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Analyse Bacteriologique

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ANALYSE BACTERIOLOGIQUE D’UNE DENREE ALIMENTAIRE

La prise d’essai:
A - cas de produit solide(exemple: viande). B -cas de produit liquide(exemple: jus).

Références
• Norme NF V 08- 010 :règles générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique. • Norme NF EN ISO 6887-1 relative à la suspension mère et dilutions décimales;1.règle générale. • Norme NF V 08- 057- 2 Microbiologie alimentaire Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique. • Norme XP V 08 – 102 relative aux règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats. • Norme NF ISO 7218 :règles générales pour les examens microbiologiques. • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

A- Cas de produit solide.
Peser dans un sachet stérile 3× 25 gr du produit à analyser aseptiquement.
25 gr

La 1ère pesée servira au contrôle bactériologique. La seconde servira à la recherche des Salmonella et des shigella. La troisième servira à la recherche de Listéria.

BALANCE

La prise d’essai pour une analyse bactériologique classique:
Verser le TSE dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit à analyser. Broyer l’aliment 6 à 8 minutes. Verser le contenu dans le flacon de TSE.

BROYEUR
STOMACHER
DE TYPE

TSE
225 ml

(suspension mère) 10ˉ¹

La prise d’essai pour la recherche des Salmonella et des Listéria.
Verser l’Eau Peptonée Tamponnée(Salmonella) et le bouillon Fraser(Listéria) dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit à analyser. Broyer l’aliment 6 à 8 minutes. Verser le contenu dans les flacons respectives.

BROYEUR DE TYPE STOMACHER

225 ml
Eau Peptonée tamponnée

225 ml
Bouillon Fraser

B – Cas de produit liquide:
Faire un mélanger de 3 à 5 unités du produit à analyser.
JUS JUS JUS JUS JUS

+1
Suspension mère

La prise d’essai pour les recherches des Salmonella et des Listéria.
Prélever 2×25 ml de la Suspension mère.
5
ml

25 ml

25 ml

+1
FRASER

Eau
peptonnée tamponnée

Listéria

Salmonella

PREPARATION DES DILUTIONS DECIMALES
a - cas de produit solide. b - cas de produit liquide.

a - Cas de produit solide:
Introduire 1 ml de la suspension 10ˉ¹ dans 9 ml de TSE. Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE.

1 ml

1 ml

1 ml
9 ml de TSE
10ˉ³

10ˉ²

10ˉ¹
Suspension

mère

b - Cas de produit liquide:
Introduire 1 ml de la suspension +1 dans 9 ml de TSE. Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ¹ et l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE,mélanger, puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE pour obtenir la dilution 10³.

1 ml 1 ml
10ˉ¹

1 ml
9 ml de TSE
10ˉ²

1 ml
9 ml de TSE
10ˉ³

+1
suspension Solution mère mère

PARAMETRES RECHERCHES
• • • • • • • • Recherche et dénombrement des microorganismes totaux (Flore mésophile). Recherche et dénombrement des levures et moisissures. Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolérants et EscherichiaColi. Recherche et dénombrement des Anaérobies Sulfito – Réducteurs à 46°C. Recherche et dénombrement de Clostridium Perfringens à 37°C. Recherche et dénombrement des Staphylococcus aureus. Recherche des salmonelles. Recherche de Listéria.

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 °C, DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.
Milieu utilisé:
Gélose PCA

Références
• • • • • • Norme NF 08 – 051 relative au dénombrement des micro– organismes – méthode par comptage des colonies obtenues à 30°C. Norme XP V 08 – 102 relative aux règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats. Norme NF V 08 – 002:Microbiologie alimentaire – Directives générales pour les examens microbiologiques. Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique. Norme NF ISO 7218:règles générales pour les examens microbiologiques. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

Inoculer les boites de pétri avec 1 ml des différentes dilutions.
1

1 ml

ml

1

1 ml

ml

1

1 ml

ml

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

Couler la gélose PCA ≈ 15 ml refroidie ≈ 45°C. Mélanger et laisser solidifier.
PCA PCA

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

Couler une deuxième couche de gélose blanche ≈ 4 ml. Laisser solidifier.
GELOSE BLANCHE GELOSE BLANCHE

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

Incuber les boites couvercle en bas 72 ±3h à 30°C.

Incuber 72h à 30°C

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 °C, DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

1ère Lecture après 24h d’incubation

Dénombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.

Germes totaux

Germes totaux

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 °C, DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

2ème Lecture après 48h d’incubation

Dénombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.

Germes totaux

Germes totaux

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 °C, DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

3ème Lecture après 72h d’incubation

Dénombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.

Germes totaux

Germes totaux

Lecture et interprétation:
Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) oū le nombre de colonies dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 300. Appliquer cette formule:

N
∑c :

∑c 1,1 x d

c + c (c = nombre de 1 ère 2 1 colonies de la 1 dilution et c = nombre 2 de colonies de la 2ème dilution ). d : le taux de dilution de la 1ère boite retenue.

N

= nombre de

micro-organismes /gr ou ml

RECHERCHE DES COLIFORMES PAR COMPTAGE DES COLONIES A 30°,35° OU 37° C DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

Références
• Norme NF V 08-051:dénombrement des coliformes par comptage des colonies,méthode de routine. • Norme NF V 08-017:dénombrement des coliformes fécaux et d’Eschérichia Coli(annexe NF V 08-015 et NF V08-016). • Norme NF ISO 7218:règles générales pour les examens microbiologiques. • Norme NF V 08- 010 :règles générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique. • Norme XP V 08-102:règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats:cas des dénombrements en milieu solide. • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

Milieu utilisé:
VRBL: (gélose au cristal Violet et au Rouge neutre, Biliée et Lactosée).

Inoculer la série de boites avec 1 ml des différentes dilutions.
1 ml
1
ml

1

1

1 ml

ml

1 ml

ml

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

Couler une couche de gélose de VRBL ≈ 15 ml, refroidie à la température ≈ 45± 1 °C. Mélanger et laisser solidifier.

VRBL

VRBL

Incuber la série de boites 24 ± 2 h à 30°,35° ou 37°C pour la recherche des coliformes.

24 ± 2 h à 37°C

24 ± 2 h à 37°C

24 ± 2 h à 37°C

Dénombrer les colonies rouges qui poussent en masse , noter la dilution correspondante. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 150.

Colonies rouges

Colonies rouges

Lecture et interprétation:
Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) oū le nombre de colonies dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 150. Appliquer cette formule:

N
∑c :

∑c 1,1 x d

c + c (c = nombre de 1 ère 2 1 colonies de la 1 dilution et c = nombre 2 de colonies de la 2ème dilution retenues). d : le taux de dilution de la 1ère boite retenue.

N

= nombre de

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

Milieu utilisé:
VRBL: (gélose au cristal Violet et au Rouge neutre, Biliée et Lactosée).

Inoculer la série de boites avec 1 ml des différentes dilutions.
1 ml
1
ml

1

1

1 ml

ml

1 ml

ml

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

Couler une couche de gélose de VRBL ≈ 15 ml, refroidie à la température ≈ 45± 1 °C. Mélanger et laisser solidifier.

VRBL

VRBL

Incuber la série de boites 24 ± 2 h à 44°C.

24 ± 2 h à 44°C

24 ± 2 h à 44°C

24 ± 2 h à 44°C

Dénombrer les colonies rouges qui poussent en masse , noter la dilution correspondante. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 150.

Colonies rouges

Colonies rouges

LECTURE ET INTERPRETATION
Comptage des coliformes termotholérants.

Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) oū le nombre de colonies dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 150. Appliquer cette formule:

N
∑c :

∑c 1,1 x d

c + c (c = nombre de 1 ère 2 1 colonies de la 1 dilution et c = nombre 2 de colonies de la 2ème dilution ). d : le taux de dilution de la 1ère boite retenue.

N = nombre de coliformes
termotholérants /gr ou ml.

Recherche et dénombrement d’Escerichia Coli:

Repiquer 3 à 5 colonies caractéristiques sur le milieu Urée Indole.

Ensemencer le milieu Urée Indole.

Incuber le milieu Urée Indole ensemencé 24 h à 37°C.

UREE

Lecture du milieu Urée Indole.
Production d’indole = formation
KOVACS KOVACS

indole

-

d’un anneau rouge.

indole +

E.Coli: urée Indole +

Lecture et interprétation.
Formule: A b : Nombre de colonies caractéristiques indole + c : Nombre total de colonies caractéristiques sur la boite. A : a : Nombre de colonies caractéristiques repiqués. Nombre d’Escherichia Coli identifiés. a = b x c

Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) oū le nombre de colonies dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 150. Appliquer cette formule: ∑ a

∑a=

1,1 x d Nombre d’Escherichia Coli identifiés.

N

d : le taux de dilution correspondant à la 1ére dilution retenue.

N = nombre d’Escherichia Coli /gr ou ml.

CHERCHE DES SALMONELL DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

Références
• Norme NF V 08 6- 052 relative à la méthode de routine pour la recherche des Salmonella. • Norme EN 12824 relative à la recherche des Salmonella. • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

A - Cas de produit solide:
Verser l’Eau Peptonée Tamponnée dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit. Broyer l’aliment. Verser le contenu dans le flacon d’E.P.Tamponnée.

Eau

BROYEUR DE TYPE STOMACHER

peptonnée tamponnée

flacon de 225 ml

B - Cas de produit liquide.
25 ml
1
ml

Prélever 25 ml de la Suspension mère

Introduire dans 225 ml d’Eau Peptonée Tamponnée
Eau
peptonnée tamponnée

(+1) +1

Étape de pré enrichissement:
Incuber la solution ensemencée d’Eau Peptonée Tamponnée 16-20h à 37°C.

Eau
peptonnée
tamponnée

INCUBER 16- 20h à 37°C

Étape d’enrichissement:
Ensemencer les bouillons de Rappaport Vassiliadis et de sélénite à partir de la solution pré enrichie. 0,1 ml 2 ml

Bouillon Rappaport Vassiliadis
RAPPAPORT

Bouillon sélénite
SFB S/C

Eau

Incuber 18- 24h à 42°C

peptonnée tamponnée

Incuber 18- 24h à 37°C

Solution pré enrichie

Étape d’isolement:
Milieux utilisés:
Gélose Hektoen Gélose au Vert Brillant et au Rouge de Phénol.

Isoler par des stries :
a- Ensemencer une boite de gélose Hektoen à partir du tube SFB. b- Ensemencer une boite de gélose au Vert Brillant et au rouge de phénol à partir du tube de Rappaport Vassiliadis.
Anse de platine
SFB S/C
RAPPAPORT

37°C

18-24 h à 37°C

42°C

Repiquer 5 colonies typiques de Salmonella sur le milieu TSI.
Colonies ayant un contour régulier. Colonies ayant la couleur du milieu ,parfois avec ou sans centre noir sur la gélose Hektoen. Colonies de couleur rose sur la gélose V.BR.RP

.

.

.

Repiquer 5 colonies typiques de Salmonella sur le milieu TSI.
Stries Anse de platine

faire une piqûre centrale.

Isoler par des stries

Incuber 24h à 37°C

Aspect d’un TSI de Salmonella.

TSI

TSI Pente Rouge Culot Noir

H2S + Gaz Pente Rouge Culot Jaune

H2S TSI Gaz

+

+ Gaz +
H2S

Pente Rouge Culot Jaune

Autres Salmonella

S.Typhi

S.Paratyphi A

Ensemencer une galerie biochimique.
CITRATE DE SIMMONS CLARK ET LUBS

.

TEMOIN LDC ODC ADH ONPG UREE GN

Lecture de la galerie biochimique.
Citrate de SIMMONS +
KOVACS

CLARK ET LUBS
VP2 VP1

RM

.

TEMOIN LDC ODC ADH ONPG UREE GN

+

-

-

Lecture de l’indole et de la TDA.
UREE
2 gouttes de réactif KOVACS 1 goutte de réactif TDA

Pas de formation d’anneau rouge.

Pas de virage.

INDOLE -

TDA -

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