BAB I PENDAHULUAN 1.

1 Latar Belakang Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifatsifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel baktei tersebut tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Kelompok bakteri tahan asam ini juga dapat hidup sebagai flora normal pada usus ternak unggas, dengan demikian sumber tersebut memudahkan dalam upaya mendapatkan isolat bekteri yang tahan asam. Dalam suatu praktikum maupun dalam penilitian terutama objeknya adalah mikroorganisme, diperlukan beberapa langkah khusus. Mikroorganisme tersebut harus dibuat dalam suatu bentuk preparat. Preparat adalah suatu kaca yang digunakan untuk media penelitian mikroorganisme. Dalam melakukan penelitian untuk menemukan mikroorganisme didalam preparat dengan menggunakan mikroskop dilakukan dengan prosedur dan tahap-tahap tertentu meliputi dari memasukan mikroorganisne atau benda lain yang akan diteliti, pengaturan skala yang digunakan supaya mikroorganisme dapat terlihat dan pengaturan diafragma yaitu pengaturan cahaya yang masuk dalam preparat supaya dapat terlihat oleh lensa objektif dan lensa okuler sehingga bayangan benda dapat terlihat dengan sejelas mungkin oleh mata. bagaimana prosedur penyiapan preparat dilakukan sangat penting untuk menentukan. Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua,

yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. 1.2 Rumusan Masalah 1.2.1 Bagaimana pembuatan preparat untuk pengecatan? 1.2.2 Apa pengecatan gram itu? 1.2.3 Bagaimana teknik pengecatan gram? 1.2.4 Bagaimana cara pengecatan gram? 1.3 Tujuan Penulisan 1.3.1 Untuk mengetahui pembuatan preparat untuk pengecatan. 1.3.2 Untuk mengetahui pengecatan gram. 1.3.3 Untuk mengetahui teknik pengecatan gram. 1.3.4 Untuk mengetahui cara pengecatan gram. 1.4 Metode Penulisan Dalam makalah ini digunakan metode kajian pustaka, yaitu dengan mencari sumber yang berkaitan melalui media elektronik. Selain itu di tambahkan pada beberapa argumentasi pribadi penulis sehingga dapat diperoleh hasil yang maksimum.

BAB II ISI 2.1 Pembuatan Preparat untuk Pengecatan

Mikroorganisme merupakan populasi makhluk hidup di alam yang jumlahnya sangat besar namun, semua mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, sama halnya dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Pengecatan dan pewarnaan merupakan salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri (Sutedjo, 1991). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan, 1986; Volk & Wheeler, 1993; Lim, 1998). Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman, 1983). Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Garm (Ratna, 1993; Dwidjoseputro, 1994). Bakteri-bakteri dari genus Mycobacterium dan spesies tertentu dari genus Nocardia mengandung sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel baktei tersebut tidak terwarnai oleh pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Kelompok bakteri tahan asam ini juga dapat hidup sebagai flora normal pada usus ternak unggas, dengan demikian sumber tersebut memudahkan dalam upaya mendapatkan isolat bekteri yang tahan asam (Cappuccino & Sherman, 1983). Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri (Sutedjo, 1991). Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin,

netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti: fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991). Kondisi yang terus memburuk membuta endospora dibebaskan dari degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak, misalnya pemanasan berkelebihan, pembekuan, radiasi, pengeringan, dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal, spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi. Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria, 2005) dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan(Jaweta, 1986; Dwidjoseputro, 1994; Assani, 1994).

2.2 Pengecatan Gram Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri

gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Sifat Komposisi dinding sel Ketahanan terhadap penisilin Penghambatan warna basa Kebutuhan nutrien Ketahanan terhadap perlakuan fisik Gram Positif Kandungan lipid rendah Lebih sensitif Lebih dihambat Kompleks Lebih tahan Gram Negatif Lipid tinggi Lebih tahan Kurang dihambat Relatif sederhana Kurang tahan

Genus bakteri yang termasuk gram negatif adalah Enterobactericeae, Salmonella spp, Shigella spp, E. Coli, Yersinia enterolitica. Sedangkan bakteri gram positif adalah Staphylococci, Streptococci, Enterococci, Clostridium, Bacillus. Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah: 1. Larutan violet kristal hucker (1 tetes) sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri. 2. Iodin (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama. 3. Ethanol 95% (secukupnya sampai cat utama luntur), sebagai bahan peluntur untukkmelunturkan cat utama. 4. Safranin (1 tetes) sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudahkehilangan warna cat utamanya.
2.3 Teknik Pengecatan Gram

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.

Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu,pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Persiapan Sebelum dilakukan pengecatan Gram, tentu harus disiapkan bahan (spesimen) yang akan diperiksa. Bahan yang akan diperiksa, dapat berasal dari : 1) langsung dari penderita dapat berupa sputum (dahak), pus (nanah), discharge telinga, discharge hidung, urin dan cairan serebrospinal. Spesimen yang akan dicat, sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear) terlebih dulu. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides, dengan atau tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop. Pembuatan preparat Alat dan bahan yang diperlukan adalah : Alat : Ose atau kapas lidi steril Gelas obyek Lampu spiritus Bahan : Bahan yang akan diperiksa. Untuk bahan yang berbeda, memerlukan cara pembuatan preparat yang berbeda pula. Berikut cara pembuatan preparat untuk berbagai sumber bahan. 1. Bahan langsung dari penderita Bahan disentrifuge terlebih dulu, kemudian endapannya dibuat preparat. Bahan yang berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin. Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala api kirakira 20 cm), sampai preparat tersebut kering. Setelah kering, teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi. Setelah betul-betul kering, preparat siap dicat. 2. Bahan dari biakan cair Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung.

3. Bahan dari media pertumbuhan padat Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas obyek tersebut. Dengan ose steril, ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita
a. Cat Gram Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu cat Gram A, B, C dan D. Masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. Komposisi dan fungsi masing-masing cat Gram, adalah sebagai berikut : 1. Cat Gram A

Cat ini terdiri atas : Kristal violet Etil alkohol 95 Ammonium oksalat Akuades : 2 gram : 20 ml : 0,8 gram : 80 ml Cat Gram A

Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet).

merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A. 2. Cat Gram B

Cat ini terdiri atas : Yodium Kalium Yodida Akuades : 1 gram : 2 gram : 300 ml

Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat). 3. Cat Gram C

Cat ini terdiri atas : Aseton Etil alkohol 95 % : 50 ml : 50 ml

Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan :

 alkohol.

Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang

bersifat demikian disebut bakteri Gram positif. Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan Bakteri yang bersifat demikian

antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif. 4. Cat Gram D

Cat Gram D terdiri atas : Safranin Etil alkohol 95 % Akuades : 0,25 gram : 10 ml : 90 ml

Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan : Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat

cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah

dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D.

2.4 CARA PENGECATAN GRAM

Sebelum melakukan pengecatan Gram, siapkan alat dan bahan yang diperlukan. Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di tempat yang terjangkau. Jangan sampai terlalu jauh sehingga menyulitkan dan memakan waktu. Alat dan bahan yang diperlukan adalah :

Alat : Rak pengecatan Kran/sumber air yang mengalir Bahan : Cat Gram A, B, C dan D Preparat yang telah siap untuk dicat KELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAM Kelebihan : 1. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. 2. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna

diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci

intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore. Kekurangan : Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan

mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.