Stanična biokemija

Nastavnik: doc. dr. sc. Boris Mildner Tel.: 4606241 E-mail: bmildner@chem.pmf.hr Konzultacije: ponedjeljak: 11 – 12h srijeda: 11 – 12h

Stanična biokemija
preliminarni raspored predavanja 15. 10. 22. 10. 27. 10. 05. 11. 12. 11. 19. 11. 03. 12. 10. 12. 17. 12. 07. 01. 14. 01. 21. 01. Uvod, metode, biološke membrane, transport iona i malih molekula sortiranje proteina u membrane i organele, sekrecijske vezikule prijenos signala u stanici pokretljivost stanice i kontrola staničnog oblika regulacija staničnog ciklusa matične stanice, stanična smrt, multicelularnost razvoj organizma, živčani sustav imunološki sustav dogovori, izbor predavača, postera..... kancerogeneza mini simpozij (Stanična biokemija)

1

Stanična biokemija
seminarski radovi • Pisani Seminarski rad je obavezan – pisati prema preporukama za završne radove; (Sažetak, Uvod, Metode, Rezultati, Rasprava, korištena literatura) • Definitivni izbor teme (i znanstvenih članaka) treba završiti do 3. 12. (do 3. 12. možete me konzultirati o izboru članka) • Do 7. 01. Seminarski radovi trebaju biti napisani i poslani (u elektronskom obliku). • 7.01. Pripremiti Sažetak i kratku (5 min) prezentaciju – 7. 01. svi ćemo birati 4 predavača za simpozij – ostali radovi prezentirat će se u obliku postera. • 21. 01. Simpozij, 4 predavanja (svako predavanje po 15 min + 5 min za raspravu), posterska sekcija – razgledavanje postera, izbor najboljeg postera, (eventualno prikaz najboljeg postera u obliku 10 min prezentacije).

Stanična biokemija
ispiti i ocjenjivanje • Ispit se sastoji od pismenog i usmenog dijela. • U ocjenu Seminara ulazi i ocjena pisanog seminarskog rada kao i ocjena prezentacije, postera, sudjelovanja u raspravama o drugim temama. • Usmenom ispitu može se pristupiti nakon što se na pismenom ispitu riješi barem 50% pitanja/zadataka i preda završna verzija seminarskog rada. Ocjena seminara utječe na 1/3 ukupne ocjene.

2

Stanična biokemija
teme za seminarske radove i prezentacije (radovi trebaju biti što recentniji)
• • • • • • • • • • • • • • • • • Jezgra Mitohondrij Lizosomi Metode (genomika, proteomika, nanotehnologija, sortiranje stanica, detekcija i separacija organela) Posttranslacijske modifikacije proteina Sekrecijske vezikule, endocitoza, egzocitoza Prijenos signala u stanicu, ili transpoteri malih molekula i iona Prijenos signala u jezgru, nuklearna pora, kromatin Pokretljivost stanice (aktin, miozin) Mitoza – mikrotubuli, kinezin, diemin Interakcije stanica – stanica Regulacija staničnog ciklusa Stanična smrt (apoptoza, nekroza) Diferencijacija stanica Živčani sustav Kancerogeneza Imunološki sustav

Život započinje sa stanicom
Stanična biokemija B. Mildner 15. 10. 2010.

3

ukratko može izvršavati brojne kemijske reakcije. može primati i slati informacije. Svaka od tih stanica može rasti. 4 . razmnažati se. Stanice postoje u različitim oblicima i u različitim dimenzijama • Osim što se morfološki razlikuju.Jajašce okruženo spermom Iz jedne oplođene stanice nastat će 1014 stanica (oko 200 različitih vrsta) koje čine ljudski organizam. stanice se razlikuju u: – Načinu gibanja – Unutarnjoj organizaciji (prokarioti – eukarioti) – Metaboličkim aktivnostima – Komunikaciji – …….

h) b) Nakupina arhea bakterija – Methanosarcina. Postoje različiti oblici i dimenzije stanica (prikazi morfološki različitih stanica (a .h) a) Eubakterije – na slici je prikaz Lactococcus lactis koji se koriste u mliječnoj industriji. Neke od ovih bakterija žive u buragu preživača te stvaraju više od 150 L metana/dan. Ove bakterije dobivaju energiju pretvorbom ugljičnog dioksida i vodika u metan.Postoje različiti oblici i dimenzije stanica (prikazi morfološki različitih stanica (a . 5 .

- Postoje različiti oblici i dimenzije stanica (prikazi morfološki različitih stanica (a .h) d) Velike pojedinačne stanice – fosilni su ostaci jaja dinosaurusa 6 .h) c) Krvne stanice (artificijelno obojane) crveno – eritrociti. zeleno – trombociti (krvne pločice) – sudjeluju u koagulaciji.Postoje različiti oblici i dimenzije stanica (prikazi morfološki različitih stanica (a . bijelo – bijele krvne stanice (leukociti) sudjeluju u imunološkoj obrani organizma.

Žute nakupine su novonastale kolonije. kolonije kćeri. 7 . koje su vidljive kao plave ili zelene točke.Postoje različiti oblici i dimenzije stanica (prikazi morfološki različitih stanica (a . a izgrađuju ih veliki broj pojedinačnih stanica.h) e) Kolonije jednostaničnih algi – Volvox aureus. Sama stanica je okruglasta tvorevina na dnu slike. Stanica je postala vidljivom ugradnjom fluorescentnog proteina. Postoje različiti oblici i dimenzije stanica (prikazi morfološki različitih stanica (a .h) f) Jedna jedina stanica – Purkinjeov neuron u malom mozgu (cerebelumu). Stanica se može povezivati putem više od 100 000 izdanaka (dendrita) s drugim stanicama. Velike kugle su nakupine mnogih pojedinačnih stanica.

Hranjive tvari koje se probavljaju u crijevu transportiraju se kroz epitelni sloj i odlaze u krv koja ih prenosi u druge dijelove organizma. Na dnu vilusa kontinuirano nastaju nove stanice.h) Stanice biljaka U stablašicama stanice su ukotvljene na jednom mjestu i okružene su krutim celuloznim oklopom. Postoje različiti oblici i dimenzije stanica (prikazi morfološki različitih stanica (a . a stare (odumrle) stanice ljušte se s vrhova vilusa.h) Slojevi epitelnih stanica – prerez crijeva. Šupljine između stanica povezuju se u cijevi koje služe za transport vode i hranjivih tvari. Svaki prstoliki izdanak (vilus) je izgrađen od mnogih stanica koje tvore sloj.Postoje različiti oblici i dimenzije stanica (prikazi morfološki različitih stanica (a . 8 .

• prokariote dijelimo na eubakterije (prave bakterije) i arhee. Tanki stanični zid smješten je do unutarnje membrane. Stanice prokariota imaju jedan odjeljak kojeg okružuje plazmatska membrana.• Bez obzira na velike razlike u morfologiji sve stanice imaju neka zajednička svojstva – stanice dijelimo na prokariote i eukariote. E. uobičajene crijevne bakterije dobiven elektronskom mikroskopijom. Nukleoid koji sadrži bakterijsku DNA. • eukariote dijelimo u 4 carstva: biljke. nemaju definiranu jezgru i imaju relativno jednostavnu unutarnju građu Prikaz presjeka Escherichia coli. periplazmatski prostor. gljive i protiste. coli. kao i neke druge bakterije okružene su s dvije membrane između kojih je tzv. nije omeđen membranom. životinje. 9 .

lizosomi probavljaju stanični materijal kako bi ga stanica ponovno iskoristila. Isto tako. genomi arhea i eukariota kodiraju homologne histonske proteine. a sekrecijske stanice prenose sintetizirani stanični materijal kako bi ga izlučile. RNA i proteini ribosoma arhea su sličniji eukariotskim ribosomima nego ribosomima bakterija. Iako su svi organizmi u granama arhea i eubakterija prokarioti. peroksisomi pretvaraju spojeve koristeći molekule kisika. Svi organizmi od jednostane bakterije do sisavaca potječu od zajedničke jednostanične pra-stanice Ovo evolucijsko stablo napravljeno je prema sličnosti sekvencija makromolekula. dok histone ne nalazimo u bakterijama. Samo jedna plazmatska membrana okružuje stanicu. ali se u unutar stanice vide brojne organele. 10 . arhee se smatraju sličnijim eukariotima od eubakteria (“istnske” bakterije”).Eukariotske stanice imaju jezgru okruženu memranom kao i unutarnje membrane koje okružuju odjeljke organele Prikaz stanice krvne plazme koja izlučuje protutijela. Golgijeva tjelešca procesiraju i modificiraju proteine. mitohondriji proizvode energiju. Npr. Značajna karakteristika eukariotske stanice je da je DNA u definiranoj jezgri koja je omeđena dvostrukom membranom. Na jezgrinu membranu nastavlja se hrapavi endoplazmatski retikul (sinteza proteina).

bolest spavanja (Trypanosoma brucei). ali mogu biti zločudni • Bakterije i arhee. • Bakterije žive u svim životinjama i biljkama – viši organizmi daju bakterijama hranu i zaštitu. veličine 1 – 2 µm. ali mogu izazvati i bolesti: kugu (Yersinia pestis). piva. anginu (Streptomyces). • Neki protisti uzrokuju bolesti – dizenteriju (Entamoeba hystolica). 11 . vaginitis (Trichomonas vaginalis). • Kvasci i plijesni. malariju (Plasmodium falciparum). vina. Ukoliko se bakterije počnu razmnažati u nekim drugim tkivima dolazi do zaraze. Bakterije su ključne za zemljinu ekologiju. Najveća koncentracija bakterija je u crijevima i one pomažu u probavi hrane. Isto su značajni u uklanjanju otpada kao i u ekosustavu mora. Jednostanični organizmi su od koristi. najrasprostranjeniji jednostanični organizmi. kruha. Osim toga važne su za proizvodnju antibiotika. ali mogu biti zločudni • Protisti (protozoa) korisni su u lancu hrane. sira i td. Međutim i one mogu biti patogene te izazvati različite bolesti – od relativno bezopasnih kožnih infekcija do po život opasne pneumonije koju izaziva Pneumocystis carinii. kako bi te razgrađene proizvode ponovno mogle iskoristiti više životinje. koji zajedno pripadaju u porodicu gljiva važne su u razgradnji biljnih i životinjskih ostataka.Jednostanični organizmi su od koristi. Imaju ulogu u plodnosti tla jer kontroliraju populacije bakterija u tlu te izlučuju dušikove i fosfatne spojeve. tuberkulozu (Mycobacterium tuberculosis) itd.

Uprkos ograničenom vremenu života pojedinog organizma. • Reprodukciju organizma omogućava umnažanje stanica koje je precizno kako bi se kontrolirala veličina. 12 .Virusi su paraziti • • Virusi se ne mogu sami razmnažati i zbog toga ih se ne smatra da su živi. reprodukcija nam daje mogućnost da živimo beskonačno kao vrsta. virusi moraju inficirati stanicu domaćina i iskoristiti proteine domaćina kako bi sintetizirali virusne proteine i u nekim slučajevima replicirali virusne genetičke makromolekule. T4 bakteriofag pričvršćuje se za bakteriju. tumora. Biološka reprodukcija zajedno sa stalnom evolucijskom selekcijom za funkcionalni plan i izgradnju organizma razlog je da se neke životinje ne mijenjaju već više od 300 milijuna godina (rakovi). oblik i ustroj organizma a da se istovremeno spriječi neželjeni rast. Do promjene dolazi zbog pritiska okoliša koji uzrokuje da samo varijanta prvotnog organizma preživi. druge su se vrste drastično promijenile u tom istom vremenskom periodu. • Dok se neke vrste vrlo malo mijenjaju tijekom velikog vremenskog razdoblja. npr. Evolucija je razlog da dolazi do promjena u stanici • Najznačajnija karakteristika organizma je njegova mogućnost reprodukcije. Kako bi opstali.

Kvasac.Seksualno razmnožavanje • Da nije bilo izmjena genetičkog materijala svaka nova individua bi bila klon postojećih individua i članovi klona imali bi jednake genetičke predispozicije (dobre i loše). razmnaža se seksualno i aseksualno 13 . Saccharomyces cerevisiae. • Seksualna reprodukcija omogućava da se izmiješaju genetičke varijacije dvije individue te da nastane nova individua sa svojstvima koje nisu imali roditelji i da to svojstvo bude korisno za preživljavanje i reprodukciju.

polarizirana tkiva i organi kao što je npr. stanice. naše ruke ili srce. b) kao četiri stanice. • Oplodnjom jajašca sa spermijem nastaje zigota (promjer 200 µm). • Mnoge stanice imaju strukturnu i funkcionalnu asimetriju – to svojstvo nazivamo polarnost stanice. četiri …. Prvih nekoliko dioba oplođenog jajašca čine podlogu za cjelokupni razvoj organizma. Karl von Baer je otkrio da se sisavci razvijaju iz jajašca koje dolazi iz majčinog ovarija. • Razvoj započinje diobom oplođenog jajašca u dvije. • Kontinuiranom proliferacijom stanica.Sisavci se razvijaju iz jedne stanice • 1827. Istovrsni koraci u razvoju humanog embrija odvijaju se tijekom nekoliko dana nakon oplodnje. Embrio je okružen membranama. 14 . • Iz polariziranih stanica nastaju asimetrična. a nakon toga i diferencijacijom nastaju sva tkiva i organi u organizmu. c) kao osam stanica. Mišji embrio u stadiju razvoja: a) kao dvije stanice.

embrio je genetički identičan odrasloj stanici iz koje je uzeta jezgra. Pet kloniranih ovaca koje su genetički identične Drugi način kloniranja je da se oplođenoj jajnoj stanici ukloni jezgra i zamijeni s jezgrom donora (diploidnom jezgrom odrasle stanice). osnovna matična stanica iz koje se razvijaju sva tkiva je zigota. 15 . odnosno prvih 8 stanica i ove stanice nazivamo embrionalnim matičnim stanicama. • Asimetričnom diobom embrionalnih matičnih stanica nastaju druge diferencirane matične stanice iz kojih se razvijaju tkiva. Rani embrio ovce je podijeljen u pet grupa i sa svakom grupom stanica oplođena je surogatna majka. Na ovaj način.Matične stanice – osnova su za razvoj tkiva i organa i potencijalno su korisne u medicini • Svako tkivo. • Kod sisavaca. mora imati matičnu stanicu. barem u stadiju razvoja.

• Nukleinske kiseline nose šifrirane informacije kako bi se mogli sintetizirati proteini u pravo vrijeme i na pravom mjestu. • Proteini daju oblik stanice i provode većinu zadataka u stanici. 16 . • Genom je pakiran u kromosomima i udvostručuje se (replicira) tijekom diobe stanica. Energija koja se oslobađa tijekom hidrolize ATP pokreće mnoge stanične procese. odašilju signale i povezuju se u makromolekule.Stanične molekule • Male molekule prenose energiju. ATP nastaje iz ADP i Pi tijekom fotosinteze u biljkama ili tijekom razgradnje šećera i masti u većini stanica. nepovoljne ili ne moraju utjecati na život organizma. • Mutacije mogu biti povoljne. Stanični rad ATP je najčešća molekula koja se koristi za pohranjivanje i prijenos energije.

Stanični rad • Stanice sintetiziraju i razgrađuju brojne molekule i strukture. • Životinjske stanice proizvode izvan stanični okoliš (van stanični matriks,ekstracelularni matriks) i molekule koje ih međusobno povezuju. • Stanice mijenjaju oblik i pokreću se. • Stanice primaju i šalju informacije. • Stanice reguliraju ekspresiju svojih gena i adekvatno se prilagođavaju. • Stanice rastu i dijele se. • Stanice umiru ili nasilno ili programiranom smrću.

Organizmi koji se koriste za ispitivanja stanične biokemije (1)

17

Organizmi koji se koriste za ispitivanja stanične biokemije (2)

Organizmi koji se koriste za ispitivanja stanične biokemije (3)

18

Organizmi koji se koriste za ispitivanja stanične biokemije (4)

Organizmi koji se koriste za ispitivanja stanične biokemije (5)

19

Organizmi koji se koriste za ispitivanja stanične biokemije (6) Organizmi koji se koriste za ispitivanja stanične biokemije (7) 20 .

• Mnogi geni koji kontroliraju razvoj slični su kod gotovo svih životinja.Organizmi koji se koriste za ispitivanja stanične biokemije (8) Genomski i proteomski osvrt na evoluciju • Studije genoma i proteoma mnogih životinjskih vrsta olakšavaju da shvatimo povijest života (evoluciju). genetski kod i strukture organela su gotovo identični kod svih životinjskih vrsta. • Darwinove ideje o evoluciji životinja mogu se povezati s genima. • Metabolički proteini. 21 .

sačuvani tijekom evolucije.Slični geni. Ovi geni kontroliraju osovinu glava – rep i omogućavaju da se specifične strukture razviju na ispravnom mjestu. te stanična kultura 22 . Stanične organele. kod miša. Hox geni kodiraju slične proteine koji kontroliraju aktivnost drugih gena. nađeni su kao nakupine u većini kromosoma svih životinja. Hox geni. Ovime se potvrđuje da se osnovna funkcija gena razvila vrlo rano. Npr. Hox geni upravljaju razvojem različitih segmenata duž osi glava – rep. Oni imaju zajedničke gene koji kontroliraju slične procese kao što su rast i razvoj srca. Hox geni su odgovorni za određeni oblik kralježnice. mutacije Hox gena uzrok su da se pojedini dijelovi tijela pojavljuju na krivom mjestu (noge umjesto antene). Kod mušica. reguliraju mnoge razvojne procese u različitim životinjskim vrstama Insekti i sisavci imali su zajedničkog pretka pred 500 milijuna godina. oči i organizaciju tijela. metode za vizualizaciju i frakcionaciju stanica.

23 . mitohondriji i kloroplasti okruženi su dvostrukim membranama. Sadrži brojne proteine koji transportiraju kako hranjive tako i otpadne molekule. Proteini membrane također se povezuju s izvanstaničnim prostorom (ekstracelularnim matriksom) ili u biljkama sa staničnim zidom. • Jezgra. a membrane su razdvojene unutarnjim (inter) membranskim prostorom.Organele eukariotske stanice • Plazmatska membrana služi kao permeabilna barijera. • Sve eukariotske stanice imaju jezgru i druge stanične organele.

translacija. 24 . kao i pre tRNA u tRNA. Enzimi koji su na unutarnjoj mitohondrijskoj membrani kao i u matriksu mitohondrija provode oksidacije šećera i masnih kiselina kao i sintezu ATP. Kroz nuklearnu poru prolaze tvari iz jezgre u citosol i obratno. a dolazi i do transkripcije DNA u pre tRNA. 4) Replikacija DNA. 2) Dorada (procesiranje) pre mRNA u funkcionalnu mRNA. Vanjska jezgina membrana nastavlja se na hrapavi ER. Nakon što su transportirani u citoplazmu ribosomske se podjedinice spajaju s mRNA i provodi se sinteza proteina. događa se samo u stanicama koje se pripremaju za diobu. Vanjske i unutarnje membrane jezgre spajaju se u mnogobrojnim (nuklearnim. 3) U nukleolusu (jezgrici) sintetiziraju se rRNA i nakon dorade transportiraju se u citoplazmu kako bi se izgradile podjedinice ribosoma. jezgrinim) porama.Organele eukariotske stanice • Jezgra sadrži genom stanice. • Mitohondrij ima jako propusnu vanjsku membranu i unutarnju membranu koja je jako naborana. Organele eukariotske stanice Četiri osnovna molekularna procesa u jezgri 1) Transkripcija gena koji kodiraju proteine – DNA se transkribira u pre mRNA. pomoću tRNA i različitih transkripcijskih faktora. Zrele (funkcionalne) RNA transportiraju se u citoplazmu.

Organele eukariotske stanice Elektronska mikrografija mitohondrija U ne-fotosintetskim stanicama. većina ATP sintetizira se u mitohondrijima. Unutarnja mitohondrijska membrana koja okružuje matriks ima mnogo nabora koje se nazivaju kriste. Organele eukariotske stanice Sažeti prikaz oksidacije glukoze i masnih kiselina u mitohondriju koji se odvijaju u 4 stupnja 25 . Vidljive su i male nakupine u matriksu koje sadrže kalcij.

Organele eukariotske stanice • Endosomi internaliziraju proteine plazmatske membrane kao i topljive tvari iz staničnog okoliša. 3) Istrošene organele i dijelovi citoplazme odlaze u lizosome autofagijom (autofagocitoza). Endosomi također sortiraju internalizirani materijal i to ili na membranu ili u lizosome gdje se internalizirani materijal razgrađuje. 26 . Sadrže brojne hidrolaze koje razgrađuju istrošene ili nepotrebne stanične komponente a također i ingestirane tvari. • Lizosomi su organele s kiselim unutrašnjim sadržajem. Organele eukariotske stanice Stanične strukture koje sudjeluju u transportu tvari u lizosome 1) Topljive makromolekule stanica iz okoliša uzima putem “obloženih udubljenja” (eng. coated pits) i endocitozom odlaze u lizosom. nukleinske kiseline i druge velike makromolekule. Unutar kiselog lumena lizosoma hidrolitički enzimi razgrađuju proteine. 2) Čitave stanice i velike netopljive čestice fagocitozom ulaze u stanicu.

ER je mrežasta tvorevina plosnatih membraskih vreća na kojima su ribosomi.Organele eukariotske stanice • Peroksisomi su male organele koje sadrže enzime koji hidroliziraju organske spojeve a da pri tome ne koriste i ne proizvode ATP. a vrlo malo obilježenog ovalbumina nalazi se u autofagosomima (AV). • Proteini koji se sintetiziraju na hrapavom ER prvo odlaze u Golgijev kompleks (tjelešce) gdje se dorađuju i razvrstavaju ili za transport na površinu stanice ili pak na neka druga mjesta u stanici. Organele eukariotske stanice Elektronska mikrografija presjeka stanice sisavaca koje je endocitirala zlatne čestice kojima je obilježen ovalbumin. 27 . Produkti nastali oksidacijom masnih kiselina koriste se za biosintezu stanici potrebnih molekula. • Membranski proteini kao i proteini koje stanica izlučuje sintetiziraju se na hrapavom endoplazmatskom retikulu (ER). Elektronska mikrografija presjeka stanice jetre pokazuje da se u sekundarnom lizosomu nalaze dijelovi mitohondrija (M) i dijelovi peroksisoma (P). Zlatom obilježeni ovalbumin (crne točke) nalaze se u ranim endosomima (EE) ili kasnim (zrelim) endosomima (LE).

Nastaju fuzijom primarnih lizosoma s drugim organelama ili vesikulama (mješinicama). Dva peroksisoma (P) nalaze se blizu mitohondrija (M) te hrapovog i glatkog endoplazmatskog retikuluma (ER). Vidljive su i nakupine glikogena. Sekundarni lizosomi su veći i nepravilnog su oblika. Po nekoliko stotina lizosoma može biti prisutno u tipičnoj životinjskoj stanici.Organele eukariotske stanice Lizosomi variraju i veličinom i oblikom. U unutrašnjosti sadrže ingestirane čestice ili membrane koje razgrađuju. Organele eukariotske stanice Elektronska mikrografija koja prikazuje različite organele u stanici jetre štakora. Lociranje lizosoma i mitohondrija u endotelnoj stanici goveđe plućne arterije. Stanica je obojena zelenom fluorescentnom bojom koja se specifično veže za mitohondrije i sa crvenom fluorescentnom bojom koja se specifično ugrađuje u lizosome. Primarni lizosomi su pretežno sfernog oblika i u unutrašnjosti ne sadrže vidljive ingestirane čestice ili ostatke membrana. 28 .

Na suprotnoj. Transportne vezikule (bijele kugle) koje su ispupale iz ER povezuju se s cis membranama (svjetlo plavo) Golgijevog kompleksa. hormona ili protutijela) Dijagram tipične sekrecijske stanice i put novo sintetiziranih proteina (crvene točke). vezikule pupaju iz trans Golgijevih membrana (crveno i narančasto). Na bazalnom kraju (donji dio slike) nalazi se hrapavi ER i Golgijev kompleks gdje se sintetiziraju i dorađuju peptidni hormoni. Ove vezikule iz trans Golgijevih membrana odlaze ili do stanične površine ili do lizosoma. 3) nezrele sekrecijske vezikule se spajaju (fuzija) i tvore velike zrele sekrecijske vezikule. apikalnoj strani (gornji dio slike) nalaze se mnogobrojne sekrecijske vezikule koje sadrže sintetizirane hormone koji će se eventualno izlučiti. 1) Neposredno nakon što se sintetiziraju na ribosomima (crne točke) na hrapavom ER. Iz cis membranskih područja proteini se kreću do središnjeg (medialnog) područja. te nakon toga do trans područja Golgijevog kompleksa. 2) U Golgijevom kompleksu proteini se koncentriraju i pakiraju u nezrele sekrecijske vezikule. 4) Nakon što se vezikule nakupe ispod apikalne membrane. Po potrebi. slično kao i hrapavi ER često su zastupljeni u sekrecijskim stanicama. proteini koji se trebaju izlučiti odlaze u lumen ER. 29 . Organele eukariotske stanice Karakteristike stanica koje su specijalizirane za sekreciju velikih količina specifičnih proteina (npr. Ove zrele vezikule ispuštaju vodu u citosol tako da se u njima nalaze sekrecijski proteini gotovo u kristalnom obliku. Transportne vezikule pupaju iz ER i prenose proteine do Golgijevog kompleksa. one se spajaju s plazmatskom membranom i ispuštaju sekrecijske proteine (egzocitoza) nakon što su receptori stanica pobuđeni odgovarajućim hormonskim ili živčanim podražajem. Elektronska mikrografija presjeka stanica koje izlučuju hormone iz štakorske hipofize. Golgijev kompleks.Organele eukariotske stanice Trodimenzionalni model Golgijevog kompleksa rekonstruiran iz slika dobivenih elektronskom mikroskopijom.

Vidljivi su dijelovi pet kloroplasta i dijelovi staničnog zida. Ove membrane sadrže pigmente koji apsorbiraju svjetlost i enzime koji proizvode ATP tijekom fotosinteze. a odgovoran je (turgor) i za izduženje stanica. 30 . • Kloroplasti sadrže kompleksni sustav tilakoidnih membrana u svojoj unutrašnjosti. Osmotski tlak vode u vakuoli stvara turgor. pritisak koji prijubljuje plazmatske membrane na stanični zid. Organele eukariotske stanice Elektronska mikrografija presjeka stanice lista Vidljivo je da stanica ima jednu veliku vakuolu koja zauzima veliki volumen stanice.Organele eukariotske stanice • Stanice biljaka sadrže jednu ili više vakuola koje služe kao spremište iona i hranjivih tvari.

Klorofil se u stanici nalazi u tilakoidnim membranama i to je mjesto gdje dolazi do sinteze ATP tijekom fotosinteze. Organele eukariotske stanice Sažeti prikaz četiri stupnja fotosinteze u kloroplastima biljaka 31 .Organele eukariotske stanice Elektronska mikrografija biljnog kloroplasta Unutarnje membranske vezikule (tilakoide) povezuju se u nakupine (grana) i smještene su u matriksu (stroma) kloroplasta.

• Stanice su gotovo transparentne te se za vizualizaciju moraju koristiti različite boje i različite optičke tehnike. 32 . Prikazan je osnovi princip građe optičkih mikroskopa. U optičkom mikroskopu uzorak se obično postavi na predmetno stakalce.Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice • Rezolucija svjetlosnih mikroskopa je oko 200 nm. Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice Optički mikroskopi mogu se iskoristiti za svjetlosnu (transmisijsku) mikroskopiju ili za fazno-kontrastnu mikroskopiju kao i za epifluorescentnu mikroskopiju. Navedena tri načina mikroskopije zahtjevaju različite svjetlosne putove i kondezacijske leće.

Navažnije svojstvo bilo kojeg mikroskopa je rezolucija – mogućnost da se razlikuju dva vrlo bliza objekta. Svjetlost koja dolazi od tungstenove lampe. a N = refrakcijski indeks medija između uzorka i leće objektiva. Rezolucija se popravlja tako da se koriste kraće valne duljine ili da se sakupi više svjetlosti kako bi se povećalo ili N ili α. D= 0. Svjetlosni put prikazan je žutom bojom. Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice • Fazno – kontrasna mikroskopija i diferencijalno interferirajuća kontrastna (DIC) mikroskopija koriste se kako bi se pratili detalji u živim neobojanim stanicama kao i da bi se pratilo gibanje stanica. fokusira se na uzorak pomoću kondezacijske leće koja je smještena ispod uzorka.61λ N sin α α = polovica kuta stožca upadne zrake na leću objektiva. to je bolja rezolucija. 33 . Što je udaljenost (D) između dva objekta manja.Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice Svjetlosna (transmisijska) mikroskopija.

faze nekih zraka svjetlosti se mijenjaju (zelene crte) i usmjeravaju se na tanke prozirne dijelove fazne ploče.Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice U fazno-kontrastnoj mikroskopiji ulazno svjetlo prolazi kroz pukotinu koja fokusira prsten svjetlosnog snopa na uzorak. Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice Kod epifluorescentnog mikroskopa ultraljubičasta svjetlost (zelena crta) iz živine lampe postavljena je iznad uzorka i fokusira se na uzorak pomoću objektne leće. 34 . Refraktirana i nerefraktirana svjelost se spajaju u okularu kako bi se dobila slika. Svjetlost koja prolazi kroz uzorak fokusira se objektnom lećom na prsten fazne ploče koja apsorbira dio svjetlosti i promijeni fazu zrake svjetlosti za ¼ njezine valne duljine. Ako uzorak lomi ili odbija svjetlost. Filterima na putu svjetlosti moguće je odabrati određenu valnu duljinu svjetlosti i mogu se podesiti tako da hvataju svjetlost koju emitira uzorak i to samo onu zrake svjetlosti koje su veće valne duljine nego što je duljina ulazne zrake svjetlosti.

Žive stanice mogu se vizualizirati mikroskopskim tehnikama kojima nastaju kontrasti zbog interferencija zraka svjetlosti s objektom. Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice U DIC mikroskopiji stanice imaju pseudoreljef. DIC slika je optički prerez kroz objekt. mogu se vizualizirati kimerni proteini u stanici Kromofora u GFP nastaje zbog oksidacijske pregradnje tri aminokiseline u nizu. U fazno-kontrastnoj mikroskopiji stanice su okružene naizmjeničnim tamnim i svjetlim vrpcama – detalji koji su u fokusu i oni koji su van fokusa simultano se prikazuju u fazno-kontrastnoj mikroskopiji. Ove mikrografije prikazuju žive stanice makrofaga kako se vide a) u povećanju svjetlosnog (transmisijskog) mikroskopa. Prikazan je samo dio reakcija koji se odvijaju u ovoj oksidacijskoj reakciji. Kako je samo uska regija u fokusu. GFP s kromoforom 35 . a) b) c) Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice • Kada se eksprimiraju kimerni proteini koji sadrže i zeleni fluorescentni protein (GFP) ili varijante fluorescentnog proteina. b) u povećanju diferencijalno interferirajućeg kontrastnog (DIC) mikroskopa i c) u povećanju fazno-kontrastnog mikroskopa.

36 . koja eksprimira kimeru GFP i dijela β-aktina hidre. Transgenična hidra. Plazmid s kimernim genom injektiran je u embrio koji je bio u stadiju 2 – 8 stanica. U nekim hidrama plazmid se integrirao u genom jedne ili u genom nekoliko susjednih stanica koje su nakon toga ušle u diobu. Stanice koje sintetiziraju GFP praćene su fluorescentnom mikroskopijom.Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice Ekspresija fluorescentnih proteina u živim stanicama i organizmima. vulgaris. Lamin A nađen je također u intra i trans-nuklearnim strukturama koje liče tubulima. Manja slika – nakupina GFP+ endodermalnih stanica prikazana je konfokalnom mikroskopijom. H. U prikazanom uzorku GFP se eksprimira u unutarnjim endodermalnim epitelnim stanicama. Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice Optički prerez žive CHO-K1 stanice koja eksprimira rekombinantni lamin A – GFP kimeru. Prikazana je ovalna jezgra s laminom A (bijelo) koji okružuje unutarnju jezgrinu membranu. Ostatak stanice ne sadrži lamin A – GFP kimeru i zbog toga je crn.

Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice • Korištenjem boja čija je fluorescencija proporcionalna koncentracijama Ca2+ ili H+ iona. 37 . Najveće koncentracije Ca2+ nalaze se na kraju leukocita gdje dolazi do kontrakcije (zeleno). inducira se zakret stanice te se koncentracija Ca2+ trenutno povećava u citoplazmi i uspostavlja se novi gradijent. Ca2+ fluorokrom može se koristiti za detekciju relevantnih koncentracija citosolnog Ca2+ u različitim dijelovima živih stanica. (desno) Kad se pipeta napunjena kemotaktičnim molekulama postavi na stranu stanice. a najmanja Ca2+ koncentracija nalazi se u gornjem dijelu stanice (plavo). dok regija s velikom Ca2+ koncentracijom (žuto) ostaje na donjem dijelu stanice. (lijevo) U leukocitu koji se kreće nastaje Ca2+ gradijent. Gradijent je orijentiran tako da je regija s najnižom Ca2+ koncentracijom u smjeru u kojem će se stanica zakrenuti. Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice Fura-2. fluorescentnom mikroskopijom može se pratiti koncentracija Ca2+ iona ili intracelularni pH u živim stanicama.

Tipični prerez koji se koristi za svjetlosnu mikroskopiju debljine je 50 – 100 nm. Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice Tkiva za mikroskopiju uobičajeno se fiksiraju. 38 . Nakon što se tkivo stvrdne. Na kraju. ili u tekuću plastiku za elektronsku mikroskopiju. za svjetlosnu mikroskopiju.Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice • U imunofluorescentnoj mikroskopiji specifični proteini i organele u fiksiranim stanicama boje se s monoklonskim protutijelima koja su obilježena fluorescentnim bojama. Prerezi se sakupljaju ili na mikroskopskim stakalcima (svjetlosna mikroskopija) ili na tankim bakrenim mrežicama (elektronska mikroskopija) te se boje odgovarajućim bojama. postavlja se u mikrotom i režu se tanki prerezi. Mnogi proteini mogu se detektirati u istom uzorku tako da se isti uzorak boji s specifičnim protutijelima koja su obilježena s različitim fluorokromima. Fiksirano tkivo se dehidrira tako da se uranja u niz otopina koje sadrže smjesu vode i alkohola. uklapaju se u kruti medij te režu u tanke prereze. tkivo se stavlja u tekući parafin.

Obje metode daju daleko jasnije slike naročito debljih uzoraka nego što je to moguće postići standardnim fluorescentnim mikroskopom. Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice • Konfokalna i dekonvulzijska mikroskopija koriste različite metode kako bi optički “prerezale” uzorak i time smanjile nejasnoće koje nastaju zbog fluorescencije koja se dobiva od svjetlosti koja nije u ravnini fokusa. • Velik napredak u kompjuterizaciji i grafičkim metodama omogućuje da se mjerenja matematički obrade iz pojedinačnih mikroskopskih slika. a vezivno tkivo nalazi se ispod sloja epitelnih stanica. Prerez tkiva obojan je žuto zelenim protutijelom koje je specifično za transporter glukoze.Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice Specifičan protein može se vidjeti u fiksiranom tkivu pomoću imunoflorescentne mikroskopije. Vidljivo je da se GLUT2 nalazi i na bazalnoj i na lateralnoj strani crijevnih stanica ali da nije prisutan u četkastim stanicama (brush border) koje sadrže mikroviluse na apikalnoj površini koja je orijentirana u lumen (šupljinu) crijeva. Kapilare se protežu kroz lamina propria. GLUT2. 39 . Prerez štakorskog crijeva obojan je Evansovim plavilom koje daje nespecifičnu crvenu florescenciju.

mikrotubuli i aktin izgledaju kao difuzne zone u stanici. Stanice makrofaga obojane su fluorescentnim bojama specifičnim za DNA (plavo). pogotovo u središtu mitotskog vretena.Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice Konfokalnom mikroskopijom moguće je fokusirati “optički prerez” kroz debeli stanični sloj. nakon što su slike obrađene dekonvulzijskim algoritmom vlaknata organizacija mikrotubula i lokalizacija aktina postale su vidljive. a) kada se uzorak promatra uobičajenim florescentnim mikroskopom mitotičko vreteno daje nejasnu sliku. u trodimenzionalnom prikazu nedorađene slike DNA. U ovom slučaju flurescencija se detektira samo u molekuli koja se nalazi u ravnini fokusa te time nastaje tanki optički prerez. koje je u mitozi. b) Konfokalna mikrografija je oštra. a na to je vezano flurokromom obilježeno protutijelo. Oplođeno jajšce morskog ježa (Psammechinus). Do nejasne slike dolazi jer se fluorescencija detektira u nekoliko ravnina koje nisu u fokusu. Niz florescentnih slika dobiven je iz različitih fokalnih ravnina (optički rezovi) te nakon matematičke obrade dobivena je trodimenzionalna slika. lizirano je detergentom te izloženo anti-tubulinskom protutijelu. Svjetlosna mikroskopija: vizualizacija stanične strukture i lokalizacija proteina unutar stanice Dekonvulzijskom florescentnom mikroskopijom dobivaju se optički rezovi velike rezulucije i oni se mogu matematički rekonstruirati u trodimenzionalne slike. mikrotubule (zeleno) i aktinska vlakna (crveno). a) a) b) b) 40 .

uklopiti. narezatti i tada obojati elektronima bogatim teškim metalima (osmijev tetroksid. ubrzavaju se električnim poljem te se fiksiraju na uzorak magnetskim kondenzacijskim lećama. elektroni se fokusiraju kondenzacijskim i objektnim lećama na metalom obloženi uzorak. uranil acetat.005 nm. • Rezolucija TEM je daleko bolja nego rezolucija svjetlosnog mikroskopa. dehidrirati. olovo citrat). rezolucija za biološke uzorke je 0.10 nm što je oko 2000 puta bolje od rezolucije svjetlosnog mikroskopa. slike se dobivaju od elektrona koji prolaze kroz uzorak ili od elektrona koji se raspršuju od metala kojim je uzorak prekriven. fotografski film ili CCD kamera. Skenirajućim magnetima pomiče se snop elektrona kroz uzorak. U stvarnosti. U transmisijskoj elektronskoj mikroskopiji (TEM) elektroni se oslobađaju sa zagrijene tungstenove katode.Elektronska mikroskopija: metode i aplikacije U elektronskoj mikroskopiji. cijela cijev (tubus) mikroskopa je pod jakim vakumom. a elektroni koji se raspršuju s uzorka (obloženog metalom) sakupljaju se pojačalom koje je ujedno i detektor. ovisno o vrsti. U skenirajućem elektronskom mikroskopu (SEM). Elektroni koji prođu kroz uzorak fokusiraju se nizom magnetskih objektiva i projertoskih leća te nastaje uvećani obris objekta na detektoru koji može biti florescentni zaslon. U oba tipa mikroskopa. budući da se elektroni lagano raspršuju u zraku. Elektronska mikroskopija: metode i aplikacije • Uzorci za transmisijsku elektronsku mikroskopiju (TEM) moraju se fiksirati. • Za TEM su potrebni vrlo tanki prerezi (oko 50 nm) tako da je ovom tehnikom moguće promatrati samo dijelove stanica. 41 . Teoretska vrijednost D = 0.

koja koristi transmisijski elektronski mikroskop. Vezanjem obilježenog proteina A na Fc domenu protutijela moguće je locirati ciljani protein (katalazu) pomoću elektronskog mikroskopa. zlatom obilježeni protein A koristi se za detekciju protutijela vezanog na specifični antigen. a) a) b) b) Elektronska mikroskopija: metode i aplikacije • Krioelektronska tomografija. Uzorci se zamrznu u tekućem dušiku i održavaju se u zamrznutom stanju tijekom mikroskopije. 42 . Nakon toga.Elektronska mikroskopija: metode i aplikacije U TEM. Tkivo jetre fiksirano je glutaraldehidom. omogućava ispitivanje hidriranih. napravljeni su tanki prerezi koji su tretirani protutijelima i proteinom A kao što je to gore opisano. katalazom) u prerezu fiksiranog tkiva. prerez tkiva se tretira s proteinom A koji je obilježen sa zlatnim česticama. Čestice zlata (crne točke) ukazuju na prisustvo katalaze samo u peroksisomima. nefiksiranih i neobojanih uzoraka. U prvom stupnju protutijela reagiraju sa specifičnim antigenom (npr.

a) U elektronskoj tomografiji snima se niz polukružnih dvodimenzionalnih projekcija s trodimenzionalnog uzorka koji je smješten u središte. Ribosomi koji su vezani na vanjsku nuklearnu membranu kao i dijelovi ER (trokuti) također su vidljivi. 43 . c) Trodimenzionalna prikaz. a) Elektronska mikroskopija: metode i aplikacije Struktura kompleksa nuklearne pore (NPC) detektirana je krioelektronskom tomografijom (2). b) Izolirana jezgra iz plijesni Dicostelium discoideum brzo je zamrznuta u tekućem dušiku i u tom stanju je održavana dok se uzorak promatrao elektronskim mikroskopom. dobiven matematički. Uzorak se naginje. Ove pojedinačne dvodimenzionalne slike koriste se za dobivanje trodimenzionalne slike uzorka (strelice na desnoj strani sheme). Različite orijentacije NPC (strelice) prikazuju NPC odozgora (lijeva i središnja slika) a pogled sa strane na NPC prikazuje desna slika. prikazuje površinu dijela membrane jezgre (žuto) na kojoj se nalaze kompleksi nuklearnih pora (plavo). U nizu slika u sredini prikazane su dvodimenzionalne slike dobivene kod pojedinog nagiba uzorka. Pojedinačne dvodimenzionalne slika dobivaju se time što elektroni dolaze na objekt s različitih strana (strelice na lijevoj strani sheme). a stacionarni su elektronska optika i detektor.Elektronska mikroskopija: metode i aplikacije Struktura kompleksa nuklearne pore (NPC) detektirana je krioelektronskom tomografijom (1).

3) da bi se stabilizirala navlaka. te se uzorak promatra transmisijskim elektronskim mikroskopom. uzorak se presvlači parama ugljika. karakteristični ponavljajući slijed (bijele paralelne crte) debljine 64 nm vidljiv je na svakom kolagenskom vlaknu. a replika se promatra TEM-om. negativno bojanje) za razliku od elektroskih mikrografija gdje su uzorci na koje su vezani metali tamni (tzv. • Ugljikom prevučeni metal daje svjetle slike (tzv. 44 . 4) Nakon što je napravljena replika. pozitivno bojanje). nakon toga ugljikom. biološki materijal se uklanja kiselinama. 2) uzorak se presvlači parama metala (zlato ili platina) koje isparava s katode. Elektronska mikroskopija: metode i aplikacije a) Dijelovi površina vrlo malih struktura koje su presvučene metalom vidljive su u transmijsijskoj elektronskoj mikroskopiji. a) 1) uzorak se nanosi na sloj liskuna te se osuši u vakumu.Elektronska mikroskopija: metode i aplikacije • Površinske detalje moguće je detektirati tako da se uzorci prevuku metalom (platina). Vlakna su debljine 200 nm. b) b) Replika prevučena platinom prikazuje vlakna kolagena iz kože teleta.

Elektronska mikroskopija: metode i aplikacije Skenirajućim elektronskim mikroskopom (SEM) moguće je dobiti trodimenzionalne slike površina metalom presučenog. Mnogobrojni vilusi (u obliku prsta) nalaze se na površini koja je okrenuta u šupljinu crijeva. Mikrovilusi se nalaze na svakom vilusu. Prikazana je SEM slika epitela koji je orijentiran prema lumenu (šupljini) crijeva. (usporedite ovu sliku sa slikom stanice crijeva koja je dobivena fluorescentnom mikroskopijom) 45 . Bazalna lamina pomaže vezati viluse na vezivno tkivo.Elektronska mikroskopija: metode i aplikacije • Skenirajućom elektronskom mikroskopijom (SEM) promatraju se metalima prevučene stanice i dobivaju se trodimenzionalne slike. ali netretiranog (nefiksiranog) tkiva.

odvajaju se stanične organele obzirom na gustoću. pritisak. zamrzavanje . • Uzastopnim diferencijalnim centrifugiranjem staničnog homogenata dobiva se niz frakcija s djelomično purificiranim organelama. ultrazvukom ili drugim tehnikama kojima je moguće postići da se stanice rasprsnu (hipotonična otopina. Frakcije se razlikuju po masi i gustoći.. Ovim postupkom dodatno se pročišćuju frakcije koje su dobivene diferencijalnim centrifugiranjem. • Ravnotežnim centrifugiranjem u gradijentu gustoće.)... Purifikacija staničnih organela Diferencijalno centrifugiranje je uobičajeno prvi korak u frakcioniranju staničnog homogenata 46 .Purifikacija staničnih organela • Stanice se mogu razbiti homogeniziranjem.

U ovom primjeru homogenat štakorske jetre prvo je odvojen diferencijalnim centrifugiranjem. naročito su korisne za pročišćavanje organela i vezikula koje su slične veličine i gustoće. Purifikacija staničnih organela • Imunološke tehnike. Tijekom perfuzije. te se na ovaj način dobiva “čista” separacija lizosoma od mitohondrija. ili imunološkim tehnikama (fluorescentna mikroskopija). detergent ulazi u stanice endocitozom. jetra se može perfundirati s otopinom koja sadrži malu količinu detergenta prije nego što se tkivo razbije. pri čemu se koriste protutijela specifična za proteine na površini organela. svaka organela migrira do odgovarajuće gustoće i zadržava se u tom sloju. Kako bi se postiglo dobro odvajanje lizosoma od mitohondrija. Alternativni postupci ispitivanja homogenosti izoliranih organela može se pratiti i enzimatski. koje se nalaze u frakciji dobivenoj diferencijalnim centrifugiranjem mogu se dodatno purificirati ravnotežnim centrifugiranjem u gradijentu gustoće. budući da se organele morfološki razlikuju. prenosi se do lizosoma.Purifikacija staničnih organela Organele. • Čistoća izoliranih organela može se pratiti elektronskim mikroskopom. 47 . Tijekom centrifugiranja od nekoliko sati pri 40000 okr/min. te ove organele postaju manje gustoće (postaju lakše) nego što su to inače. Frakcija (talog) dobiven nakon centrifugiranja na 15000 g resuspendirana je i nanesena na gradijent saharoze koji je priređen u kiveti za centrifugiranje.

stanična kultura i diferencijacija stanica • Protočnom citometrijom mogu se identificirati različite stanice na osnovu toga što različite stanice različito raspršuju svjetlost i različito fluoresciraju. Kompleksi bakterija s vezanim vezikulama mogu se odvojiti centrifugiranjem. FACS. Aureus. “Fluorescence activated cell sorter”. b) Tanki presjek koji se promatrao elektronskim mikroskopom dokazuje da su vezikule obložene klatrinom vezane na stanice S.Purifikacija staničnih organela Male obložene vezikule (coated pits) mogu se odvojiti vezanjem protutijela koje je specifično za površinski protein vezikule (klatrin). Smjesa se dodaje u suspenziju Staphilococcus aureus bakterija koje na površini sadrže protein A koji se veže na Fc domenu protutijela. Bakterije imaju na površini protein A koji se veže za Fc domenu protutijela. koristan je za odvajanje različitih vrsta stanica. a) b) Izolacija stanica. a) interakcijom proteina A s na protutijela vezana klatrinom obložena vezikula povezuju se vezikule s bakterijom. U ovom primjeru membrana štakorske jetre inkubirana je s protutijelom specifičnim za klatrin. Klatrin je protein koji oblaže vanjsku površinu nekih citosolnih vezikula. 48 .

Dijagram na kojem su prikazani intenziteti crvene fluorescencije (apscisa) u odnosu na intenzitet zelene fluorescencije (ordinata) pokazuje da od tisuća stanica koje su u slezeni samo polovica njih su T limfociti (gornji desni kvadrant). Razdvajanje stanica provodi se u milisekundama. Izolacija stanica. 2) Mjeri se emitirana fluorescencija svake stanice kao i raspršenje svjetlosti svake stanice. 1) Koncentrirana suspenzija obilježenih stanica miješa se s puferom koji se koristi za ubrizgavanje i stanica po stanica prolazi kroz snop laserskih zraka. U ovom primjeru staniice mišje slezene obilježene su crvenim fluorescentnim protutijelima koja su specifična za CD3 protein na površini T stanice. 49 . Stvaranjem kapljice nastaje negativan naboj koji je proporcionalan količini fluorescencije koja je na stanici. Ostale stanice imaju slabu fluoresceenciju i prema tome spadaju u druge vrste bijelih stanica.2. 3) Suspenzija dolazi do otvora (pukotine) i stvaraju se male kapi koje uglavnom sadrže samo po jednu stanicu. stanična kultura i diferencijacija stanica Fluorescence activated cell sorter (FACS) razdvaja stanice koje su različito obilježene s fluorescentnim reagensima. 4) Kapljice koje nisu nabijene kao i one koje imaju drugačiji naboj odvajaju se u električnom polju. stanična kultura i diferencijacija stanica Pomoću FACS uređaja mogu se razdvojiti T stanice od ostalih bijelih stanica. Stanice su sortirane FACS uređajem te je bilježen iintenzitet crvene i zelene fluorescencije. Kapljice jednakog naboja se sakupljaju. Intenzitet fluorescencije na obje osi prikazan je u logaritamskim vrijednostima. te zelenim protutijelima koja su specifična za drugi površinski protein Thy 1. te se tijekom 1h može razdvojiti i do 10 milijuna stanica.Izolacija stanica.

vitamine. a druge. ove stanice ubrzo gube potencijal za rast i većina njih prestane rasti (starost kulture). Mali broj stanica. uglavnom fibroblasti. stanična kultura i diferencijacija stanica • Rast stanica kralježnjaka u kulturi zahtjeva medij koji sadrži esencijalne aminokiseline. Izolacija stanica. b) U kulturi u kojoj se uzgajaju stanice miša ili drugih glodavaca. Ako se nastavi s uzgojem ovih stanica. Za ove stanice se kaže da su besmrtne. brzina rasta se povećava (faza I). početna smrt stanica (nije prikazano) povezana je s pojavom zdravih stanica koje rastu. one će stvoriti staničnu liniju koja će se beskonačno razmnožavati. razrijede i ponovno započne uzgoj (pasaža) u bočicama i ako se ovaj postupak kontinuirano ponavlja. masne kiseline. Ako se žive stanice sakupe. • Većina stanica kralježnjaka rasti će u kulturi samo ukoliko su stanice priljubljene na negativno nabijenu podlogu na koju su vezani dijelovi ekstracelularnog (izvan staničnog) matriksa. prežive i nastavljaju s diobom. • Primarne stanice koje potječu iz tumorskih stanica ili one koje se spontano transformiraju iz primarnih stanica rastu bez ograničenja (beskonačno) u kulturi i iz njih nastaju stanične linije. Ukoliko se ovim stanicama omogući povoljan medij. zbog onkogenih mutacija. te peptidne i proteinske faktore rasta.Izolacija stanica. stanična kultura i diferencijacija stanica Stadiji tijekom uspostavljanja stanične linije a) Kada se stanice izoliraju iz humanog tkiva te se započne s uzgojem. a nakon toga brzina rasta ubrzano opada. sve stanice u kulturi prestaju rasti (starost). U fazi III. neke stanice umiru. Sveukupno. 50 . stanična vrsta nastavlja s konstantnom brzinom diobe tijekom približno 50 generacija (faza II). Većina faktora rasta nalazi se u serumu. započnu rasti.

Izolacija stanica. b) Fazno-kontrastnom mikroskopijom može se detektirati da u diferenciranim stanicama (b) nastaju sinciciji s mnogo jezgara. 51 . adipoznog tkiva. u kulturi. d). (a. Ove se stanice često koriste u biokemijskim istraživanjima. (c. epitela i drugih tipova stanica. stanična kultura i diferencijacija stanica • Određene stanične linije mogu se inducirati da diferenciraju u kulturi te da stvaraju stanice mišića.Izolacija stanica. c) ili u mediju u kojem se inducirala diferencijacija (b. Bojanjem s fluorescentnom bojom Hoechst (plavo) detektirane su jezgre.d) Bojanjem s crvenim fluorescentnim protutijelima koja su specifična za teški lanac miozina ukazuje da se tijekom diferencijacije eksprimirao specifični protein mišića. primarnih mišjih mioblasta u stanice mišića Primarni mišji mioblasti uzgajani su u mediju u kojem se nije inducirala diferencijacija (a. stanična kultura i diferencijacija stanica Diferencijacija.

stanična kultura i diferencijacija stanica Diferencijacija stanica C2C12. mnoge stanice su se spojile i stvorile sincicije s mnogo jezgara. stanične linije transformiranih mišjih mioblasta (2). Nakon što su se C2C12 stanice počele uzgajati u mediju koji je sadržavao konjski serum. koncentracije pojedinih mRNA značajno su se mijenjale.Izolacija stanica. omogućeno je da se vide jezgre. Bojanje DNA s DAPI. koji ima niske koncentracije mitogenih faktora rasta. 52 . stanične linije transformiranih mišjih mioblasta (1). Izolacija stanica. stanična kultura i diferencijacija stanica Diferencijacija stanica C2C12. Tijekom diferencijacije u sincicijske stanice. u kojem je velika koncentracija mitogenih faktora rasta. a) b) C2C12 stanice proliferiraju ali ne diferenciraju u mediju koji sadrži fetalni teleći serum. Ove sincicijske stanice sintetiziraju teški lanac miozina što se može detektirati zelenim fluorescentnim protutijelom koje je specifično za taj protein.

cvena O. DIC mikroskopija Bojanjem s Red O. stanična kultura i diferencijacija stanica Stanična linija 3TT3L1 preadipocita može diferencirati u adipocite (1). Northern analizom vidljiva je ekspresija dva ključna gena adipocita – PPARγ i transporter glukoze GLUT4 u diferenciranim 3T3L1 stanicama (desni stupac).Izolacija stanica. Izolacija stanica. dok ove mRNA nisu detektirane u nediferenciranim 3T3L1 preadipocitima. β-aktin je korišten kao kontrola da se pokaže da je jednaka količina mRNA nanesena na gel. 53 . stanična kultura i diferencijacija stanica Stanična linija 3TT3L1 preadipocita može diferencirati u adipocite (2). vidljive su kapljice triglicerida u diferenciranim stanicama.

U posebnim posudicama medij se sa svake strane poroznog filtera može mijenjati te se može pratiti (difuzija) molekula kroz epitelne stanice. Izolacija stanica. ako se uzgaja u posebnim posudicama. 54 . MDCK stanice stvaraju polarizirani epitel kada se uzgajaju na poroznoj membrani koja je s jedne strane obložena kolagenom i drugim sastojcima bazalne lamine. hibridoma stanica proizvodi samo monoklonska protutijela koja je prvobitno sintetizirala i izlučivala roditeljska B-stanica. aminopterin i timidin) koristi se za izolaciju hibridnih stanica. stanična kultura i diferencijacija stanica Madin – Darby stanična linija dobivena iz bubrega psa (MDCK). stanična kultura i diferencijacija stanica • Fuzijom besmrtne stanice mijeloma i jedne stanice B limfocita nastaje hibridna stanica koja može beskonačno proliferirati i taj klon nazivamo hibridoma stanica. • HAT medij (medij koji sadrži hipoksantin. koristan je eksperimentalni model za izučavanje epitelnih stanica. Kako svaki pojedinačni B limfocit proizvodi protutijela specifična za jednu antigenu determinantu (epitop). Između stanica nastaju čvrsti spojevi ako je dovoljna koncentracija kalcija u mediju.Izolacija stanica.

normalne stanice rasti će čak i u prisutnosti antifolata. Ako su preteče koji se koriste u spasonosnom putu prisutni u mediju. stanice koje se nisu spojile umiru. spaja se s normalnim stanicama slezene koje proizvode protutijela. Svaka hibridomska stanica proizvodi jedno specifično protutijelo. APRT ili TK) neće preživjeti u mediju koji sadržava antifolate. proliferiraju u klonske stanice koje se nazivaju hibridoma stanicama. enzim koji je potreban za rast stanica u HAT mediju. 3) Ispitivanjem pojedinačnih klonova identificiraju se one stanice koje prepoznavaju antigen X. 1) Besmrtne mijelomske stanice kojima nedostaje HGPRT. Stanice koje prežive. Stanice slezene umiru budući da imaju ograničeni život u staničnoj kulturi. dobivaju se hibridoma stanice koje proizvode monoklonska protutijela. 55 . De novo i spasonosni putovi sinteze nukleotida. Međutim stanice u kulturi kojima nedostaje jedan od enzima spasonosnog puta (HGPRT. 2) Kada se uzgajaju u HAT mediju. U kulturi preživljavaju samo hibridne stanice mijelomskih stanica i stanica slezene.Izolacija stanica. stanična kultura i diferencijacija stanica Fuzijom stanica i selekcijom. Antifolati kao što su aminopterin i ametopterin inhibiraju reaktivaciju tetrahidrofolata te time sprečavaju de novo sintezu purina i timidilata. Životinjske stanice mogu sintetizirati purinske nukleotide i timidilat u “de novo” metaboličkom putu. Za neke od ovih reakcija potreban je prijenos formilne skupine (CHO) s tetrahidrofolata kao što je to prikazano u gornjem dijelu sheme (plavo). Slezena se uzima od imuniziranog miša s antigenom X. Mnoge životinjske stanice mogu koristiti “spasonosne putove” (crveno) kako bi sintetizirali purinske baze i timidilat. a stanice mijeloma jer nemaju HGPRT.

56 . organele) stanica.Pitanja 1) pitanje Ono što znademo o funkcijama stanica ovisi o eksperimentima u kojima se koriste specifične stanice i specifični dijelovi (npr. Koje su uobičajene tehnike za izolaciju specifičnih stanica iz smjese različitih stanica? Koje se tehnike koriste za izolaciju organela? Opišite principe ovih tehniika.

2) pitanje Zašto su kemijske boje potrebne za vizualizaciju stanica i tkiva ako uzorke želimo promatrati svjetlosnim mikroskopom? Koja je prednost fluorescentnih boja i fluorescentnog mikroskopa u odnosu na kemijske boje koje se koriste za bojanje uzoraka koja se promatraju svjetlosnim mikroskopom? Koja je prednost konfokalne mikroskopije u odnosu na uobičajenu fluorescentnu mikroskopiju? 3) pitanje Koja je razlika između stanične vrste (soja). i klona? 57 . stanične linije.

4) pitanje Objasnite zašto se određene stanične linije koriste za proučavanje diferencijacije i funkcije mišića i adipocita. 58 . 5) pitanje Objasnite zašto je potreban proces stanične fuzije kako bi se dobila stanica koja proizvodi monoklonsko protutijelo.

kisela fosfataza hidrolizira monofosforne estere kod kiselog pH. 6) Pitanje nastavak organela plazmatska membrana glatki ER lizosomi peroksisomi hrapavi ER mitohondriji biljeg organele najaktivnija frakcija 15 12 11 7 5 3 % saharoze 10 15 17 35 40 45 59 . Rezultati ovih analiza (frakcije u kojima je opažena najveća aktivnost biljega) prikazana je u tablici. katalaza katalizira razgradnju vodikovog peroksida. odvojene su u 20 različitih frakcija te su testirane na specifične biljege određenih organela. a permeaza aminokiselina uključena je u transport aminokiselina kroz membranu. Molekule biljega koje su korištene imaju sljedeće funkcije: citokrom oksidaza je enzim uključen u proces sinteze ATP kada se provodi aerobna razgradnja glukoze ili masnih kiselina.6) pitanje Stanice mišje jetre su homogenizirane i nakon što su odvojene jezgre. citidil transferaza uključena je u biosintezu fosfolipida. supernatant je podvrgnut ravnotežnoj centrifugaciji u gradijentu saharoze (0 – 50 % saharoze). Frakcije dobivene nakon centrifugiranja. ribosomska RNA dio je strukture ribosoma.

utjecao na rezultat ravnotežnog centrifugiranja? 60 . koji bi razbio strukturu membrane te odvojio lipide od proteina. Na koji bi način dodatak detergenta u homogenat. sparite staničnu organelu s molekulom biljega. Da li je hrapavi endoplazmatski retikul teži ili lakši od glatkog endoplazmatskog retikula? Koja komponenta stanice je najlakša? Zašto? Opišite alternativni način na koji bi identificirali frakciju u kojoj se nalazi pojedina organela.6 pitanje (nastavak) a) b) c) d) e) U tablici.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful