos cadenas paralelas de ácidos grasos, que se estructuran en la membrana en forma de doble capa, con las cabezas polares situadas hacia el exterior y unidas por las colas no polares, dentro de las cuales se encuentran fuertemente asociadas las proteínas membranarias. La superficie de esta membrana toma una característica forma ondulada o rizada.

Las proteínas de las membranas o glicoproteínas, tienen un peso molecular entre 10.000 a 120.000 Dalton, pudiendo ser de tipo intrínseco situadas en el interior de la doble capa lipídica antes mencionada y asociadas a la parte no polar, o bien de tipo extrínseco ubicadas hacia el exterior de la membrana. Entre estas proteínas destacan la adenosintrifosfatasa (ATPasa), teniendo por misión transportar los solutos (azúcares, aminoácidos, etc.) a través de la membrana plasmática. La fluidez de paso de la membrana depende de la composición en los ácidos grasos de los fosfolípidos y la cantidad de esteroles que también contiene. Cuando las colas de los fosfolípidos están situadas ordenadas, la membrana se torna más rígida e impermeable, mientras que cuando se desordenan, ésta se convierten más permeable, dependiendo una u otra forma de la temperatura del medio fermentativo. En cuanto a los esteroles, el más importante es el ergosterol, siendo sintetizados exclusivamente en las mitocondrias, en condiciones de aerobiosis durante la fase de crecimiento de las levaduras. Se encuentran situados en la membrana plasmática y unidos a los fosfolípidos. La presencia de ergosterol permite la penetración de los azúcares dentro de la célula, siendo por lo tanto un factor de importancia en el correcto desarrollo de la fermentación alcohólica. Del mismo modo, el enriquecimiento de los fosfolípidos membranarios en ácidos grasos insaturados, como los ácidos oleico y linoleico, favorecen la permeabilidad de la membrana plasmática, y por lo tanto también el intercambio de sustancias con el medio exterior. La presencia de etanol en cantidades crecientes, en ocasiones también impermeabiliza la pared celular. Por último, la temperatura baja durante la fase de crecimiento de la levaduras, aumentan el contenido en ergosterol en la pared celular, y por lo tanto asegura el desarrollo y final de la fermentación. Sin embargo, la temperatura baja reduce la permeabilidad celular, y por lo tanto, limita los fenómenos de intercambio entre el interior y el exterior de las células.
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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

2.2.2. Autolisis de las levaduras.
El concepto autolisis de las levaduras define la autodegradación enzimática de las distintas partes de las mismas, que comienza inmediatamente después de la muerte de las células, cuando cesa su actividad. La degradación de las membranas de las levaduras, comprende por una parte la liberación de las enzimas de hidrólisis acumuladas en el espacio periplásmico de la pared celular, y por otra la destrucción de los componentes de las paredes, permitiendo el vertido de los compuestos autolizados hacia el exterior.

La autolisis de las levaduras se desarrolla en las siguientes etapas: primera, una fase de activación que desorganizando las endoestructuras celulares libera las enzimas de hidrólisis contenidas en la pared celular. Segunda, un desprendimiento de manoproteínas de cadenas cortas unidas covalentemente al glucano en las paredes internas de las levaduras. Tercera, una liberación de manoproteínas de alto peso molecular procedente de la zona periplásmica de la célula. Y cuarta, una posible degradación de estas sustancias liberadas en el medio, interviniendo enzimas glucanasas, manosidasas, y proteasas. La liberación de estos polisacáridos de las paredes de las células se produce por la acción de enzimas parietales: endo-β-(1→3) y endo-β(1→6) glucanasas, estando localizadas éstas en el espacio periplásmico de las paredes celulares, presentando una importante actividad durante la fermentación alcohólica, sobre todo en la fase de crecimiento exponencial de las levaduras, y un contendido cada vez más debilitado durante algunos meses después de la misma. La autolisis de las levaduras durante la conservación de los vinos sobre sus lías, conduce a una liberación de las manoproteínas fijadas sobre el glucano de las paredes celulares, así como una hidrólisis parcial de las glucomanoproteínas, siendo estos compuestos resultantes muy solubles en medios acuosos como es el vino. Las manoproteínas pueden ser degradadas por enzimas tales como: exo-(1→6)-α-Dmanosa, exo-(1→2)-α-manosa y α-D-manosidasa.

La autolisis comprende tres aspectos diferentes, el primero una liberación de aminoácidos por proteolisis debido a un efecto de las enzimas proteolíticas contenidas en las mismas levaduras, cuya actividad se ve bastante reducida por la acidez del vino, pero que podría ser más importante si el pH del medio fuera superior. Así a un valor de pH de 3,0 los aminoácidos liberados durante la autolisis representarían solamente el 13 por 100 del nitrógeno total liberado, mientras que a un pH de 5,0 supondrían un 60 por 100. El segundo una formación de compuestos volátiles, que participan en el aroma de los vinos, los cuales serán descritos posteriormente. Y el tercero se refiere a la degradación de las paredes celulares de las levaduras, produciéndose una fuerte actividad enzimática debida principalmente a la intervención de β-glucanasas existentes en el espacio periplásmico, que hidrolizando los glucanos liberan las manoproteínas contenidas en la pared celular externa, según el mecanismo descrito a continuación. Durante este proceso se produce un engrosamiento de un 10 por 100 de la pared celular, mientras que el espesor de la capa polisacarídica, o cara externa de la pared celular, aumenta del orden de un 26 por 100, empobreciéndose ésta en aminoácidos, enriqueciéndose en hexosas por la actividad enzimática, y aumentando fuertemente la relación manosa / glucosa.
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Fermentación Maloláctica
con unas 150 a 250 unidades de manosa muy ramificadas a su vez con otras cadenas laterales de manosa más cortas de una a tres unidades, unido a la cadena peptídica sobre la asparagina mediante un enlace Nglicosil y haciendo intervenir dos unidades de N-acetil-glucosamina. Recientemente se ha descubierto otra cadena lateral de glucomanano, así como también otra cadena de etanolamina-fosfato-manosamanosa-manosa-glucosamina-inositol-fosfolípido, que se unen del mismo modo a la cadena peptídica principal.

Las manoproteínas excretadas por las levaduras durante la fermentación alcohólica, especialmente durante la fase de crecimiento exponencial, no poseen las mismas propiedades que las formadas por hidrólisis de las enzimas parietales por la autolisis de las levaduras, siendo éstas últimas las que poseen efectos protectores frente a los enturbiamientos proteicos y a las precipitaciones tartáricas, debido a que poseen una masa molecular cercana a los 30.000 Dalton. La autolisis de las levaduras en los vinos puede ser muy rápida en medios de pH 4,5 a 5,0 y a temperaturas de 35º a 40º C, mientras que en las condiciones reales de los vinos, con valores de pH entre 3,0 a 3,5 y temperaturas inferiores a 15º C, se puede realizar en un plazo de 2 a 3 meses o más, intensificándose la autolisis si periódicamente se agitan las lías, como se hace con el “bâttonage” en la crianza de ciertos vinos blancos y tintos en barrica o depósito. La liberación de estos polisacáridos también puede ser activada, mediante la adición de preparados específicos de levaduras inactivas ricas en enzimas glucanasas, o también mediante la adición de la propia enzima β-1,3 glucanasa sintetizada, cuya tecnología se tratará posteriormente. Las bacterias lácticas también son capaces de ceder al vino compuestos polisacáridos parecidos a las manoproteínas de las levaduras cuando se produce su destrucción por autolisis, ya que estas sustancias también se encuentran en sus paredes celulares, aunque la cantidad de estos polisacáridos cedidos al medio es muy inferior al procedente de las levaduras. Sin embargo, durante la FML en presencia de lías o restos de la fermentación alcohólica, las bacterias lácticas son capaces de acelerar la destrucción de las paredes celulares de las levaduras contenidas en las lías, debido posiblemente a la acción de enzimas β-glucanasas formadas por las bacterias, con el propósitos de proveerse de los factores de crecimiento contenidos en la masa de levaduras muertas: proteínas, aminoácidos, minerales, etc. y especialmente de los glucanos parietales.

Las manoproteínas constituyen el 25 a 50 por 100 de la pared celular de las levaduras, pudiendo encontrarse en los vinos en cantidades de hasta 100 a 150 mg / litro, y de acuerdo con la siguiente composición: • Manoproteínas mayoritarias en un 80 por 100 del total, que contienen un 90 por 100 de manosa y un 10 por 100 de proteínas, estando su masa molecular oscila de 100.000 a 2.000.000 Dalton. • Glucomanoproteínas minoritarias en un 20 por 100, conteniendo un 25 por 100 de glucosa, 25 por 100 de manosa y 50 por 100 de proteínas, encontrándose su masa molecular entre 20.000 a 90.000 Dalton. La presencia de estos polisacáridos en los vinos blancos o tintos, presenta una serie de importantes efectos, que por un lado afectan a las características sensoriales de los vinos, y por otra parte a la estabilidad de los mismos.
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2.2.3. Las manoproteínas: composición y propiedades.
La estructura de las manoproteínas se encuentra formada por una cadena peptídica lineal, llevando por un lado otras cadenas más cortas de una a cuatro moléculas de manosa, unidas a la cadena peptídica por enlaces O-glicosil sobre la serina y treonina, y por otra parte de un ·-D-manano de alta masa molecular,

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

Mejora gustativa de los vinos. La presencia de polisacáridos en los vinos aumenta la sensación de volumen y untuosidad en la boca, apareciendo a veces tonos dulces más patentes en los vinos blancos.

Estabilización de las precipitaciones tartáricas, protei cas y de color. La presencia de estos polisacáridos en los vinos, proporciona una cierta estabilidad frente a las precipitaciones tartáricas y proteicas, como si de “coloides protectores” se tratase. Las manoproteínas formadas por las levaduras en la fase de fermentación, así como los residuos de arabinogalactanos II procedente de la hidrólisis de sustancias pécticas, no tienen efecto alguno sobre la insolubilización de tartratos; mientras que los ramnogalacturonanos II y las manoproteínas de autolisis de microorganismos, son capaces de frenar o impedir dichas precipitaciones. Cuando el contenido en ramnogalacturonano II es inferior a los 30 mg / litro, como en el caso de los vinos blancos comunes, puede ser un activador de la nucleación de estas sales, pero cuando excede los 100 mg / litro, como en los vinos tintos o en los blancos fermentados en barrica, se comporta al igual que las manoproteínas, como inhibidor de la nucleación y crecimiento de los cristales de tartratos. Esta propiedad es de tal interés enológico, que se está estudiando la utilización de manoproteínas “exógenas” para el tratamiento de estabilización de los vinos. Por otra parte, las arabingalactan-proteínas II y las manoproteínas, procedentes tanto de las levaduras de fermentación, como de su autolisis, también presentan un efecto inhibitorio frente a las precipitaciones proteicas de los vinos, así como estabilizante de la materia colorante en estado coloidal. Estas propiedades protectoras se deben a su carácter fuertemente hidrófilo, que las hace ser unas sustancias muy solubles y estables en soluciones hidroalcohólicas como es el vino, e impidiendo la formación de agregados, algo parecido al efecto producido por otro poliósido autorizado en el tratamiento de vinos, como es la goma arábiga, mezcla de arabinogalactanos II y arabinogalactan-proteínas II. Estos poliósidos son bastante resistentes a las degradaciones enzimáticas, siendo difícilmente metabolizados por los microorganismos del vino, e incluso tambien las manoproteínas poseen un efecto activador de las bacterias lácticas del género Leuconostoc, que puede ser interesante para el desarrollo de la FML, aunque perjudicial para otras posibles alteraciones de los vinos.

Del mismo modo, la presencia de las lías reduce el contenido en taninos elágicos procedentes de la madera de roble, bien por fijación de estos compuestos sobre la paredes de las levaduras, o bién por su combinación con las manoproteínas liberadas por las levaduras; aunque también éstas se pueden unir a los taninos más simples y reactivos provenientes de vendimia, obteniéndose unos taninos polimerizados, conocidos como “buenos taninos” o “taninos dulces”, sensorialmente muy similares a los existentes en las vendimias de buenas añadas de los grandes vinos. La autolisis de las levaduras, produce un enriquecimiento del medio en aminoácidos y ácidos nucleicos, comportándose como sustancias exaltadoras del sabor, y en consecuencia mejorando la fase gustativa del vino.

Conservación de aromas varietales en los vinos. Independientemente de las sustancias aromáticas que pueden formarse o modificarse durante una FML en barrica o en depósito, las manoproteínas pueden secuestrar los aromas varietales en su estructura tridimensional, conservándolos de este modo más tiempo en los vinos.
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Fermentación Maloláctica
de oxidación-reducción es más elevado, pudiendo entonces oxidarse excesivamente el vino; mientras que si son usadas, con más de dos a tres años de edad, el potencial oxidación–reducción desciende, pudiendo entonces aparecer olores anormales de reducción producidos por las lías. Una buena norma puede ser renovar las barricas cada 2 a 3 años, introduciendo un medio o un tercio de barricas nuevas, y manteniendo el resto de barricas con la edad proporcional. La estancia sobre lías diminuye la posibilidad del defecto del “enrojecimiento oxidativo” de los vinos blancos, caracterizado por la aparición de un tono gris rosáceo en vinos ligeramente oxidados, no procediendo este color de una posible contaminación de antocianos, y por lo tanto tampoco puede ser decolorado por el anhídrido sulfuroso o por una modificación del pH, aunque sí por la exposición de las botellas de vino a la luz solar. Los tratamientos de clarificación con caseína o PVPP, tampoco son eficaces. La sustancia responsable no es conocida, siendo sin embargo absorbida por las lías de fermentación, o por el contrario prevenir su aparición con la adición de ácido ascórbico en la fase previa del embotellado (100 mg / litro). Existe un test que mide el índice de sensibilidad al enrojecimiento oxidativo, que consiste en medir el vino en un espectrofotómetro a 500 nm de longitud de onda, antes y después de 24 horas de adicionar agua oxigenada, multiplicando por 100 el valor diferencial alcanzado. Cuando este valor es superior a 5, entonces existe un riesgo de enrojecimiento oxidativo en el vino blanco analizado.

Mejora del color en los vinos blancos. Por una parte, la fijación de los compuestos fenólicos oxidables del vino blanco, bien sobre las paredes de las levaduras, o también con las manoproteínas producida por su autolisis, limitan el sustrato oxidable del vino, y en consecuencia también su oxidación.

Pero por otra parte, durante la estancia en barrica del vino sobre sus lías, el oxígeno que penetra a través de la madera o de las manipulaciones del vino, como los trasiegos o rellenos, compensa la capacidad reductora de las lías, evitando de este modo la aparición de olores azufrados desagradables, y al mismo tiempo la oxidación del vino, resultando entonces unos vinos blancos aromáticamente correctos y de una sorprendente coloración pálida.

2.3. Pérdidas de color en los vinos tintos.
Durante la FML se produce una disminución de la intensidad de color en los vinos tintos, motivada por un desequilibrio de las moléculas de antocianos debido a una modificación del pH, así como también por una destrucción de estas sustancias, debido posiblemente a la hidrólisis de las moléculas de antocianos, producida por el complejo enzimático de las bacterias lácticas en la búsqueda de la parte azucarada de las mismas.
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El equilibrio entre la oxidación y reducción se consigue manteniendo el parque de barricas con una edad adecuada, pues cuando éstas son nuevas, el potencial

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

En la actualidad, la investigación enológica está buscando paliar este importante efecto negativo en los vinos tintos, encontrando algunas posibles soluciones, como la utilización de levaduras genéticamente modificadas para la eliminación del ácido málico durante la fermentación alcohólica, y sin que ello suponga una pérdida de color en los vinos. O bien utilizando la técnica de micro-oxigenación del vino tinto antes de la FML, buscando la polimerización y estabilización de los antocianos con los taninos, antes de que ésta se desarrolle y cause una disminución de la intensidad de color, mediante la aplicación de una dosis de 10 a 25 ml de oxígeno por litro de vino y por mes. La FML de los vinos tintos realizada en barrica, produce del mismo modo una estabilización del color, y en consecuencia evita una caída de la intensidad colorante, ya que al introducir el vino en las barricas, comienza a penetrar aire a través de la madera a razón de 2 a 4 mg de oxígeno por litro de vino y por mes, produciéndose una polimerización de los antocianos y taninos de tipo “puente etilado”; donde el etanal o acetaldehído que contiene el vino procedente de la oxidación del etanol en presencia de polifenoles o de iones Fe3+ o Cu2+, o bien de la descarboxilación del ácido pirúvico, reacciona con las valencias negativas de los taninos en las posiciones 4 y 8, así como también con los antocianos en la forma carbinol (AOH) neutra.

lías, el efecto protector de la morfología de las levaduras por los polifenoles, pues en ausencia de éstas sustancias las levaduras adquieren rápidamente una forma aplastada hacia el final de la fermentación alcohólica, mientras que cuando existen polifenoles en el medio, las levaduras permanecen esféricas, emitiendo la hipótesis de que los compuestos fenólicos protegen las paredes de la levaduras frente a la hidrólisis enzimática, y dificultan en consecuencia la cesión de manoproteínas al vino.

2.4. Modificación de los aromas en los vinos.
Durante la FML se produce una modificación de los aromas de los vinos, debido en parte a una disminución de los aromas varietales por una degradación o hidrólisis de los compuestos aromáticos de la uva; por otra parte a una atenuación o desaparición de algunas sustancias aromáticas agradables formadas durante la fermentación alcohólica, donde destacan: 3-metil-n-butilacetato, n-hexilacetato, 2-fenil-etilacetato y 2-etil-n-hexanoato; y por último a la formación de diferentes ésteres, como el acetato de etilo de inconfundible olor a pegamento, o el lactato de etilo de olor lácteo, o bien los alcoholes superiores como: n-propanol, 2-butanol y n-hexanol de olor más pesado y grosero. Pero quizás el compuesto aromático más característico que se forma durante la FML es el diacetilo o 2,3-butanodiol, formado a partir de la degradación del ácido cítrico por las bacterias lácticas, y con un inconfundible olor a mantequilla, perceptible por encima de los 5 a 7 mg/litro. El anhídrido sulfuroso reduce el contenido en diacetilo, debido a una interacción entre ambas sustancias, atenuándose el impacto olfativo, que puede aparecer de nuevo cuando se reduce el nivel de sulfuroso. Las poblaciones reducidas de bacterias lácticas, la presencia de oxígeno en el medio, los valores de pH bajos y la temperaturas reducidas, ralentizan la FML y en consecuencia contribuyen a elevar el nivel de diacetilo en los vinos. Por el contrario, el contacto del vino con las lías, así como la presencia de azúcares residuales en el mismo, disminuyen la formación de esta sustancia. Por otra parte, la autolisis de las levaduras también

El polímero formado es de color rojo-malva muy estable, de tono vivo al principio y evolucionando con el tiempo hacia un matiz más oscuro llamado como “rojo sombra” o rojo picota. Este es uno de los motivos de realizar este proceso en barricas nuevas o seminuevas, donde la penetración del oxígeno a través de la madera es la que exactamente corresponde para realizar el proceso de polimerización antes descrito. Se ha estudiado durante la crianza de los vinos sobre

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Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica 2.5. Práctica de la fermentación maloláctica en barrica.
No se debe confundir la técnica de fermentación de mostos blancos en barrica, con la de FML en barrica generalmente de vinos tintos, pues aunque con ambos métodos se consigue unos efectos sensoriales muy parecidos originados por la autolisis de las levaduras; en la primera se trata de realizar la fermentación alcohólica de un mosto blanco dentro de un envase de madera, seguido de una estancia del vino sobre sus lías, con o sin FML posterior, y buscando obtener como principal fin, unas mayores sensaciones de volumen y complejidad en la boca; mientras que con la segunda se pretende conseguir, además de una mayor estructura gustativa, otros objetivos sensoriales diferentes, como son la estabilización del color del vino tinto, así como la adquisición de aromas agradables muy particulares, mediante la FML del vino en envases de madera de similares características, y también seguido de una permanencia del vino sobre sus lías. Un primer aspecto técnico a tener en cuenta para la FML en barrica son las características fisico-químicas que debe reunir el vino tinto. Este deberá poseer unas mínimas condiciones cualitativas, sobre todo en lo referente a la calidad de la vendimia, así como también a su grado de maduración, partiendo de vinos sanos y bien elaborados, mejor dotados de una elevada carga de fruta, y presentando una analítica y estructura fenólica suficiente, que podemos resumir en las siguientes condiciones: • Indice de polifenoles totales (IPT) superiores a 60 o 70. • Intensidad de color (IC) superior a 10 o 12. • Riqueza en antocianos superior a 600 o 800 mg/litro. • Riqueza en taninos superior a 3 o 4 gramos/litro. • Relación antocianos / taninos de 1 / 4 a 1 / 5. • Nivel de dióxido de azufre lo más bajo posible. • Acidez total superior a 5 o 6 gramos / litro en ácido tartárico. • Valores de pH los más bajos posible y siempre inferiores 4. • Acidez volátil moderada y siempre inferior a 0,5 a 0,6 gramos / litro. • Ausencia de azúcares residuales. El vino tinto deberá introducirse lo más íntegro posible, es decir con toda la carga de lías que pudiera contener como consecuencia de la fermentación alcohólica, con objeto de disponer de la mayor masa posible de levaduras para su posterior autolisis. Lógicamente, en el caso de desear la extracción de un nivel de manoproteínas más reducido, entonces será posible realizar el correspondiente trasiego, consiguiendo la eliminación parcial de las lías gruesas, y prestando siempre atención para no airear en exceso el vino,
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genera la formación de compuestos volátiles, que participan en el aroma de los vinos, donde destacan cuantitativamente y cualitativamente, los ésteres pesados de los ácidos grasos de cadena larga; así como los alcoholes terpénicos como el linalol, α-terpineol, citronelol, geraniol y farnesol; también los alcoholes superiores, como el alcohol isoamílico y el fenil-2-etanol, y sus aldehídos, citando el metil-3butanal de olor herbáceo y el benzaldehído de aroma a almendras amargas; las lactonas como la α-decalactona de olor a melocotón y nuez de coco y el 3-hidroxi-4,5-dimetil-5-furanona o sotolón de aroma a nuez que aparece patente en los vinos criados bajo velo de levaduras; y por último los compuestos azufrados volátiles, u otras sustancias, como el vitispirano, que es un derivado norisoprenoide de aroma alcanforado o eucalipto. Por último, la madera de roble y sobre todo su interacción la FML, hacen que aparezcan en el vino sustancias aromáticas agradables procedentes de este material. Los compuestos cedidos por la madera de roble se ven muy atenuados, por una parte los taninos por su combinación con los polisacáridos de las paredes celulares, y por otra parte algunas sustancias aromáticas son reducidas por las levaduras perdiendo el carácter aromático, especialmente la vainillina y los aldehídos furánicos de aromas tostados. Mientras que otros compuestos, como el eugenol de aroma especiado o la β-metil-γ-octolactona de aroma a coco no se ven afectados. La consecuencia es un vino de menor carácter maderizado, así como de boca más suave e integrada. Las bacterias lácticas consumen cantidades notables de vainillina de la madera de roble, lo que explica su contenido inferior en los vinos que han realizado la FML en barrica. Recientemente se ha comprobado que, la presencia de lías en la barrica, favorece la síntesis de furfuriltiol, sustancia de agradable aroma a café tostado, muy característico de los vinos que se elaboran por FML en barrica; el cual procede de la reacción del sulfuro de hidrógeno (SH2) con el furfural contenido en la madera tostada, favoreciendo en consecuencia la aparición de este compuesto en las barricas nuevas. Sin embargo, durante la estancia del vino sobre sus lías, las enzimas glucanasas pueden producir una liberación de aminoácidos y glucosa, llegando esta última sustancia hasta concentraciones de 500 a 900 mg / litro, pudiendo incidir en el desarrollo de levaduras del género Brettanomyces de nefastas consecuencias para el vino almacenado en la barrica.

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

pues esto dificultaría el posterior arranque de la FML. Un criterio que puede seguirse en este sentido es el de eliminar las lías más pesadas de tamaño superior a las 100 μm, compuestas principalmente de restos vegetales de la vendimia y después de una sedimentación de 24 a 48 horas, conservando las lías gruesas y finas de tamaño inferior a 100 μm, compuestas principalmente de levaduras. Con el fin de facilitar el arranque de la FML, algunos enólogos conservan el vino con sus lías en depósito, y esperan que éste inicie la FML, para inmediatamente trasegarlo sin aireación y con todas sus lías hacia las barricas. De este modo se vence la dificultad que ofrece el arranque de este proceso en pequeños envases de madera, donde por una parte el vino se puede enfriar, y por otra parte, la posible entrada de aire debido a la operación de trasiego, o bien al que penetra a través de la madera, dificultan el desarrollo y la actividad de las bacterias lácticas. Sin embargo, esta forma de operar no es muy conveniente, pues se pierde parte del efecto de protección del color que se busca con la FML en barrica, ya que se reduce el tiempo necesario para la polimerización de antocianos y taninos, cuya reacción de por sí es bastante lenta. Un segundo aspecto a tener en cuenta es el tipo de envase a utilizar, debiendo siempre tratarse de barricas nuevas, o a los sumo seminuevas, donde se posibilite la entrada de aire en los anteriormente citados valores de 2 a 4 mg de oxígeno por litro de vino y por mes, y utilizando diferentes tipos de maderas y grados de tostados, en función de los gustos particulares de cada elaborador. Sin embargo siempre es aconsejable para este tipo de elaboraciones, utilizar maderas bastante tostadas, para favorecer la síntesis del furfuriltiol, una sustancia de agradable aroma a café con leche, cuyo origen se detalla más adelante. El volumen del envase tiene también una gran importancia, pues debe facilitarse en la medida de lo posible, el contacto de las lías con el vino. En los recipientes de gran volumen, la superficie de contacto líasvino es muy limitada, sin embargo, cuando se utiliza una barrica, esta superficie es más elevada.

Así para un depósito de 200 hl, la superficie lías-vino situadas en el fondo del mismo es del orden de 2 a 3 cm2 / litro, mientras que para una barrica bordelesa de 225 litros es de 5 a 10 cm2 / litro.

Para aumentar esta superficie de contacto, se procede al removido periódico de las lías después de terminar la FML, mediante una operación conocida como “bâtonnage”, realizada durante el tiempo de contacto que se crea oportuno, en general de 4 a 8 meses, y con una periodicidad suficiente de 3 a 7 días. Para realizarla, existen diferentes herramientas de “bâtonnage”, desde simples listones de madera o metal, hasta complicados sistemas de agitación; siendo un buen y sencillo sistema de removido, el rodado o girado de la barrica en un ángulo 180º, realizado en el primer caso, directamente sobre el suelo, lo que supone un pequeño desplazamiento de la barrica, o en el segundo caso, utilizando un durmiente especial dotado de un juego de cuatro pequeñas ruedas.

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Fermentación Maloláctica
Durante el desarrollo de la FML en barrica, es conveniente que las barricas no estén llenas del todo, respetando un espacio de un 5 a 10 por 100, pues debido al metabolismo de las bacterias lácticas, siempre de produce un desprendimiento de gas carbónico, y además se debe evitar el derramamiento del vino cuando se introduce el dispositivo de “bâtonnage”, y mejor colocando un sistema de cierre semihermético, existiendo tapones específicos para esta operación.

La operación de “bâtonnage”supone poner las levaduras en suspensión en el vino, consiguiendo de esta forma, una superficie de contacto lías-vino elevadísima, del orden de 18 m2 / litro o 180.000 cm2 / litro, muy superior a las conseguidas con un mero contacto estático. A las pocas horas de realizar esta operación, las lías se vuelven a depositar en el fondo del recipiente, lo que implica realizar su removido de forma periódica, con los plazos anteriormente señalados.

Otra razón que obliga a la utilización de envases de pequeño volumen, es la influencia que tiene el tamaño del recipiente en la aparición de olores azufrados defectuosos, pues las lías situadas en el fondo de envases de gran capacidad, hace que las lías sean comprimidas y entonces se favorezca la aparición de estas sustancias. Sin embargo, separando temporalmente las lías del vino y alojándolas en barricas durante un mes, se logra atenuar su actividad sulfitoreductasa, pudiendo ser luego reincorporadas al vino y evitar de este modo la aparición de olores azufrados, especialmente del sulfuro de hidrógeno y del metanotiol. La pérdida progresiva de la aptitud de las lías de liberar compuestos azufrados, puede explicar entre otros factores, la posibilidad de mantener vino sobre sus lías en barricas o bien en depósitos de mayor volumen.

Un tercer aspecto a contemplar son las condiciones ambientales ideales para el desarrollo de la FML en barrica, pues por una parte deben posibilitar la actividad de las bacterias lácticas, y por otra parte mantener el ambiente adecuado para permitir una buena estancia del vino en barricas. Durante la FML, el factor ambiental más importante es la temperatura, que deberá estar comprendida entre los 18º a 22º C, para lo que se recurre generalmente a la climatización de la sala de barricas, e incluso llegando a la instalación de suelos radiantes en una zona de la bodega. Sin embargo, cuando la FML termina, las condiciones ambientales deben cambiar radicalmente, pues en primer lugar es conveniente bajar la temperatura del vino bruscamente, hasta alcanzar valores comprendidos entre 5º a 10ºC, buscando inhibir la actividad bacteriana, para en segundo lugar, después alcanzar temperaturas entre 12º a 15º C que permitan unas buenas condiciones de crianza del vino, acompañado de otras muy importantes como: humedad relativa no superior de 70 a 80 por 100, ausencia de olores extraños, poca o nula iluminación, etc.
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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

La autolisis de las levaduras en los vinos puede ser muy rápida en medios de pH 4,5 a 5,0 y a temperaturas de 35º a 40º C, mientras que en las condiciones reales de los vinos, con valores de pH entre 3,0 a 3,5 y temperaturas inferiores a 15º C, se puede realizar en un plazo de 2 a 3 meses o más, intensificándose la autolisis si periódicamente se agitan las lías. Un cuarto aspecto a tener en cuenta es la utilización de cultivos seleccionados de bacterias lácticas, obtenidas industrialmente en forma líquida, congelada o liofilizada, y preparadas de forma sencilla para su adición al vino, en unos casos mediante una protocolo de reactivación, o bien en la actualidad mediante su adición directa (“one-step”). La bacteria láctica seleccionada más utilizada es la Oenococcus oeni, antiguamente llamada Leuconostoc oenos, que contienen una población de 1 x 1011 a 1 x 1012 bacterias vivas por gramo, lo que supone una dosis del orden de 30 a 50 mg / litro, que asegura la siembra de una población de 1 a 10 millones de células por ml y creciendo en el medio hasta unos 50 millones de bacterias por ml de vino. La inoculación de bacterias seleccionadas impide el desarrollo de las bacterias lácticas salvajes, que pueden tener un efecto negativo sobre la calidad del vino, especialmente en la acidez volátil, y debida al desarrollo de bacterias lácticas salvajes de los géneros Lactobacillus y Pediococcus. Además, las bacterias lácticas seleccionadas suelen ser criotolerantes, desarrollándose bien a temperaturas de 13º a 14º C, lo que evita el calentamiento de los vinos, y permite un desarrollo de la FML lenta y a baja temperatura, conservando mejor los aromas varietales de los vinos y reduciendo las pérdidas de materia colorante en los vinos tintos. La inoculación con cantidades elevadas de bacterias lácticas reduce sensiblemente la formación de diacetilo en los vinos, así como evitando la formación de las aminas biógenas. Para aumentar la cesión de manoproteínas a los vinos que permanecen sobre sus lías, se puede añadir la misma enzima que hidroliza los glucanos de la Botrytis cinerea, es decir una β-(1→3)-D-glucanasa; realizando el tratamiento con una dosis de 1 a 2 gramos / hectólitro de vino, durante un tiempo de 2 a 4 semanas, y siempre sobre las levaduras muertas de la fermentación; respetando además las condiciones del medio señaladas con anterioridad, es decir: temperatura superior a los 10º C y ausencia de bentonita en el vino. Otra opción es añadir cortezas de levaduras de elevado contenido en manoproteínas (CLECM), en dosis de 20 a 40 gramos/hectolitro. La utilización de autolizados de levaduras también tiene un gran interés, pues estas sustancias pueden ser añadidas a partir de preparados comerciales de cepas de levaduras de Saccharomyces cerevisiae seleccionadas por su elevado poder proteolítico, rea110

lizándose su autolisis en un medio hidroalcohólico tamponado a pH 3,0 y 30º a 50º C de temperatura, siendo después centrifugadas para separar las paredes celulares y luego secadas por calor. También existen preparados de levaduras inactivas, a la cual se le aplica un proceso de extracción específico para hacer más fácil la liberación de polisacáridos de las paredes celulares. Aplicado en dosis de 30 gramos por hectolitro en vendimias tintas, al principio de la fermentación alcohólica y de la maceración, se consigue suministrar al medio una cantidad temprana de polisacáridos, que son capaces de fijar los taninos extraídos de los hollejos y de las pepitas, estabilizándolos en el vino y comunicándoles sensaciones de redondez y volumen. Un quinto aspecto a contemplar, es el control y ries gos del proceso de FML en barrica. Previo a su inicio es importante realizar una analítica al vino, para conocer algunos parámetros. Unos servirán para conocer las posibles dificultades del medio para el arranque de la FML: anhídrido sulfuroso libre y total, azúcares, pH, y grado alcohólico, y otros servirán para controlar el desarrollo de la misma: acidez total, acidez volátil y ácido málico. La FML se manifiesta exteriormente por un patente desprendimiento de anhídrido carbónico, que forma en la superficie del vino una espuma característica, al mismo tiempo que comienza una continua caída de la acidez total, con una progresiva disminución del ácido málico y un aumento del ácido láctico, así como también del ácido acético sobre todo al finalizar el metabolismo. La evolución de los ácidos málico y láctico se pueden medir mediante métodos enzimáticos, aunque la mejor manera de hacerlo es hacerlo por cromatografía sobre papel, que supone un método semicuantitativo y rápido de realizar. Otro sistema para la fácil medición del ácido málico o del ácido láctico es el sistema Reflectoquant de la firma Merck, que consiste en la utilización de un aparato reflectómetro para la evaluación de tiras analíticas, que impregnadas de mosto o vino, son capaces de medir instantáneamente una gran cantidad de parámetros, donde además de estos ácidos, destacan los siguientes: azúcares, dióxido de azufre libre, acidez total, calcio, potasio, etc. Además de la disminución de la acidez total y de la evolución de los ácidos málico y láctico, también es conveniente controlar el incremento de la acidez volátil, pues una subida anormal de esta sustancia puede indicar una anomalía en el desarrollo de la FML, e incluso llegar a tener que tomar medidas para paralizar el proceso microbiano. La seguridad de que una FML se realice con una determinada especie o cepa de bacteria láctica, puede ser comprobada con métodos de análisis

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Fermentación Maloláctica
permanecerá mucho tiempo sobre una masa de lías. • • • • • Acidez volátil. Anhídrido sulfuroso libre y total. Potencial redox. Control microbiológico. Análisis sensorial.

moleculares (RAPD, Ribotipado, ARDRA, AFLP, etc.), que permiten una identificación rápida y precisa de estos microorganismos. Del mismo modo otras técnicas, como la de hibridación fluorescente in situ (FISH. fluorescent in situ hybridization), posibilitan además de la identificación de las bacterias, su recuento simultáneo. El final de la FML es una etapa que debe ser controlada y manejada adecuadamente, pues normalmente los vinos son abandonados, y entonces se pueden producir transformaciones indeseables sobre otras sustancias del vino, que tienen como consecuencia una excesiva subida de la acidez volátil. Cuando el ácido málico desaparece, las bacterias lácticas comienzan a metabolizar el ácido cítrico del vino, produciéndose una “fermentación citroacética” que produce notables cantidades de ácido acético. Para evitarlo se debe operar de la siguiente forma: cuando en el vino resta medio gramo por litro o menos de ácido málico, la FML se debe de dar por finalizada, y entonces se procede al trasiego y sulfitado del vino (3 a 6 gramos / hl) para paralizar a las bacterias lácticas; resultando el vino sin ácido málico al terminar el proceso, debido a que la enzima maloláctica residual es capaz de metabolizar por inercia los restos de este ácido, a pesar de la muerte de estas bacterias, y quedando por lo tanto el ácido cítrico sin degradar. La duración de la FML es muy variable, transcurriendo en un plazo medio de una a dos semanas, aunque en algunas ocasiones puede desarrollarse en un período mucho más largo, cuando se manifiestan en contra uno o más factores de crecimiento, siendo la baja temperatura y el valor reducido de pH los que más influyen en esta ralentización. Terminada la FML, los controles que se deben realizar al vino en crianza sobre sus lías, deben ser los habituales para un vino situado en estas condiciones, teniendo especial cuidado en lo referente a posibles alteraciones microbianas, pues no se debe olvidar que éste

El nivel de anhídrido sulfuroso a mantener en el vino debe ser lo más bajo posible, con objeto de permitir la formación de acetaldehído y así posibilitar la polimerización de antocianos y taninos, pero esta carencia de dióxido de azufre puede conducir al desarrollo de microorganismos indeseables, como las mismas bacterias lácticas que podrían metabolizar otras sustancias del vino: ácido cítrico, ácido tartárico, glicerina, etc., o también bacterias acéticas, e incluso de levaduras indeseables como las Brettanomyces, todos ellos de nefastas consecuencias. Del mismo modo, la ausencia de anhídrido sulfuroso podría conducir a una oxidación irreversible en el vino. Con este motivo, es muy importante realizar controles periódicos de los vinos, atendiendo especialmente a su análisis sensorial, que permitirá al enólogo conocer la evolución del vino, y así decidir el final de su permanencia sobre las lías, pudiendo entonces completarse la crianza en madera con una estancia suplementaria en barrica. En sexto y último lugar, las condiciones de embotella do de los vinos elaborados por este sistema, no pueden ser más sencillas, pues en general no es necesario realizar tratamiento de estabilización alguno, pues como anteriormente se ha comentado, los vinos resultan estables frente a las insolubilizaciones de tartratos, proteínas y materia colorante. Aunque los tratamientos de estabilización de los vinos, como las clarificaciones y estabilización tartárica, no afectan sustancialmente a su contenido en manoproteínas, mientras que las filtraciones muy cerradas pueden hacerlo en cierta cuantía, y teniendo como consecuencia una rápida colmatación de los filtros.

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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

Unicamente podría ser necesario realizar un ajuste del nivel de anhídrido sulfuroso libre hasta 30 a 40 mg/litro, y en ocasiones añadir una dosis de hasta 200 mg/litro de goma arábiga inmediatamente antes del embotellado, con el propósito de prevenir la precipitación de materia colorante en el tiempo.

2.6. Crianza de vinos sobre lías en depósito.
Una alternativa a la FML en barrica y su posterior estancias sobre las lías, consiste en realizar este mismo proceso en depósitos de mayor capacidad, y en consecuencia aprovechar las mismas ventajas que este método ocasiona, y sin que las sensaciones aromáticas y gustativas aportadas por la madera se transmita y “deforme” a los vinos. Se trata de obtener un vino fermentado en barrica, pero sin barrica. Esta técnica se puede aplicar tanto a los vinos tintos como a los blancos, donde simplemente consiste en dejar los vinos sobre sus lías, removiéndolas con la misma periodicidad, y consiguiendo que el poder reductor de las lías se compense con oxígeno aportado, bien mediante aireación o mejor utilizando la técnica de micro-oxigenación, permitiendo de este modo la autolisis de las levaduras sin la aparición de olores azufrados desagradables. Las cantidades de oxígeno a aplicar oscilan entre 1 a 3 ml por litro y día, acompañadas de un puesta en suspensión de las lías, utilizando para ello cualquier dispositivo al efecto: bombas de remontado, agitadores de hélice, turbobazuqueadores, etc.

El control de este proceso es similar al anteriormente expuesto, aunque en este caso se debe prestar especial atención para conseguir un buen equilibrio de oxidación-reducción, aireando u oxigenando algo más cuando el vino se comience a reducir, o bajando la aireación u oxigenación, e incluso llegando a corregir el nivel de anhídrido sulfuroso libre, cuando el vino presente ligeros síntomas de oxidación.

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Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica
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IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

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114

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Fermentación Maloláctica

115

F

IV.3 Fermentación maloláctica: cuándo y cómo

Antonio PALACIOS Carlos SUÁREZ José María HERAS Sibylle KRIEGER.
Lallemand
3.1 Introducción 3.2 fermentación maloláctica: si o no 3.3 Conclusión

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Fermentación Maloláctica

3.1 Introducción
l vino es uno de los productos más antiguos donde los procesos microbiológicos hacen una contribución importante en la calidad final del producto. La elaboración del vino es un proceso bien conocido desde hace siglos, pero no obstante nuevos desarrollos, especialmente tratamientos biotecnológicos, son lentamente aceptados y utilizados en las bodegas.

IV.3. Fermentación maloláctica: cuándo y cómo

E

Más recientemente, las bodegas más modernas han introducido instalaciones que hacen posible seguir unas normas higiénicas rigurosas, donde todos los procesos de elaboración se controlan, incluyendo los microbiológicos. Al comienzo de esta evolución apareció el uso de levaduras seleccionadas con fines enológicos, siendo un tratamiento muy extendido en nuestros días. A principios de los años noventa, los cultivos de bacterias lácticas liofilizadas se habían introducido en los mercados, comenzando con productos tipo “Standar”, que requieren un tiempo y trabajo intenso de reactivación. Posteriormente los cultivos tipo “1-Step” (de un solo paso), con una única etapa de adaptación y luego, los primeros cultivos de inoculación directa, que aparecieron en los años noventa. Los nuevos cultivos tipo MBR® se introdujeron a principios del año 2000, pertenecen ya a la segunda generación de cultivos de bacterias malolácticas de inoculación directa. Estos cultivos con alta concentraron bacteriana, representan una herramienta útil e innovadora para una controlada, rápida y confortable fermentación maloláctica (FML) dentro de un proceso de vinificación en condiciones limitantes, con resultados predecibles y uniformes.

3.2 Fermentación maloláctica: si o no
La realización de la FML nunca ha sido cuestionada en un vino tinto, pero en vinos blancos, es todavía una materia de preferencia y del estilo de vino. Investigando en diversos vinos tintos y blancos australianos, Bartowski y Henschke1 observaron que la gran mayoría de vinos tintos habían experimentado una FML completa, encontrando en los vinos blancos una gama completa de diferentes niveles de FML, comenzando sin FML en vinos de la variedad Riesling y terminando por vinos reservas Chardonnay con 100% de FML y con mucho cuerpo. Pero la mayoría de los vinos blancos habían experimentado una FML parcial.

117

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

Desde hace algún tiempo, era posible distinguir fácilmente los vinos blancos producidos en las regiones norteñas de climas fríos con una acidez muy marcada, de los vinos producidos en climas más cálidos. Pero obviamente el gusto de los consumidores ha cambiado a través de los tiempos, la mayoría de los consumidores prefieren un vino blanco afrutado con una acidez moderada5. Así aparecen unas preguntas importantes a resolver: ¿En qué vino?, ¿En qué grado la acidez tiene que ser disminuida? y mediante ¿Que método?. Durante años, la FML ha sido reconocida únicamente por la reducción de la acidez, pero más recientemente la FML se ha mostrado como un medio para mejorar organolépticamente y dar una estabilidad microbiológica al producto final, Krieger, 1999 6. La decisión FML "SI" o "NO" tiene que ser tomada muy rápidamente en el proceso de vinificación. Si la decisión es "NO" para los vinos blancos o FML parcial, los tratamientos posibles y únicos serán: una buena clarificación, adición de SO2 y disminución de la temperatura. Más recientemente, un nuevo aditivo se ha introducido en la industria del vino llamado lisozima como un elemento de control de bacterias lácticas, Gerbaux, 983 y Gerland 99 4. La OIV ha aprobado el uso de lisozima en el vino y la decisión se transmitió debidamente a la CEE. Este • La lisozima no tiene efecto antioxidante. Así, el SO2 no puede ser completamente reemplazado. • Como la lisozima tiene una estructura proteica, la bentonita reacciona con la enzima inmediatamente. Si un tratamiento con bentonita se lleva a cabo, debe hacerse con anterioridad a la adición de lisozima. • El efecto de la lisozima disminuye después de algunas horas. La lisozima puede inhibir la FML durante un período corto de tiempo, pero

organismo ha incluido la lisozima en la lista de tratamientos y prácticas autorizadas en la vinificación, pero dentro de unos límites, a condición de ser determinados dichos límites. Desafortunadamente la Comisión no fue capaz de establecer estos límites en el plazo de tiempo requerido. En USA el uso de lisozima está permitido, pero la bodega debe notificarlo a la BATF. En nuestro conocimiento, ninguna reglamentación existe para Australia y Nueva Zelanda. La lisozima es una enzima extraída de la clara de huevo de gallina, con una acción inhibitoria muy específica sobre bacterias Gram +, especialmente lácticas. Las diversas experimentaciones realizadas han mostrado que aplicando lisozima en dosis de 500 mg/l al comienzo de la fermentación alcohólica en vinos con un alto riesgo de sufrir FML o dos adiciones separadas en el tiempo en vinos con menor riesgo, al comienzo y al final de la fermentación alcohólica, pueden evitar la FML, permitiendo utilizar niveles reducidos de SO2. Acorde a Gerbaux (98), las dosis de SO2 pueden ser reducidas a 4 o 5 g/hl con la presencia de lisozima. La fermentación alcohólica no se ve influenciada por el tratamiento con lisozima. Algunas reglas importantes tienen que ser respetadas en la aplicación de lisozima en vinificación en blanco: reacción positiva después de un calentamiento, aunque numerosas experimentaciones no han podido probar ninguna inestabilidad proteica en el vino embotellado. • ATENCION: La adición de ácido metatartárico para la estabilización tartárica de vinos tratados con lisozima, provoca una fuerte turbidez en el vino, aunque los vinos se hayan tratado con bentonita. Este fenómeno no ha podido ser aclarado hasta el momento.

el vino todavía tiene que ser filtrado antes de ser embotellado para evitar una FML espontánea en botella. • La actividad de la lisozima disminuye con el pH. • Existe riesgo de recontaminación cuando se mezclan vinos tratados y no tratados. • Aunque siendo inactivada, la lisozima permanecerá en el vino a causa de su estructura proteica. Los vinos tratados mostrarán una

A pesar de todas las ventajas y la buena actividad de la lisozima, las reglas básicas de buenas prácticas enológicas todavía tienen que ser respetadas: higiene, higiene e higiene. Si la decisión se ha hecho en favor de una FML parcial, las adiciones de lisozima en la gama de 200 a 300 mg/l durante la fermentación, pueden parar la FML durante varias horas. Nuevamente, se debe prestar atención a la disminución del efecto de la lisozima a
118

través del tiempo, por lo que se hace preciso vigilar las posibles recontaminaciones. Durante la vendimia de 1999, la supervivencia de bacterias lácticas salvajes en el vino podía ser observada durante meses, pudo comprobarse lo mismo en algunos vinos tratados con lisozima, aunque con menor frecuencia. Una observación realizada por parte del ITV en Francia, que debe ser todavía confirmada, conduce a pensar que en vinos inoculados con

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Fermentación Maloláctica
de la inoculación con el cultivo llamado Alpha. El control (tanque 1) no fue tratado con lisozima, en el tanque 2 se hizo FML con una adición pequeña de lisozima cuando se había degradado la mitad del ácido málico, y en el tanque 3, se agregó lisozima al principio, directamente después de la inoculación con Alpha, para evitar cualquier degradación del ácido málico. La adición de lisozima provoca una muerte brusca de las bacterias y 4 días después de la adición de lisozima, no debería detectarse ninguna bacteria.

cultivos seleccionados para iniciar la FML, las bacterias parecen ser más fácilmente inactivadas por lisozima que las bacterias propias de una FML espontánea. Así, si la decisión es una FML parcial, interrumpiendo la FML con lisozima o SO2, la recomendación es inducir la FML mediante cultivos iniciadores seleccionados. La figura 1 muestra la supervivencia y la cinética de la FML en un vino Riesling de 1999 (Alemania) después

Figura 1.
FML en un vino Riesling de 1999 después de la inoculación directa con Alpha, con y sin tratamiento de lisozima (pH 3,03; alcohol 12 % vol; AT 8,0 g/l; SO2 total < 35 ppm; temperatura 18 °C)
5,0 1,0E+07
1 (m álic o) sin lisozim a

1,0E+06
Células Viables (cfu/ml)

4,0 1,0E+05
ácido málico

2 (m álic o) lis ozim a MLF 50 % MLF 3 (m álic o) lis ozim a al principio 1 (cfu) sin lisozim a

3,0
(g/l)

adic ión de lisozim a

1,0E+04

2,0

1,0E+03

1,0E+02 1,0 1,0E+01

2 (cfu) li s ozim a MLF 50 % 3 (cfu ) lis ozim a al principio

0 0 5 10 15 20 Tiem po (d) 25 30 35

1,0E+00

Cuando la FML se para en alguna etapa de la degradación del ácido málico, pueden aparecer algunas secuelas organolépticas. Durante la FML, pueden producirse algunos compuestos con gusto indeseable, que se degradarán nuevamente al final o durante la FML. Si la FML se interrumpe, algunos de estos compuestos pueden ser no degradados permaneciendo en el vino. En la mayoría de los casos, es mejor mezclar un vino con FML completa con el mismo vino donde se ha evitado la FML. De esta forma, será posible hacer una maceración post-FML, incluyendo en el esquema de elaboración una buena gestión en la producción de diacetilo1.
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 CHA RDO NNA Y (1 0 t a n q u e s ) P IN O T N O IR (1 7 t a n q u e s ) A NT ES M L F D ES P U ES M L F M LF + 3 m

Si la FML es deseada, las decisiones adicionales son necesarias en lo que concierne al "COMO", y "CUANDO", “FML espontánea o inducida”. Si la decisión es en favor de la FML, se recomienda restringir la aplicación de SO2 al comienzo de la vinificación. El nivel de SO2 total no debe ser superior de 50 mg/l. Un contenido en SO2 libre de 15-20 mg/l puede atrasar la FML o incluso impedirla completamente, que es frecuentemente el caso de vinos con pH bajo, donde el efecto antimicrobiano del SO2 libre es mucho más fuerte. Si la preferencia es de FML espontánea, las uvas deberán ser sanas. Los conteos altos de células viables de bacterias lácticas salvajes pueden tener una influencia negativa sobre la calidad del vino. En la mayoría de los casos, cuando Lactobacillus o Pediococcus dominan la FML espontánea, frecuentemente resultan niveles altos de subproductos indeseables, tal y como acidez volátil, aromas de reducción; o en el supuesto del crecimiento excesivo de Pediococcus, altos niveles en aminas biógenas (histamina entre otras), que pueden provocar problemas importantes a personas sensibles (Figura 2).

% DE VINOS CON CONCENTRACIONES DE HISTAMINA > 2.5 mg/l

Figura 2.
Aminas biógenas – Evolución durante la vinificación (datos:ITV FRANCE, 1998)
119

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

En vinos con alto pH, la inoculación temprana del cultivo bacteriano seleccionado y caracterizado, como las cepas L31 o Alpha, es altamente recomendable.

Figura 3.
Desarrollo de una FML controlada

En condiciones óptimas para el crecimiento de bacterias, como pH alto, excesiva madurez o presencia de uvas botritizadas, temperaturas próximas a los 22º C, una temprana adición de lisozima (500 mg/l) consigue reducir la presencia de bacterias lácticas indeseables y ayuda a conseguir una fermentación alcohólica más saludable. La FML puede ser inducida posteriormente al final de la fermentación alcohólica inoculando bacterias seleccionadas (Figura 3). La alta tolerancia a las bajas temperaturas (inferiores a 13-14º C) de los nuevos cultivos MBR® de inoculación directa, puede ser un parámetro muy interesante a utilizar en vinificación en tinto así como en blanco. Además supone una ventaja económica, ya que no es

necesario calentar el vino o las bodegas para alcanzar una temperatura entre 18º y 22° C. Reduciendo la temperatura, se reduce la velocidad de la FML. Lonvaud-Funel8 ha publicado resultados donde se muestra un incremento del diacetilo y una degradación más lenta del ácido málico, así como un incremento en la producción de ácido acético cuando la FML es muy rápida. Una degradación del ácido málico más lenta permite estabilizar mejor el color en los vinos tintos a baja temperatura, resultando un descenso menor del color, causado solamente por el cambio de pH. Por esta razón, ciertos enólogos franceses prefieren para sus vinos una FML lenta a baja temperatura (comunicación personal Vignerons Buzet). Ver figura 4.

Figura 4.
Tiempo de FML en Pinot Noir de Burgundy de 1999 (Francia), después de inocular directamente los cultivos seleccionados a diferentes temperaturas (pH 3,46, alcohol 13,3 %vol)

120

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Fermentación Maloláctica
Laurent y Henick-Kling7 comprobaron que pueden encontrar diferencias en el impacto aromático según la contribución de diferentes cepas de bacterias. A algunas cepas se les ha reconocido la capacidad de producir un fuerte impacto de mantequilla, nueces y aromas de levadura; otras cepas parecen contribuir muy poco en el aroma del vino1. La Figura 5 muestra la cinética de degradación del ácido málico en vinos Riesling de Alemania de 1999 (pH 3,03, alcohol 95,0 g/l) a una temperatura de 18 °C, inoculando con diferentes cultivos comerciales. La figura 6 muestra los resultados del perfil sensorial de estos vinos.

Otra ventaja muy importante resultante de inducir la FML con cultivos seleccionados, es limitar el crecimiento de bacterias en el vino, ya que los cultivos son inoculados a un nivel de 2 millones de bacterias por ml de vino, creciendo hasta 50 millones de células por ml. Para inducir la FML de forma espontánea, es necesario crecer desde 100 bacterias/ml hasta 50 millones de células, lo cual significa un crecimiento celular mayor y mayor número de generaciones, acumulándose gran cantidad de metabolitos. Lo que significa un mayor riesgo de producir un impacto láctico indeseable.

Figura 5.
Cinética de la degradación del ácido málico en vinos de Riesling, 1999 (D). (pH 3,03, alcohol 95,0 g/l).

Las cinéticas de las FML llevadas a cabo en tanques de acero inoxidable inoculados con varias cepas de bacterias seleccionadas fueron comparadas en la degradación del ácido málico durante 30 días. Los análisis de implantación fueron positivos para todas las cepas, lo cual indica que las cepas inoculadas indujeron la FML. Este tipo de control es necesario para poder relacionar las diferencias observadas durante la evaluación sensorial de los vinos según la contribución de cada cepa en particular. A pesar de observar unas cinéticas de degradación de málico muy similares, la evaluación sensorial de los

vinos reveló unas diferencias significativas entre las diferentes cepas. Los vinos fermentados con la cepa MCW mostraron una mayor apreciación de los descriptores "cuerpo/intensidad". Esta cepa ha tenido un importante mercado en California debido a su contribución en los aromas de mantequilla, nueces, nata y carácter de levadura. Unos análisis químicos más exhaustivos revelaron niveles de acetaldehído medidos a mitad de la FML superiores. La cepa Alpha, como en otros casos, dio una percepción sensorial dirigida hacia un vino afrutado en combinación con complejidad aromática y mejora del cuerpo. En los vinos fermentados con SP1, se produjo un incremento del afrutado.
121

IV. Inicio, desarrollo y control de la fermentación maloláctica

Figura 6.
Influencia de los inóculos bacterianos de FML en el perfil gustativo de un vino Riesling QBA de 1999 (Württemberg – Alemania)

El diacetilo esta asociado al carácter de mantequilla. Este compuesto se forma como intermediario en la degradación de azúcares y del ácido cítrico por parte de las bacterias lácticas. Bartowsky 1. Fornachon y Lloyd2 demostraron que los vinos que han sufrido la FML contienen más diacetilo que los vinos sin FML. Concentraciones superiores a 5-7 mg/l son indeseables en los vinos, pero si el diacetilo participa en concentraciones inferiores, contribuye positivamente en el aroma y en la calidad organoléptica del vino. La concentración de diacetilo puede ser manejada de una forma significativa por el enólogo. La dosis de inoculación de bacterias afecta al grado de degradación del ácido málico y tiene una influencia importante en la concentración final del diacetilo.

La figura 7 muestra el contenido en diacetilo de un vino Pinot Noir de Baden en Alemania de 1998. Tres cultivos comerciales distintos fueron inoculados a diferentes dosis junto a levaduras o directamente después de la fermentación alcohólica. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Inmediatamente después de la FML, los ensayos "A" fueron tratados con SO2 (100 mg/l) y filtrados posteriormente. Los ensayos "B" sufrieron una crianza sobre lías durante cuatro semanas realizando un “batonnage” por semana; después de las cuatro semanas, los ensayos "B" fueron también tratados con dióxido de azufre y filtrados. Los contenidos en diacetilo al final de la FML fueron significativamente diferentes. Obviamente, el tiempo de inducción de la FML durante la fermentación alcohólica o posteriormente, tiene poca influencia en el contenido de diacetilo de los vinos.

Figura 7.
Contenidos en diacetilo en vinos Pinot Noir de 1998 según el tratamiento y dosis de inoculación
4,5 4 3,5

diacetilo (mg/l)

3

mg/l

2,5 2

diacetilo (mg/l) después MLF diacetilo (mg/l) después de filtrar + SO2 A diacetilo (mg/l) después 4 B sem anas sobre lias

Diacetilo después de ferm. alcoh.
1,5 1 0,5 0

2x10e5 cfu/ml después ferm. alcoholica

2x10e5 cfu/ml inoculación simultanea

1x10e6 cfu/ml inoculación simultanea

1x10e6 cfu/ml después ferm. alcohol. fermentation

2x10e6 cfu/ml inoculación simultanea

2x10e6 cfu/ml después ferm alcohol. fermentation

4x10e6 cfu/ml inoculación simultanea

122

4x10e6 cfu/ml después ferm alcohol. fermentation

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Fermentación Maloláctica
se corresponde con el umbral mínimo de percepción sensorial en vinos de Chardonnay9. Aun así, el diacetilo no puede explicar por sí solo la gran variación en el perfil aromático entre vinos fermentados con diferentes cultivos bacterianos, como recientemente Richardson y Henick-Kling11 han mostrado en vinos de Cabernet Sauvignon y Chardonnay después de realizar la FML y analizando los vinos usando técnicas de GC/MS y GC/olfactometría.

Además, no se ha podido observar en nuestros ensayos una influencia importante por parte de la cepa inoculada, pero si se pudo mostrar un efecto según la dosis de inoculación en la concentración final de diacetilo. Los ensayos inoculados con alta dosis (5x106 cfu/ml) de bacterias, donde hubo un crecimiento limitado, mostraron niveles bajos de diacetilo (1,1 mg/l), mientras que en los ensayos inoculados con un bajo número de bacterias (2x104 cfu/ml) se encontraron cantidades de diacetilo de 3,9 mg/l. Después de adicionar dióxido de sulfuroso, huvo un detrimento del 50 % del diacetilo medible, debido a la interacción entre ambas moléculas, aunque todavía permanece por enzima del umbral mínimo detectable en vinos de Pinot noir. En todos los ensayos con tratamiento sobre lías se observó un importante y rápido detrimento en la concentración de diacetilo. Independientemente del nivel de diacetilo al comienzo de la crianza sobre lías, solo 0,2 mg/l de diacetilo fueron medidos después de cuatro semanas, lo cual

3.3 Conclusión
Basándose en los amplios resultados encontrados en una extensa bibliografía internacional y en los nuestros propios, creemos que se puede manejar el perfil sensorial de los vinos eligiendo el cultivo bacteriano adecuado para dirigir la FML, siendo un cultivo bien definido por sus propiedades fermentativas y efectos organolépticos.

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123

V. La microoxigenación

L

Índice

127

127

V.1. Microoxigenación y fermentación maloláctica
Stéphane Yerle Oenodev S.A.R.L.

M

V.1. Microoxigenación y fermentación maloláctica
Stéphane YERLE
Oenodev S.A.R.L.
1.1 Histórico y presentación de la microoxigenación 1.2 ¿Microoxigenación y fermentación maloláctica? 1.3 Bases de la oxigenación cuantificada 1.4 Aplicaciones de la microoxigenación. 1.5 Reacciones del vino implicadas en la microoxigenación. 1.6 Nociones teóricas sobre el control de la microoxigenación antes de la fermentación maloláctica 1.7 Parámetros de control de la microoxigenación antes de la fermentación maloláctica. 1.8 Novedades sobre la secuencia cronológica de la microoxigenación y de la fermentación maloláctica.

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Fermentación Maloláctica

V.1. Microoxigenación y fermentación maloláctica

o se trata en modo alguno de sustituir la barrica. La microoxigenación y la barrica son incluso complementarios, como lo demuestra el hecho de que nuestro mayor mercado en la región de Burdeos sea Saint-Emilion, donde el 90% de nuestros clientes crían el vino en barrica. Por lo tanto, con la microoxigenación se confiere estructura a los vinos antes de su envejecimiento. Esta técnica viene a ser como los cimientos de una casa: cuanto más sólidos sean, mejor resistirá la casa el paso del tiempo.

N

(...) Todos los vinos del mundo necesitan oxígeno. Algunos muy poco, como el Beaujolais, mientras que otros, muy tánicos, tienen necesidades enormes, como el Madiran. (...)" A continuación se exponen algunos comentarios del inventor, que todavía permiten resumir la herramienta adicional que tenemos en la microoxigenación.

1.1 Histórico y presentación de la microoxigenación Los experimentos de un viticultor con talento
A principios de los años 1990, Patrick Ducournau y la familia Laplace, viticultores de la denominación Madiran, deciden estudiar el control de los aportes de oxígeno durante la crianza. Enfrentados a los problemas de la crianza de los vinos elaborados a partir del varietal Tannat, ricos y con una alta concentración de taninos (hasta 7 g/l) y también de antocianos al principio de la crianza (2 g/l, comparada con la concentración de 0,6 g/l de un vino de Garnacha o Pinot Noir), observan una desecación de los vinos al final de la crianza. Así comienza la búsqueda de una técnica de crianza adecuada que permita conservar la untuosidad y el carácter afrutado del vino, ya se críe en depósito o en barrica. En 1991, los primeros ensayos de aportes de oxígeno cuantificados y constantes demuestran rápidamente su superioridad con respecto a los trasiegos y más aún con respecto a la ausencia de oxígeno: los vinos evolucionan mejor, y también, cosa más sorprendente para la época, parecen evolucionar más despacio. En unas circunstancias en las que los vinos evolucionaban perdiendo color y desecándose, ahora conservan más color y más fruta, pero también y sobre todo conservan taninos más arropados. (LEMAIRE, 1995). En 1996, apoyándose en el éxito naciente de la microoxigenación, se funda Boisé France con el objeto de desarrollar una gama de viruta de roble pensada por el enólogo y para el enólogo: en lugar de contentarse
127

V. La microoxigenación

con el mero efecto aromático de la madera (lactona, aldehídos, fenoles volátiles y furanos), se perseguían además efectos enológicos sobre la estructura (riqueza en taninos elágicos).

mente en las bodegas, y así adaptar nuestros productos a las necesidades de los clientes.

1.2 ¿Microoxigenación y fermentación maloláctica?
Esta pregunta es tan antigua como la historia del vino. En realidad, no se trata tanto de una tecnología como de una antigua práctica. Porque en 1993, Patrick Ducournau y sus colaboradores no han inventado una receta; simplemente han puesto a punto una herramienta de oxigenación lenta fiable, precisa y regulable. Una de sus aplicaciones modernas se inscribe entre la fermentación alcohólica y la FML, con objeto de estabilizar el color y la estructura del vino, y es el fruto de años de observación de los efectos beneficiosos del contacto prolongado entre un vino joven con un pH bajo, sin azufrar, y el aire. Se habla entonces de FML en barrica, una operación que genera etanal porque al vaciar la barrica ésta contiene un vino con color, concentrado y sin azufre, similar al obtenido mediante el bazuqueo borgoñón que a menudo provoca la caída del sombrero de orujo, dejando el vino contenido en una cuba troncocónica en contacto con el aire libre. En la actualidad, Oenodev se ha convertido en una empresa especializada en la crianza de vinos, y se sigue planteando las mismas preguntas. ¿Cuál es el mejor ajuste de las herramientas eficaces desarrolladas durante estos últimos años (microoxigenación, inyector de oxígeno, virutas de roble, bazuqueador…) para conseguir el vino perseguido a partir de una materia prima determinada? Lo mismo cabe decir sobre la fase estratégica de la espera de la FML: ¿cuáles son los límites e imperativos de esta aplicación?

La validación científica
Financiada inicialmente por un proyecto ANVAR con el aval científico del INRA de Montpellier, representado por Michel Moutounet, la empresa Oenodev se ha esforzado por conseguir rápidamente una validación científica de la patente registrada en 1993. En la actualidad, la validación científica de la microoxigenación se basa fundamentalmente en ensayos en bodegas. Se ha hecho un seguimiento analítico de los vinos, y los estudios se han basado en grupos de jurados expertos, entrenados regularmente en ese tipo de análisis sensorial por un profesional (Maurice Chassin, del Institut de Dégustation de Tours). En 2006, ya la técnica suma 13 años de validación en todo el mundo y en todo tipo de tintos, así como de blancos y rosados tanto en bodegas industriales como en estaciones experimentales (INRA Pech Rouge, Institut Rhodanien, Universidad de Tarragona, Estación Enológica de Rueda,…). Además, desde hace tres años, Oenodev también dispone de su propia nave tecnológica equipada con 150 cubas inertes de tres hectolitros, en las que se puede controlar la turbidez, la temperatura y la madera. Con la experiencia, las prescripciones han cambiado. Desde principios de los años 1990, la técnica de microoxigenación se ha refinado. Los ensayos en bodega han llevado a modificar las precauciones. Antiguamente, el aporte de oxígeno empezaba después de la fermentación maloláctica (FML), con el vino azufrado. Se prefería no correr ningún riesgo. Desde hace algunos años, se prescribe una adición de oxígeno más precoz, justo al final de la fermentación alcohólica.

1.3 Bases de la oxigenación cuantificada
Ante todo, hablemos del propio principio de la microoxigenación y de la mecánica que consiste en estabilizar la evolución de la estructura de un vino tinto. Es el principio de la oxigenación cuantificada: velocidad de introducción del O2 en el vino, inferior en todo momento a la velocidad de reacción del O2 en el vino. Eso es lo que sucede empíricamente en barrica (aporte lento, a un ritmo de entre 0,5 y 0,75 ml/l/mes), y es lo que hemos reproducido para las cubas gracias a un sistema de microoxigenación con mayor control: Caudal débil, continuo y controlado de O2 ; 100 % de transferencia al vino.

Oenodev, innovación sobre el terreno
En la actualidad, Oenodev tiene una plantilla de 25 personas, de las que 17 son enólogos, 2 técnicos y 3 investigadores repartidos por todos los continentes. Con sus filiales en Australia, Estados Unidos, Argentina, Chile e Italia, Oenodev dispone de su propia red de distribución, lo cual le permite llevar la misma propuesta al mundo entero. En España, AZ3oeno constituye el mejor ejemplo de colaboración de Oenodev con cuatro jóvenes enólogos competentes y formados desde los primeros pasos de la microoxigenación: cursos de cata, expertos en clientela (oxígeno disuelto y Brettanomyces), asesoría en microoxigenación y crianza sobre lías… Esta presencia única sobre el terreno permite transmitir rápidamente la información recopilada directa128

De ese modo, la gran diferencia entre el aporte puntual (trasiego) y el aporte cuantificado es que nunca se produce una acumulación de oxígeno disuelto (< 0,03 ppm) lo cual asegura la preservación de numerosos compuestos, en especial aromáticos. Para ello, Oenodev ha colaborado con el INRA de Pech Rouge para desarrollar el primer protocolo de dosificación del oxígeno disuelto en los vinos por métodos electroquímicos.

Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica Figura 1.

Niveles de oxígeno disuelto idénticos en barrica y en cuba inerte (Lemaire, 1994).

1.4 Aplicaciones de la microoxigenación.
Las principales aplicaciones de la microoxigenación serán pues: Aporte de O2 a las levaduras durante las FA Aporte de O2 durante la crianza sobre lías de los vinos blancos, consiguiéndose mayor untuosidad y frescor aromático Disminución de los caracteres de reducción Reducción de los caracteres herbáceos Trabajo de la estructura global de los tintos.

un heterociclo oxigenado C unido al ciclo A. Después, estas moléculas se podrán asociar directamente mediante enlaces C4-C6 o C4-C8. Globalmente, los antocianos tienen las mismas características químicas que los flavanoles, con la diferencia de la posibilidad de rotación alrededor del enlace entre el ciclo B y el heterociclo C. Así, se podrán observar reacciones de polimerización directa entre taninos y antocianos a través de enlaces C4-C6 o C4-C8. También se pueden producir otras reacciones de polimerización, principalmente a través del etanal . ¿Cómo se forma el etanal en el vino? Se obtiene mediante oxidación conjunta de los ortodifenoles y el etanol (trabajos de Singleton 1974-1987). El O2 presente en el medio (y en mayor medida gracias a la microoxigenación) reacciona con los ortodifenoles originando ortoquinona y peróxido de oxígeno, que permitirá la oxidación del etanol en etanal. De ese modo, se pueden obtener distintos tipos condensación: Taninos – Etilo – Taninos Taninos – Etilo – Antociano Esta última asociación se caracteriza por un aumento del color rojo y púrpura. De ese modo, el aporte de oxígeno a un vino tinto estructurado y rico en anto129

-

Nos concentraremos en esta última aplicación, aunque en la actualidad numerosos usuarios apliquen con éxito esta técnica en las situaciones restantes.

1.5 Reacciones del vino implicadas en la microoxigenación.
A continuación expondremos esquemáticamente las reacciones diversas que se producen en el vino gracias a la oxigenación cuantificada. Aquí tenemos representado un flavanol (vulgarmente denominado tanino). Los flavanoles forman parte de la familia de los flavanoides (igual que los antocianos, dicho sea de paso) y se caracterizan por una estructura de 15 carbonos que consta de dos ciclos fenólicos A y B, y de

V. La microoxigenación

cianos libres permite estabilizar los antocianos con los taninos por mediación del puente etanal, bloqueando la evolución de estos últimos (los antocianos cierran la polimerización al final de la cadena). Por lo tanto, es necesario oxigenar vinos suficientemente estructurados y colorados para obtener un buen rendimiento de la reacción, pues la oxidación del etanol (reductor secundario) en etanal requiere una oxidación previa de los taninos (reductor primario). Por último, la oxigenación de un vino desequilibrado por falta de color (y por tanto de antocianos) desembocaría en la polimerización sin límite de los polifenoles entre sí, provocando la desecación y el amarilleo (SAUCIER, 1997). Así pues, en presencia de grandes cantidades de antocianos monoméricos, las reacciones conducen a moléculas de menor peso. La polime-

rización inducida por el etanal cesa cuando los dos extremos de la cadena están ocupados por un antociano. (CHENIER & al 2000). Los últimos ensayos realizados durante la campaña 2002 (ver figura 2) por el departamento de Investigación y Desarrollo de Oenodev permiten confirmar el efecto positivo de este aporte sobre el color del vino, y la pertinencia del modelo de control de la oxigenación en función de la percepción del etanal (CABRI, DUCOURNAU, LEMAIRE, 2002). Esta fase de estabilización es necesaria para la buena evolución de cualquier tinto en barrica, pues además de estabilizar su color, confiere al vino una mayor resistencia a la oxidación gracias a una menor oxidabilidad de sus polifenoles.

Figura 2.
Evolución del color de un vino sometido a un aporte cuantificado entre FA y FML (Oenodev, 2002).
Balance de densidades ópticas: 420, 520, 620, IC y matiz al cabo de 23 días de micorooxigenación antes de la FML
DO 420 DO 520 DO 620 IC Matiz

20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 DO 420 DO 520 DO 620 IC Matiz

Testigo 4,63 5,95 1,93 12,51 0,78

30 cc 5,55 7,57 2,25 15,37 0,73

60 cc 6,33 8,45 2,45 17,23 0,75

90 cc 6,63 9,23 2,63 18,49 0,72

Por lo tanto, se puede observar que: Los vinos jóvenes se caracterizan por sus altos contenidos de pigmentos no resistentes a la decoloración por el SO2 y más concretamente por los antocianos nativos En los vinos más viejos, los contenidos de estos compuestos han disminuido claramente, dejando su lugar a compuestos más estables, como los piranoantocianos y los pigmentos T-A+ En los vinos microoxigenados, se ha podido observar la presencia de flavanoles piranoantocianos, y el análisis por espectometría de masa ha permitido identificar compuestos en los que participa el etanal (simbolizado en azul turquesa): Condensación de compuestos fenólicos

gracias, principalmente, al etanal (F-etil-A+). Por otra parte, se han identificado otros dos tipos de moléculas resultantes bien de la reacción directa entre antocianos (Ant-Ant) bien con la participación del etanal (Ant-etil-Ant). Este último descubrimiento es absolutamente innovador en el mundo de la enología, puesto que es la primera vez que se ha puesto de manifiesto este tipo de reacción, que bien podría contribuir al cambio de las características organolépticas, y más concretamente del color (su evolución). La característica general de los pigmentos obtenidos es una mayor resistencia a la decoloración por el SO2, y por lo tanto una mayor estabilidad de la materia colorante con el paso del tiempo (ATANASOVA, 2003).

-

-

130

Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica
vino oxigenado
entre los núcleos A y B. Hay que señalar que se trata de una polimerización que hace aumentar el grado de polimerización medio. Los productos formados son de tamaño considerable (y por lo tanto menos solubles, hasta precipitarse) y presentan un color pardusco (VIDAL, 2003). Es la llamada desecación de los vinos tintos característica de las oxigenaciones tardías, al final de la crianza.

vino joven

vino viejo

A

A
COOH

F A

A

F n

A F

A

A

CPNR SO2

A n

F n

Pigmentos resistentes a la decoloración por SO2
ATANASOVA, 2003 (tesis doctoral)

1.6 Nociones teóricas sobre el control de la microoxigenación antes de la fermentación maloláctica
Para controlar esta fase ideal de oxigenación de los vinos, Oenodev ha desarrollado varios modelos que recurren tanto al análisis como a la cata, de forma similar a las operaciones de seguimiento de la crianza en barrica. ¡El enólogo no elige la fecha del trasiego de barrica en función de los resultados de su espectrofotómetro! Por lo que se refiere a la percepción del etanal, desde 2002 (figura 3) Oenodev ha confirmado la existencia de una excelente correlación entre la concentración química de este compuesto y su percepción sensorial.

Ahora bien, hay que recordar que la oxigenación no está reservada a esta fase únicamente, y que más adelante, durante la crianza, el equilibrio inicial taninos/antocianos se modifica debido a la desaparición de una gran cantidad de antocianos. Esto induce una evolución excesiva de los flavanoles en un medio oxidante pobre en antocianos. La polimerización oxidativa de los flavanoles se lleva a cabo por mediación de la formación de quinonas. En este caso, la polimerización no se realiza entre los núcleos A y C, sino

Figura 3.
Correlación entre el etanal percibido y el etanal analizado (Oenodev, 2002).

Comparación entre el etanal percibido y el etanal analizado (Etanal analizado mediante CPG) 50,00 45,00 40,00 35,00 30,00
Etanal mg/l
T Analizado 60 Analizado T perçu 60 perçu 30 Analizado 90 Analizado 30 perçu 90 perçu

5,00

4,00

3,00

25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 8/10/02 17/10/02 23/10/02 29/10/02 0,00 1,00 2,00

Intensidad

131

V. La microoxigenación

He aquí una tabla de simulación en función de algunas reglas: • Aumento del volumen, pero sin evolución del OD (Oxígeno Disuelto) y del etanal: hay que incrementar la dosis (dosis insuficiente) ; Aumento del volumen, del etanal y sobre todo del OD: hay que reducir la dosis, pues no se ha utilizado parte del O2; Aumento del volumen y del etanal y estabilidad del OD: hay que mantener la dosis (dosis correcta) ; Estabilidad de los diversos factores: hay que preguntarse por los factores limitadores, como la turbiedad; Estabilidad del volumen y del etanal pero aumento del OD: ensamblaje imperativo, pues falta concentración.

Al final, serán los objetivos de reactividad y de aporte total (dosis acumulada) los que dicten el trabajo de oxigenación, sabiendo que el etanal no constituye un fin en sí, sino un paso obligado para la construcción de la futura estabilidad de los vinos. El etanal no se debe conservar en ningún caso después de la FML a niveles distintos de los de un vino sin tratar. Dependiendo de los vinos, el umbral de detección es del orden de 20 mg/l.

1.7 Parámetros de control de la microoxigenación antes de la fermentación maloláctica.
Empezando por los grandes parámetros que hay que vigilar antes de la FML, la turbidez es el que más influencia tendrá en la reactividad del vino: ¡una biomasa puede consumir diez veces más que cualquier carga tánica! A continuación se facilitan algunos valores de referencia del consumo de oxígeno: Lías (108 levaduras/ml): alrededor de 900 g/l/h Vino blanco limpio: 0,2 g/l/h Vino tinto joven limpio: 120 g/l/h

En la actualidad, la dosificación del oxígeno disuelto se lleva a cabo de forma rutinaria hasta algunas decenas de ppb mediante la luminiscencia (figura.4), una técnica que no requiere ni regeneración, ni calibrado, y que permite al enólogo controlar de ese modo el oxígeno disuelto desde la extracción de los mostos hasta el embotellado de los vinos. Entre la FA y la FML el oxígeno disuelto constituye pues un valioso asistente de ayuda a la decisión, que Oenodev propone sistematizar.

Cuanto mayor es la turbidez, menos eficaz sobre la estructura es el oxígeno, pero más se favorece el aumento de untuosidad originado por la autolisis de las levaduras. Sin embargo, no hay que olvidar que esta autolisis requiere largos Figura 4. meses de espera a alta tempePrincipio de medición del oxígeno disuelto por luminiscencia (Hach Lange, 2004). ratura (VUCHOT, 2001).

Lange LDO™
Cuerpo Caps

Moléculas luminescentes
Capa polímero

Oxígeno

Por otro lado, el segundo parámetro que debe figurar entre los elementos de control, y sin el cual no se puede hacer nada, son las Brettanomyces. Estas auténticas levaduras de contaminación esperan a la fase de latencia del final de la fase alcohólica para desarrollarse en ausencia de azufre, en un momento en que en el medio abundan azúcares. Nuestro microbiólogo, el doctor Jean François Bilis, ha demostrado el interés del recuento sistemático al final de la FA para desplegar medios preventivos y poder mocrooxigenar con tranquilidad. Recordemos que las Brettanomyces no han esperado a la microoxigenación para desarrollarse, y que los aportes puntuales (trasiego que ocasiona la disolución de algunas ppm) son los que más estimulan las colonias (GILIS, 2003). Estas levaduras son

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Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica
crianza, observamos que los lotes oxigenados por acumulación de oxígeno disuelto (trasiego y dosis excesivas) son los que permiten la mayor proliferación de Brettanomyces (figura 5).

capaces de consumir hasta 0,3 mg de O2/l/hora con una población de 105 UFC/ml, de modo que pueden anular todo el efecto positivo del oxígeno aportado bruscamente. En este ensayo, realizado durante la

Figura 5.
Evolución de las poblaciones de Brettanomyces en función del modo de oxigenación (después de la FML, Oenodev, 2001).
16 00000 Azufre 14 00000 O2 - 20 cc (dosis excesiva) O2 - 10 cc O2 - 5 cc (dosis normal) 12 00000 (UFC/ml) Brettanomyces O2 - Efecto inyector del Oxígeno 10 00000 Cata 1 Cata 3 Cata 2

80 0000

60 0000

40 0000

Efecto inyector

20 0000

0 0 5 10 15 Tiempo (días) 20 25 30

En esta fase estratégica, entre la FA y la FML, no debemos desdeñar el papel determinante desempeñado por los azucares residuales en el desarrollo de las levaduras de tipo Brettanomyces. Más que el oxígeno, la presencia de glucosa y fructosa en canti-

dades importantes es capaz por sí sola de aniquilar todo el trabajo de crianza de los vinos. En efecto, Gilis (figura 6. 2003) ha demostrado que la influencia de los azúcares (> 2 g/l) es más determinante que la del oxígeno.

Figura 6.
Evolución de las poblaciones de Brettanomyces en función de la concentración de azúcares residuales (Oenodev, 2003).

133

V. La microoxigenación

Una presencia importante de azúcar residual incrementa considerablemente la producción de fenoles volátiles (+ 40% de etilguayacol, + 45% a + 60% de etilfenol). Desde el punto de vista gustativo, sólo los vinos que contienen azúcares residuales desarrollan un olor “animal” característico (sudor, cuero, establo) muy desagradable, que aparece durante la fase estacionaria y aumenta considerablemente durante la fase de declive. Son vinos que presentan una desaparición total de los caracteres afrutados, y en boca se caracterizan por una pérdida de untuosidad, un aumento del amargor, y una sensación general de sequedad. En el caso de los vinos secos, se observa un cambio en la paleta aromática, que desemboca en una disminución del carácter afrutado en beneficio de los caracteres especiados que contribuyen en la complejidad. Esta es pues una razón adicional para terminar primero la fermentación alcohólica antes de proceder a ninguna adición de oxígeno.

Por todos esos motivos de turbidez y estabilidad microbiológica, Oenodev preconiza recurrir sistemáticamente al centrifugado de los vinos almacenados en grandes depósitos > 500 hl, pues ha quedado demostrado el interés de esta herramienta debido a su acción de eliminación selectiva de las Brettanomyces y no de las bacterias, lo cual permite concluir las FML con toda tranquilidad. Finalmente, el último parámetro de control, a saber el oxígeno disuelto, permite comprobar el buen consumo del oxígeno aportado, en especial en el caso de los inviernos fríos, pues la temperatura condiciona estrechamente su consumo por parte de los polifenoles. Antes de la FML, por lo general los vinos tienen temperatura suficiente, pero el control del oxígeno disuelto también puede garantizar que no se caiga en una dosificación excesiva por falta de concentración fenólica del vino: una vez más, el oxímetro demuestra ser una ayuda muy valiosa.

Figura 7.
Ausencia de relación entre dosis de oxígeno y oxígeno disuelto antes de la FML (Oenodev, 2001).

D.O. / Dosis de Oxigeno medida en más de 160 depositos. 2,0 1,8 1,6 1,4
D.O. mg/l

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 20

R2=0.3

40 60 80 Dosis de microoxigenación ml/l/mes

100

También hemos puesto de manifiesto la ausencia de oxígeno disuelto en la totalidad de los depósitos microoxigenados antes de la FML cuando las dosis añadidas son acordes con las recomendaciones, es decir de hasta 60 ml/l/mes (Figura 7). A veces, la práctica nos lleva a continuar el trabajo de oxigenación después de la FML, cuando los vinos aún están suficientemente equilibrados, y en caso de que la temperatura sea correcta, pero habrá que tener cuidado en todo momento de no volver la estructura
134

más desecadora, por oxigenación de un vino empobrecido en antocianos (en especial tras un periodo de frío prolongado, cuando se pierden más antocianos que taninos). Este riesgo no existe antes de la FML y esa es la razón por la cual el 100% de los usuarios prefiere iniciar la adición en ese momento: el rendimiento de la reacción siempre es óptimo, a condición de que se controle el entorno del vino (turbidez, oxígeno disuelto y Brettanomyces). En efecto, si se administra bien esta adición, no debe aumentar el oxígeno disuelto.

Informe Técnico Fundación para la Cultura del Vino

Fermentación Maloláctica
ácido málico se practica conjuntamente con el de los azúcares. En algunos lotes, se microoxigenan los vinos al final de la FA y también de la FML (por la coinoculación) sin adición azufre, cuando ya no queda ácido málico, en cuyo caso se bloqueará la población de bacterias mediante la adición de lisozimas. El perfil de oxigenación coincide entonces con el aplicado al vino sin azufrar (adición total > 10 ml/l) y el azufre no se añadirá hasta el final de la oxigenación, en una dosis de 5 g/hl.

1.8 Novedades sobre la secuencia cronológica de la microoxigenación y de la fermentación maloláctica.
Durante los ensayos realizados sobre la vendimia de 2005, los investigadores del departamento de I+D de Oenodev han estudiado la posibilidad de microoxigenar después de la FML un vino sin azufrar pero estabilizado con lisozimas. La siembra se lleva a cabo mediante inoculación conjunta, y el seguimiento del

Figura 8.
Aplicación innovadora de la adición de oxígeno mediante lisozimas (Oenodev, 2005).
Fermentación Alcohólica Maceración Crianza

Levaduras

Oxígeno: - 40 mL/L/mes - 2 días 30 mL/L/mes - 6 días 15 mL/L/mes - 2 días 10 mL/L/mes - 11 días Total: 13 ml/l sobre 21 días

Azúc Ac. Málico

Azúcares (g/L)

Bacteria

Málico (g/L)

Lisozimas

Fin MicroO 2 MicroO 2

SO 2

Tiempo (días)

El estudio comparativo entre esta aplicación y una adición más clásica antes de la FML demuestra que se consigue mayor efecto sobre el color (intensidad y tono) antes que después de la FML, en el vino sin azufrar, a pesar de que esta última aplicación innovadora también aporta resultados alentadores (figura 8). En efecto, sabemos que esta diferencia de resultado se explica sin lugar a dudas por la mejor reactividad de los antocianos y del etanal con un pH bajo. En

cambio, resulta obvio que de cara al objetivo de un mayor control de las diversas poblaciones de microorganismos (bacterias y levaduras contaminantes), la inoculación conjunta seguida de una adición de lisozimas al final de la FML puede ser positiva si se desea estabilizar significativamente el color del vino mediante una micro-adición de oxígeno. Por otra parte, en este ensayo confirmamos que no existe relación entre un aporte cuantificado y el desarrollo de la FML, observación corroborada en numerosas bodegas (figura 9).

135

V. La microoxigenación

Figura 9.
Comparación de la FML entre un testigo y un vino microoxigenado (Oenodev, 2005).
6,00

5,00

Ácido Málico Testigo Ácido Málico (Microoxigenación)

4,00
Ac. Malique (g/L)

3,00

2,00

1,00

0,00 0 10 20 30 40 50 60 Temps (jours) 70 80 90 100

Por último, para incrementar la reactividad del sistema tanino-antociano, también se podría plantear una reducción del pH del vino durante esta fase, o bien la sustitución del efecto de las lisozimas por acidificación, mediante técnicas de electromembranas (electrodiálisis mediante membranas bipolares) que tal vez nos abran nuevas perspectivas de aquí a algunos años… Lo que es indudable a estas alturas, es decir al cabo de los más de diez años que viene definiéndose, es que la microoxigenación, inspirada en la antigua práctica de la crianza de los vinos, es una técnica fiable, segura y precisa. El enólogo dispone al fin de

una herramienta regulable de adición moderada de oxígeno, que puede utilizar con la máxima seguridad controlando parámetros como la temperatura, el oxígeno disuelto, la medición de la turbidez, el seguimiento de las poblaciones de Brettanomyces, las lisozimas y por último la siembra de bacterias malolácticas. Al margen de los esquemas convencionales de aplicación del oxígeno entre la FA y la FML, se abren nuevas perspectivas que permiten al enólogo dirigir todas las facetas del juego: controlar el proceso de elaboración en función de imperativos técnicos y de objetivos propios, hasta el producto final: el vino.

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