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PROTOCOLO PARA LA DETERMINACIÓN DE PEROXIDASA Extracción Laminkara (1995) 0.

2 g de polvo de acetona o 1 g de pulpa fresca ↓ 5 mL de Tris-HCl (frío) 100 mM pH 7.1 + 1% de polivinil pirrolidona (PVP) ↓ Homogenizar 30 seg ↓ Centrifugar 20 min a 10,000 g a 4°C ↓ Muestra: Tris-HCl pH 7.1 100 mM 2.6 mL Guayacol 0.1M 0.25 Peróxido de hidrógeno 0.25% 0.1 Extracto (sobrenadante) 0.05 mL y dependiendo de la concentración podría ser menor cantidad, ej. en tomate 10 µL. Blanco: Tris-HCL 2.65 mL Guayacol 0.25 Peróxido de hidrógeno 0.1 ↓ Medir a 470 nm en 3 min (U g-1 de peso fresco). En CARY50 seleccionar enzimática kinetics, y max en 1.0, ciclo (min) en 0.1 y final (min) en 2.0 o 3.0 Notas: - 1 unidad de actividad enzimática es igual a la formación de 1 µM de tetraguayacol/ min-1 a temperatura de 22-24°C. - 1 g muestra se utiliza 50 µL con mezcla dentro de celda. - Lavado de celda: metanol-agua-metanol Ejemplo de curva: 0.1 µg/mL Y=0.0018x 0.2 µg/mL Y=0.0056x 0.3 µg/mL Y=0.0064x 0.4 µg/mL Y=0.0093x + 0.0079; + 0.0722; + 0.0841; + 0.1386; R2=0.9984 R2=0.9960 R2=0.9992 R2=0.9984