Gen-membawa kunci untuk kesamaan kita dan warisan keunikan masing masing individu.

Ketika gen bekerja dengan baik, tubuh kita berkembang dan memiliki fungsi yang baik. Tapi bila sebuah gen tunggal - bahkan segmen kecil dari sebuah gen tunggal – mengalami kekacauan, dapat berefek dengan adanya cacat dan penyakit, bahkan kematian. Gen adalah subunit pekerja dari DNA. DNA adalah blue print dari setiap indivualis organism. Merupakan database informasi kimia besar yang membawa set instruksi lengkap untuk membuat semua protein yang akan dibutuhkan tubuh. Setiap gen berisi serangkaian instruksi tertentu, biasanya mengkodekan protein tertentu. Agar sel dapat membuat protein, informasi dari gen disalin, basis dengan basis, dari DNA ke dalam alur baru dari messenger RNA (mRNA). Kemudian mRNA berjalanan keluar nukleus menuju ke sitoplasma, dan pada bagian sel yang disebut organel ribosom, mRNA mengarahkan perakitan asam amino yang terlipat menjadi molekul protein.

BIOTEKNOLOGI –

REKAYASA PROTEIN

DNA hadir sebagai dua pasang rantai panjang, melingkar dalam bentuk heliks ganda. Setiap untai terdiri dari jutaan blok bangunan kimia yang disebut base. Sementara hanya ada empat dasar kimia yang berbeda dalam DNA yaitu Adenin, Timin, Sitosin, dan Guanin, urutan base-base yang terjadi menentukan informasi yang tersedia. DNA berada pada inti, atau nukleus, masing-masing dari triliunan sel tubuh. Setiap sel manusia (dengan pengecualian sel darah merah, yang tidak memiliki inti) berisi DNA yang

Siti Julaiha / 0906597420

Pasca Sarjana Teknologi Biomedis 250000000 basis tersimpan pada. kromosom. Universitas Indonesia
sama. koding DNA yang fungsinya belum diketahui. Apa itu Protein?
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Setiap sel memiliki 46 molekul DNA untai ganda. Setiap molekul terdiri dari 50-

DNA setiap kromosom mengandung banyak gen dan membentang luas, termasuk non

Pasca Sarjana Teknologi Biomedis Page 1 Universitas Indonesia [Mei 2010]

Protein adalah susunan rantai polimer yang terbentuk dari sintesa asam amino asam amino dalam rangkaian kompleks berbagai jenis ikatan dan struktur sehingga terbentuk jenis jenis protein yang berbeda satu sama lain. Dalam tubuh manusia, protein terbentuk dari dari sintesa yang terjadi dalam sel dimulai dari sintesa rantai ganda DNA yang terdapat dalam nukleus sel yang mengalami proses sintesa transkripsi menjadi rantai tunggal RNA dan dari rantai RNA tersebut mengalami proses transkripsi dengan adanya ribosom sehingga terbentuk proses pembentukan rantai ganda dengan proses pembentukan folding atau lipatan lipatan rantai menjadi rantai kompleks dalam struktur yang berbeda.

REKAYASA PROTEIN
Struktur protein yang berbeda menyebabkan terjadinya perbedaan fungsi juga pada protein protein yang terbentuk dalam sel. Karakteristik asam amino sangat diperlukan ketika rekayasa protein digunakan untuk memulai suatu proyek. Biasanya proyek yang bertujuan melakukan perubahan pada protein yang telah eksis atau ada, memulai langkah awalnya dengan penentuan asam amino yang digunakan untuk menciptakan mutasi. Hal ini sangat penting karena kontribusi asam amino terhadap fungsi protein merubah sifat dan karakteristik protein, sehingga pengetahuan atau analisa terhadap karakteristik asam amino harus telah dipikirkan. fungsi dan karakterisik novel/baru, adalah Ketike merekayasa protein untuk juga hal yang tidak umum namun menarik untuk dilakukan

mengatur beberapa mutan menggunakan asam amino yang bervariasi dan

merekayasa mutasi secara multiple pada satu protein. Rekayasa protein adalah apllikasi campuran menarik dari pengetahuan : -

Biologi Molekuler Analisa Struktur Kimia Protein Matematika Ekonomi Komputasi atau Bio Informatika Biokimia

untuk memproses pengembangan protein menjadi produk yang berguna dan berharga. Merupakan disiplin ilmu yang dikategorikan muda usianya, dengan penelitian penelitian yang

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 2

saat ini dilakukan untuk memahami struktur ikatan protein, rekognasi protein untuk prinsip prinsip desain yang dapat diterapkan.

SEJARAH REKAYASA PROTEIN
Rekayasa protein dimulai dari penemuan penemuan terhadap enzim dan fungsi fungsinya, yaitu pada tahun 1833 Anselme Payen& Jean-Franois Persoz dari Perancis, melakukan Isolasi dari komplek amilasi dari germinating barley dan menamakannya diastase Starch 1835 sugars (maltose) J. Jakob Berzelins dari Swedia Mendemosntrasikan bahwavstarch dapat dipecahkan secara efisien menggunakan ekstraksi malt. Hal yang dikenal dengan nama  Katalisis 1836 1876 Theodor Schwann dari Jerman Mengisolasi pepsin, enzim pertama yang disediakan dari jaringan hewan. William Khne Susunan tidak teratur /Unorganized fermen fermen diistilahkan menjadi En zim yang dipetik dari bahasa yunani berasal dari En berari in dan zyme berarti laven/ragi pada yeast 1897 Buchner bersaudara berasal dari Jerman Mengekstraksi secara bebas sel sel Yeast Glucose ethanol + CO2

TUJUAN REKAYASA PROTEIN
- Mengembangkan protein untuk sesuatu yang berguna atau berharga di bidang industri atau

kesehatan . - Membentuk produk baru dari suatau campuran protein
- Merubah struktur atau sifat protein sehingga dapat dihasilkan perubahan pada produk protein

dengan target struktur atau sifat yang diinginkan.
- Merubah protein sehingga dapat diterjemahkan untuk memberikan informasi dan aplikasi lain.

- Menganalisa sifat protein yang ada untuk aplikasi produk lain
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 3

- Meningkatkan kemampuan dan efisiensi penggunaan produk untuk suatu produk

KEGIATAN REKAYASA PROTEIN
• • •

Peningkatan katalisis dengan substrat alami atau kofaktor Peningkatan katalisis dengan substrat nonnatural atau kofaktor Peningkatan katalisis di nonnatural pelarut Peningkatan ligan mengikat

STABILITAS PROTEIN

• •

Peningkatan termostabilitas Peningkatan aktivitas pada pH alternatif Peningkatan aktifitas dalam kekuatan ion yang berbeda Peningkatan protein lipat Penurunan kerentanan terhadap proteolisis Farmakokinetik


EKSPRESI PROTEIN

Peningkatan tingkat ekspresi di host nonnatural Target ekspresi ke lokasi selular yang berbeda Penambahan tag untuk mendeteksi ekspresi protein Perubahan modifikasi posttranslational

• • •

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 4

SIFAT-SIFAT LAIN
• • • • • •

Menambahkan tag untuk memfasilitasi pemurnian Mengubah kecenderungan untuk polimerisasi Menambahkann tag untuk memvisualisasikan lokalisasi Merekayasa mengikat situs alosterik Mengubah titik isoelektrik Menurunkan imunogenisitas

APLIKASI REKAYASA PROTEIN
-

Pembuatan enzim Memproduksi jenis obat obatan Menghasilkan vaksin antibody tertentu Beberapa Contoh Aplikasi langsung secara komersial sebagai berikut :

-

Menggukanan perancah/scaffold protein berdasarkan domain pada Protein A untuk mengembangkan molekul moleku seperti antibody (Company : Affibody)

-

Menambahkan asam amino yang tidak terkodekan kapada protein, memungkinkan sintesa protein dengan diversity bahan kimia (Company : Ambrx)

-

Menggunakan perancah protein berdasarkan perpindahan untuk mengembangkan molekul molekul seperti antibody, membuat penggabungan protein protein (Fusi) dan receptor agonist (Company: BioRexis)

-

Menggunakan perancah protein berdasarkan lectin Tipe C untuk mengembangkan molekul molekul seperti antibody, teknologi protein trimerisasi (Company : Borean).

-

Merekayasa proteases untuk menurunkan molekul molekul yang ditargetkan (Company: Catalyst).

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 5

-

Menggunakan domain Fibronektin untuk mengembangkan molekul molekul seperti antibody, menciptakan protein protein dua fungsi dengan domain ikatan target yang terhubung terhadap domain enzimatik (Company: Compound Therpaeutics).

-

Pengembangan peningkatan metode untuk humanisasi antibody (Company: Kalobios) Menggunakan perancah protein berdasarkan lipocalin untuk mengembangkan molekul molekul seperti antibody (Company: Pieris)

-

Menggunakan perancah protein berdasarkan Kristal gamma untuk mengembangkan molekul molekul seperti antibody (Company: Scil)

-

Menggunakan perancah protein berdasarkan Sistein Knots untuk mengembangkan molekul molekul seperti antibody (Company: Selecore)

-

Merekayasa fungsi efektor yang diinginkan terhadap protein protein SMIP seperti antibody (Company : Trubion).

-

Menggunakan teknologi PDA untuk Merekayasa fungsi efektor yang diinginkan terhadap antibody dan menciptakan protein protein domain negative dan protein protein dengan peningkatan sifat propertinya (Company : Xencor).

-

Rancangan dan konstruksi dari protein atau enzim baru dengan teknologi baru/novel atau fungsi fungsi yang diinginkan dengan memodifikasi susunan asam amino menggunakan teknologi rekombinan deokssrinukleaikasid (RDT)

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 6

TEKNIK REKAYASA PROTEIN
Ada tiga jenis teknik utama yang sering digunakan untuk melakukan rekayasa protein protokol. Metode ini melakukan pendekatan teori terhadap : 1. Pendekatan Desain De Novo
2. Pendekatan

Desain Rasional, termasuk diantaranya adalah teknik pendekatan

mutagenesis Site Directed.
3. Pendekatan Desain Mutagenesis Acak/Random , termasuk diantarnya adalah Evolusi

yang diarahkan/Directed Evolusi, DNA Shuffling, dan Mutasi Kimia (Teknik Pendekatan Glikosilasi, Pegilasi, Lipida, dll)
4. Teknik Penggabungan protein (Fusion Protein)

Untuk lebih jelasnya semua teknik teknik ini akan dipaparkan sebagai berikut :.

STRATEGIS DESAIN DE NOVO
Teknik yang menawarkan kemungkinan pembentukan struktur baru dengan cara : Mengidentifikasi susunan dan geometrik asam amino yang optimal untuk stabilisasi geometry backbone -

Mengembangkan algoritma yang powerful untuk solusi optimal Mendesain dan merekonstruksi protein sintetik menggunakan infromasi dari struktur 3 dimensi dari akumulasi protein alam dan ikatan ikatan protein. Contoh : Methionine : Memperlihatkan segmen rigid, central part segmen helix dan daerah buried natural protein. Threonine : Memperlihatkan segmen flexible Lysine : Membentuk segmen helix yang baik dan mengajukannya pada Terminal-C Leucine : Membentuk segmen Helices yang stabil, prefer buried region, ditemukan pada posisi tengah helix

-

Menemukan susunan Asam amino yang terbaik, untuk memastikan ikatan pada struktur yang dipilih , seperti ikatan alpha helix atau betta barrel. Contoh : Mengidentifikasi asam amino yang terdapat pada struktur protein yang unik berdasarkan perubahan performansi energi termodinamik pada rantai protein.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 7

-

Desain komputasi protein dengan algoritme menemukan susunan asam amino untuk mengidentifikasi susunan asam amino yang memiliki energi energi rendah untuk struktur target.

Bagaimana Struktur protein ditentukan Sebagian besar struktur protein yang dikenal sampai saat ini telah dipecahkan dengan teknik eksperimental X-ray kristalografi, yang biasanya memberikan data resolusi tinggi tetapi tidak memberikan informasi waktu tergantung pada fleksibilitas konformasi protein itu.

NMR (spektroskopi resonansi magnet), yang menyediakan data resolusi agak rendah pada umumnya dan terbatas untuk protein yang relatif kecil, tetapi dapat memberikan informasi waktu yang bergantung tentang gerak sebuah protein dalam larutan.

X-RAY KRISTALOGRAFI

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 8

Sinar masuk (datang dari kiri atas) menyebabkan setiap scatterer memancarkan kembali sebagian kecil intensitas sebagai gelombang bola. Jika scatterers disusun simetris dengan pemisahan d, gelombang ini bola akan selaras (tambahkan konstruktif) hanya dalam arah mana jalan-panjang perbedaan mereka 2d θ dosa sama dengan suatu multiple integer dari panjang gelombang λ. Dalam hal ini, bagian dari berkas yang masuk dibelokkan oleh 2θ sudut, memproduksi tempat refleksi
Diagram Pita ofmyoglobin struktur, menunjukkan heliks alfa berwarna. protein tersebut panjang, molekul linier dengan ribuan atom, namun posisi relatif setiap atom telah ditentukan dengan resolusi sub-atom dengan kristalografi sinar-X. Karena sulit untuk memvisualisasikan semua atom sekaligus, pita menunjukkan jalan kasar dari polimer protein dari N-terminus (biru) ke C-terminus nya (merah).

Struktur kristal protein pertama dari mioglobin paus sperma, sebagaimana ditentukan oleh Max Perutz dan Kendrew Sir John Cowdery pada tahun 1958, yang menyebabkan Hadiah Nobel dalam Kimia. Difraksi sinar-X analisis mioglobin awalnya dimotivasi oleh observasi kristal mioglobin di kolam kering dari darah di atas geladak kapal dari perburuan paus.

NMR (SPEKTROKOPI RESONANSI MAGNET)
NMR adalah pengetahuan stuktur biologi, yang diapalikasikan oleh NMR untuk menginvestigasi jenis protein protein. Protein NMR dilakukan pada sampel air dari protein yang sangat murni.

Sampel terdiri dari antara 300 dan 600 microlitres dengan konsentrasi protein dalam rentang 0,1-3 milimol. Sumber protein dapat berupa alam atau dihasilkan dalam sistem ekspresi menggunakan teknik DNA rekombinan melalui rekayasa genetik.
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 9

Panah biru mewakili orientasi N - H ikatan peptida obligasi yang dipilih. Dengan menentukan orientasi yang cukup obligasi relatif terhadap medan magnet luar, struktur protein dapat ditentukan

Nuklir penentuan struktur magnetik resonansi menghasilkan sebuah ensemble struktur. Struktur hanya akan bertemu jika data yang cukup untuk mendikte lipatan tertentu. Dalam struktur ini, hanya kasus untuk menjadi bagian dari struktur. Dari PDB 1SSU.

KETERBATASAN
Strategi desain de Novo ini memiliki beberapa limitasi atau problem seperti :
-

Ketersediaan data struktur protein 3 Dimensi yang terbatas. Pengetahuan yang terbatas terhadap ilmu ikatan protein, struktur terhadap fungsi biologsi protein protein tersebut.

-

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 10

APLIKASI STRATEGI

Susunan unik protein menghasilkan rancangan terhadap susunan Potensial Protein dari

beberap ratus ribu asam amino dapat dihasilan ⇒ ~10130 susunan protein potensial melalui metode komputasi atau eksperimental.:

Estimasi energi pada desain protein yang memperlihatkan perubahan energi selama

proses folding.  Hipotesa termodinamik yang dimulai dari struktur asli protein yang diberikan dengan adanya konformasi asam amino yang meminimalkan energi bebas molekul. estimasi energi ini memperlihatkan :
o o

Hasil dari

Hot spot residu untuk adanya interaksi energi Data Statistik terhadap fungsi efektif energi (SEEFs) yang bermanfaat untuk database struktur protein

o

Sifat sifat fisik terhadap fungsi efektif energi (PEEFs) yang bermanfaat untuk melakukan analisa komputasi.

o

Sifat sifat empiris terhadap fungsi efektif energi (EEEF) yang bermanfaat untuk menganalisa single termodinamik dan multiple site mutasi.

o

Kestabilan protein yang berguna untuk menyusun baris multiple ikatan dan daerah konservatis pada jenis protein (Current Opin , in Structural Bio. 2002, 12:441)

Desain proses komputasional juga berguna untuk merancang model folding inverse Rotamer yang berbeda dari tritopan asam amino pada posisi tertentu

bagian protein kedalam rancangan untai yang diasumsikan sebagai rotamer multiple dan perancah tetap. dalam protein.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 11

Model desain folding inverse (A) partsi protein didesign side-chains mengasumasikan multiple rotamer (merah) dan scaffold tetap (biru). (B-D) rotamer berbeda tritopan asam amino pada posisi tertentu di protein.

 Mengidentifikasi susunan dan geometrik asam amino yang optimal dengan target terhadap stabilisasi gemoteri backbone protein. o

Desain komputer untuk faktor tumor nekrosis (TNF) varian pada depicted gold. Mutasi, merah, mencegah desain varian dari ikatan TNF reseptor, biru. Penambahan mutan hasil TNF pada campuran hetrogen trimer, memiliki aktivitas yang dikompromised. Penambahan mutat berlebih TNF menjanjinkan level renda homotrimer aktive native TNF. Gambar berdasarkan pada material suplemen reference 39. Struktur kristal 1TNR digunakan untuk menciptkan representatif struktur.

STRATEGIS DESAIN RASIONAL PROTEIN
Merupakan teknik yang menggunakan pengetahuan scientifik dan mendetail tentang latar belakang seperti struktur dan fungsi protein atau sifat protein, serta susunan gen yang akan direkayasa pada susunan polipeptida untuk digunakan dalam:
-

Mendapatkan produk produk gen yang baru dari protein yang ada Menemukan hubungan antara struktur dan fungsi protein serta stabilitas Molekul melalui informasi dari struktur 3 Dimensi protein. Mengidentifikasi susunan Asam Amino seperti mengetahui asam amino yang memiliki energi terendah untuk merubah struktur ikatannya. Mengembangkan pengetahuan pengetahuan baru tentang karakteristik protein.

-

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 12

-

Merancang protein atau enzym dengan sifat yang diinginkan melalui teknik manipulasi berdasarkan penerapan atau peniruan teknik mutasi alam seperti : -

Site Directed Mutagenesis dengan PCR-Based atau Error Prone Mutasi Penambahan atau Penghilangan dengan multiplikasi PCR based Perubahan Domain atau Penggabungan domain (Fusion) dengan Enzim

– enzim nuclease dan / atau Kloning. Ligasi, dan multiplikasi PCR-Based, dll Metode ini mudah diimplemantasikan dan secara umum tidak membutuhkan biaya besar, sejak teknik pendekatan site –directed mutagenesis diterapkan dengan baik.

KETERBATASAN
Strategi Rasional desain juga memiliki beberapa limitasi atau problem seperti :
-

Pengetahuan tentang ilmu ikatan protein, juga terhadap fungsi biologsi, atau struktur protein sangat terbatas dan sering tidak tersedia

-

Jika diaplikasikan,maka memperkirakan efek efek dari variasi mutasinya akan sangat sulit dilakukan.

-

Strategi desain Site Direkted Mutaganesisi memiliki Banyaknya librari pada mutan yang dihasilkan

limitasi atau problem dengan

APLIKASI DESAIN RASIONAL
Aplikasi Teknik teknik ini dperlukan dalam berbagai hal seperti :
-

Melakukan analisa terhadap interaksi antara protein protein, dan folding/unfoloding protein Melakukan permodelan struktur protein. Melakukan analisa terhadap interaksi ikatan DNA, Melakukan eksplorasi susunan protein, Melakukan kontruski hibrid protein, probing promoter dan Mengekspresikan Protein dan Regulasi region serta Menganalisa aktifitas enzim. Melakukan modifikasi sifat sifat kimia protein

-

-

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 13

-

Memproduksi obat dengan misalnya mengefektifkan Ribonukelasi yang digunakan pada terapi tumor.

-

Teknik ini dapat menghasilkan aplikasi dalam mengkarakteristik jenis antibodi. Penelitian yang ekstensif dan studi tentang daerah iktan 02 (ligand) pada protein hemoglobin. Dengan struktur hemogloben terlarut pada kristalografi X-ray , asam amino yang bertugas untuk mengikat ligand pada protein, bersama dengan helix spesifik dan posisinya ditentukan dan dapat ditampilkan. Residu residu yang bekerja pada konjunksi dengan cincin heme porpirin.

Gambar memperlihatakn tetramer hemoglobin dengan empat daerah yang mengikat ligan dengan distal dan proksimal histidines dalam model tongkat biru cerah. Cincin heme porfirin ditampilkan dalam model tongkat merah dan putih.

Gambar ini memperlihatkan peledakan di kawasan yang mengikat ligan. Rantai samping dari asam amino asam amino kunci pada ikatan ligan (O2 dalam gambar) dan cincin heme porpirin ditunjukkan dalam model tongkat. Ruang kuning penuh molekul merupakan heliks sekitarnya yang membentuk hemoglobin.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 14

Menggunakan strategi desain rasional dapat menyarankan mutasi yang mungkin untuk asam amino kunci yang bertanggung jawab atas pengikatan hemoglobin pada ligan. Sebagai contoh, jika diinginkan sterically menghalangi situs pengikat jika hemoglobin, direncanakan membuat situs-mutasi untuk memperkenalkan mutasi yang akan memberikan sifat fisik dan elektrokimia yang dikehendaki. Memilih fenilalanin untuk menggantikan leusin pada posisi 29 akan mengisi situs dengan rantai samping aromatic yang besar. Hasil ini dapat dilihat pada gambar berikut A dan B.

Gambar A. menggambarkan daerah yang mengikat atau "saku" dari subunit hemoglobin. Spasi warna hijau diisi domain memperlihatkan residu leusin wild type dan orientasinya pada pocket. Molekul berwarna merah adalah iksigen dan ditampilkan berikatan terhadap grup heme porfirin (molekul flat pada model tongkat).

Gambar B. memperlihatkan daerah yang mengikat setelah leusin wild type telah digantikan oleh sebuah fenilalanin. Strategi rasional fenilalanin mengisi saku hemoglobin dikonfirmasi pada gambar yang didasarkan dari x-ray kristalografi.

STRATEGIS DESAIN RASIONAL STRUKTUR DAN FUNGSI PROTEIN
Studi Modern resolusi yang lebih tinggi Ini adalah metode eksperimental untuk dapat memicu lipatan sampel unfolded protein, dan mengamati dinamika yang dihasilkan. Teknik cepat digunakan secara luas termasuk neutron hamburan, ultrafast, pencampuran

solusi, fotokimia metode, dan spektroskopi laser suhu melompat. Komputasi juga memprediksi struktur tersier protein. Teknik initio De novo (memprediksi struktur protein berhubungan dengan komputasi), Sangat berbeda dengan Metode lipatan Dinamika Molekul protein. (MD) merupakan perangkat penting mempelajari pelipatan protein dan dinamika di silico. Karena biaya komputasi, simulasi MD lipat dengan air eksplisit hanya terbatas pada peptida dan protein yang sangat kecil.
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 15

MD simulasi protein yang lebih besar tetap terbatas pada dinamika struktur eksperimental atau berlangsung pada temperatur tinggi. Untuk mensimulasikan prosees lipat yang lama (diluar sekitar 1 mikrodetik), seperti protein lipat ukuran kecil (sekitar 50 residu) atau lebih besar, beberapa pendekatan atau penyederhanaan dalam model protein perlu diperkenalkan. Teknik untuk mempelajari Protein Folding Circular Dichroism Spektroskopi adalah salah satu alat paling umum dan dasar terpolarisasi sirkular. Dalam protein, struktur seperti lembaran helicies alpha dan beta yang kiral, dan dengan demikian menyerap cahaya tersebut. Penyerapan cahaya ini bertindak sebagai penanda tingkat foldedness dari ansambel protein. Teknik digunakan untuk mengukur keseimbangan serapan sebagai fungsi konsentrasi protein dengan mengukur perubahan denaturant atau suhu. untuk mengukur penyerapan cahaya

Jenis spektroskopi juga dapat dikombinasikan dengan perangkat cepat-pencampuran, untuk mengukur protein kinetika lipat dan untuk menghasilkan plot chevron. Perkembangan dichroism lingkaran getaran (VCD) sangat besar. VCD studi protein sering dikombinasikan dengan difraksi sinar X-kristal protein, FT-IR data untuk solusi protein dalam air berat (d2O), atau perhitungan kuantum ab initio untuk memberikan tugas struktural ambigu yang tak dpt diperoleh dari CD melibatkan Fourier Transform (FFT)

instrumen, untuk menentukan konformasi protein dalam larutan bahkan untuk molekul protein

Spektrometri Circular Dichroism (CD)
Alat ini diperlukan dalam melakukan pengukuran struktur sekunder protein dengan menggunakan teknologi standard dalam mengukur aktifitas optikal protein, yaitu mengukur perbedaan absorbandi pada struktur sirkular bagian kanan dan kiri struktur protein melalui Polasrisa cahaya dari sample protein. Ketetapan standar Far-UV atau daerah amide adalah 170 -250 nm untuk ikatan peptida dan daerah Near UV adalah 250 – 300 nm untuk aromatik asam amino. Seperti yang terlihat pada gambar di bawah ini.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 16

Eksperimen teknik penentuan struktur protein Dilipat struktur protein secara rutin ditentukan oleh Kristalografi sinar-X dan NMR. Memahami dichroism melingkar: dasar-dasar polarisasi untuk benar-benar memahami dichroism lingkaran, yang pertama harus memahami dasar-dasar polarisasi Terpolarisasi linier cahaya adalah cahaya yang osilasi terbatas untuk pesawat tunggal. Semua negara terpolarisasi cahaya dapat digambarkan sebagai jumlah dari linear terpolarisasi tegak lurus satu sama lain, biasanya dirujuk ke penampil sebagai vertikal dan horizontal terpolarisasi cahaya. Ini ditampilkan dalam animasi di bawah ini. (Gerakkan mouse di atas gambar untuk melihat animasi Animasi dibuat dari program Emanim..)

Kalau misalnya kita ambil horisontal dan vertikal terpolarisasi amplitudo gelombang cahaya yang sama di fase satu sama lain, gelombang cahaya yang dihasilkan (biru) adalah linear terpolarisasi pada 45 derajat, seperti terlihat pada animasi di bawah.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 17

Jika kedua polarisasi yang keluar dari fase, gelombang resultan berhenti menjadi terpolarisasi linier. Misalnya, jika salah satu terpolarisasi adalah keluar dari fase dengan yang lain oleh gelombang-kuartal, resultan akan heliks dan dikenal sebagai cahaya terpolarisasi sirkular (CPL). The heliks dapat berupa-tangan kanan (R-CPL) atau kidal (L-CPL) dan non-gambar cermin superimposable. Unsur optik yang mengkonversi antara cahaya terpolarisasi linier dan cahaya terpolarisasi sirkular disebut piring seperempat-gelombang. Sebuah piring seperempat-gelombang birefringent, yaitu indeks bias dilihat oleh horizontal dan vertikal terpolarisasi cahaya berbeda. Sebuah pelat sesuai berorientasi akan mengkonversi cahaya terpolarisasi linier ke sirkular cahaya terpolarisasi dengan memperlambat salah satu komponen linier balok sehubungan dengan yang lain sehingga mereka keluar seperempat-gelombang fase. Ini akan menghasilkan sebuah berkas baik-kiri atau kanan CPL. Kalau misalnya kita ambil horisontal dan vertikal terpolarisasi amplitudo gelombang cahaya yang sama di fase satu sama lain, gelombang cahaya yang dihasilkan (biru) adalah linear terpolarisasi pada 45 derajat, seperti terlihat pada animasi di bawah.

Spektrometri Fluorosense
Yaitu alat yang digunakan untuk melakukan pengukuran yang sempurna dalam mengkonfirmasi perubahan perubahan yang terjadi pada protein. Seperti yang dilakukan pada penglabelan Serotonin N acetiltransferasi (AANAT) dengan fluoresen (FL) dan rhodamin (Rh) , yang mengharapkan terjadinya transfer resonansi energi fluoresen (FRET) untuk AANAT sebagai monomer (no FRET) dan sebagai oligomer (FRET).

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 18

Atau juga pelabelan in vivo pada Glutatione S-transferasi (GST) yang mengandung residue sistein N-terminal dengan membran permiable tetrametilrhodamin thioester (TMR).

TEKNIK

DESAIN

RASIONAL

PROTEIN

DENGAN

PENDEKATAN

MUTAGENESIS SITE DIRECTED

Teknik Mutasi Site Direkted meniru mutasi alam yang terjadi pada gen organisme hidup dengan merubah residu asam amino tunggal melalui teknik mutasi kodon yang mengkodekan asam amino. Teknik ini adalah metode terlama yang digunakan pertama kali dalam rekayasa protein. Dengan sintesa oligonukleotida yang dimasuukan ke dalam suatu plasmid. Metode pertama dari site directed mutageneis dikembangkan degna metode Single Primer, oleh Gilliam et.al 1980 dan Zaller dan Smith, 1983. Seperti yang dideskripsikan pada metode alam yang melibatkan sintesa in vitro DNA dengan sintesa kimia Oligonukleotida (7 hingga 20 rantai panjang nukleotida) yang membawa base yang sesuai dengan sususnan yang dilengkapinya. Metode ini membutuhkan DNA yang tersedia pada bentuk rantai tunggal untuk dimutasikan, dan dikloning dengan vektor gene M13 untuk mempermudahnya.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 19

Susunan Asli Asam Amino

Silent

Mutasi

atau

Missense

yaitu

perubahan susunan nukleotida tanpa adanya perubahan susunan protein. Nonsense yaitu Perubahan susunan asam amino yang merubah terminal atau menghentikan ujung-C protein. Penambahan protein. susunan asam amino

yang merubah terminal atau ujung-C

Pengurangan yang merubah pada protein

susunan

asam

amino

terminal atau ujung-N

Perbaikan Protein dengan metode DNA Mismatch ini adalah salah satu proses yang paling penting untuk mengkoreksi kesalahan repliksi dalam organisme hidup, sehingga dapat meningkatkan keakuratan replikasi DNA hingga mencapai faktor 1000.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 20

Sintesa primer DNA bersintesa dengan oligonukleotida

dimasukkan ke dalam molekul

heteroduplex dihasilkan. Setelah transformasi dari host E. coli, heteroduplex ini menimbulkan homoduplexes yang urutannya berasal dari wild-tipe DNA atau yang mengandung dasar bermutasi. type. Pengambilan mutan, dilakukan dengan penyaringan hibridisasi asam nuklead dan probe nya yang dilabel dengan 32P-label oligonukleotida. Parameter yang berperan termasuk diantaranya suhu dan konsentrasi kation yang didapat sebagai sinyal positif dari Mutasi Klon. Hal ini memungkinkan kesiapan untuk mendeteksi mutan yang diinginakna (Wallace et. 1981, Traboni et al. 1983). Sangat dianjurkan untuk memeriksa urutan mutan secara langsung dengan menggunakan Frekuensi mutasi klon yang muncul lebih rendah dibandingkan dengan klon wild

metode sekuensing DNA, untuk memastikan bahwa prosedur tidak melakukan perubahan adventif lainnya. Ha Ini sangat dibutukan pada versi pertama teknik yang menggunakan DNA polimerasi E-Coli. Penggunaan yang DNA polimerase high fidelitey yang lebih baru dapat meminimalkan masalah mutasi asing serta memperpendek waktu untuk menyalin untai kedua. ini tidak "menggantikan-untai" oligomer, sebuah proses yang oligonukleotida mutan asli.
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 21

Selain itu, polimerase akan menghilangkan

DNA yang diklone pada plasmid daan didapatkan dari bentuk duplex dapat juga dikonversikan atau dirubah menjadi molekul partial single yang sesuai , dilakukan oleh Dalbadie-Mc Farland et al.1982. Sehingga dalam pengembanganya terkadang digunakan juga double sebagai ganti rantai primer DNA seperti gambar bawah kanan.

PENDEKATAN

TEKNIK

MUTASI

PENAMBAHAN

ATAU

PENGHILANGAN DENGAN PCR BASED – ENZIM NUKLEASE
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 22

Sebuah variasi dari prosedur yang telah dijelaskan sebelumnya diatas, teknik mutasi pada ini melibatkan oligonucleotides yang mengandung susunan yang dapat ditambahkan atau dihapuskan. Selama hibrida stabil terbentuk dengan wild type DNA beruntai tunggal, priming sintesis DNA in vitro dapat terjadi, akhirnya menimbulkan klon sesuai dengan susunan yang ditambahakan atau dihapuskan (Wallace et al. 1980, Norrander et al. 1983).

TEKNIK

PENDEKATAN

MUTASI

PERUBAHAN

DOMAIN

ATAU

PENGGABUNGAN DOMAIN (FUSION) DENGAN ENZIM LIGASI DAN MULITIPLIKASI PCR-BASED
MUTAGENESIS YANG DIARAHKAN DENGAN OLIGONUKLEOTIDA DENGAN PERUBAHAN DOMAIN
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 23

Sebagai contoh berikut :

Mutagenesis in Vitro Klonin gen dapat bermutasi secara khusus, sehingga memungkinkan adanya mutasi tertentu. Komponen utama yang dibutuhkan dalam protocol Direkted mutagenesisi ini diantarnya : DNA Template, Primer Mutasi, DNA Polimerase, dNTP. Dan beberapa variasi lain untuk meningkatkan efisiensinya.

APLIKASI TEKNIK PENDUKUNG SITED DIRECTED MUTAGENESIS

REAKSI RANTAI POLIMER / POLYMER CHAIN REACTION/PCR Teknik PCR merupakan cara untuk mengisolasi fragmen DNA secara cepat dan juga untuk mencapai akumulasi eksponensial dari target DNA.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 24

Teknik ini didasarkan pada urutan DNA yang telah ditentukan sebelumnya, seperti oligonuklotida pendek (~ 20bp) dikembangkan dan dilengkapi untuk menyusun DNA target yang diapit . Oligonucleotides bertindak sebagai primers untuk menyalin DNA yang serupa (Replikasi DNA).

Setiap siklus replikasi menggandakan jumlah target DNA :

Kemudian amplifikasi/memperbanyak DNA secara eksponensial dilakukan :

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 25

Beberapa contoh PCR yang dapat untuk Rekayasa Protein diantaranya :

-

PCR – Media Mutagenesis
Mutagenesis Oligonukleotida mismatch dapat menciptakan titik mutasi yang diinginkan pada daerah yang telah ditentukan sebelumnya (site pre-determined) dengan molekul DNA klone. Salah satu dari berbagai metode mutagenesisi adalah sel-base oligonukleotida mismatch (untuk alternative PCR-base site directed mutagenesis).

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 26

Penggunaan mutagenetik oligonukleotide secara langsung pada nukleotida tunggal yang disubstitusi pada gene. Gene dikloning pada M13 untuk menciptakan rekombinasi DNA rantai tunggal. Primer oligonukleotida dirancang untuk melengkapi secara berurutan bagian dari susunan gen yang meliputi nukleotida yang akan dimutasi (A) dan mengandung base nonkomplementari yang diinginkan pada posisinya (C). Meskipun berupa internal mismatch, annealing dari primer mutagenic dapat dilakukan , dan sintesa rantai kedua dapat diperpanjang dengan polimerasi DNA serta celah/gap ditutup dengan DNA ligase. Hasil heteroduplek dapat ditransformasikan ke dalam E-coli, dimana dua populasi rekombina dapat dikembalikan menjadi wilde type dan mutant homoduplek, yang kemudian dapat diidentifikasikan dengan hibridisasi molecular (dengan menggunakan primer mutagenic sebagai probe oligonuklotida alel spesifik).

-

PCR Base – Site Directed Mutagenesis

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 27

-

PCR Base – Turunan Primer Site Directed Mutagenesis

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 28

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 29

-

PCR Mutagenesis
(A)

Mutagenesis ujung 5‘
Primer dimodifikasi pada ujung 5‘ untuk memulai proses, sebagai contoh, Group yang telah dilabelkan, susunannya mengandung site restriksi yang sesuai, atau promoter phage untuk menggerakkan ekspresi gen.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 30

(B) Mutagenesis Site – Spesifik
Mutagenesis menunjukkan dapat menghasilkan produk amplifikasi dengan

menglokasikan mutasi pre-determinasi yang spesifik pada segmen central. Reaksi PCR A dan B dihadapkan pada segmen overlapping yang diamplifikasi pada DNA yang mengandung mutasi yang telah dimasukkan (dengan mempertimbangkan mismatching base menggunakan primer mutant – 1M atau 2M). Setelah dua produk dikombinasikan, denaturasi dan reanneal dilakukan, polimerasi DNA dapat memperpanjang ujung 3‘ heteroduplek dengan ujung 3‘ yang tersembunyi. Kemudian, produk panjang penuh dengan mutasi yang dimasukkan pada segmen central dapat diamplifikasi dengan menggunakan hanya primer outer 1 dan 2.

-

PCR Base Tunggal Mismatched
Pada awal pengembangan metode PCR, amplifikasi DNA menunjukkan bahwa teknik Base tunggal mismatched sangat potensial untuk diaplikasikan pada mutagenesis (Schart et al. 1986).

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 31

Single base mismatched antara amplifikasi primer dan template dikorporasikan pada susunan template sebagai hasil amplifikasi. Hituchi et al. (1988) menerangkan bahwa variasi metode dasar memungkinkan mutasi pada produksi fragmen DNA dengan PCR. Dua primer reaksi PCR memproduksi reaksi dengan melakukan tumpang tindih atau overlapping dua fragmen DNA, yang semuanya menampung mutasi yang sama pada daerah overlapnya. Susunan yang overlap memungkinkan terbentukanya fragmen menjadi hibridisasi. Salah satu dari dua hybrid diperpanjang dengan DNA pllimerase untuk memproduksi fragmen dupleks. Hibrid satunya memiliki recessed ujung 5’ dank arena bukan sebagai substrate untuk polimerasi, maka akan secara efektif hilang dari percampuran reaksi. Seperti pada mutageneisi konvernsional perpanjangan primer, dan mutasi penghilangan dan atau penambahan daerah asam amino dapat juga diciptakan. Langkah yang ditunjukkan pada bagian kiri atas ujung diagram menunjukkan metode basic PCR mutagenesis. Setengah bagian ke bawah menunjukkan bagaimana mutasi dapat dipindakan pada molekul DNA bagian tengh. Primer ditunjukkan dengan huruf tebal dan primer A dan A’ saling melengkapi. Metode Higuchi (1988) sedikit rumit karena membutuhkan empat primer dan 3 PCRs (sepasang PCRs untuk amplifikasi segmen overlapping dan tiga PCR untuk menggabungkan dua segmen). Reagen Komersial produsen telah mengembangkan beberapa metode yang lebih sederhana dan dua dari metode ini dideskripsikan dibawah : 1. Prosedur yang tidakmembatasi perubahan base tunggal, dengan memilih primer yang sesuai untuk ditambahkan atau dihilangkan. 2. Taq polimerase yang menyalin DNA dengan fidelitas rendah, dengan resiko mutasi yang ekstraneous terjadi selama reaksi amplifikasi. Problem ini dikurangi dengan menggunakan polimerasi termostabil dengan fidelitas tinggi, dan konsentrasi template yang tinggi serta pengurangan siklus amplifikasi dari 1-siklus.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 32

-

PCR Metode Exsite TM.
Pada metode Exsite TM, kedua rantai vektor yang membawa target gen yang akan diamplifikasi menggunakan PCR tetapi satu dari primer membawa mutasi yang diinginkan. Hasil produksi dari populasi liner duplex membawa gen mutasi yang akan dikontaminasikan dengan tingkat rendah pada siklus template DNA aslinya. Template DNA diturunkan dari Sel E-coli dengan sistem modifikasi restriksi intak , kemudian dilakukan metilasi dan disensitifkan untuk restriksi dengan DpnI Endonuklease. DNA linear diproduksi dengan amplifikasi akan resistan terhadap pembukaan Dpnl dan setelah sirkulasi dengan ligasi blunt-end dapati dikembalikan dengan transformasi kedalam

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 33

E-coli.

Setiap molekul hibrid mengandung rantai tunggal template metilasi DNA dan

unmetilasi amplifikasi yang akan dihancurkan dengan Endonuklease.

PCR Metode Exsite TM

PCR – Metode Gen Tailor

- PCR – Metode Gen Tailor
Metode ini menargetkan DNA yang dimetilasi in vitro sebelum langkah mutagenesis dan overlapping primer digunakan. Linier amplifikan yang diproduksi, membawa mutasi yang diinginkan tetapi saat ditransformasikan langsung pada E-coli, Sel Host memperbaiki sirkulasi enzim mutasi

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 34

DNA linear, sementara Endonuklease McrBC menguraikan Metilat-tempate DNA, meninggalkan hanya un-metilat sebagai produk mutasi.

- Reverse Transkripsi PCR
Metode sensitif untuk mendeteksi dan menganalisa transkripsi mRNA atau RNA pada posisi yang rendah. RNA tidak dapat digunakan sebagai template PCR sehingga harus Teknik ini diawali dengan ditranskripsikan dahulu menjadi cDNA dengan reverse transkripsi dan Moloney virus atau Avian virus dan duplikat cDNA kemudian diperbanyak. pencampuran mixing short polimer timidine (oligodT) dengan mRNA dan anneal RNA’s poliadenalit tail. Reverse transkripsi ditambahkan dan digunakan oligo dT sebagai primer untuk sintesa pertama rantai cDNA.

-

PCR - Gen Sekuensi untuk Mutasi

Produk PCR untuk Mutasi gen yang disaring didapatkan dari Genome DNA menggunakan primer intron-spesfik yang mengapit exon atau dengan Reverse Transkripsi PCR. (A) Genome DNA, Exons 1-4 dapat diamplifikasi secara terpisah dari Genome DNA menggunakan pasangan primer intron yang spesifik (1F + 1R, 2F + 2R, dsb.) (B) Reverse Transkripsi PCR. Mempercayakan pada beberapa mRNA yang

dipresentasikan pada sel sel yang secara mudah diakses seperti sel sel darah,
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 35

memungkinkan konversi ke cDNA. overlapping/tumpang tindih.

cDNA kemudian dapat digunakan sebagai template menciptakan Fragmen DNA yang

untuk pasangan primer exon yang spesifk untuk

-

PCR- Perpanjangan Polimorph Fragmen Restriksi Fragment

Metode untuk mendeteksi daerah restriksi polimorp. Alleles 1 dan 2 dibedakan dengan polimorph yang merubah susunan nukleotida dari daerah resktriksi spesifik untuk restriksi nuklease. Allele 1 mempunyai daerah, tetapi alelle 2 mempunyai nukleotida yang telah dirubah. PCR primer dapat didesain secara sederhana dari susunan yang mengapit daerah restriksi untuk memproduksi produk yang pendek. Penghancuran Produk PCR dengan enzime R dan fraksinasi ukuran dapat menghasilkan penulisan sederhana untuk dua alelles.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 36

-

PCR – STRPS

PCR dapat digunakan untuk menghasilkan tandem pendek polimorps yang berulang (STRPs). Penulisan dari dinukleotida CA/TG mengulang polimorphs yang mempunyai tiga alel sebagai hasil variasi pada jumlah pengulangan CA. Pada autoradiograph setiap alel direpresentasikan dengan band utama bagian atas dan dua minor „band bayangan“. Setiap A dan B mempunyai genotipe A (1,3) dan B (2,2).

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 37

- PCR – Spesifik Alel
Dasar dari PCR spesfik alel ini mengkoreksi pasangan base pada ujung 3‘ Primer PCR. Spesik alel oligonukleotida primer ASP1 dan ASP2 dirancang untuk menyamakan susunan dua alel terhadap posisi daerah sebelumnya pada varian nukleotida, sampai dengan dan berakhir pada varian itu sendiri. ASP1 akan mengikat secara sempurna untuk melengkapi susunan rantai alel 1, memungkinkan amplifikasi dengan primer yang dilindungi. Namun, ujung C-3‘ pada ASP2 primer mismatched dengan T dari susunan alel 1, sehingga amplifikasi tidak dapat dilakukan. Serupa dengan ASP2 dapat mengikat sempurna kepada alel 2 dan memulai amplifikasi, tidak seperti ASP1.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 38

-PCR –DOP
Memungkinkan kloning cDNA menggunakan turuan oligonukleotida. Kloning cDNA untuk porcine urate oksidase mneggunakan turunan oligonukleotida yang berhubungan dengan susunan asam amino yang diketahui. Primer sense dikonstruksikan terhadap kodon 7-11 dan dua base yang pertama dari kodon 12, dan primer antisense berhubungan dangan kodon 34-38 (Lee et.al, 1980). Susunan asam amino dipilih untuk mengkonstruksikan primer yang dipilih dari basis kandungan tinggi asam amino yang dispesifikan dengan hanya dua kodon (Asp, Tyr, Lys, Asn, His). memfasilitasi kloning subsekuen sel base. Primer mempunya perpanjangan 5‘ mengandung susunan yang dikenali untuk restriksi nukleases, untuk

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 39

-

PCR – Linked Primer

PCR link primer memungkinkan amplifikasi in-diskriminate susunan DNA pada target DNA yang rumit/kompleks. Molekul Linked (adaptor) adalah rantai ganda oligonukleotida yang dibentuk dengan ligasi dua rantai tunggal oligonukleotida dilengkapi pada susunan kecuali yang memiliki kompatible tergantung 5‘ dengan retriksi nuklease tergantung/overhang (pada kasus ini, GATC 5‘ tergantung diproduksi oleh Mbol). Setelah ligasi dari linker terhadap target fragmen restriksi, primer linked-spesifik dapat menghasilkan amplifikasi semua fragmen dengan mengikat dua molekul linker yang mengapit.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 40

-

Anchored PCR – Genome Walking

Sumber komplek target dari DNA yang terdiri dari fragmen yang banyak dimana susunan anchor (labuhan) dilampirkan, sebagai contoh linker oligonukleotida rantai ganda. Ide untuk menggunakan spesifik primer untuk susunan anchor dan satu spesirik untuk susunan X yang diketahui dapat untuk membebaskan fragmen fragme yang mengandung susunan X dan mendapatkan akses susunan tidak teridentifikasi sebelumnya yang berdampingan terhadap X. Pada contoh ini, susunan anchored ditunjukkan hanya pada bagian sisi kiri dari amplifikasi yang jelas dan dimungkinkan dari susunan karakterisasi N1 sebelumnya yang berdekatan dengan susunan X yang diketahui. seperti PCR buble-linker. Variasi metode derivatif telah disusun,

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 41

Anchored PCR – Genome Walking

PCR - Taqman Assay

-

PCR - Taqman Assay

Metode sensitif untuk mendeteksi spesifik Alelle menggunakan aktifasi exo 5‘ dan 3‘ dan primer ketiga dengan Fluor dan Quencher. Penambahan 2 primer PCR konvensional, P1 dan P2, yang spesifik untuk susunan target, primer ketiga P3, didesain untuk mengikat secara spesifik daerah pada susunan target downstream pada suatu ikatan P1. Pelabelan P3 dengan dua fluorophores,. reporter dye (R) dilampirkan pada ujung 5’ dan quencher dye yang mempunyai perbedaan panjang gelombang emisi dilampirkan pada reporter dye yaitu pada ujung 3’. Karena ujung 3’ diblok/dihalangin, P3 primer ketiga tidak dapat dengan sendirinya prime pada setiap sintesa DNA baru. Selama reaksi PCR, Polimerasi Taq DNA mensintesa rantai prima DNA baru dengan P1 / primer pertama dan enzim mendekati primer ketiga, aktifitas proses dari arah 5’  3’ menurunkan P3 primer ketiga dari ujung 5’. Hasil akhir adalah rantai DNA yang timbul melebihi daerah ikatan P3 reporter serta quenche dye tidak lagi mengikat molekul yagn
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 42

sama. Karena Reporter dye tidak lagi dekat pada quencher, hasilnya meningkatkan emisi intensitas reporter yang akan dengan mudah dideteksi

-

PCR - Hot Star

Teknik yang mengubah cara pencampuran PCR dengan pemanasan awal. Polimerase diaktifkan, tapi target belum mengalami didenaturasi dan Primer dapat mengikat ke lokasi non-spesifik (atau bahkan satu sama lainnya). polimerase . Atau, sistem Teknik dilakukan manual dengan memanaskan komponen reaksi pada suhu pencairan (mis. 95 ° C) sebelum menambahkan yang menghambat aktivitas polimerase yang pada suhu Hot-start/coldlingkungan, baik oleh pengikatan suatu antibodi, atau dengan adanya inhibitor yang terikat kovalen yang hanya terdisosiasi setelah langkah aktivasi temperatur tinggi. dan hanya diaktifkan pada temperatur tinggi. finish PCR dicapai dengan polimerase hibrida baru yang tidak aktif pada suhu lingkungan

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 43

Polimerase Taq berasal dari bakteri T. aquaticus diidentifikasi sebagai enzim yang mampu menahan kondisi protein yang dipisahkan oleh suhu tinggi selama proses PCR. Suhu Taq's optimal untuk kegiatan adalah 75-80 ° C, dengan waktu paruh dari 9 menit pada 97,5 ° C, dan dapat meniru 1000 untai pasangan basa DNA dalam waktu kurang dari 10 detik pada 72 ° C. Taq DNA polymerase lacks the 3´→5´ proof-reading activity yang biasa terdapat pada polymerases. Taq mis-incorporates 1 base in 104. A 400 bp target akan mengandung error 33% pada molecules setelah 20 cycles. Error distribution will be random. Biasanya memiliki tingkat kesalahan diukur sekitar 1 dalam 9.000 nukleotida Error diperhatikan bila target ingin memperbanyak DNA — individual Error tidak diperhatikan jika target molecule dapat menyembunyikan beberapa mutasi.

menginginkan susunan amplified DNA atau memotongnya dengan restriction enzymes. Proof-reading thermo-stable enzyme amplifikasi keakuratan yang tinggi . Amplifikasi produk biasanya pada range size 100-1500 bp. Target yang lebih panjang di perbanyak — >25 kb. Membutuhkan modifikasi pada reaksi buffer, ocktails polymerases, dan waktu ekstensi yang lebih lama. seperti DNA polimerase Pfu, memiliki aktivitas

proofreading, dan digunakan sebagai pengganti (atau dalam kombinasi dengan) Taq untuk

- Error Prone PCR
Teknik PCR dengan ketelitian yang rendah. Digunakan untuk menentukan varians baru protein berdasarkan prinsip bahwa Taq polimerase dapat berannealing pada pasangan base yang tidak kompatible satu sama lainnya selama proses amplifikasi atau penguatan dalam kondisi PCR yang tidak sempurna. Teknik ini diilakukan dengan meningkatkan konsentrasi ion Mg 2+ , penambahan ion Mn 2+, Membedakan Konsentrasi pada keempat dNTPs, Penggunaan dITP, dan Meningkatkan jumlah Taq Polimerase (Polimerase tanpa buktu fungsi pembacaan).

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 44

Dan banyak lagi contoh Teknik teknik PCR yang digunakan dalam rekayasa Genetik.

STRATEGI

DESAIN

MUTAGENESIS

ACAK/

RANDOM

MUTAGENESIS
Hasil percobaan teknik kadangkala memberikan perubahan yang diinginkan dengan adanya mutasi yang tidak diperkirakan. Dalam teknik ini tidak diperlukan pengetahuan tentang struktur atau susunan protein, ataupun mekanisme protein, melainkan penerapan pengetahuan dalam :

-

Random mutagenesis
Digunakan untuk menciptakan perbedaan genetik

-

Seleksi atau Screening/Penyaringan
Digunakan untuk memilih varian yang memiliki kualitas yang diinginkan.

Dalam beberapa tahapan mutasi dan seleski, metode ini meniru evolusi alam. digunakan untuk menghilangkan mutasi netral dan merusak.

Biasanya

Prinsip dasar yang mendasari desain strategi ini adalah untuk memvariasikan asam amino secara random atau acak pada susunan polipeptida untuk mendapatkan kombinasi kombinasi baru dan kemudian menyeleksi produk produk gen baru (protein) . Contoh mutagenesisi acak/random yang digunakan dalam rekayasa protein adalah Evolusi yang diarahkan (Directed evolusi).

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 45

Teknik pendekatan dengan evolusi yang diarahkan memungkinkan untuk mencipatkan protein protein baru dan produk produk gen dengan mutasi yang diinginkan menggunakan teknsik mutagenesis cutting-edge (pemotongan ujung) yang menjadi teknik perancangan kembali protein protein yang telah eksis atau ada. Namun, secara efisiensi bahan kimia keseluruhan dari perancangan kembali protein protein dapat mengurangi nzim yang terjadi secara naturral. Sangat diinginkan atau dipilih oleh para peneliti untuk menampilkan assay evolusi direk ini pada mutasi mutasi yang menghasilkan kondisi stabil terhadap tekanan tekanan seperti temperatur, pH dll , ditempatkan pada kultur populasi sel menggunakan instrument seperti kemostat. Dengan munculnya teknik untuk melakukan mutagenesis acak/random ini memungkinkan untuk menjelaskan hubungan struktur protein-fungsi dengan memperbaiki atau mengubah urutan polipeptida. Mutasi ini diperkenalkan dengan menggunakan metode yang disebut Error prone PCR (Polymerase Chain Reaction). Polimerase yang digunakan dalam PCR rentan terhadap Produk mutasi kesalahan, sehingga timbul kesalahan dalam memperkenalkan urutan gen. dapat disaring untuk mutasi pada produk gen atau protein. Tahapan dalam Random Mutasi adalah :
1. Memilih Gene 2. Menciptakan librari/pustaka dari varian varian 3. Memasukkan pustaka gen kepada vector yang diekspresikan 4. Memasukkan pustaka gen atau vector ke bakteri, yang memproduksi varian varian

PCR ini kemudian diligasikan ke dalam plasmid ekspresi protein dan perpustakaan mutan

enzim dari satu sel atau satu sususnan
5. Menyaring koloni koloni untuk sifat sifat yang diinginkan 6. Mengisolasi gen gen yang akan dikembangkan dan mengulangi proses

Seperti yang tergambarkan berikut ini :

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 46

Faktor yang menentukan keberhasilan strategi adalah:  Kualitas dan desain Pustaka/Library  Pemilihan metode evolusi  Pemilihan Rekombinasi DNA  Metode Seleksi atau Penyaringan/Skreening

Limitasi atau keterbatasanyang dihasilkan dari strategi ini adalah:  Susunan protein yang dikembangkan memiliki sifat yang hampir mirip dengan susunan induk atau parental, sepanjang path evolusinya.  Kapasitas metode untuk menciptakan susunan fungsional yang baru sangat terbatas dan membutukan library/pustaka yang besar.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 47

EVOLUSI YANG DIARAHKAN/DIRECTED EVOLUSI
Untuk memahami evolusi diarahkan, maka diperlukan pemahaman tentang evolusi. Seleksi alam, bersama dengan kombinasi gen-protein, ber interaksi, mendorong evolusi. Dalam evolusi, fungsi enzim tertentu dan sifat enzim berubah, menyempurnakan dan disesuaikan dengan organisme lingkungan. Perubahan ini tidak bekerja dalam arah tertentu atau terhadap apapun tujuan yang tepat, tetapi terjadi secara spontan pada bentuk yang sangat spesial dalam menanggapi reproduksi spesifk dan persyaratan hidup. Kita tahu ini, tapi kita tidak tahu bagaimana tepatnya interaksi proses bekerja. Juga hal apa yang bekerja dengan baik dalam lingkungan selular tidak efektif dalam lingkungan nonnatural untuk beberapa alasan, seperti substrate yang tdk dpt melarut, produk yang tidak stabil atau reaksi kimia tambahan.. Sehingga enzim alam yang digunakan dalam pertanian, kedokteran dan industri aplikasi mungkin tidak selalu memberikan hasil yang dapat diandalkan. Apa yang dibutuhkan adalah enzim-enzim yang stabil yang dapat tetap aktif dalam jangka periode waktu yang lama pada lingkungan nonselular dan yang dapat bekerja dengan berbagai substrat. Di sinilah evolusi yang diarahkan dapat diaplikasikan. Evolusi yang diarahkan merupakan proses yang dikendalikan dalam biologi sintetis yang digunakan untuk merekaya protein atau RNA dengan sifat-sifat tertentu yang diinginkan yang mungkin atau tidak mungkin terjadi secara alami. Dalam jenis rekayasa protein ini, ilmuwan bekerja menuju tujuan yang didefinisikan secara pasti - mungkin sebenarnya ada banyak cara untuk mencapai tujuan pasti, namun peneliti memilih salah satu yang paling tidak memerlukan upaya - dan memonitor keseluruhan proses. Eksperimen Directed Evolution Eksperimen evolusi yang diarahkan dapat dilakukan pada sel-sel hidup (in vivo) dan juga tanpa menggunakan sel hidup (in vitro). Salah satu putaran percobaan biasanya mengambil tiga langkah untuk menyelesaikan dan putaran beberapa percobaan biasanya diperlukan untuk mendapatkan protein atau RNA dengan ciri-ciri yang diperlukan. Untuk memulainya, dilakukan langkah mengisolasi gen-gen dengan sifat-sifat spesifik yang diinginkan dan, dengan menggunakan proses mutagenesis dan / atau rekombinasi, membuat perpustakaan besar varian gen; semakin besar perpustakaan semakin besar kesempatan untuk menemukan varian gen dengan sifat-sifat yang dibutuhkan. Kemudian pustaka varian gen disaring untuk menemukan dan mengisolasi varian gen yang ditingkatkan dan kemudian diamplifikasi berkali-kali dan disajikan dalam bakteri, jamur atau organisme lain yang cocok. Dalam putaran percobaan berikutnya, varian gen terpilih dari putaran sebelumnya selanjutnya ditingkatkan lagi dan begitu seterusnya sampai akhirnya didapatkan gen dengan sifat-sifat yang
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 48

dibutuhkan.

METODE NON KOMBINASI DOMAIN SWAPPING
Konstruksi aktual dari desain rasion genes domain – swapped genes dapat diselesaikan dengan beberapa teknik yaitu :
-

Metode Kaset Mutagenesis Susunan site restriksi mengapit susunan DNA tertentu untuk ditempatkan dan dihancurkan dengan enzim restriksi dan penggantian susunan dengan memasukkannya di antara sitesnya (Wells et.al.1985).

-

Metode Pemotongan Gene/Splicing dengan PCR perpanjangan overlapping Molekul DNA direkombinasikan tanpa menggunakan pembatasan endonukelase (Horton, et.al 1989). Fragemen gen yang akan direkombaniskan dari gen orangtua dapat dihasilkan dalam reasi PCR.

METODE KASET MUTAGENESIS
Pembatasan situs dapat terjadi secara alami atau artifisial dimulai pada lokasi yang diinginkan pada gen target dengan oligonukleotida-directed mutagenesis. Pemilihan pembatasan situs didasarkan pada keunikannya terhadap plasmid dan konservasi asam amino akhir urutan pengkodean.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 49

METODE PEMOTONGAN GEN DENGAN PCR OVERLAP EXTENSION
Primer untuk reaksi-reaksi ini didesain sehingga ujung produk mengandung urutan komplementer. Ketika produk PCR ini dicampur, alur memiliki urutan yang sesuai pada ujung rantai 3 ‘yang tumpang tindih dan bertindak sebagai primer satu sama lain, dan ekstensi oleh polimerase DNA menghasilkan suatu urutan di mana urutan asli dihubungkan bersama-sama. Memungkinkan untuk menggabungkan dua fragmen dalam satu langkah kloning, namun langkah kloning multiple dibutuhkan untuk melakukan swap domain internal.

Dalam variasi metode, Protokol PCR tiga langkah digunakan untuk pembentukan protein chimeric, hanya satu langkah kloning dibutuhkan untuk bertukar dari domain internal (Grandori et al 1997).

Metode ini dapat digunakan untuk menggantikan suatu domain tertentu dalam protein A oleh domain analog dalam protein B. Studi tentang hibrida domain-bertukar dapat dihasilkan .

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 50

METODE KOMBINASI
 Kadang-kadang sulit diketahui mutasi seperti apa yang dapat menghasilkan sifat tertentu pada suatu protein  Misalnya, untuk meningkatkan termostabilitas suatu protein masih sulit untuk dilakukan hanya dengan melakukan prediksi pada struktur 3 dimensi (3-D) untuk menentukan asam amino mana yang menentukan sifat ini  Dengan metoda ini dapat dilakukan mutasi pada berbagai tempat untuk kemudian dilakukan identifikasi protein mutan yang mana yang dapat menghasilkan fungsi yang diinginkan

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 51

Menggunakan

pendekatan in vitro acak , prediksi terhadap

fragmen protein yang harus

menyatu dan posisi crossover yang harus ditempatkan tidak diperlukan. Metode ini memiliki beberapa teknik pendekatan yaitu :
-

Pendekatan chimeragenesis acak adalah penyisipan acak. Seperti namanya, metode

ini melibatkan penyisipan urutan DNA ke lokasi acak gen target (Heffron et al. 1978; Luckow et al. 1987; Hallet et al. 1997; Manoil dan Bailey 1997).
-

Investigasi hibrida yang dihasilkan oleh penyisipan acak dapat digunakan untuk

mengidentifikasi situs-situs yang yang menerima insersi fungsional dari sebuah domain protein menjadi perancah/scaffold ( Betton et al.1997).
-

Pendekatan lain, permutasi melingkar protein, menghasilkan relokasi N-dan C-

Termini (Graf dan Schachman 1996). Metode ini dapat digunakan untuk memahami jalur evolusi dan untuk mengidentifikasi situs permisif secara sistematis untuk permutasi melingkar, informasi mengungkapkan tentang modularitas scaffolrd (Baird. Et all 1999; Hennecke et al. 1999).
-

Pendekatan Rekombinasi homolog dan Pendekatan Rekombinasi nonhomolog

Penjelasan pendekatan pendekatan ini dipaparkan sebagai berikut :

METODE PENDEKATAN CHIMERAGENESIS ACAK
Secara teori, teknik ini sebernarnya dapat dibagi menjadi pendekatan nonkombinasi dan kombinasi dengan keuntungan(+) dan kerugian(-) yang dipaparkan berikut :

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 52

Pada metode in,i Protein Hibrid yang mengandung segmen (domains / subdomains) dari paling sedikit dua natural yang berbeda atau protein dari orang tua lelaki (Armstrong 1990). Domains dan subdomains didefinisikan terhadap struktural motif untuk variasi ukuran dan kekomplekan, termasuk unit unit kecil yang rata rata memiliki 10 – 30 asam amino, melipat menjadi unit fungsional , dan domains besar dari beberapa ratus asam amino yang memiliki aktivitas enzim (Ostermeier and Benkovic 2001).

Beberapa tipe hybrids:
-

Single crossover hybrids terdiri dari bagian N-terminal satu protein dan bagian Cterminal protein lainnya.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 53

-

Multiple crossover hybrids, satu atau lebih

internal stretches dari susunan asam

amino ditempatkan pada segmen yang berhubungan dari enzim lain.
-

Fusion hybrids, domain fungsional dari protein yang terhubung dengan domain dari protein lainnya, menciptakan produk gabungan/fuse yang lebih besar dari parentnya.

Hybrid dapat menyebabkan mutasi, penghilangan dan penambahan asam amino. Rational design hybrids membutuhkan identifikasi preliminari dari modul fungsional (Hopfner et al. 1998; Schneider et al. 1998) dengan inspeksi terhadap struktur 3 Dimensi pada setiap enzim asalnya. Tidak adanya informasi struktur, dapat digantikan dengan informasi alignment susunan asam amino untuk mengidentifikasi segmen potensial yang penting. Susunan DNA diinspeksi pada lokasi permukaan locate exon–intron yang mendefinisikan batas struktur dan fungsi unit. Metode Advances hybrid menciptakan chimeric libraries pada tipe random, menghilangkan keperluan atas informasi struktur atau susunan alignment (Ostermeier et al. 1999b; Stevenson and Benkovic 2002). Random methods memungkinkan untuk memamparkan kontribusi segmen protein terhadap fungsinya tanpa preconceived bias. Metode mempunyai keuntungan terhadap titik gabungan antara domain struktur dan fungsi atau subunit dapat dilokasikan dengan sesuai. Inspeksi hybrids dapat menciptakan pengertian yang berharga terhadap elusive dan residue penting–residue contacts dan long-distance residue networks yang sangat krusial pada aktifitas protein (Agarwal et al. 2002; Rajagopalan et al. 2002; Benkovic and Hammes-Schiffer 2003).

METODE REKOMBINASI HOMOLOG
Rekombinasi homolog dari fragmen gen menandakan reassembly fragmen DNA dari gen

orangtua dengan menggabungkan DNA dari beberapa orang tua menjadi produk akhir gen. Mekanisme reassembly didasarkan pada urutan DNA homologi dan gen dengan homologi rendah (kurang dari 70%) tidak dapat dikombinasikan (Sieber et al. 2001). Akibatnya, ada bias

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 54

inheren dalam rekombinasi homolog libraries: posisi crossover jatuh pada daerah tinggi, bukan rendah, kesamaan DNA . Meskipun demikian, metode ini dapat sangat berguna dalam domain swapping, karena seringkali gen orangtua berbagi homologi tingkat tinggi. Selanjutnya, rekombinasi homolog dapat digunakan untuk menggabungkan fragmen dari lebih dari dua gen induk, memungkinkan menjelajahi urutan dari seluruh keluarga enzim dalam satu percobaan. Berikut adalah Knokouts Gen yang dihasilkan oleh rekombinasi homolog :

Metoda untuk memisahkan protein dengan sifat yang diinginkan dan mengidentifikasi mutasi penyebab perubahan: 1. Penelusuran (Skrining): semua pustaka yang ada diperiksa secara acak untuk mencari protein dgn sifat yang diinginkan 2. Metoda seleksi: Pustaka diseleksi sedemikian rupa sehingga hanya yang memiliki perbaikan sifat yang ditelusuri

Protokol diterapkan pada metoda kombinatorial: 1. Metoda pembuatan pustaka kombinatorial dengan keragaman yang tinggi sehingga meningkatkan kemungkinan diperoleh protein dengan sifat yang diinginkan

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 55

2. Penentuan metoda yang digunakan untuk memisahkan protein dengan sifat yang diinginkan dan mengidentifikasi mutasi penyebab perubahan

METODE REKOMBINASI HOMOLOG – DNA SHUFFLING
Protokol dasar untuk rekombinasi homolog in vitro homolog gen orangtua disebut sebagai DNA Shuffling (William PC Stemmer, 1994, 1998). DNA SHUFFLING adalah Teknik evolusi dengan karakterisik berbeda yang meniru proses desain atau rekombinasi alami pada reproduksi seksual dan mempercepat proses perancangan melalui seleksi langsung pada in vitro yaitu mencampurkan dan menyesuaikan protein (match) untuk menghasilkan varian lebih, dengan mempertimbangkan : Teknik ikatan/Folding Protein Termostabilitas Aktivitas Enzim

Aplikasi teknik ini dilakukan pada Rekombinasi homolog invitro dari beberapa seleksi Pool Gen melalui Fragmentasi acak atau Random dan pemrosesan kembali melalui teknik PCR. Sekelompok homolog gen secara acak dibelah menjadi fragmen kecil dengan penghancuran oleh Enzim restriksi DNaseI. Fragmen selanjutnya dipasang kembali oleh PCR di mana mereka berfungsi sebagai template dan primer. Fragmen menyelaraskan dan cross-prime satu sama lain untuk replikasi memberikan untai DNA hibrida dengan beberapa komponen dari gen induk yang asli.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 56

DNA shuffling memimpin perkembangan teknik terkait yang menawarkan keunggulan dalam situasi tertentu. Misalnya, dalam modifikasi sederhana dari protokol asli, enzim restriksi sebagai ganti DNaseI untuk memotong gen induk. didasarkan pada shuffling, Kikuchi et al. (1999) digunakan campuran restriksi endonuklease

Hal hal yang diperlukan untuk melakukan rekombinasi Homolog DNA Shuffling ini adalah :
-

Penerapan rekombinasi homolog pada susunan susunan yang lebih dari 1 Kb Keberadaan daerah Homologous memisahkan daerah daerah yang berbeda (perbedaan wilayah).

-

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 57

-

Struktur Scafford-like Protein yang memungkinkan proses yang sesuai untuk Shuffling / Pencampuran.

Pengembangan Metode Rekombinasi Homolog dengan DNA Shuffling ini mengalami banyak perkembangan dalam aplikasinya di bidangn Rekayasa Protein, diantaranya :

1. Family Shuffing
Yaitu gen berasal dari family yang sama, merupakan homolog yang tinggi. Contoh shuffling ini dilakukan pada rekayasa gen Chephalogsporinase menjadi Antibiotik Lactam (Aktivitas Moxalaktamase) dimana Klon yang terbaik mengandung titik mutasi delapan segmen dari 3 ketahanan 270-540 ikatan/fold per 4 gen dan 33 asam amino . Meningkatkan

Contoh dari family shuffling dengan efisiensi tinggi berdasarkan multi step PCR dan Rekombinasi DNA in vivo dilakukan pada Yeast / Jerami , dengan mengallisa fungsi dan mengumpulkan statistic data dari kombinasi Pustaka antara Human Cytochrome P4501A1 dan 1A2, yang dikembangkan oleh Denis Pompon, Gilles Truan dan Valerie Abecassie, 2000. Aplikasi ini dikenal dengan sebutan Shuffling Kombinas Libraries Enhanced oleh Rekombinasi pada Yeast atau disingkat CLERY.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 58

2. Enzim Restriksi Shuffling – Chimareas
Dibandingkan dengan protokol DNA shuffling aslinya, Enzim restriksi shuffling memiliki keuntungan menghasilkan frekuensi chimeras yang lebih tinggi karena dihindarinya penggunaan DNaseI. Hidrolisis DNaseI pada DNA beruntai ganda lebih memilih lokasi yang berdekatan dengan nukleotida pirimidin dan akibatnya bisa memulai urutan bias ke rekombinasi tersebut. Restriction-enzim berbasis shuffling,mempunyai kelemahan bahwa situs crossover bias bertepatan dengan pembatasan situs-situs yang sudah ada. Contoh shuffling ini dalam rekayasa protein misalnya pada Hu-IFNs yang dikodekan oleh family dari lebih 20 duplikat gen non allelic membagi 85-98% urutan identitas pada tingkat asam amino. Protein ini memiliki aktifitas antiviral dan antiproliferative yang kuat yang memiliki utilitas klinis sebagai antikanker dan terapi antivirus. Meskipun utilitas IFNs chimeric berasal dari keluarga gen ini telah diakui, hanya sebagian kecil dari kemungkinan 10^26 chimeras telah dieksplorasi, baik dalam evolusi manusia alami atau dengan metode biologi molekuler modern, dan hanya satu IFN subtype-alam, Hu- IFN-2, telah digunakan dalam studi klinis. IFN yang paling aktif direkayasa adalah IFN alfacon-1,
Page 59

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

adalah sebuah konsensus dari 13 wild type-gen Hu-IFN yang saat ini digunakan dalam terapi hepatitis C.

3. Staggered Extension Process (StEP)
adalah variasi lain dari DNA shuffling (Zhao et al 1998;. Stephen J. Benkovic, 1999, Volkov et al. 2000). Metode ini digunakan untuk menciptakan protein protein hybrid. Dalam prosedur ini, terminal primer digunakan untuk meniru DNA target menggunakan PCRs dengan ekstensi waktu yang sangat singkat sekali untuk menghasilkan untai pendek DNA yang direplikasi. Rantai tumbuh DNA bertindak sebagai primer dalam siklus berturut-turut dan perubahan template direplikasi beberapa kali, dengan demikian mengumpulkan Komponen dari gen induk yang berbeda. Pada proses ini dibutuhkan susunan DNA dengan homolog yang tinggi.
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 60

Contoh aplikasi pada shuffling ini peningkatan half-life untuk substilen. Gen hibrid dikonstruksikan dari dua gen homolog. Cloning dari gen hibrid menghasilkan produksi protein hibrid. Hanya satu rantai dari setiap gen ditunjukkan setelah langkah denaturasi awal.

4. Rekombinasi priming acak (RACHITT)
Variasi lain dari DNA shuffling untuk menciptakan hybrid protein adalah :
-

Rekombinasi priming acak (Shao et al 1998). Yaitu teknik reassembly /pengumpulan DNA dengan sintesa interrupting/penyelaan yang dieksperimentkan oleh Short 1997. DNA Shuffling dan metode yang terkait telah diaplikasi praktis di bidang rekayasa protein industri, tetapi hasilnya seringkali sulit untuk merasionalisasi karena chimeras yang dihasilkan memiliki banyak parents dan beberapa posisi crossover.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 61

Hal ini tidak signifikan bila tujuannya adalah produk akhir, yaitu enzim direkayasa dengan sifat yang diinginkan.
-

Rekombinasi

Chimeragenesis acak

pada template transien atau sementara

(RACHITT) yang dieksperimenkan oleh CoCo et al. 2001.

5. Incremental Truncation for The Creation Hybrid Enzymes (ITCHY)
Adalah metode pendekatan kombinasi untuk menciptakan hybrid dari dua protein yang berhubungan. Dua protein yang berhubungan dienkodekan oleh gen 1 dan gen 2 . Hasil akhir nya merupakan gen hibrid yang terdiri dari ujung 5‘ gen 1 dan ujung 3‘ gen 2. Teknologi pemotongan tambahan mengilhami penemuan strategi chimeragenesis yang lebih maju dan lebih sesuai untuk memahami hubungan struktur dan fungsi protein.
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 62

Strategi pertama dari pemotongan ini, adalah pemotongan incremental

untuk

pembuatan enzim hibrida (ITCHY-Incremental truncation for the creation Hybrid Enzymes (ITCHY) yang dikembangkan oleh G, Truan et al., 2000, menghasilkan perpustakaan protein hibrida single crossover antara dua gen induk. Aplikasi hasil ITCHY terdapat pada perpustakaan gen dengan pemotongan tambahan pada posisi crossover yang didistribusikan secara acak. Perpustakaan ini berisi hibrida dengan sisipan dan penghapusan DNA, dan produkproduk dari berbagai ukuran yang diproduksi. Tambahan pemotongan (arrow pertama) dan penambahan pemotongan enzim hibrida (ITCHY). Dalam ITCHY, perpustakaan pemotongan inkremental dihasilkan oleh penghancuran DNA oleh exonuclease III. Fragmen yang dihasilkan kemudian diligasikan bersama-sama untuk menghasilkan perpustakaan akhir.

Thio-ITCHY, merupakan variasi metode

ITCHY, dengan menggunakan Analog

nukleotida trifosfat yang dikembangkan oleh Lutz, et al.2001.
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 63

Dalam sebuah PCR, dNTP α-phosphothioate digabungkan secara acak dan pada frekuensi rendah ke dalam wilayah yang ditargetkan untuk pemotongan DNA. Internucleotide phosphothioate yang dihasilkan menghubungkan ketahanan terhadap hidrolisis exonuclease 3'-5 ', memberikan ketahanan DNA target terhadap degradasi dalam pembuatan ExoI berikutnya. Thio-ITCHY telah berhasil digunakan untuk menggabungkan kembali gen dengan urutan identitas dengan hanya 36% untuk menghasilkan chimeras aktif (Saraf et al 2006)

Keterbatasan utama ITCHY dan Thio-ITCHY adalah bahwa crossover hibrida tunggal hanya dapat dihasilkan urutan. dari dua orang tua , membatasi potensi keanekaragaman

6.

Penggabungan/ Fusion (SCRATCHY)

ITCHY dan DNA Shuffling secara berurutan

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 64

Metode rekombinasi homolog berhasil digunakan dengan mengkombinasikannya pada metode lain untuk menentukan faktor-faktor penentu spesifisitas substrat dan aktifitas enzim pada berbagai variasi family protein. (Griswold et al. 2005; Park et al. 2006). Metode ini digunakan untuk mencari hubungan struktur-fungsi dan mekanisme evolusi protein (Griswold et al 2005;. Peisajovich et al. 2006). Ketika dikombinasikan dengan skrining genetik atau teknik pilihan, dapat digunakan untuk memperoleh wawasan baru ke dalam enzim. Untuk membuat perpustakaan beberapa crossover, Benkovic dan rekan kerja menggabungkan ITCHY dan DNA shuffling secara berurutan dalam metode ini disebut “SCRATCHY" (Lutz et al 2001b).

7. Homologi Urutan Independen Protein (SHIPREC)
Sieber dan rekan kerja mengembangkan teknik yang berbeda untuk menciptakan crossover satu perpustakaan chimeric antara dua gen parental tanpa bias untuk posisi crossover (Sieber et al. 2001). Metode rekombinasi homologi urutan independen protein atau Sequence Homology Independent Protein Recombination(SHIPREC), dimulai dengan produksi suatu dimer gen yang kemudian terpecah-pecah oleh DNaseI. Fragment ukuran orangtua dipulihkan dan dibalikkan oleh ligasi melingkar dan restriction menghancurkan untuk menghasilkan sebuah perpustakaan enzim hibrida dengan distribusi yang merata dari posisi crossover.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 65

8. EXON Shuffling
In vitro exon shuffling merupakan exon domain encoding atau set dari exon pada target gen dan homolog dari yang lainnya. Gen yang berhubungan diamplifikasi menggunakan chimeric oligonukleotide pada primer dan template pada reaksi seperti PCR yang menyusun kembali Gen dengan panjang penuh. Step terakhir melibatkan penyaringan Pustaka Exon shuffling untuk fungsi atau property yang diinginkan. Teknik ini dikembangkan oleh Joost A Kolkman dan Willem P.C. Stemmer, 2001.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 66

METODE REKOMBINASI NON HOMOLOG
Sebagaimana dibahas, Keterbatasan utama metode rekombinasi homolog adalah hanya gen dengan homologi tinggi yang dapat dikombinasikan. Seringkali kelompok protein membagi struktur tiga-dimensi yang sama, tetapi urutan DNA identitasnya rendah. Rekombinasi seperti kelompok protein dengan metode rekombinasi homolog akan bahwa

menghasilkan sebuah perpustakaan di mana posisi crossover akan berbaring secara eksklusif pada daerah kecil susunan DNA dengan homologi tinggi. Sebaliknya, metode rekombinasi non homolog tidak bergantung pada urutan homologi gen orang tua karena tidak melakukan hibridisasi fragmen homolog , melainkan membuat langkah

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 67

ligasi berujung tumpul (blunt-ended) yang digunakan untuk membawa gen fragmen bersama. Akibatnya, tidak ada bias terhadap komposisi fragmen gen ditemui. Dengan metode rekombinasi nonhomolog, memungkinkan untuk membuat perpustakaan chimeras dari dua gen yang sepenuhnya tidak berhubungan. Sebagian besar metode rekombinasi nonhomolog didasarkan pada pemotongan inkremental, dalam bentuk yang paling sederhana menunjukkan penciptaan perpustakaan protein yang memiliki satu atau lebih asam amino , dihapus baik dari C-atau N-terminus . (Ostermeier et al 1999a). Pemotongan Tambahan dan metode terkait tergantung pada

exonuclease III (ExoIII) protein dan sifat-sifatnya. ExoIII mengkatalisis pencernaan fragmen gen dari 3 'ke ujung 5' pada dikontrol, seragam, dan sinkron tingkat (Wu et al 1976). basa DNA yang dihapus. Aliquots Kecil campuran reaksi dihapus selama langkah pencernaan untuk membuat perpustakaan gen dengan nomor yang berbeda dari pasangan

APLIKASI METODE REKOMBINASI
o

Rancangan rekombinan Hemoglobin manusia digunakan untuk menentukan pengganti

darah. Dilakukan oleh Looker D, Abbott-Brown D, Cozart P, Durfee S, Hoffman S, Mathews AJ,
Miller-Roehrich J, Shoemaker S, Trimble S, Fermi G, et al Nature 356:258-60 , (1992)
o

Efek Penanaman allosterik unik dari buaya kepada hemoglobin manusia, Komiyama NH,

Miyazaki G, Tame J, Nagai K Nature 373:244-6 (1995)
o

Merekayasa mutan HGF/SF dengan ikatan yang dikurangi untuk heparin sulfat proteoglikan

dan meningkatkan aktifitas in vivo. Dilakukan oleh Hartmann G., Prospero T., Brinkmann V., Ozcelik O., Winter G., Hepple J., Batley S., Bladt F., Sachs M.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 68

APLIKASI DESAIN RASIONAL EVOLUSI YANG DIARAHKAN(DIRECT EVOLUTION)
Meningkatkan enzim fitness untuk aplikasi yang ditentukan Enzyme adaptasi: • Meningkatkan aktifitas Substrat Baru • Substrate specificitas -- Multiple substrates affinity • Thermostabilitas-- melting point (Tm)
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 69

• Adaptasi Temperatur: Activitas pada suhu yang berbeda -- Psychrophilic vs. Mesophilic vs. Thermophilic • Stabilitas atau aktifitas pada linkungan artificial/buatan -- Solvent vs. aqueous solutions -- Metal ions (protease) • Antibiotic resistansi Kiri : Librari generasi mutan acak enzim TEM-1 menggunakan P dan 8 -oxoG mutagenesis Kanan: A-TEM 1 mutan (3D.5) yang dihasilkan oleh random mutagenesis dengan 2.500 kali lipat Aktivitas hidrolisis yang lebih tinggi terhadap antibiotic sefalosporin (dari Zaccolo dan Gherardi, J mol Biol 1999).

Contoh Studi evolusi yang diarahkan pada adaptasi temparartur Enzim Psikrofilik (Kentara Miyazaki, Patrick Wintrode, Rowan Grayling, Donn Rubingh, Frances Arnold, 2000)
-

Susunan Asam amino Alignment pada Subtilisin S41(Davail, et.al 1992), S39 (Narinx,

1992), SSII (Wati,1997), BPN (Wells, 1983), E (Stahl Ferrari ,84’),Carlsberg (Jacobs,85’)
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 70

dan Termitase (Meloun, 85’). Alignmen multiple dilakukan dengan CLUSTAK W (Thompson,94’). Residu ditemukan frekuen >50% . Mutasi pada 3-2G7.
-

Lineage substilisin varian S41. Varian generasi pertama yang didapat sebelumnya. Generasi pertama direkombinasikan

(Miyazaki&Arnold, 1999). Tujuh mutasi didapat dari

oleh StEO dan varian terbaik, 2-6C5 didapat pada generasi Pustaka kedua. Diparentkan /dihubungkan dengan gen orangtua untuk menciptakan generasi pustaka ketiga oleh PCR Error prone. Hanya nonsinonim mutasi ditunjukkan.
-

Subtilisin dari struktur yang diketahui.

Tujuh mutasi termostabil diidentifikasi padad

varian 3-2G7. Kalsium Ca hitam menindikate site ikatan Ca2+ yang ketat dan indikate Ca abu abu site mengikat Ca2+ yang lemah, yang dilokasikan dibelakang loop yang mengandung Ser175 Model diciptakan menggunakan MOLSCRIPT (Kraulis, 1991). Dependasi Temperatur aktifitas spesifik subtilisin S41, 3-2G7, dan SS11.
-

Bagaimana Enzim beradaptasi dilihat dari studi evolusi yang diarahkan :

Divergent

evolution leads untuk Adaptasi pada lingkungan yang berbeda , Sebuah trade off antara aktivitas katalitik pada suhu dan thermostabililt rendah. (Miyazaki, Wintrode)
-

Rekayasa Stabilitas Enzim – T4 lisozie dengan introduksi pada Ikatan S-2 (Matsumura) Rekayasa Stabilitas Enzim – Triosephospate isomerase dari Yeast dengan

menggantikan Asn (deaminasi pada temperatur tinggi) , Ahern et.al. Stabilita Enzim diekspresikan sebagai half-life, atau laju inaktivasi enzim pada 100oC. Half life yang lebih lama menunjukkan enzim yang lebih stabil.
-

Rekayasa Aktifitas Enzim – Tyrosyl-tRNA synthetase dari B. Stearothermophilus dengan

menggantikan Thr 51 (meningkatkan affinitas ATP), Wilkinson et.al. Rekayasa pengaruh Ca/ Calsium – untuk menganalisa independensi Subtilisin.

Saturasi mutagenesi , menghasilkan 7 dari 10 daerah ditemukan untuk memberikan peningkatan stabilitas. Mutan yang dihasilkan 10x lebih stabil daripada enzim asli dalam ketiadaan Calsium. Dan 50% lebih stabil daripada enzim asli dengan adanya Calsium.
-

Mengurangi Sensitifitas Protein dengan Streptococcus streptokinase, 47 kDa protein Plasmin juga menurunkan streptokinase [feedback

yang melarutkan clot darah. Komplex dengan plasminogen untuk merubah ke plasmin, yang menurunkan serat pada clot, loop]. Membutuhkan administer streptokinase pada 30-90 min infusi[heart attacks]. Longlived streptokinase diadministered sebagai single injection.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 71

-

Studi kestabilan temperature protein protein mutan dan bagaimana evolusi yang

diarahkan terhadap produk gen B .subtilis pada Termofile b. Stearothermophilus.

PERBEDAAN DESAIN RASIONAL vs DIRECT EVOLUSI
DESAIN RASIONAL SITE DIRECTED MUTAGENESIS Titik mutasi yang tepat dilakukan pada area tertentu dapat diketahui karena penggunaan oligonukleotida yang sangat diperlukan selama protocol langkah amplifikasi PCR . Hasilnya berupa Library/pustaka dari : Wild-type dan Mutasi DNA (spesifik site) (Library yang terdiri dari hanya 2 species) Mutasi dsDNA plasmid dapat dirancang, dimana protokolnya tergantung pada penggunaan ssDNA dengan usaha intensif. Problem : Perubahan suatu sifat tertentu akan mengganggu karakteristik lainnya Problem : Library yang terdiri dari banyak varians sehingga memerlukan proses Seleksi atau screening DIRECT EVOLUSI RANDOM MUTAGENESIS Titik mutasi dilakukan pada semua area pada daerah Interest DNA karena tidak diketahui secara tepat titik yang diinginkan. Hasilnya berupa Library/pustaka dari : Wild-type dan Mutasi DNA (random)

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 72

Langkah langkah proses yang terkait :

Langkah langkah proses yang terkait :

TEKNIK DIRECT EVOLUSI DENGAN METODE MUTASI KIMIA POST TRANSLASI

Glycosylation

PEGylation as a Mimic of Glycosylation

Lipidation

1 Thiol Tag (X: –SH) 2 Amine Tag (X: –NH2) 3 Carbonyl Tag (X: –C=O) 4 Olefin Tag (X: –=) 5 Azide Tag (X: –N3) 6 Alkyne Tag (X: –≡) .

1 Amine Tag (X: –NH2) 2 Azide Tag (X: –N3) 3 NCL Assembly 4 Hydroxyl Tag (X: –OH) 5 Thial Tag (X: –SH) 6 Disulfide Tag (X: –SS

1 NCL Assembly 2 Hydroxyl Tag (X: –OH) 3 Thiol Tag (X: –SH) 4 Olefins (X: –=)

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 73

Modifikasi bentuk kualitatif kimia , misalnya, biotinylation untuk tag afinitas, fluoresensi label untuk visualisasi, sering mengabaikan isu-isu strategis utama . Tingkat Konversi - beberapa modifikasi metode kimia protein yang dipakai sekarang telah dioptimalkan untuk tingkat yang memungkinkan konversi lengkap. Partial konversi menciptakan kembali kebutuhan untuk pemurnian dimodifikasi dari yang tidak dimodifikasi. Selektivitas - metode yang dirancang untuk selektifitas kimia jarang dilakukan dalam konteks protein, yang seringkali mengandung banyak kelompok fungsional sebagai potensial, kompetitif, reaktif partner.

METODE GLYCOSYLASI
Teknologi dengan cara: - Menghilangkan atau menambahkan daerah Glycosylation - Merubah sifat biokimia atau aktifitas Protein - Meningkatkan kestabilan protein Dilakukan dengan cara merubah Daerah Glycosylation:
-

Menggunakan

teknik

Mutagenesis

Site-Directed

untuk

menetapkan

Daerah

glycosylation yang baru. Sebagai contoh Erythropoietin Hubungan direct/langsung antara Karbohidrat yang mengandung Asam Sialik dan serum half-life nya dan aktifitas biologi in vivo.
-

Hubungan Inverse/berlawanan antara ikatan Reseptor (contoh: Glikosilasi yang lebih banyak menyebabkan lemahnya ikatan).

Glycan dimulai dari penggabungan daerah baru yang untuk kebutuhan target sintesis reagen glycan kompleks dengan strategi untuk memulai situs-selektif. Meskipun peran glycans tersebar luas dalam fungsi protein, dia hanya muncul pada kasuskasus dasar. Metode untuk mengakses glycoforms murni atau meniru nya, saat ini mulai memainkan peranan kritis dalam aspek unpicking yang tepat untuk fungsi glycan.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 74

Aplikasi Metode Glikosilasi misalnya pada
-

Treatwal awal Pengobatan Anemia •Hypothesis : Glycosylation yang lebih banyak menyebabkan: ‐‐> half life yang lebih panjang ‐‐> Lebih aktif ‐‐> mengurangi afinitas ikatan

Produk pemrosesan : HyperglycosylatedEPO (Aranesp) Hasil In vivo : Tidak adanya kehilangan pada fungsi obat Penambahan serum half‐life (3‐fold lebih panjang) Mengurangi frekuensi administrasi

-

Modification of a protein with a generic 2-methoxy-2-imino activated monosaccharide.

a four equivalents of sodium methoxide; b pH 9.5, 2 h, 41 of 59 residues modified. BSA bovine serum albumin Amine Tag (X: –NH2)

-

Modifikasi HAS menggunakan couling mediasi square. Modifikasi ketone handle dimasukkan pada Z-domain protein Stapilococal dengan fungsionalsiasi Oksamine N Asetilglukosamine.

METODE PEGILASI

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 75

- PEGylation (monomethoxypolyethyleneglycol) - Kovalen lampiran polimer, poli (ethylene glycol) (PEG) secara khusus, untuk protein

terapeutik adalah metode mapan (Harrisdan Catur 2003).
- Metode ini digunakan untuk meniru

beberapa efek alam glikosilasi dalam rangka

meningkatkan perlindungan protein terhadap degradasi enzimatik, memperpanjang sirkulasi setengah hidup dan meningkatkan daya larut.
- Prinsip Metode ini serupa dengan Glycosylation.

Aplikasi pada Protein Drugs menghasilkan : Secara relatih memiliki half-lives yang singkat Distribusi tissue/jaringan yang lebar Potensial untuk Immunogenicity

Hingga saat ini enam protein pegylated telah disetujui oleh Food dan Obat-obatan, dan lebih dari selusin sedang dalam tahap pengembangan klinis, sehingga menggambarkan pentingnya mereka dalam rekayasa fungsional terapeutik protein (Kochendoerfer 2003, 2005; Veronese dan Pasut 2005). Berbagai metode pegilasi kimia telah dikembangkan, sebagian besar berdasarkan

pengaktifan polimer PEG dengan fungsi aldehida (untuk ligasi oleh reduktif amination dengan kelompok amino pada protein), sebuah kelompok hidroksil diaktifkan (Tresyl atau tosyl), ester aktif succinimidyl, atau karbonat diaktifkan (succinimidyl karbonat imidazoyl formate, karbonat fenil); Metode ini biasanya kekurangan situs-selektivitas, seperti halnya untuk ligasi ke grup amino (kelompok α-amino dan ε-amino lysines, N-terminus) menggunakan karbonat aktif dan ester, aldehida atau tresylates; modifikasi sembarangan berasal dari metode ini membuat batch-tobatch reproduktibilitas yang lebih rumit. Tipe dominan : myristoylation, prenylation dan palmitoylation.

Penerapan metode kimia untuk menyelidiki perannya dalam modulasi fungsi protein.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 76

Protein prenylation di alam mengacu pada lampiran pasca-translasi baik farnesyl (C-15) atau geranylgeranyl (C-20) rantai lipid untuk sistein di urutan tertentu pada tulang punggung protein (Eastman et al ;. McTaggart 2006) dekat (dan setelah lebih lanjut dimodifikasi pada) C-terminal dari protein. Proses ini dikatalis oleh tiga enzim berbeda: farnesyltransferase protein dan protein geranylgeranyltransferase tipe I dan II. Prenylation memiliki efek dramatis pada lipophilicity target protein, membantu membran menahan protein, contoh keluarga kecil Ras G-protein, membentuk kompleks dengan protein pendampingnya, REP, dan selanjutnya terprenilasi (Rak et al 2004). Ramamurthy et al 2003), membuat studi rasional prenylation target yang menarik. Dalam kasus protein Ras, yang telah terlibat dalam ketidakpekaan untuk apoptosis sel baris kanker tertentu, farnesylation dan membran sangat penting untuk fungsi target berikutnya (Cohen et al 2.000). Ditemukan bahwa inhibisi dari Ras-farnesyltransferase nuklir menekan ekspresi gen faktor-κB diatur (Takada et al 2004). Farnesylation Protein dan geranylgeranylation memainkan peran dalam penyakit asasi tertentu, seperti osteoporosis, penghambatan geranylgeranylation mencegah pembentukan dan fungsi normal dari osteoklas, sel-sel yang terlibat dalam penghancuran jaringan tulang (Van Beek et al 1999;. Woo et al.2005), dan dalam progeria Hutchinson-Gilford, penyakit dimana pasien mengalami penuaan yang cepat (Meta et al 2006)..

METODE LIPIDASI
Tipe dominan : myristoylation, prenylation dan palmitoylation. Menerapkan metode kimia untuk menyelidiki perannya dalam modulasi fungsi protein. Protein prenylation di alam mengacu pada lampiran pasca-translasi baik farnesyl (C-15) atau geranylgeranyl (C-20) rantai lipid untuk sistein di urutan tertentu pada tulang punggung protein (Eastman et al ;. McTaggart 2006) dan setelah lebih lanjut dimodifikasi pada C-terminal protein. Proses ini dikatalis oleh tiga enzim berbeda: farnesyltransferase protein dan protein geranylgeranyltransferase tipe I dan II. Prenylation memiliki efek dramatis pada lipophilicity target protein, membantu membran menahan protein, contoh keluarga kecil Ras G-protein, membentuk kompleks dengan protein pendampingnya, REP, dan selanjutnya terprenilasi (Rak et al 2004). Ramamurthy et al 2003), membuat studi rasional prenylation target yang menarik. Dalam kasus protein Ras, yang telah terlibat dalam ketidakpekaan untuk apoptosis sel baris kanker tertentu, farnesylation dan membran sangat penting untuk fungsi target berikutnya (Cohen et al 2.000).
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 77

Ditemukan bahwa inhibisi dari Ras-farnesyltransferase nuklir menekan ekspresi gen faktor-κB diatur (Takada et al 2004). Farnesylation Protein dan geranylgeranylation memainkan peran dalam penyakit asasi tertentu, seperti osteoporosis, penghambatan geranylgeranylation mencegah pembentukan dan fungsi normal dari osteoklas, sel-sel yang terlibat dalam penghancuran jaringan tulang (Van Beek et al 1999;. Woo et al.2005), dan dalam progeria Hutchinson-Gilford, penyakit dimana pasien mengalami penuaan yang cepat (Meta et al 2006)..

Aplikasi Aktual Metode Lipidasi :
-

Modifikasi residu tyrosine dengan farnesyl atau rhodamine oleh palladiummediated.; π-allyl coupling allyl asetate atau carbamate precursor. Kondisi adalah a Pd(OAc)2, Triphenyl phosphine trisulfonate (TPPTS), H2O/dimethyl sulfoxide, pH 8.5– 9.0 .

-

Reaksi Karbenoid dengan tryptophan sebagai tag aromatic. Walaupun tidak selective, reaksi memaparkan tipe reaksi baru yang berguna untuk modifikasi protein.

TEKNIK FUSION PROTEIN/PENGGABUNGAN PROTEIN
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 78

Teknik ini adalah rekayasa protein baru / nobel dengan menggabungkan atau menyatukan susunan protein protein berkode pada satu gen terhadap susunan protein berkodekan gen yang berbeda. Contoh yang ada adalah penggunaan An untuk meracuni langsung daerah target. Seperti Denileukin diftitox (Ontax) – yaitu terapi yang disetujui FDA untuk Kanker, dengan hasil 30% pasien menglami pengurangan pembesaran tumor sebesar 50%. Ontak berasal dari Fusion Protein : IL‐2 + diptheria toxix dan aa 2nd‐133 human IL‐2 +1st‐389 aa of diptheria toxintargets IL‐2 receptors pada CTCLs untuk membunuh mereka Denileukin diftitox (Ontak) telah disetujui FDA pada terapi kanker Ontak mengikat permukaan sel lymphoma melalui reseptor IL‐2 Saat Internalisasi, diptheria toxin membunuh sel sel.

Netral drift adalah dan / atau protein.

perubahan urutan yang terjadi di bawah rezim-rezim nonadaptive

(memurnikan pilihan) dengan tetap mempertahankan struktur asli dan fungsi organisme,

Drifts netral yang dipercepat : terdiri putaran iteratif in vitro mutagenesis acak dengan harga relatif tinggi (~ 2 mutasi per gen per putaran) dan seleksi protein varian yang mempertahankan aktivitas asli protein dan tingkat ekspresi. SeleKsi Pemurnikan : mutasi penghapusan merugikan atau berbahaya (atau alel) dalam populasi atau suatu perpustakaan gen bawah nonadaptive evolusi, yaitu dengan tetap menjaga struktur asli dan fungsi organisme dan / atau protein. Sebuah sinonim istilah seleksi negatif. Seleksi Positif (atau adaptif): fiksasi alel mutasi menguntungkan atau di penduduk di bawah keadaan berubah, misalnya, pemilihan mutasi yang memberkati enzim dengan fungsi baru.

APLIKASI REKAYASA PROTEIN DENGAN FUSION PROTEIN
Fusion protein terdiri dari dua sekuens gen yang diligasikan bersama-sama dan tercantum sebagai molekul tunggal. Satu urutan mengkodekan untuk tag "," yang memiliki afinitas yang kuat untuk ligan yang diketahui. Urutan lain untuk mengkodekan molekul target molekul selama penyaringan, pemurnian atau studi interaksi. Peneliti melihat plasmid vektor untuk mengungkapkan protein fusi, mereka membutuhkan yang diinginkan. Tag tersebut kemudian digunakan sebagai pegangan untuk memanipulasi target

metode dan alat untuk penyaringan dan pemurnian populasi yang dihasilkan.
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 79

Teknik teknik line komprehensif yang dibutuhkan untuk skrining, mendeteksi dan pemurnikan yang saat ini paling sering digunakan yaitu tagged protein - glutathione S transferase (GST), protein pengikat maltosa (MBP) dan polyhistidine. Garis lengkap produk untuk biotinylated protein juga termasuk bagian protein fusi yang mungkin diakses oleh tag. Reaksi pengikatan plates terlapist (precoated dengan target ligan yang diinginkan) yaitu:
• Glutathione untuk GST • Dekstrin untuk MBP • Ni +2 atau Co 2 chelated untuk 6xHis tag • NeutrAvidin Protein pengikat Biotin, Avidin dan Streptavidin untuk Biotin • Resin Pra-pengendapan SwellGel pada filterplates untuk kapasitas tinggi-melalui

pemurnian lebih tinggi
• Poppers lisis Cell dan Reagen Ekstraksi dan Kits

Setelah kehadiran molekul target yang diinginkan diverifikasi, B-PER Reagen/ Pereaksi Ekstraksi Bakteri Protein dan Y-PER Pereaksi Ekstraksi Yeast Protein Pereaksi menyediakan cara mudah pemurnian yang efisien. Teknik ini mencakup semua yang diperlukan untuk memurnikan molekul target, dari buffer lisis pada kolom afinitas untuk buffer elusi. B-PER Reagent dipatenkan, ringan dan nonionic deterjen yang memfasilitasi ekstraksi sederhana dan cepat dari target pada kondisi larut dan tidak larut. Y-Pereaksi PER adalah deterjen nonionic ringan yang memungkinkan 100% lebih ekstraksi dari sel ragi dari manik-manik kaca. Teknik B-PER dan Y-PER dapat digunakan untuk ekstraksi protein rekombinan larut dan pemurnian inklusi protein terlarut.

Aplikasi alat untuk penyaringan dan pemurnian protein fusi, untuk mengetahui interaksi protein dengan menggunakan teknik pendekatan Fusi protein: Protein ekstraseluler  Tahapan isolasi
 Sentrifugasi cairan sel/ medium kultur ⇒ menghasilkan :  Supernatan (crude extract)

 Pelet (sel & komponen non-protein)

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 80

-

Protein intraseluler  Tahapan isolasi :  Cuci jaringan/ sel dengan bufer salin : untuk menghilangkan pengotor/ bahan ekstraseluler  Sel mikroba : sentrifugasi & resuspensi dalam bufer
 Lisis sel ⇒ memecah/membuka sel ⇒ ekstrak : homogenat  Menggunakan

mortar/pestle, homogenizer, sonicator, tissue

grinder, cell disruptor, blender
 Menghasilkan : homogenat  Sentrifugasi ⇒ menghasilkan :  pelet (mengandung protein membran) 

supernatan (crude extract)

Klasifikasi Metode Isolasi Protein berdasarkan Jenis Jaringan Protein

Tujuan dari Pemisahan Protein adalah
  

Mendapatkan kemurnian protein, Penggunaan bentuk aktif Mendapatkan jumlah langkah minimum

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 81

Memungkinkan pemrosesan dengan waktu yang singkat

Metode Pemisahan Protein adalah

TEKNIK PEMISAHAN METODE KROMATOGRAFI
 Protein protein membedakan bentuk dan charge

Kromatografi gel filtrasi. Campuran protein dalam volume kecil diterapkan pada kolom yang diisi dengan manikmanik berpori. Karena protein yang besar tidak bisa masuk volume internal manik-manik, mereka muncul lebih cepat daripada yang kecil.

TEKNIK PEMISAHAN KELARUTAN / SOLUBILITAS

 Metode Penggaraman/Salting out Kelarutan sensitif terhadap kekuatan ion. Awal "salting in" dan kemudian "salting out" pada kadar garam tinggi. Pelarut terikat dengan berinteraksi pada garam sehingga tidak cukup untuk melarutkan protein.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 82

Kadar garam maksimal pada target protein larut, sentrifuge dan membuang pelet. Tambahkan cukup garam untuk menurunkan protein. Kumpulkan pelet.  Pelarut organik Mempunyai prinsip sama dengan penggaram; mengambil keuntungan dari kelarutan yang berbeda. Menghindari total protein denaturasi.  pH Protein memiliki kelompok berionisasi berrentang pKs. Ketika muatan total protein nol (titik isoelektrik/pI). Protein paling larut pada pl karena interaksi mereka untuk meminimalkan muatan muatan.
 Kristalisasi

Metode kelarutan dimana protein adalah ppt dapat digunakan untuk menumbuhkan kristal protein. Terjadi ketika protein relatif murni.  Ketika konsentrasi garam yang tinggi hadir, protein cenderung terkumpul dan mengendap keluar dari solusi: "salting out / penggaraman keluar"
 Endapan protein yang berbeda pada konsentrasi garam berbeda. pH, suhu dan

kemurnian protein memainkan peran menentukan titik salting out.  Amonium sulfat adalah garam yang dipilih karena menggabungkan banyak fitur yang berguna:  Efektifitas penggaraman / Salting out  pH versalitas  Kelarutan tinggi  Larrutan dengan temperature panas  Harga yang rendah
 Amonium sulfat konsentrasi: persentasi kejenuhan

 Persamaan sederhana untuk perhitungan gram amonium sulfat yang dibutuhkan untuk membuat suatu solusi X% dari% Xo:
 

515 (X-Xo) G=------------------------100-0,27X

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 83

TEKNIK PEMISAHAN ION EXCHANGE KROMATOGRAFI
 Anion and Cation

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 84

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 85

TEKNIK PEMISAHAN GEL FILTRASI (EKSLUSI SIZE)
Memisahkan berdasarkan ukuran

Porous beads yang terbuat dari material yang berbeda. Ukuran pores dapat dikontrol.
 Molekul kecil cukup mudah untuk melalui beads yang lebih besar ukurannya dan

berkeliling kemudian mengalir lebih cepat. Pengecualian pada semua protein yang terlalu besar untuk melalui pores.  Dapat digunakan sebagai metode preparasi atau digunakan untuk menentukan

ukuran molekul.  Gels terbuat dari deekstran, agarose or polyacrylamide

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 86

TEKNIK PEMISAHAN METODE AFINITAS
 

Affinitas terhadap ligands Rekayasa afinitas sites, e.g. histidine tag

Ligan yang memiliki ikatan kuat terhadap protein ditempatkan pada matriks :
-

Protein dengan ikatan yang diinginkan tetapi yang lain dapat melalui. Elute menggunakan larutan ligan. Selain molekul kecil, juga dapat menggunakan antibody Kemajuan dalam biologi molekuler memerlukan rekayasa kelompok poli-nya yang mengikat pada Ni atau menggunakan bagian dari protein lain dan kolom yang mengikat ke protein lain.

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 87

TEKNIK ISOLASI PROTEIN DAN VISUALISASI PROTEIN
-

Protein bermigrasi pada medan listrik pada tingkat yang tergantung pada muatan total,

ukuran, dan bentuk
-

Elektroforesis gel merupakan teknik pemisahan oleh muatan (pemisahan dalam media

sebagai gels) pada media Gel berpori (pati / poliakrilamida): gel & pewarnaan
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 88

-

Fokus isoelektrik *: protein dipisahkan dalam gel gradien pH berkelanjutan, protein

berpindah ke titik pada gel yang sama untuk pl nya, yaitu tak ada muatan.
-

SDS-PAGE *: Sodium Dodecil Sulfat - elektroforesis gel poliakrilamida yang

memperlakukan protein dengan deterjen ionik yang memisahkan berdasarkan ukuran SDS mengikat protein protein. @ 1 SDS / 2 aa's sehingga proporsional terhadap massa jenis

IDENTIFIKASI PROTEIN DAN QUANTIFIKASI
 Identification – biasa dilakukan dengan spectrophotometry

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 89

Spectrophotometers mengukur intensitas cahaya beam sebelum dan sesudah cahaya melewati larutan solvent dengan sampel terlarut padanya (in a cuvette). Membandingkan intensitas dua cahaya terhadaap panjang gelombang yanG dilewati. • Percent transmittance Rasio dari intensitas cahaya melewati sampel terhadap intensitas cahaya yang bersinar pada sampel dikalikan 100%. Absorbance adalah logaritma transmittan. Menggunakan instrument Spectronic 20 spectrofotometer UV/ Vis.

TEKNIK DETEKSI PROTEIN - METODE SPEKTROFOTOMETRI
 UV absorbansi pada 280 nm. (pengukuran aromatik aa's)

Reaksi Kolorimetri – Dye berwarna mengikar untuk asam amino
 Reaksi

Ninhydrin Biuret test

=

rx's mg

w

amino quantities,

=

blue =

color

(10-9 ion violet

M) Copper color

berdasarkan

pada

mengikat

stiochiometrically

Bradford test = ug amounts berdasarkan dye Coomassie blue – mengikat peptide, Fluoroescamine dye = pg quantities... (10-12 M)
 Quantifikasi jumlah protein ditampilkan berdasarkan hukum BEER-LAMBERT linear

relationship antara. Light Absorbance vs. Conc  Protein Standard Curve

Quantifikasi Konsentrasi Protein dengan Aktifitas ENZYME
Berkaitan jumlah protein &aktivitas enzim 1 (internasional) UNIT KEGIATAN Enzim jumlah protein yang mengubah 1 micromole dari Substrate ke produk per menit pada 250C pada pH yang optimal UREASE 1 unit (IU) akan membebaskan 1,0 μmole amonia dari

urea per menit pada pH 7,0 pada suhu 25 ° C [Equivalent untuk 1.0 I.U.] 1UNIT KEGIATAN KHUSUS

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 90

jumlah micromoles dikonversi per min per mg protein yaitu, Unit (seperti di atas) aktivitas enzim per mg protein 1 UNIT KEGIATAN MOLEKUL jumlah unit aktivitas enzim per μmole

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 91

Selain dari teknik teknik yang dijelaskan diatas, dalam pengembangannya banyak sekali teknik teknik yang digunakan dalam rekayasa protein ini diantaranya : QUANTITASI PROTEIN :
• • • • • • • • • Penentuan Protein dengan UV Absorption Lowry Method Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Bradford Method Penentuan Ultrafast Protein menggunakan Microwave Enhancement Metode Nitric Acid untuk Estimasi Protein pada Biological Samples Quantitasi Tryptophan pada Proteins Quantitasi Flow Cytometric dari Cellular Proteins Kinetic Silver Pewarnaan Proteins

ELECTROPHORESIS OF PROTEINS DAN PEPTIDES DAN DETEkKSI PADA GELS
• • • • • • • • • • Nondenaturing Polyacrylamide Gel Electrophoresis Proteins SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis Proteins Gradient SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis Proteins SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis Peptides Identifikasi Nucleic Acid Ikatan Proteins Menggunakang Nondenaturing Sodium Decyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDecS-Page) Cetyltrimethylammonium Bromide Discontinuous Gel Electrophoresis Proteins: Pemisahan MrBased Proteins dengan aktifitas native Retained Acetic–Acid–Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Basic Proteins Acid–Urea–Triton Polyacrylamide Gel Electrophoresis Histones Isoelectric Focusing of Proteins pada Ultra-Thin Polyacrylamide Gels Protein Solubility pada dua-Dimensi Electrophoresis:

Basic Principles and Issues
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • Preparasi Protein Sample dari jaringan Mouse dan Human untuk 2-D Electrophoresis Radiolabel Eukaryotic Sells dan Persiapan Subsequent untuk 2-D Electrophoresis Dua-Dimensi Polyacrylamide Gel Electrophoresis menggunakan Pembawa Ampholyte pH Gradients pada dimensi pertama Casting Immobilized pH Gradients (IPGs) Nonequilibrium pH Gel Electrophoresis (NEPHGE) Difference Gel Electrophoresis Pembandingan 2-D Electrophoretic Gels terhadap database internet Immunoblotting 2-D Electrophoresis Separated Proteins Quantifikasi Radiolabeled Proteins pada Polyacrylamide Gels Quantification Proteins pada Polyacrylamide Gels Pewarnaan cepat dan sensitive untukf Unfixed Proteins in Polyacrylamide Gels dengan Nile Red Teknik Pewarnaan Zinc-Reverse Pewarnaan Protein dengan Calconcarboxylic Acid in Polyacrylamide Gels Deteksi Proteins pada Polyacrylamide Gels dengan Pewarnaan Silver Background-Free Protein Detection pada Polyacrylamide Gels dan pada Electroblots menggunakan Pewarnaan Transisi Logam Metal Chelate Deteksi Proteins pada Polyacrylamide Gels dengan Pewarnaan Fluorescent Detection Proteins dan Sialoglycoproteins pada Polyacrylamide Gels Using Eosin Y Stain Electroelution Proteins dariPolyacrylamide Gels Autoradiography dan Fluorography Acrylamide Gels

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 92

BLOTTING DAN METODE DETEKSI
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Protein Blotting by Electroblotting Protein Blotting by the Semidry Method Protein Blotting by the Capillary Method Protein Blotting of Basic Proteins Resolved on Acid-Urea-Trinton-Polyacrylamide Gels Alkaline Phosphatase Labeling of IgG Antibody ®-Galactosidase Labeling of IgG Antibody Horseradish Peroxidase Labeling of IgG Antibody Digoxigenin (DIG) Labeling of IgG Antibody Conjugation of Fluorochromes to Antibodies Coupling of Antibodies with Biotin Preparation of Avidin Conjugates MDPF Staining of Proteins on Western Blots Copper Iodide Staining of Proteins and Its Silver Enhancement Detection of Proteins on Blots Using Direct Blue 71 Protein Staining and Immunodetection Using Immunogold Detection of Polypeptides on Immunoblots Using Enzyme-Conjugated or Radiolabeled Secondary Ligands Utilization of Avidin- or Streptavidin-Biotin as a Highly Sensitive Method to Stain Total Proteins on Membranes Detection of Protein on Western Blots Using Chemifluorescence Quantification of Proteins on Western Blots using ECL Reutilization of Western Blots After Chemiluminescent Detection or Autoradiography

CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS AND PEPTIDE PRODUCTION AND PURIFICATION
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Carboxymethylation of Cysteine Using Iodoacetamide/Iodoacetic Acid Performic Acid Oxidation Succinylation of Proteins Pyridylethylation of Cysteine Residues Contents Side Chain Selective Chemical Modifications of Proteins Nitration of Tyrosines Ethoxyformylation of Histidine Modification of Arginine Side Chains with p-Hydroxyphenylglyoxal Amidation of Carboxyl Groups Amidination of Lysine Side Chains Modification of Tryptophan with 2-Hydroxy-5-Nitrobenzylbromide Modification of Sulfhydryl Groups with DTNB Chemical Cleavage of Proteins at Methionyl-X Peptide Bonds Chemical Cleavage of Proteins at Tryptophanyl-X Peptide Bonds Chemical Cleavage of Proteins at Aspartyl-X Peptide Bonds Chemical Cleavage of Proteins at Cysteinyl-X Peptide Bonds Chemical Cleavage of Proteins at Asparaginyl-Glycyl Peptide Bonds Enzymatic Digestion of Proteins in Solution and in SDS Polyacrylamide Gels Enzymatic Digestion of Membrane-Bound Proteins for Peptide Mapping and Internal Sequence Analysis Reverse Phase HPLC Separation of Enzymatic Digests of Proteins

PROTEIN/PEPTIDE CHARACTERIZATION
Peptide Mapping by Two-Dimensional Thin-Layer Electrophoresis–Thin-Layer Chromatography Peptide Mapping by Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis Peptide Mapping by High-Performance Liquid Chromatography Page 93

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

Production of Protein Hydrolysates Using Enzymes Amino Acid Analysis by Precolumn Derivatization with 1-Fluoro-2,4- Dinitrophenyl-5-L-Alanine Amide (Marfey's Reagent) Molecular Weight Estimation for Native Proteins Using High-Performance Size-Exclusion Chromatography Detection of Disulfide-Linked Peptides by HPLC Detection of Disulfide-Linked Peptides by Mass Spectrometry Diagonal Electrophoresis for Detecting Disulfide Bridges Estimation of Disulfide Bonds Using Ellman's Reagent Quantitation of Cysteine Residues and Disulfide Bonds by Electrophoresis Analyzing Protein Phosphorylation Mass Spectrometric Analysis of Protein Phosphorylation Identification of Proteins Modified by Protein (D-Aspartyl/L-Isoaspartyl) Carboxyl Methyltransferase Analysis of Protein Palmitoylation Incorporation of Radiolabeled Prenyl Alcohols and Their Analogs into Mammalian Cell Proteins: A Useful Tool for Studying Protein Prenylation The Metabolic Labeling and Analysis of Isoprenylated Proteins D Phosphopeptide Mapping Detection and Characterization of Protein Mutations by Mass Spectrometry Peptide Sequencing by Nanoelectrospray Tandem Mass Spectrometry Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry for Protein Identification Using Peptide and Fragmention Masses Protein Ladder Sequencing Sequence Analysis with WinGene/WinPep Isolation of Proteins Cross-linked to DNA by Cisplatin Isolation of Proteins Cross-linked to DNA by Formaldehyde

GLYCOPROTEINS
Detection of Glycoproteins in Gels and Blots Staining of Glycoproteins/Proteoglycans in SDS-Gels Identification of Glycoproteins on Nitrocellulose Membranes Using Lectin Blotting A Lectin-Binding Assay for the Rapid Characterization of the Glycosylation of Purified Glycoproteins Chemical Methods of Analysis of Glycoproteins Monosaccharide Analysis by HPAEC Monosaccharide Analysis by Gas Chromatography (GC) Determination of Monosaccharide Linkage and Substitution Patterns by GC-MS Methylation Analysis Sialic Acid Analysis by HPAEC-PAD Chemical Release of O-Linked Oligosaccharide Chains O-Linked Oligosaccharide Profiling by HPLC O-Linked Oligosaccharide Profiling by HPAEC-PAD Release of N-Linked Oligosaccharide Chains by Hydrazinolysis Enzymatic Release of O- and N-Linked Oligosaccharide Chains N-Linked Oligosaccharide Profiling by HPLC on Porous Graphitized Carbon (PGC) N-Linked Oligosaccharide Profiling by HPAEC-PAD HPAEC-PAD Analysis of Monosaccharides Released by Exoglycosidase Digestion Using the CarboPac MA1 Column Microassay Analyses of Protein Glycosylation Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Fluorophore-Labeled Carbohydrates from Glycoproteins HPLC Analysis of Fluorescently Labeled Glycans Glycoprofiling Purified Glycoproteins Using Surface Plasmon Resonance Sequencing Heparan Sulfate Saccharides Analysis of Glycoprotein Heterogeneity by Capillary Electrophoresisand Mass Spectrometry Page 94

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Affinity Chromatography of Oligosaccharides and Glycopeptides with Immobilized Lectins

ANTIBODY TECHNIQUES
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Antibody Production Production of Antibodies Using Proteins in Gel Bands Raising Highly Specific Polyclonal Antibodies Using Biocompatible Support-Bound Antigens Production of Antisera Using Peptide Conjugates The Chloramine T Method for Radiolabeling Protein The Lactoperoxidase Method for Radiolabeling Protein The Bolton and Hunter Method for Radiolabeling Protein Preparation of 125I Labeled Peptides and Proteins with High Specific Activity Using IODO-GEN Purification and Assessment of Quality of Radioiodinated Protein Purification of IgG by Precipitation with Sodium Sulfate or Ammonium Sulfate Purification of IgG Using Caprylic Acid Purification of IgG Using DEAE-Sepharose Chromatography Purification of IgG Using Ion-Exchange HPLC Purification of IgG by Precipitation with Polyethylene Glycol (PEG) Purification of IgG Using Protein A or Protein G Analysis and Purification of IgG Using Size-Exclusion High Performance Liquid Chromatography (SE-HPLC) Purification of IgG Using Affinity Chromatography on Antigen-Ligand Columns Purification of IgG Using Thiophilic Chromatography Analysis of IgG Fractions by Electrophoresis Purification of Immunoglobulin Y (IgY) from Chicken Eggs Affinity Purification of Immunoglobulins Using Protein A Mimetic (PAM) Detection of Serological Cross-Reactions by Western Cross-Blotting Bacterial Expression, Purification, and Characterization of Single-Chain Antibodies Enzymatic Digestion of Monoclonal Antibodies How to Make Bispecific Antibodies Phage Display: Biopanning on Purified Proteins and Proteins Expressed in Whole Cell Membranes Screening of Phage Displayed Antibody Libraries Antigen Measurements Using ELISA Enhanced Chemiluminescence Immunoassay Immunoprecipitation

MONOCLONAL ANTIBODIES
• • • • • • • Immunogen Preparation and Immunization Procedures for Rats and Mice Hybridoma Production Screening Hybridoma Culture Supernatants Using Solid-Phase Radiobinding Assay Screening Hybridoma Culture Supernatants Using ELISA Growth and Purification of Murine Monoclonal Antibodies Affinity Purification Techniques for Monoclonal Antibodies A Rapid Method for Generating Large Numbers of High-Affinity Monoclonal Antibodies from a Single Mouse

Pada 1980-an, telah menjadi jelas bahwa E. coli tidak dapat digunakan untuk menghasilkan beberapa protein terutama yang membutuhkan modifikasi pasca-translasi untuk aktivitas biologis dan beberapa kompleks protein lain yang mengandung beberapa ikatan disulfida. Selain itu, banyak protein disajikan dalam E. Coli adalah akumulasi intra dalam bentuk larut, inklusi bodies tidak aktif, dari aktivitas biologis yang harus dipulihkan oleh denaturasi rumit
Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI Page 95

dan mahal serta proses refolding. Selama pertengahan 1980-an, kelemahan ini E. coli menyebabkan perkembangan penggunaan sistem ekspresi dengan sel hewan / sel tumbuhan. Namun, meskipun sistem tersebut telah terbukti mampu menghasilkan protein aktif yang otentif, nemun sering ditemui kegagalan untuk mengembangkan metode yang sederhana dan efisien, hasil tinggi, biaya rendah untuk produksi protein dalam jumlah besar. Sebaliknya, baru-baru ini kemajuan dalam protein refolding, translokasi dan peran chaperons molekul dan foldases telah memungkinkan desain strain E. coli rekombinan yang menumpuk protein dalam bentuk terlarut, protein mensekresikan ke periplasm, ekspor ke medium, dan protein langsung ke membran luar sel untuk menampilkan permukaan. Kemajuan ini akan diperkuat lebih lanjut status dominan E. coli sebagai host untuk produksi protein rekombinan.

Keputusan untuk menargetkan ekspresi protein ke kompartemen selular tertentu, yaitu, dengan ruang sitoplasma, ruang periplasmic atau medium, terletak pada keseimbangan keuntungan dan kelemahan dari masing-masing kompartemen (Gambar 2).

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 96

Figure 2. Keuntungan dan Kerugian produksi pretin pada setiap kompartemen Escherichia coli

DAFTAR PUSTAKA
-

-

-

-

-

-

Scott E.E., Paster, E.V., and Olson J.S., The Stabil ities of Mammalian Apomyoglobins Vary Over a 600-Fold Range and Can be Enahanced by Comparative Mutagenesis, J. Biol Chem., 2000 Sep 1;275(35):27129-36. Protein Engineering The Emergence of Protein Engineering Biochem. J. (1987) 246, 117 (Printed in Great Britain) William V. SHAW , Protein engineering The design, synthesis and characterization of factitious proteins ,REVIEW ARTICLE Department of Biochemistry, Unmversity of Leicester, Leicester LEI 7RH, U.K. John S. Olson, PhD; Method Title: Protein Engineering Contact Person or Lab. Silvia Ferrer, Iñaki Tuñón, Vicent Moliner and Ian H Williams J. R. Soc. ,Theoretical sitedirected mutagenesis: Asp168Ala mutant of lactate dehydrogenase Interface 2008 5, 217-224 A. Gururaj Rao* ,The Outlook for Protein Engineering in Crop Improvement , Biophysics and Molecular Biology. Oscar Alvizo, Benjamin D. Allen, and Stephen L. Mayo, Howard Hughes M, Computational protein design promises To revolutionize protein engineering ,Biochemistry and Molecular Biophysics Option, 2. Charlotte A.Dodson1,3, Neil Ferguson1,4, Trevor J.Rutherford1, Christopher M.Johnson1 and Alan R.Fersht1,2,5 Engineering a two-helix bundle protein for folding studies C.Kohrer,U.Rajbhandary,(Protein_Engineering, Springer 2009) John M. Walker, The Protein Protocol Handbook, University of Hertfordshire, Hatfieil UK, Second Edition, Humana Press,2002 Danda Pani Chapagain, Pramod Niraulam, Protein engineering, Animal Biotechnology, SANN College, Gaihridhara Jun 15 2009 (Vol. 29, No. 12)
Page 97

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

-

-

-

-

Nina Flanagan , More Detailed Knowledge of Structure and Function Drives Field Forward Quickly, Feature Article Protein Engineering Reaches New Frontiersm,. Zygmunt S. Derewenda¤ , The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization , Molecular Physiology and Biological Physics, March 2004 Prafulla K. Chandra1* and Stephen K. Wikel1, Analyzing ligation mixtures using a PCR based method , 1Center for Microbial Pathogenesis, MC3710, School of Medicine, University of Connecticut Health Center, 263 Farmington Avenue, Farmington, CT 06030-3710. USA. *Corresponding Author: Prafulla K. Chandra, University of Connecticut Health Center, 263 Farmington Avenue, Farmington, CT 06030-3710. USA. Email: pchandra@uchc.edu Submitted: March 7, 2005; Revised: March 22, 2005; Accepted: May 20, 2005. Nathan S. Mosier, Michael R. Ladisch, MODERN BIOTECHNOLOGY Connecting Innovations in Microbiology and Biochemistry to Engineering Fundamentals, 2009 by John Wiley & Sons, Inc. All rights reserved , Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, Published simultaneously in Canada John M. Walker,METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY™ Protein Engineering Protocols SERIES EDITOR, humana press Katja M. Arndt, Kristian M. Müller, Institut für Protein Engineering Protocols Edited, Biologie III, Universität Freiburg, Freiburg, Germany © 2007 Humana .Press Inc. Yury e. KHUDYAKOV, MEDICINAL PROTEIN ENGINEERING 6000 CRC Press Taylor & Francis Group Broken Sound Parkway NW, Suite 300, Boca Raton, FL 33487-2742 © 2009 by Taylor & Francis Group, LLC Birchmeier C., Birchmeier W., Gherardi E. Current Biology 8, 125-134 (1998) Sergio G Peisajovich & Dan S Tawfik , Protein engineers turned evolutionists

Siti Julaiha/Pasca Sarjana Teknologi Biomedis UI

Page 98

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful