DIRECT PCR

Oleh : Nama NIM Rombongan Kelompok Asisten : Saefullah Habibi Z.A : B1J008010 : VI :3 : Zakiyyah

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2011

I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Perkembangan ilmu pengetahuan yang sangat pesat menghasilkan teknologi yang semakin tinggi pula. Berkembangnya kajian biologi molekular, yang membawa pengaruh yang sangat besar terhadap berbagai aspek kehidupan manusia, khususnya aspek medis. Pengklonan DNA dalam setiap sel merupakan metode terbaik untuk mempersiapkan gen tertentu atau urutan DNA lainnya dalam jumlah banyak. Akan tetapi, ketika sumber DNA sedikit atau tidak murni, suatu metode yang disebut PCR bisa melakukan lebih cepat dan lebih efektif. PCR (Polymerase Chain Reaction), merupakan teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif. Teknik PCR mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106 kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik). Produk PCR diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabil-panas dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih siklus denaturasi, anil primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan dengan bromida etidium. PCR merupakan prosedur yang didasarkan atas kemampuan DNA polymerase untuk mengkopi sebuah utas DNA dengan elongasi utas komplementer yang diinisiasikan oleh sepasang primer oligonukleotida. Secara teoritis, setiap siklus reaksi menggandakan jumlah target DNA, menghasilkan tingkat amplifikasi jutaan kali lipat. Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 2030 kali. Setiap siklus terdiri dari tiga tahap yaitu, denaturasi template, annealing atau penempelan primer, dan polimerisasi atau pemanjangan primer. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi, tahap ini berlangsung pada suhu tinggi, 9496C, tahap penempelan atau annealing pada suhu antara 4560C dan tahap pemanjangan atau elongasi dengan enzim Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76C.

Teknik PCR, gen yang jumlahnya terbats dapat menjadi target dan direplikasi. Hal ini hanya dapat dilakukan jika bagian dari sekuens yang diinginkan sudah diketahui. Sekuens ini digunakan untuk membuat ooligonukleotida yang biasanya terdiri dari 20-25 basa, dikenal sebagai primer. Primer menandai titik awal sintesis DNA ketika DNA polymerase dan dNTP telah ditambahkan.

B. Tujuan Praktikum kali ini bertujuan untuk melakukan PCR koloni bakteri untuk mengamplifikasi gen penyandi 16s rRNA.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi Alat yang digunakan meliputi sarung tangan, UV transiluminator, tusuk gigi steril, mikro pipet, tabung mikro sentrifuse, hot plate, termocycler, alat elektroforesis dan lemari pendingin. Bahan yang digunakan adalah koloni bakteri yang ditumbuhkan dari sampel lingkungan, akuades, bufer mix PCR (H2O, bufer PCR, dNTPs, primer OPA-7, enzim DNA Taq polimerase), DNA template, agarosa, alkohol dan bufer elektroforesis. B. Metode Cara kerja pada praktikum kali ini adalah: 1. Disinfeksi meja kerja dan lingkungan sekitar dengan alkohol 2. Diambil sampel bakteri dengan tusuk gigi steril 3. Dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse yang telah di beri H2O sebanyak 10 l, dengan cara digoyang agar rata. 4. Dilakukan ulangan sebanyak 23X, yaitu bakteri 4 ulangan, jamur 9 ulangan secara duplo, dan kontrol 1 yaitu H2O 10 l. 5. Diberi label ke dalam mikro sentrifuse agar tidak tertukar. 6. Dimasukkan kedalam alat PCR tidak tertumpuk dan harus penuh serta seimbang. 7. Tutup dengan kencang, setting waktu selama 5 menit. 8. Diambil dan disimpan dalam lemari es. 9. Disiapkan tabung sentrifuse baru sebanyak 23 isi dengan buffer mix PCR dan setiap tabung diberi label. 10. Mikropipet diatur. 11. Kedalam masing-masing tabung dimasukkan sebanyak 50 l 12. Ditunggu selama 30 kali siklus.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil

Banyaknya sampel PCR 23

Bakteri 4

Jamur (duplo) 9

Kontrol 1

B. Pembahasan Berdasarkan hasil yang diperoleh bahwa proses PCR yang dilakukan sebanyak 23 sampel dengan 4 sampel bakteri, 9 sampel jamur yang diplatting duplo dan 1 sampel kontrol selama 30 siklus dengan menghasilkan pita-pita DNA yang bagus, karena suhu serta komponen PCR yang digunakan sesuai dengan ukurannya. Hal tersebut sesuai pernyataan Sulistyaningsih (2007) yang menyatakan bahwa jumlah siklus yang optimum terutama tergantung pada konsentrasi awal DNA template saat parameter lain telah dioptimasi, biasanya adalah 25-35 siklus. Siklus yang terlalu sedikit akan memberikan hasil yang sedikit, sebaliknya bila terlalu banyak akan meningkatkan jumlah dan kompleksitas produk nonspesifik, menimbulkan efek plateau. Menurut Sudjadi (2008) menyatakan bahwa Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu tekhnik yang dipakai secara luas dalam biologi molekuler, DNA polymerase dipakai untuk memperkuat tanpa menggunakan organisme hidup. Fatchiyah (2006) menambahkan bahwa reaksi polymerase berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro menggunakan enzim Taq Polimerase. Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan juataan kali dari jumlah semula, yaitu sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Fungsi larutan yang digunakan dalam praktikum ini diantaranya: 1. H2O sebagai pelarut. 2. Buffer PCR sebagai penyeimbang yaitu penstabil enzim DNA Taq polimerase dan mengkondisikan reaksi agar tetap bekerja secara optimal. 3. dNTPs sebagai penyusun DNA baru. 4. Primer untuk mengawali proses pemanjangan 5. Enzim DNA Taq polimerase sebagai pembangun DNA dengan cara memasangkan dNTPs dan DNA templat. 6. DNA templat sebagai DNA target atau cetakan.

7. Mg2+ sebagai kofaktor untuk enzim DNA Taq polimerase. 8. Buffer mix PCR terdiri dari H2O sebanyak 36,7 l, dNTPs sebanyak 3 l, primer OPA-7 sebanyak 2 l, enzim DNA Taq polimerase sebanyak 0,3 l, buffer mix 5l. Tambahkan DNA sampel sebanyak 3 l sehingga jumlah keseluruhan 50 l, dilakukan 30x siklus. Enzim Taq polimerase ditambahkan menggunakan teknik hot-start. Hal ini untuk mencegah terjadinya penempelan primer pada temperatur rendah. Penempelan primer yang terjadi pada temperatur rendah tidak spesifik sehingga akan menghasilkan amplifikasi dengan spesifisitas rendah. Spesifisitas rendah juga menurunkan sensitifitas karena adanya kompetisi antara produk spesifik dan nonspesifik (Retnoningrum 1997). Primer yang digunakan adalah OPA-7 2l, karena jika konsentrasi primer terlalu tinggi dapat terjadi mispriming yang mengakibatkan meningkatnya jumlah produk non spesifik. Jika konsentrasi primer terlalu rendah, hasil dari produk PCR akan rendah. Tahapan reaksi PCR diantaranya sebagai berikut: 1. Pre-PCR/ Aktivitasi Taq polimerase selama 3 menit pada suhu 94C. 2. PCR 30 siklus yang terdiri atas tahap-tahap Denaturasi selama 20 detik pada suhu 94C Annealing/penempelan primer selama 30 detik pada suhu 38C Extensi/polimerisasi selama 1,5 menit pada suhu 72C 3. Post-PCR selama 5 menit pada suhu 72C Menurut Gumilar (2008), Proses PCR berisi satu seri yang terdiri dari 20-30 siklus. Setiap siklus terdiri dari 3 tahap. Pertama, rantai ganda DNA harus dipanaskan hingga 96C untuk memisahkan rantai. Langkah ini disebut melting: di mana ikatan hydrogen yang menghubungkan dua rantai DNA dipecahkan. Sebelum langkah pertama ini, lama pemanasan sering diperpanjang untuk memastikan bahwa template DNA dan primers telah terpisah sempurna masing-masing menjadi rantai tunggal. Setelah rantai DNA terpisah, temperatur diturunkan sehingga primers dapat menempelkan rantainya pada rantai tunggal DNA. Langkah ini disebut annealing. Temperatur pada langkah ini tergantung pada primers dan biasanya 5C di bawah temperatur melting. Temperatur yang salah waktu langkah annealing dapat menyebabkan primers tidak semuanya terikat pada template DNA atau terikat tidak teratur. Akhirnya DNA polymerase harus mengisi rantai yang hilang. Ini dimulai pada

primers dan terus sepanjang rantai DNA. Langkah ini disebut elongation. Temperatur elongation tergantung DNA polymerase. Waktu untuk langkah ini tergantung pada DNA polymerase dan panjang rantai DNA yang diamplifikasi. Sulistyaningsih (2007) menambahkan bahwa suhu dan lamanya waktu yang dibutuhkan untuk annealing primer tergantung pada komposisi basa, panjang dan konsentrasi primer. Suhu annealing biasanya 5C dibawah nilai Tm primer, berada pada range 55C-72C. Suhu extention ditujukan untuk proses perpanjangan sekuen DNA. Suhu extention biasanya dipilih 72C, karena merupakan suhu optimum enzim Taq polymerase. Suhu extention yang rendah bersamaan dengan konsentrasi dNTP yang tinggi mengakibatkan misextention primer dan perpanjangan nukleotida yang salah, sebaliknya kombinasi antara suhu annealing/extention yang tinggi dengan konsentrasi dNTP yang rendah akan menghasilkan ketepatan produk akhir PCR yang tinggi. Lamanya waktu extention tergantung pada sekuen target, konsentrasi sekuen target dan suhu extention. Menurut Fatchiyah (2006), komponen-komponen yang dibutuhkan dalam PCR antara lain: 1. DNA templat, merupakan sepernatan hasil lisis sel yang berisi DNA yang ingin diamplifikasi. 2. Primer, disusun dari sintesis oligonukleotida sepanjang 15-32 bp dan mampu mengenali urutan yang akan diamplifikasi. Standar sepasang primer untuk amplifiasi mempunyai kisaran pasangan basa sekitar 20 basa pajangnya pada tiap primer. Kandungan basa guanine dan sitosin berada diantara 45-60%. 3. DNA Polimerase, merupakan enzim yang mengkatalisis polimerisasi DNA. Biasanya digunakan Taq polymerase yang stabil pada suhu tinggi karena enzim ini diisolasi dari Thermos aquaticus yang hidup pada sumber air panas. 4. Penggunaan dNTP sebagai building blocks berfungsi untuk menyediakan sumber basa nukleotida yang akan digunakan pada polimerisasi. dNTP terdiri dari dATP, dGTP, dCTP dan dTTP. 5. Buffer PCR, terdiri atas Tris-HCL, KCL dan Triton X-100 berfungsi untuk mengkondisikan reaksi PCR agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. 6. Mg2+, berfungsi sebagai kofaktor enzim polymerase sehingga bekerja optimal. Teknik PCR digunakan unutk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, diagnosis dini penyakit seperti AIDS, profil genetik unutk forensic, keragaman hayati

dan aplikasinya, evolusi biologi, mutagenesis, perhitungan mtDNA di sel ataupun jaringan (Fatchiyah, 2006). Polymerase Chain Reaction (PCR) juga dapat digunakan unutk amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi, bidang kedokteran forensic, melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan finger print. Teknologi PCR telah digunakan juga utuk mengidentifikasi infeksi yang disebabkan organisme yang tidak dapat dikultur. Kondisi ini, digunakan sekuen 16s rRNA yang highly conserved, dimana area lain kurang conserved dan bersifat spesifik untuk species (Weiss, 1995). Selain itu, PCR digunakan untuk diagnosis saluran genitalia karena Chlamydia trachomatis. C. trachomatis adalah mikroorganisme yang sulit dibiakkan (Crotchfelt et al., 1997). PCR juga digunakan untuk diagnosis cepat tuberkulosis dengan sensitifitas 90-98%, dibandingkan dengan kultur yang memerlukan waktu beberapa minggu (Rattan, 2000).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: 1. Amplifikasi gen/ DNA secara in vitro dengan hasil yang banyak bahkan sampai ribuan maupun jutaan dapat dilakukan dengan teknik PCR

2. Hasil yang diperoleh dari 23 sampel PCR dengan 30 kali siklus didapatkan hasil yang bagus dengan munculnya pita-pita DNA. 3. Teknik PCR dilakukan dengan 3 tahap yaitu Denaturasi pada suhu 94C, Annealing pada suhu 38C dan Polimerisasi pada suhu 72C. 4. Komponen yang diperlukan untuk PCR yaitu DNA templat, primer, enzim DNA polymerase, dNTP, buffer PCR dan Mg2+.

B. Saran Sebaiknya pada saat praktikum, praktikan dilibatkan langsung dalam acara tersebut. Sehingga tidak hanya menonton dan mendapatkan hasil matangnya saja.

DAFTAR REFERENSI Crotchfelt, K. A., Weish, L. E., DeBonville, D., Rosenstraus, M., Quinn, T. C. 1997. Detection of Neisseria gonorheae and Chlamydia trachomatis in Genitourinary Specimens from Men and Women by a Complification PCR Assay. J. Clin Microbiol 35: 1536-1540. Fatchiyah. 2006. Polymerase Chain Reaction: Dasar Teknik Amplifikasi DNA dan Aplikasinya. Laboratorium Sentral Biologi Molekuler & Seluler Universitas Brawijaya Malang, Malang.

Gumilar, G., Supriyanti F. M. T., dan Siti H. H. 2008. Bioteknologi. FPMIPA UPI, Bandung. Rattan, R. 2000. PCR for Diagnosis of Tuberculosis. Ind. J Tub 47 (79). Retnoningrum, D.S. 1997. Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Diagnosis Penyakit Infeksi. Jurusan Farmasi FMIPA ITB, Bandung. Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Penerbit Kanisius, Yogyakarta. Sulistyaningsih, E. 2007. Polymerase Chain Reaction (PCR): Era Baru Diagnosis dan Manajemen Penyakit Infeksi. Biomedis, 1(1):17-25. Weiss, J. B. 1995. DNA Probe and PCR for Diagnosis of Parasitic Infections. Clin, Microbio. Rev. 8(1): 113-130.