Auriostigue Bautista Juan Carlos

Genero Mycobacterium 5

1896 Lehmann y Neumann primeros en introducir el género en la literatura científica.

Clase Orden Familia Género

Actinomycetes Actinomycetales Mycobacteriaceae Mycobacterium

 Hay más de 100 especies dentro de este género.

 Bacilos delgados, rectos o ligeramente curvos; algunas veces exhiben crecimiento filamentoso.  No formadores de esporas.  No encapsulados.  Aerobios y Mesófilos.  Catalasa positivos.  O/F glucosa: Oxidativos  Inmóviles.

 Son de crecimiento lento: 2-60 días.

Genero Mycobacterium 3,7

Genero Mycobacterium
 Algunas especies son formadoras de pigmentos carotenoides.

 Aunque se reportan como grampositivos debido a su similitud estructural, estos se tiñen levemente o no se tiñen con la tinción de Gram.

 El rasgo característico de este genero es la estructura compleja de su pared celular compuesta por ácidos micólicos de alto peso molecular y ceras.

I. Complejo tuberculosis
 Agentes causales de tuberculosis pulmonar y extrapulmonar.  Bacterias de crecimiento lento.  No productoras de pigmentos.

II.

Micobacterias No Tuberculosas (MNT o Atípicas).
 Agentes causales de micobacteriosis.

III. Complejo lepra
 Agentes causales de lepra.

Genero Mycobacterium 5

Complejo tuberculosis
Especie
M. tuberculosis M. bovis

Distribución

Vía de transmisión
Respiratoria • Leche contaminada. • Respiratoria.

Características clave
• Usualmente susceptible a la Pirazinamida (PZA) . • Reducción de nitratos (+). Niacina (+). Aeróbico. • Resistente PZA. • Reducción de nitratos (-). Niacina (-). Microaerofílico. • Resistente PZA. • Reducción de nitratos (-). Niacina (-). Aeróbico.

Cosmopolita

Cosmopolita Cosmopolita
Afecta a personas altamente inmunocomprometidas.

M. bovis- BCG

Vacunación

M. africanum

África oriental y occidental

Respiratoria

• Susceptible PZA. • Reducción de nitratos (-). Niacina (variable). Microaerofílico.

Otros

M. microti M. canettii M. caprae M. pinnipedii

Grupo de Runyon

Descripción
 Colonias que producen pigmentos tras la exposición a la luz después de crecer en la oscuridad.  Tardan > 7 días en aparecer en medios sólidos. Colonias que producen pigmentos tanto en la oscuridad como en la luz.  Tardan > 7 días en aparecer en medios sólidos.

Especies de interés
M. kansasii

Infecciones
Enfermedad pulmonar crónica. Enfermedades extrapulmonares.

I Fotocromógenos

M. marinum

 Enfermedad cutánea (granuloma de alberca).

II Escotocromógenos

M. scrofulaceum

 Lesiones cutáneas.  Enfermedad pulmonar.  Adenitis cervical y bacteriemia.

M. szulgai

 Enfermedad pulmonar.  Adenitis cervical. Bursitis.

Genero Mycobacterium 2,3

Micobacterias No Tuberculosas
Grupo de Runyon
III No Fotocromógenos

Descripción
 Colonias que carecen de

Especies de interés
Complejo avium

Infecciones
• Infecciones pulmonares. • Enfermedades diseminadas (pac. con VIH) • Enfermedades pulmonares. • Infecciones cutáneas y subcutáneas. • Infecciones posoperatorias. • Enfermedad diseminada. • Infecciones pulmonares. • Infecciones de la piel.

pigmentos sin importar que se cultiven en luz u oscuridad.  Tardan > 7 días en aparecer en medios sólidos. Tardan < 7 días en aparecer en medios sólidos.  No productoras de pigmentos.

M. xenopi M. ulcerans M. fortuitum M. abscessus

IV De crecimiento rápido

Especies

Descripción
No cultivable en medios artificiales

Infecciones
• Lepra tuberculoide. •Lepra lepromatosa.
• Lepra en roedores.

Complejo lepra

M. leprae
M. lepramurium

Enfermedad infecciosa, generalmente crónica, causada por el complejo Mycobacterium tuberculosis, que se transmite del enfermo al sujeto sano por inhalación de material infectante, ingestión de leche de vaca infectada por dicho complejo, contacto con personas enfermas o animales bovinos enfermos. Es una enfermedad que compromete principalmente a los pulmones pero puede propagarse a otros órganos. Es una infección crónica de tipo granulomatosa con necrosis y caseificación.  Fiebre leve-moderada.  Sudoración.  Adelgazamiento progresivo y astenia.  Tos progresiva que puede ir evolucionando con producción de esputo, esputo purulento y hemoptisis.

Genero Mycobacterium 5

Epidemiología

Esputo

5-10 mL 3-5 mL (3 muestras seriadas)

 Primera de la mañana.  Recipiente de plástico de boca ancha, estéril.  Bien cerrado y rotulado.

 Se puede utilizar solución salina estéril para inducir el esputo.  Ya no se utilizan las muestras de 24 h.

Genero Mycobacterium 2,6

Examen directo
 Tinción con carbolfuccina (Ziehl-Neelsen , Kinyoun).  Tinción con fluorocromos (rodamina - auramina). La baciloscopia sigue siendo la técnica de elección para confirmar los casos infecciosos (pulmonares). Sensibilidad diagnóstica: Mas de 90 %  Sensibilidad analítica: 5000 - 10000 bac /mL.

Genero Mycobacterium 2

Cultivo a) Descontaminación
 Consiste en homogenizar la muestra y ELIMINAR la flora acompañante que impedirá el desarrollo de las Micobacterias sobre los medios de cultivo.

Existen barios métodos entre los que se encuentran:  NaOH a concentración final del 2 %. Puede afectar la viabilidad de las
Micobacterias.

 N- Acetil-L- Cisteina – NaOH. El NALC es un agente mucolítico de tal manera
que disminuye la concentración de NaOH y el tiempo requerido, manteniendo la viabilidad de los bacilos.

 Zefiran –fosfato trisódico. Es un compuesto de amonio cuaternario.  Cloruro de cetilpiridinio (CPC). Es un compuesto de amonio cuaternario.  Ácido oxálico.

Genero Mycobacterium 2,6

Cultivo a) Descontaminación

1

2

3

 Se agrega un volumen del reactivo descontaminante igual a la muestra.

 Opcionalmente: se adiciona un indicador de pH.

 Se homogeniza perfectamente la muestra.

Genero Mycobacterium 2,6

Cultivo a) Descontaminación

4

5

6

 Dejar digerir durante 15 minutos.

 Neutralizar la base con solución amortiguadora.  Centrifugar y eliminar sobrenadante.

 Resuspender sedimento con 1-2 mL de solución amortiguadora.

Genero Mycobacterium

Cultivo
b) Medios

Genero Mycobacterium 2,6

Cultivo b) Medios

1

2

 Cultivar con 2-3 gotas del concentrado.  Cultivar por lo menos 3 tubos con medios de cultivo diferentes.  Proteger uno de los tubos de la luz.

 Incubar en posición vertical  Examinar semanalmente durante 18 h. durante un período máximo de 8  Incubar a 37 ºC (10) semanas. preferentemente con 5-10% CO2.

Genero Mycobacterium 5

Cultivo c) morfología colonial

Mycobacterium szulgai

Mycobacterium scrofulaceum

Genero Mycobacterium 5

Cultivo c) morfología colonial

Mycobacterium kansasii

Mycobacterium fortuitum

Genero Mycobacterium 5

Cultivo c) morfología colonial

M. avium

Genero Mycobacterium 5

Cultivo c) morfología colonial
Mycobacterium tuberculosis

Las colonias generalmente aparecen en el medio después de 2-3 semanas de incubación.  Al principio las colonias son pequeñas (1-3 mm), secas, friables, rugosas, granulares de color ante.  Después incrementan su tamaño (5-8 mm), las colonias típicas tienen bordes irregulares aplanados y un centro en forma de coliflor.  Debido a su crecimiento abundante estas bacterias se llaman eugónicas.  Las colonias se retiran fácil del medio pero son difíciles de emulsificar.

Genero Mycobacterium 6

Cultivo d) Reporte

Genero Mycobacterium 2

Identificación
 Velocidad de crecimiento: se realiza determinando el tiempo en el cual aparecen colonias visibles.  Producción de pigmentos (Fotocromogenicidad).  Una vez desarrolladas las colonias.  Exponer los tubos cultivados (cubierto /descubierto) a una luz brillante, como una lámpara, durante 1-2 h.  Las tapas deben aflojarse, ya que la producción de pigmento depende del oxígeno.  Los tubos cubierto se envuelven otra vez y se incuban, manteniendo las tapas flojas.  Examinar los tubos 24 y 48 h después de la exposición.

Genero Mycobacterium 2

Identificación
 Producción de pigmentos (Fotocromogenicidad).

 FOTOCROMÓGENOS

 ESCOTOCROMÓGENOS

 NO FOTOCROMÓGENOS

Genero Mycobacterium 2

Identificación
Niacina (Ácido nicotínico).
Todos las Micobacterias la producen durante su desarrollo ya que participa en reacciones Redox. Sin embargo M. tuberculosis y otras Micobacterias no la metabolizan rápido y hacen que se acumule en el medio.  Para la realización de esta prueba se recomiendan cultivos en L-J de por lo menos 3 semanas de desarrollo y con un mínimo de 50 colonias.

 Extraer la niacina con agua destilada estéril. A) Añadir la solución alcohólica de anilina y la solución de cianógeno. B) Insertar la tira reactiva.  Incubar e interpretar.
 Positivo  Negativo

Genero Mycobacterium 2

Identificación
Reducción de nitratos
 Emulsionar una colonia bien desarrollada en 2 mL del caldo nitrato.  Homogenizar e incubar durante 2 h.  Adicionar los reactivos (ác. sulfanílico + α- naftilamina).  La aparición de un color rosa-rojo es una prueba positiva.
 Positivos  Negativos

Genero Mycobacterium 2

Identificación
 Catalasa  Semicuantitativa
 Cultivar un tubo de L-J (vertical) con la colonia problema e incubar durante 2 semanas.  Adicionar 1 ml del reactivo de catalasa.  Medir la columna de burbujas formadas.

 a 68 ºC
 Determina la capacidad de la enzima catalasa de permanecer activa tras el calentamiento; es una medida de la estabilidad térmica de la enzima.  Realizar una emulsión de colonias en buffer de fosfatos.  Calentar a 68 ºC durante 20 minutos.  Enfriar y añadir el reactivo de catalasa ( H2O2 30%-Tween 80
al 10%).

 Positivo fuerte: >/= 45 mm  Positivo débil: < 45 mm Negativo: no burbujas.

 Observar la formación de burbujas.

Genero Mycobacterium 2

Identificación
 Tolerancia a la sal.
 Siembre un tubo de L-J con 5% de NaCl e incube. Observe los tubos en busca de crecimiento colonial cada semana.  Si después de 4 semanas de incubación no hay crecimiento la prueba se reporta como negativa.

 Ureasa.
 Mismo principio que la prueba convencional.  Se utiliza caldo urea el cual después de inoculado se incuba durante 1 semana y se realiza la interpretación.
 Positivo  Negativo

Genero Mycobacterium 2

Identificación
 Hidrólisis del Tween 80  Determinar la capacidad de producir lipasas capaz de hidrolizar el Tween (detergente) en ác. oleico y sorbitol polioxietilado.
 Inocular el reactivo de Tween 80 con una asada de la colonia.  Incubar y observar después de 1, 5 y 10 días de incubación.  Positivo: aparición de un color rosa o rojo a los 10 días o antes.  Negativo: sin cambios en la coloración después de 10 días.

Genero Mycobacterium 2

Identificación
 Reducción del telurito
 Inocular el caldo Midlebrook 7H9 con una asada densa de la colonia.  Incubar durante 7 días.  Adicionar 2 gotas de telurito de potasio y mezclar.  Incubar durante 3 días.  Cada día se examina el fondo del tubo (sin mezclar el tubo).
 Positivo: aparición de un precipitado negro de telurio metal en el fondo del tubo.  Negativo: No hay precipitado negro en el fondo del tubo.

Genero Mycobacterium 2

Identificación
 Arilsulfatasa: Evalúa la presencia de esta enzima que degrada el disulfato de fenolftaleína a fenolftaleína (que da un color rosa intenso en presencia de bicarbonato).

 Inhibición del crecimiento por la hidrazida del ácido tiofeno-2- carboxílico (TCH).
 Pirazinamidasa.  Captación de hierro.  Crecimiento en MacConkey (cristal violeta).

Genero Mycobacterium 1

Tratamiento

Genero Mycobacterium

 Cepa: Mycobacterium phlei.

Cepa
Ziehl-Neelsen

Cultivo

Catalasa

2 Tubos de L-J (cubrir uno con papel aluminio)

Caldo Midlebrook 6H9

1 Tubo L-J +5% NaCl 1 Tubo con AST +Glicerol

-Registrar velocidad de desarrollo. -Observar morfología colonial. -Realizar prueba de Fotocromogenicidad.

- Prueba de reducción del telurito de potasio.

Genero Mycobacterium

Fuentes de referencia
1. 2. 3. 4. 5. Norma Oficial Mexicana NOM- 006- SSA2-1993 para la prevención y control de la tuberculosis en la atención primaria a la salud. Forbes B. et al. Diagnóstico microbiológico. 12 edición. Buenos Aires: editorial medica panamericana, 2009. 478-509. Pumarola A. Microbiología y parasitología humana. 2 edición. Madrid: Salvat, 1987. 511-533. Bióloga Susana Balandrano. Métodos diagnósticos en TB, métodos convencionales y nuevas metodologías. Laboratorio de Micobacterias INDRE. 2011. MacFaddin JF. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia médica. 3a. ed. Buenos Aires: Médica Panamericana, 2003.