Enfasis Alimentacion 2005, Ao XI, N 1:64 -71 (Feb-Mar).

Mtodos alternativos, precisos y rpidos para el control microbiolgico de alimentos

Silvia Michanie1
silvia@michanie.com.ar 1. Consultora en Seguridad Sanitaria de Alimentos, y Prof. Universidad de Belgrano y de la UTN, Buenos Aires.

Este articulo es un extracto de la conferencia presentada en el Congreso de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos realizado en Crdoba, Argentina del 24 al 26 del 2004. El constante crecimiento en el desarrollo de los mtodos alternativos usados para el control microbiolgico de los alimentos merece una somera revisin con el objeto de informar al usuario aquello que esta disponible para su uso. Un mtodo alternativo es aquel que demuestra o estima el mismo analito tal cual se mide usando el mtodo de referencia correspondiente para una categora de alimentos. En este contexto analito es el componente medido por el mtodo; es decir, un microorganismo usualmente patgeno, un recuento o numeracin de algn grupo microbiano, taxonmico o no. En nuestros das, hay en el mercado kits de mtodos alternativos para detectar bacterias y sus toxinas, parsitos, virus, priones, micotoxinas, biotoxinas, alergenos, numerosas sustancias qumicas, metales pesados, antibiticos y la especie animal. Los mtodos de referencia son aquellos que son reconocidos y ampliamente aceptados internacionalmente. Algunos ejemplos de estos mtodos son los publicados en: Standard Methods for the Examination of Dairy Products (mtodos oficiales en los EE.UU.) publicados por American Public Health Association (APHA) Environmental Protection Agency de los EE.UU. Food Safety Inspection Service, Departamento de Agricultura de los EE.UU. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, (APHA) International Commission of Microbiological Specification of Foods (ICMSF) Association of Official Analytical Chemist International AOAC- sus Mtodos Oficiales de AnlisisBacteriological Analytical Manual de la Food & Drug Administration de los EE.UU. no oficiales- publicados por AOAC. American Association of Cereal Chemists (AACC)

Obviamente, tambin son mtodos de referencia los publicados por la Organizacin Internacional de Normalizacin (ISO), como tambin los mtodos de la Federacin Internacional de Lechera, hoy en ISO como FIL/ISO. En los ltimos aos ISO y la Comisin Europea de Normalizacin realizaron estudios Interlaboratorios de los mtodos tradicionales que detectan los principales microorganismos patgenos y as, las actuales normas para patgenos y recuentos presentan datos de precisin. La lista no es exhaustiva y seguramente existe alguna otra asociacin que propone sus mtodos.

Razones o atributos que poseen los mtodos alternativos Liberar lotes rpidamente Ahorrar costo financiero Ahorrar trabajo manual Racionalizar el recurso humano Usar equipos semi totalmente automticos Facilitar la ejecucin de los ensayos Analizar cantidades importantes de Alimentos (por ej., 200.000 muestras / ao) Contribuir en momentos de crisis Ahorrar espacio en depsitos Facilitar la eliminacin de residuos biolgicos Aumentar la velocidad de los anlisis y/o su respuesta Disponer de kits sensibles, precisos con buen limite de deteccin Ahorrar por miniaturizacin

La mayora de los kits pueden ser usados en: Laboratorios de baja complejidad La mayora de los kit o equipos requieren personal con adiestramiento mnimo tiles en la verificacin del sistema HACCP

tiles para el monitoreo de la higiene en tiempo real Realizar el control rpido de proveedores Y muy pronto ..realizar controles en fronteras Los biochips o microarrays estn en pleno desarrollo y ensayo, y permitirn realizar controles en fronteras.

Desventajas Entre las desventajas actuales la determinacin de la Presencia / Ausencia (P / A) de un microorganismo patgeno por un mtodo alternativo es que aun es considerado un ensayo de screening o prueba tamiz. Es decir, aun se requiere exige la confirmacin de los positivos por un mtodo tradicional. Sin embargo, estimo que en muy poco tiempo este impedimento desaparecer para aquellos mtodos que han sido validados bajo un protocolo armonizado. Los resultados negativos son considerados definitivos. Aun son de screening (confirmar los resultados positivos de microbios patgenos) Algunos mtodos necesitan enriquecer el analito que se busca antes de detectarlo Usualmente, costos algo mas elevados que los mtodos tradicionales El horario del laboratorio podra modificarse segn el mtodo No siempre son flexibles; es decir, el kit no permite mas de un tipo de uso No siempre hay disponibilidad regular de los kits en el mercado. Tome precauciones al respecto. Por ej., disponga de alternativas que pueda usar rpidamente Algunos mtodos tambin detectan los microorganismos muertos

Automatizacin Los mtodos alternativos son manuales, semi y totalmente automticos. Por ej., hay equipos como el Spiral Plater que una vez cargado inocula la placa en forma automtica y otros como el MiniVidas que realiza un ensayo ELFA un tipo de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) - usado para detectar patgenos que, tambin, una vez inoculados son totalmente automticos. Incluso, emite un registro con el resultado del ensayo.

Algunos requisitos Entre los requisitos que conviene priorizar al elegir un kit o equipo destacamos que debe ser apropiado al fin que se persigue, validado, disponible con regularidad en el mercado, de precio accesible y sencillo para el personal que lo operara. Adems, se debe calcular el

ahorro de tiempo que significar para la empresa y las posibilidades de contar con el equipo en comodato.

En Microbiologa de Alimentos qu buscamos? Recuento de flora normal, de alteradores, de iniciadores, y de mohos y levaduras. Detectamos y/o contamos microorganismos indicadores y patgenos, y/o sus toxinas Caracterizamos microorganismos y sus toxinas Evaluamos o monitoreamos la higiene de superficies, equipos, lquidos de enjuague y aire. Los microorganismos patgenos al hombre que se transmiten por los alimentos son: Salmonella Listeria monocytogenes Escherichia coli O157:H7 Otras serovariedades patgenas de E.coli pertenecientes a los grupos EPEC, ETEC, EHEC, EIEC y EAEC Campylobacter yeyuni Staphyloccus aureus Bacillus cereus Clostridium perfringens

Los recuentos o numeraciones frecuentemente realizadas son de: Enterobacteriaceae Escherichia coli Coliformes Coliformes fecales hoy en desuso Coliformes termo tolerantes Mohos y levaduras Vibrio cholerae O1 Cryptosporidium Giardia Clostridium botulinum Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Aeromonas hydrophila Plesiomonas shigelloides Enterobacter sakazakii

Con excepcin de las serovariedades de E.coli, desde el comienzo de la lista hasta Giardia inclusive hay mtodos alternativos disponibles. Sin embargo, la mayora de los kits o

equipos disponibles han sido desarrollados para detectar Salmonella, Listeria y E.coli O157:H7, y para los recuentos de indicadores de higiene. Conviene mencionar que desde hace algn tiempo se promueve la determinacin y/o el recuento de E.coli en lugar del grupo coliformes o coliformes fecales. Se ha establecido que la presencia de coliformes en frutas y verduras no es necesariamente de origen fecal. Incluso, se ha visto que coliformes psicrtrofos son capaces de multiplicarse entre 2 y 5 C en productos cocidos conservados al fro en plantas de carnes. Por lo tanto, el recuento de coliformes ha perdido el significado que tenia como indicador de higiene durante la produccin. Para el anlisis microbiolgico del agua la Organizacin Mundial de la Salud propuso el cambio de coliformes fecales por coliformes termotolerantes o termo resistentes (capaces de fermentar la lactosa entre 44 45 C) con gneros como E.coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter. Los tres ltimos no son necesariamente de origen fecal.

En Microbiologa de Alimentos, qu tipo de ensayos hacemos usualmente? Contar o enumerar (patgenos, grupos de microorganismos o grupos taxonmicos) Detectar (Presencia / Ausencia) patgenos Caracterizar microorganismos Detectar y caracterizar toxinas microbianas

Recuentos o Numeracin Qu hay disponible? Muy someramente mencionamos los siguientes: 1. Varias firmas comerciales reemplazaron la placa de Ptri por membranas rehidratables (Petrifilm de 3M, Sanita Kun, Compact Dry). Estos kits ahorran la preparacin del material y permiten, tambin, hacer ensayos en plantas con laboratorios de muy baja complejidad. Existen membranas rehidratables para recuentos de microorganismos indicadores y de patgenos. Para el uso siempre se deben respetar las indicaciones del fabricante y las posibles limitaciones del sistema. 2. Un sistema similar pero automtico es el Spiral Plater. Las placas se siembran en gradiente. No requiere hacer diluciones. La sensibilidad esta acorde al volumen de siembra y dimetro de la placa. Hay varias marcas comerciales. Cuenta tambin con lector automtico de placas. 3. En el sistema Redigel se produce la gelificacin en la placa por la presencia de cloruro de calcio en sta y la presencia de metoxil pectina en el diluyente. No he observado que se comercialice en Argentina aunque es un producto de 3M.

4. En el campo de la filtracin las Membranas Hidrofbicas Cuadriculadas (HGMF) combinan el recuento en placa, la membrana filtrante y la tcnica del NMP (Nmero Mas Probable). Es mtodo oficial de Canad. 5. Tambin existe otro sistema que combina la filtracin por membrana con la bioluminiscencia de ATP. Una vez producido el desarrollo se aplica un spray para liberar el ATP. Permite el recuento por medio de un procesador de imagen. 6. Asimismo, en el rea de la filtracin el sistema Direct Epifluorescent Filter Technique (DEFT) es muy til para detectar mohos y levaduras en bebidas. Consiste en una filtracin y la tincin de los cidos nucleicos con naranja de acridina fluorescente que se observan con un microscopio con luz epifluorescente. 7. El advenimiento de las sustancias cromo y fluorognicas traj enormes ventajas frente a los medios de cultivo tradicionales y son usadas en medios slidos y lquidos para contar o detectar microorganismos. 8. SimPlate es un sistema de recuento en placas especiales basados en el NMP y con el uso de sustancias cromo y fluorognicas. 9. Otros mtodos de recuento se basan en la medicin de la actividad metablica de los microorganismos. Con este propsito se usan equipos que miden la impedancia, conductancia o capacitancia de los medios de cultivo, segn conveniencia. 10. Otros sistemas miden cambios pticos del medio de cultivo, qumioluminscencia, fluorescencia, Citometra de flujo, etc.

Deteccin de microorganismos patgenos Son realmente numerosos los kits comerciales que existen en el mercado como as tambin los equipos y no es objeto de esta presentacin sealar las marcas comerciales ni abarcar todo lo disponible. Solamente presentamos los principios en que se basan. Biosensores. Qu son? Son bio-molculas inmovilizadas superficies bioactivas en las que se produce una interaccin entre un analito y una enzima, una clula un anticuerpo especifico. Esta reaccin bioqumica se convierte en una seal fcil de medir. 1. La mayora de los kits o equipos disponibles se basan en la interaccin antgeno anticuerpo. Basados en este tipo de reaccin hay muy diversos tipos de ensayos como: 1.1 la cromatografa de inmunoafinidad muy til en la deteccin de micotoxinas; 1.0 los enzimoinmunoensayos (EIA ELISA) son reacciones sustrato enzimticas que hacen visible o ponen en evidencia la interaccin antgeno anticuerpo. 2.0 la separacin inmunomagntica seguida de un ensayo tradicional para poner en evidencia el microorganismo patgeno; 3.0 la inmunocaptura inmunoseparacin mas un enriquecimiento posterior seguido de un ELISA;

4.0 la interaccin seguida de migracin lateral mas una segunda interaccin (inmunoprecipitacin); 5.0 la aglutinacin de partculas de latex muy til para la caracterizacin de los microorganismos, y 6.0 la inmnomovilizacin de Salmonella utilizada para la deteccin de salmonelas mviles. 2. Los mtodos moleculares realizan por ej., el enriquecimiento del microorganismo patgeno seguido de hibridacin del ADN y luego un EIA, usado este ultimo para poner en evidencia la reaccin previa. 3. Tambin est, muy difundida la PCR o Reaccin en Cadena de la Polimerasa que consiste en una amplificacin del ADN. Sobre este protocolo hay diversos kits que estn en el mercado, incluso, alguno de ellos automtico. 4. Algunos ensayos, tambin moleculares, epidemiologa molecular. son sumamente tiles en el campo de la

5. En este momento se desarrollan y ensayan biochips o microarrays (disposicin en cierto orden) que es un micro-ordenamiento de biomolculas en forma de matriz sobre una pequea pieza de vidrio u otro material. La superficie contiene varios cientos de spots con biomolculas ligadas. El ensayo esta basado en la hibridacin de cadenas complementarias. Prometen detecciones simultneas de microorganismos patgenos de inters.

Caracterizacin de los microorganismos Estn disponibles ensayos bioqumicos, serolgicos, reacciones de latex, fagotipificacin y mtodos moleculares tiles en la investigacin de brotes de enfermedades de transmisin alimentaria. Los sistema disponibles miniaturizados son domsticos y comerciales; algunos de ellos totalmente automticos. Conviene recordar que antes de realizar una caracterizacin debemos asegurar la pureza de la cepa.

Deteccin y caracterizacin de las toxinas microbianas Hay disponible mtodos alternativos para detectar toxinas de Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli O157 y Clostridium botulinum. Existen kits y equipos que caracterizan las toxinas por una reaccin de ELISA (TECRA) o por ELFA (MiniVidas). Tambin, existe un kit de inmunoprecipitacin que detecta las Verotoxinas de E.coli O157 (Merck)

Evaluacin de la Higiene de las Superficies Con este propsito existen en el mercado: Hisopos o esponjas de poliuretano Hygicult similares El uso de placas de Replicate Organism Direct Agar Contact (RODAC) o similares

Bioluminiscencia de ATP -numerosos equiposHisopos para detectar presencia de protenas Hisopos para detectar presencia de azcares Los 3 ltimos brindan resultados en tiempo real y permiten, de ser necesario, establecer de inmediato acciones correctivas. Salvo los 3 ltimos los resultados se expresan por cm2. Evaluacin de lquidos de lavado o enjuague Es usual evaluar la calidad higinica de los lquidos de enjuague por ej., en sistemas CIP cleaning in place-. Para satisfacer esta necesidad es til la filtracin de un volumen conocido e importante de lquido por membranas tipo manifold o por medio de unidades filtrantes. Igualmente estos sistemas son tiles cuando se necesita evaluar la accin de los bactericidas usados en equipos no cerrados en que podemos recoger lquidos, higinicamente, para su anlisis. Los resultados se expresan por ml o cm3.

Evaluacin del aire Desde hace tiempo existen en el mercado muestreadores de aire que captan y hacen impactar un importante volumen de aire sobre la superficie de placas de Ptri de tamao regular o similar a ellas. El tipo de agar de las placas queda a eleccin del usuario segn lo que busque. Los resultados se expresan por m3 de aire. Estos equipos son muy tiles para evaluar el aire de zonas de envasado asptico, como as tambin en zonas que no se requiere aire estril pero deseamos monitorear su calidad.

Validacin de los mtodos alternativos La validacin de los mtodos alternativos es una necesidad para el usuario del mtodo como as tambin para la firma que desarrolla el kit o equipo. Si bien recientemente se ha publicado la norma ISO 16140:2003 que presenta un protocolo para validar los mtodos microbiolgicos alternativos aun nos parece que no se ha alcanzado una armonizacin global y vemos que existen diferentes protocolos segn se trate de la norma ISO, de AOAC International, de NordVal, MicroVal o AFNOR (Organismo Francs de Normalizacin). La validacin es una necesidad para los fabricantes y una garanta y seguridad para el usuario pero la armonizacin global de la misma es tambin sumamente necesaria.

Conclusiones Algunos estudios estiman un crecimiento del 17 % de las ventas anuales para los mtodos alternativos frente a un 8 % de los mtodos tradicionales en Latinoamrica. Los mtodos inmunolgicos son los que muestran un mayor crecimiento. El desarrollo de los mtodos alternativos continuar y sern de utilidad para la vigilancia de los alimentos realizada por la autoridad sanitaria y por las empresas incluyendo la pequea y mediana empresa.

A ningn proveedor le interesa que Ud. tenga una mala experiencia con sus equipos. Recurra a ellos, plantee sus necesidades y vea que le ofrecen.

Agradecimiento Mi gratitud a Mariano Czastkiewicz por la revisin del este manuscrito