You are on page 1of 27
GUIÓ GUIÓ DE DE PRÀCTIQUES PRÀCTIQUES D'INFORMÀTICA D'INFORMÀTICA DE DE MICROBIOLOGIA MICROBIOLOGIA

GUIÓGUIÓ DEDE PRÀCTIQUESPRÀCTIQUES D'INFORMÀTICAD'INFORMÀTICA DEDE MICROBIOLOGIAMICROBIOLOGIA SANITÀRIASANITÀRIA

DE DE MICROBIOLOGIA MICROBIOLOGIA SANITÀRIA SANITÀRIA 2006 2006 - - 2008 2008 Aquesta obra està sota

20062006 -- 20082008

Aquesta obra està sota una llicència Reconeixement-CompartirIgual de Creative Commons.

Dept. Microbiologia Facultat de Biologia Universitat de Barcelona

Av. Diagonal, 645 08028 Barcelona Telf. 93 402 14 88 Fax. 93 403 46 29

- Coordinador de Teoria:

Joan Tomàs

- Coordinador de Pràctiques:

Óscar Gallardo

- Disseny del guió:

Óscar Gallardo

Dept. Microbiologia Facultat de Biologia Universitat de Barcelona

Av. Diagonal, 645 08028 Barcelona Telf. 93 402 14 88 Fax. 93 403 46 29

Índex de continguts

BLOC 1: IDENTIFICACIÓ DE MICROORGANISMES. MÈTODES NUMÈRICS:

4

PART I: IDENTIFICACIÓ DELS MICROORGANISMES DE LES GALERIES DE

PROBES BIOQUÍMIQUES ENTEROSYSTEM 18 R i API 20 Strep

4

Introducció a la pràctica:

4

Protocol de la pràctica:

4

A.

API 20 Strep (Mètode tradicional amb llibre)

4

B.

ENTEROSYSTEM 18 R (Mètode informàtic)

4

Resultats:

5

PART II: FUNCIONAMENT DELS MÈTODES NUMÈRICS PER A LA

IDENTIFICACIÓ DE MICROORGANISMES

6

Introducció a la pràctica:

6

Protocol de la pràctica:

6

A. Disseny d'un experiment d'identificació numèrica amb PIB:

6

B. Exemple d'identificació numèrica amb PIB:

10

C. Creació i edició de matrius d'identificació amb IdBact:

12

BLOC 2: IDENTIFICACIÓ DE MICROORGANISMES. MÈTODES MOLECULARS:

15

PART I: ANÀLISIS DE LES DADES D'UN EXPERIMENT D'E.L.I.S.A

15

Introducció a la pràctica:

15

Protocol de la pràctica:

15

A. Anàlisi de les dades de l'experiment pràctic d'E.L.I.S.A

15

B. Propostes opcionals

18

PART II: IDENTIFICACIÓ D'UN PATOGEN MITJANÇANT SEQUENCIACIÓ.

 

19

Introducció a la pràctica:

19

Protocol de la pràctica:

19

ANNEX 1:

25

Programes utilitzats i on aconseguir-los:

25

ANNEX 2:

26

Laboratory Test Criteria for Diagnosis of Plague (from CDC):

26

ANNEX 3:

27

Llicència Creative Commons:

27

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

BLOC 1: IDENTIFICACIÓ DE MICROORGANISMES. MÈTODES NUMÈRICS:

PART

I:

IDENTIFICACIÓ

DELS

MICROORGANISMES

DE

LES

GALERIES

DE

PROBES BIOQUÍMIQUES ENTEROSYSTEM 18 R i API 20 Strep.

Introducció a la pràctica:

En aquest apartat, continuant amb la pràctica de l'anàlisi microbiològica de mostres d'orina,

finalitzarem la identificació d'un bacteri pertanyent a la Família de les Enterobacteriàcies i d'un pertanyent al grup dels estreptococs, a partir dels resultats obtinguts de la inoculació i la lectura de les galeries miniaturitzades de probes bioquímiques ENTEROSYSTEM 18 R i API 20 Strep,

respectivament.

La metodologia que farem servir en tots 2 casos serà diferent ja que es tracta de galeries miniaturitzades de cases comercials diferents.

Protocol de la pràctica:

A. API 20 Strep (Mètode tradicional amb llibre).

Agafarem el número de 6 xifres obtingut en llegir els resultats de l'API 20 Strep. Cada xifra d'aquest número es genera agafant un grup de 3 probes, i sumant els números que hi ha sota d'aquelles probes que hagin donat positiu (només de les que hagin donat positiu).

Agafem el llibre subministrat per la casa comercial per aquesta galeria de probes, i comencem a cercar el número com si estiguéssim cercant una paraula en un diccionari: primer cerquem la secció corresponent a la primera xifra; després, dintre d'aquesta secció, cerquem per la segona xifra, i així fins que trobem el nostre número sencer.

Anotarem el microorganisme que s'indiqui per aquest número, i la seva probabilitat.

B. ENTEROSYSTEM 18 R (Mètode informàtic).

En aquest cas, disposem d'un programa informàtic per a una identificació ràpida.

Obrir el programa Liofilchem Identification Code Disk (Inicio → Programas → SOFTWARE

Identification Code Disk (Inicio → Programas → SOFTWARE → Varios → liofilc → liofilc) . Hem

→ Varios → liofilc → liofilc) . Hem de veure la següent pantalla:

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Assegurar-se que està seleccionada la galeria de probes ENTEROSYSTEM 18 R.

Fer clic sobre el cercle corresponent a cada proba bioquímica fins que aparegui un + si la proba va donar positiva o un si la proba va donar negativa; en cas de que la proba fos negativa també podem deixar el cercle de la proba en blanc:

Negativa

també podem deixar el cercle de la proba en blanc: Negativa Positiva Negativa – Un cop

Positiva

Negativa

Un cop tinguem totes les probes positives marcades amb +, veurem que s'ha generat un número

marcades amb + , veurem que s'ha generat un número a la part de baix, on

a la part de baix, on posa NUMERICAL CODE:

Aquest número es genera de manera semblant al que varem obtenir en el cas de l'API 20 Strep.

al que varem obtenir en el cas de l'API 20 Strep. – Fer clic sobre el

Fer clic sobre el botó de cerca que hi ha al costat del codi numèric per tal que el programa cerqui aquest número a la seva base de dades i ens proporcioni una identificació del microorganisme, tal com es mostra en el següent exemple:

microorganisme, tal com es mostra en el següent exemple: Els números que s'observen a la dreta

Els números que s'observen a la dreta son els percentatges de probabilitat de que es tracti del microorganisme indicat.

Si volem veure tota la llista de codis numèrics que fa servir el programa, podem fer clic al botó de visualització de codis: .

fa servir el programa, podem fer clic al botó de visualització de codis: . Resultats: API

Resultats:

API 20 Strep:

ENTEROSISTEM 18 R:

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

PART II: FUNCIONAMENT DELS MÈTODES NUMÈRICS PER A LA IDENTIFICACIÓ DE MICROORGANISMES.

Introducció a la pràctica:

Les galeries miniaturitzades de probes bioquímiques es basen en mètodes numèrics per tal

diferenciar el microorganisme problema, de la resta de microorganismes del grup al que creiem que pot pertànyer el nostre microorganisme, i així poder identificar-lo amb un determinat valor de probabilitat.

En aquest mètodes numèrics, es fan servir matrius d'identificació on estan representats tots

els microorganismes d'un grup (per exemple tots els bacteris entèrics, tots el cocs mesòfils Gram

+,

microbis d'uns altres del mateix grup. A més, en aquestes matrius està indicada, per a cada microorganisme i cada proba o característica, la probabilitat de que la prova/característica sigui positiva pel microorganisme. Així, en realitzar algunes d'aquestes proves amb el nostre microorganisme problema i comparar els resultats obtinguts amb la matriu d'identificació podem arribar a calcular la probabilitat de que el nostre microorganisme sigui un dels representats a la matriu.

) i totes les proves bioquímiques o altres característiques que ens permetran diferenciar uns

En aquest apartat d'identificació:

farem servir 2 programes que ens permeten treballar amb matrius

Probabilistic

Identification

of

Bacteria

http://www.som.soton.ac.uk/staff/tnb/pib.htmamb matrius Probabilistic Identification of Bacteria IdBact v. 1.1, de Goran Kronvall i Daniel Wiman (Karolinska

IdBact v. 1.1, de Goran Kronvall i Daniel Wiman (Karolinska Institutet). http://www.ki.se/labmed/clim/get_copy.htmof Bacteria http://www.som.soton.ac.uk/staff/tnb/pib.htm v. 1.9.2, de Trevor Bryant Southampton). (University of

v.

1.9.2,

de

Trevor

Bryant

Southampton).

(University

of

Protocol de la pràctica:

A. Disseny d'un experiment d'identificació numèrica amb PIB:

d'un experiment d'identificació numèrica amb PIB: Tinció inmunofluorescent de Yersinia pestis , 2000x.

Tinció inmunofluorescent de Yersinia pestis, 2000x. Origen: CDC

Farem servir el programa “Probabilistic Identification of Bacteria” per dissenyar el nostre propi sistema de galeries miniaturitzades per tal d'identificar Yersinia pestis. Yersinia pestis es un bacil Gram negatiu, aerobi, pertanyent a la família de les enterobacteriàcies, que pot infectar els éssers humans causant la malaltia anomenada pesta. Es transmet inicialment des de rosegadors infectats a través de les puces, encara que també es pot transmetre de persona a persona a través de les partícules que una persona amb infecció pulmonar (pesta pneumònica) expulsa en tossir. Actualment es una malaltia poc freqüent als paisos desenvolupats, però es encara freqüent en paisos com la Índia (on va haver-hi una epidèmia al 1994) i altres paisos africans.

proves

bioquímiques miniaturitzades, com les que hem fet servir però orientada específicament a la

identificació de Yersinia pestis.

A pràctiques,

realitzarem

les

primeres

etapes

del

disseny

d'una

galeria

de

Obrir

el

navegador

Web

Mozilla

Firefox

i

el navegador Web Mozilla Firefox i (a descarregar l'escriptori), la “ anar a Matriu

(a

descarregar

l'escriptori),

la

Web Mozilla Firefox i (a descarregar l'escriptori), la “ anar a Matriu entèrics” ( entdatv2.csv )

anar

a

Matriu

entèrics” (entdatv2.csv) i la “

la “ anar a Matriu entèrics” ( entdatv2.csv ) i la “ Matriu per Yersinia pestis

Matriu per Yersinia pestis” (ypestis.csv).

la

pàgina

web

bacteris

per

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Un cop descarregades les matrius que utilitzarem, obrir el programa Probabilistic Identification

utilitzarem, obrir el programa Probabilistic Identification of Bacteria (Inicio → Programas → SOFTWARE → Varios

of Bacteria (Inicio → Programas → SOFTWARE → Varios → PIBWin) . Apareix un

quadre de diàleg per triar la matriu d'identitat que volem fer servir.

On posa “Tipo de archivos” triar la opció “CSV files [*.csv]” i seleccionar la matriu d'identificació d'enterobacteriàcies anomenada “entdatv2.csv”, tal com es mostra a la següent imatge:

entdatv2.csv ”, tal com es mostra a la següent imatge: – Fer clic sobre la pestanya

Fer clic sobre la pestanya “Matrix

imatge: – Fer clic sobre la pestanya “ Matrix ” d'identificació que acabem de carregar. que

d'identificació que acabem de carregar.

que hi sota la barra de menús, per veure la matriu

Localitzar Yersinia pestis en la columna de l'esquerra de la matriu, i observar les proves per les

que aquest microbi es positiu (+), variable (V) o negatiu (-):

microbi es positiu (+) , variable (V) o negatiu (-) : – Fer clic al menú

Fer clic al menú “Options” i entre les opcions generals desmarcar la casella “Display matrix as +/v/-” per tal de veure el percentatge de positius per a cadascuna de les proves de la matriu:

de positius per a cadascuna de les proves de la matriu: Ara, haurem de triar aquelles

Ara, haurem de triar aquelles proves que ens permetrien diferenciar Yersinia pestis de tota la resta d'enterobacteriàcies. Això ho podríem fer a ma, anant fent càlculs amb tots els valors numèrics de tots els microbis de la matriu per totes les proves de la matriu en comparar-los amb els valors de Yersinia pestis. Però aquest programa te unes eines que ens ho faran molt més fàcil.

Fer clic al menú “Tools”, i després al submenú “Select Best Tests”. Apareixerà una nova pestanya, a part de les ja existents, anomenada “Best Tests for Matrix”, on podrem triar entre trobar aquelles proves que millor diferencien una soca de la resta, o les que permeten diferenciar totes les soques entre elles:

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària – Seleccionar la primera opció, si no està marcada per

Seleccionar la primera opció, si no està marcada per defecte, i tria a la llista desplegable la soca Yersinia pestis.

Fer clic al botó “Select Tests” i el programa calcularà per nosaltres quines son les proves òptimes per identificar el nostre microorganisme problema, diferenciant-lo de la resta.

Observar i anotar les proves i, tot comparant amb la matriu d'identificació, indiqueu els resultats que donaria Yersinia pestis per a cadascuna d'elles:

Prova Yersinia pestis
Prova
Yersinia pestis

Quines d'aquestes proves no son totalment compatibles amb el format de galeries de proves bioquímiques miniaturitzades? Justifica-ho:

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Cal doncs eliminar aquelles proves que no ens interessen per la galeria, i tornar a calcular les proves indispensables per identificar i diferenciar el nostre microorganisme problema.

Fer clic al botó “Exclude Tests”. Apareixerà la següent pantalla, on per defecte estan marcades per la seva exclusió les proves que ja tenim seleccionades:

la seva exclusió les proves que ja tenim seleccionades: – Per desmarcar totes les proves fer

Per desmarcar totes les proves fer clic al botó “Include All Tests”. A continuació marcar només aquelles proves que hem seleccionat com no interessants per a la nostra galeria de proves bioquímiques miniaturitzades. I acceptar la selecció fent clic al botó “Ok”.

Fer clic al botó “Select Tests” per tornar a calcular quines són ara les proves òptimes per identificar i diferenciar el nostre microorganisme problema.

Observar i anotar les proves. Indicar al costat els resultats que hauria de donar Yersinia pestis:

Prova Yersinia pestis
Prova
Yersinia pestis

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Prova

Prova Yersinia pestis
Prova Yersinia pestis
Prova Yersinia pestis

Yersinia pestis

Prova Yersinia pestis
Prova Yersinia pestis
Prova Yersinia pestis

B. Exemple d'identificació numèrica amb PIB:

Farem servir el disseny experimental de l'apartat anterior per identificar Yersinia pestis en tres hipotètiques mostres d'esputs de pacients d'un hospital. Les dades, que s'han obtingut fent servir la galeria de proves bioquímiques miniaturitzades que hem dissenyat, són les següents:

 

Pacient A

Pacient B

Pacient C

MacConkey

 

- +

-

Lysine decarboxylase

 

- -

-

Simmons citrate

 

- -

-

ONPG

 

+ +

+

Indole

 

- -

-

Cellobiose PWS

 

- -

-

Rhamnose PWS

 

- +

-

Salicin PWS

 

+ +

-

Sucrose PWS

 

- -

?

Xylose PWS

 

+ +

?

Si no està ja obert, obrir el programa Probabilistic Identification of Bacteria (PIBWin)

.
.

Fer clic al menú “File” i després al submenú “Open Identification Matrix”.

On posa “Tipo de archivos” triar la opció “CSV files [*.csv]” i seleccionar la matriu d'identificació de Yersinia pestis anomenada “ypestis.csv

Fer clic sobre la pestanya “Results

” – Fer clic sobre la pestanya “ Results ” que hi ha sota la barra

que hi ha sota la barra de menús, per veure la graella

de proves bioquímiques i poder introduir les dades:

graella de proves bioquímiques i poder introduir les dades: – Omplir les caselles de les proves

Omplir les caselles de les proves bioquímiques fent clic amb el botó esquerre del ratolí per posar

. En cas de proves dubtoses o no realitzades deixar en

posar . En cas de proves dubtoses o no realitzades deixar en un i amb el

un

i amb el botó dret per posar un

realitzades deixar en un i amb el botó dret per posar un blanc . – Un

blanc.

Un cop emplenades les caselles per als resultat d'una de les mostres, apareixerà la pestanya

Identification

identificació i la probabilitat que té cada microorganisme de ser el correcte (“ID Modal Score”):

microorganisme de ser el correcte (“ID Modal Score”): . Fent clic a sobre d'ella veurem els

. Fent clic a sobre d'ella veurem els microorganismes resultat de la

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària – Per inserir nous resultats, tornar a la pestanya “

Per inserir nous resultats, tornar a la pestanya “Results

Omplir la taula següent:

a la pestanya “ Results ” – Omplir la taula següent: i fer clic al botó

i fer clic al botó “New”.

 

Microorganismes

Probabilitat

Pacient A

   
   

Pacient B

   
   

Pacient C

   
   

Hi han hagut errors en fer les proves o la identificació? Cal fer més proves per algun pacient? Justifica la resposta.

En cas de que calguin fer més proves, es poden triar les més adients a la pestanya “Additional

Tests

.
.

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

C. Creació i edició de matrius d'identificació amb IdBact:

El programa IdBact és molt semblant al PIBWin, però, a diferència d'aquest permet crear i editar matrius d'identificació. De manera que farem servir aquest programa per crear una matriu d'identificació a partir de dades experimentals obtingudes amb assajos repetitius amb 4 especies del gènere Pseudomonas.

Obrir el programa IdBact (Inicio → Programas → SOFTWARE → Varios → Microbiology →

→ Programas → SOFTWARE → Varios → Microbiology → IdBact) . – Fer clic al botó

IdBact) .

Fer clic al botó per crear una nova matriu d'identitat

Matrix”).

botó per crear una nova matriu d'identitat Matrix”). (també al menú: “File → New – Apareix

(també al menú: “File → New

Apareix el quadre de diàleg “Design a New Matrix”. Indicar que farem 9 proves (“Number of Tests”) i que el número de bacteris (“Number of Bacterias”) serà 4:

número de bacteris (“Number of Bacterias”) serà 4 : – Es generarà un graella que haurem

Es generarà un graella que haurem d'emplenar tot afegint les espècies a la primera columna, i les proves a realitzar a la primera fila, tal com es veu en aquest exemple:

a la primera fila, tal com es veu en aquest exemple: – Les dades per emplenar

Les dades per emplenar aquesta matriu d'identificació s'han obtingut com a resultat de realitzar les diferents proves amb els diferents bacteris un número determinat de vegades, tot apuntant en cada cas si la prova donava positiu o negatiu. Fent servir les dades de la taula següent, calcula el percentatge de positius per a cada prova i cada bacteri, i introdueix la part entera del valor que obtinguis a la graella del programa IdBact.:

 

Especies

Assajos

MacConkey

Reducció

0.4%

Hidròlisis

DNasa

Fluorescència

Lecitinasa

10%

10%

bacterianes

de Nitrats

Selenit

de Caseina

Glucosa

Lactosa

 

Nº assajos

17

29

18

17

12

10

13

17

16

Pseudomona

Positius

16

28

12

14

2

6

12

14

5

s

aeruginosa

Negatius

1

1

6

3

10

4

1

3

11

 

%

Positius

                 
 

Nº assajos

23

23

14

28

13

25

12

11

18

Pseudomona

Positius

22

5

0

18

0

18

9

9

9

s

fluorescens

Negatius

1

18

14

10

13

7

3

2

9

 

%

Positius

                 
 

Nº assajos

18

29

11

23

12

21

24

20

24

Pseudomona

Positius

17

3

0

0

0

6

0

17

14

s

putida

Negatius

1

26

11

23

12

15

24

3

10

 

%

Positius

                 
 

Nº assajos

21

24

15

21

26

11

13

26

16

Pseudomona

Positius

20

23

0

0

0

0

6

0

0

s

alcaligenes

Negatius

1

1

15

21

26

11

7

26

16

 

%

Positius

                 

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Un cop creada la matriu d'identificació passarem a provar-la. Per això, primer hem de passar al

mode d'identificació numèrica del programa fent clic al botó mode de càlcul

menú: “Numerical identification”). Apareixerà una graella per entrar les dades del nostre experiment, molt semblant a la graella del programa PIBWin de l'apartat anterior:

a la graella del programa PIBWin de l'apartat anterior: (també al – Omplir les caselles teclejant

(també al

del programa PIBWin de l'apartat anterior: (també al – Omplir les caselles teclejant + ó –

Omplir les caselles teclejant + ó (1 ó 0) segons la prova sigui positiva o negativa, tot atenent a la següent taula, on hi han els resultats de les anàlisis clíniques fetes amb frotis dèrmics de dos hipotètics pacients d'un hospital:

 

Pacient 1

Pacient 2

MacConkey

+

+

Reducció de Nitrats

+

 

Creisement amb 0.4% Selenit

   

Hidròlisis de Caseina

   

DNasa

   

Fluorescència

+

+

Lecitinasa

   

Creixement amb 10% Glucosa

   

Creixement amb 10% Lactosa

   

Picar “Intro” o “Return” al teclat un cop omplertes les caselles per obtenir els resultats:

  – Picar “Intro” o “ Return ” al teclat un cop omplertes les caselles per

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària – Fer clic al botó “ Ok Next ” – Omplir

Fer clic al botó “Ok Next

Omplir la següent taula amb els resultats obtinguts:

per realitza una nova identificació.

 

Microorganismes

Probabilitat

Pacient 1

   
   

Pacient 2

   
   

Es pot dir amb aquest resultats que s'ha arribat a la identificació del microorganisme causant?

En cas de requerir-se més proves, per trobar quines són les que s'haurien de fer a continuació per tal d'afinar la identificació, es poden fer servir els següents botons a la pantalla de resultats:

Suggereix una proba per diferenciar entre els 2 bacteris amb major probabilitat de ser el microorganisme problema.fer servir els següents botons a la pantalla de resultats: Suggereix una proba per diferenciar millor

Suggereix una proba per diferenciar millor entre tots els microorganisme de la matriu. És útil quan la diferencia probabilística entre els diferents microorganismes proposats en la identificació és bastant semblant.amb major probabilitat de ser el microorganisme problema. – Quines probes caldria fer per identificar Pseudomones

Quines probes caldria fer per identificar Pseudomones aeruginosa en el cas del pacient 1?

I per identificar Pseudomones fluorescens en el cas del pacient 2?

Fer servir el botó “Matrix” per veure quin resultat es l'adient per les proves suggerides pel

programa per tal d'arribar a les identificacions que volem (Pseudomones aeruginosa pel pacient 1

i Pseudomones fluorescens pel 2).

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

BLOC 2: IDENTIFICACIÓ DE MICROORGANISMES. MÈTODES MOLECULARS:

PART I: ANÀLISIS DE LES DADES D'UN EXPERIMENT D'E.L.I.S.A.

Introducció a la pràctica:

En aquest apartat farem servir un full de càlcul predissenyat per treballar amb les dades d'absorbància obtingudes al laboratori en l'experiment d'E.L.I.S.A fent servir el lector espectrofotomètric de plaques (lectura a 405 nm). Un full de càlcul predissenyat és una manera ràpida, senzilla i econòmica per treballar de manera puntual amb dades provinents d'un lector de plaques no connectat directament a un ordinador. Però si haguéssim de fer moltes lectures i el nostre lector de plaques estigues connectat a un ordinador, llavors faríem servir programes per l'adquisició i el tractament de dades com per exemple el programa anomenat Titri (disponible als ordinadors per si es vol provar):

Titri (disponible als ordinadors per si es vol provar): Titri v. 5.04, de Gestur Vidarsson (University

Titri v. 5.04, de Gestur Vidarsson (University Hospital Utrecht). http://www.tripod.com/members/~gestur/

Protocol de la pràctica:

A. Anàlisi de les dades de l'experiment pràctic d'E.L.I.S.A.

,
,

Obrir el navegador Web Mozilla Firefox

web

Full de càlcul per l'anàlisi de dades de

l'E.L.I.S.A.” (ELISA.odt). En cas de no tenir disponible cap programa de full de càlcul a l'ordinador, es por fer servir un full de càlcul on-line. Tens l'enllaç a http://microsanitaria.googlepages.com.

anar

a

la

pàgina

El primer que s'ha de fer és introduir els estàndards, amb els que s'elaborarà la recta patró Concentració (D.O. 600nm ) – Absorbància 405nm . Recordar que, per fer els estàndards en el nostre E.L.I.S.A., varem fer 5 dilucions d'un cultiu de Salmonella tiphymurium A del qual coneixíem la D.O. 600nm :

A

B

C

D

E

F

G

H

Estàndards de Salmonella typhimurium A Blanc 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Estàndards de
Salmonella typhimurium A
Blanc
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1/2
1/5
1/10 1/30
1/50
B
1/2
1/5
1/10 1/30
1/50
B
1/2
1/5
1/10 1/30
1/50
B
-1
-2
-1
-2
-1
-2
-1
-2
-1
-2
-1
-2
Mostra 1
Mostra 2

Així, introduirem al formulari “Estàndards” la D.O. 600nm mesurada del cultiu de Salmonella tiphymurium A, i també les dilucions que es van fer al laboratori. Les dilucions s'han d'introduir en forma de fraccions, tal com es mostra a la imatge:

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària Observar que també s'inclou el blanc (valor 0, amb fons

Observar que també s'inclou el blanc (valor 0, amb fons blau, a la filera de dilucions).

A continuació ficarem els valors d'absorbància a 405nm que varem obtenir al laboratori pels estàndards i els blancs:

varem obtenir al laboratori pels estàndards i els blancs: – Baixar cap a baix per veure

Baixar cap a baix per veure el resultat dels càlculs i les representacions gràfiques de la recta patró:

i les representacions gràfiques de la recta patró: Pots observar tant la recta patró obtinguda a

Pots observar tant la recta patró obtinguda a partir dels valors mitjans d'absorbància a 405nm per a cada concentració assajada (gràfica de l'esquerra, en lila), com la recta patró obtinguda per regressió lineal (gràfica de la dreta, en verd), la qual ens permetrà trobar la concentració de les nostres mostres a partir de la seva absorbància a 405nm.

Dibuixa a la següent graella quadriculada la teva recta patró Concentració (D.O. 600nm ) – Absorbància 405nm que has obtingut, i compara-la amb la recta patró que ja vas fer:

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Recta

patró

Concentració

(D.O. 600nm )

– Absorbància

405nm

Creus que és una bona recta patró?

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Canviar al formulari “Mostres” per poder introduir els resultats d'absorbància de les nostres mostres.

Abans d'introduir les dades d'absorbància cal introduir la dilució que es va carregar de cada mostra a cada pouet. Recordar introduir les dilucions en forma de fraccions, tal com es mostra a

les dilucions en forma de fraccions , tal com es mostra a la imatge: – A

la imatge:

en forma de fraccions , tal com es mostra a la imatge: – A continuació introduir

A continuació introduir les dades d'absorbància a 405nm obtingudes al laboratori per les mostres. El full de càlcul farà els càlculs de concentració a partir de la recta patró obtinguda per regressió lineal, tot tenint en compte la dilució de la mostra aplicada a cada pouet:

Concentració = Absorbància 405nm terme independent b

pendent recta patró a

1

dilució

 b  pendent recta patró  a  ⋅ 1 dilució Adicionalment, obtindrem el càlcul

Adicionalment, obtindrem el càlcul de la mitjana de concentració (D.O. 600nm ) i la desviació estàndard (S) per a cada mostra. Anota els resultats obtinguts:

 

D.O. 600nm Mitja

Desviació estàndard

Mostra 1:

   

Mostra 2:

   

B. Propostes opcionals.

  Mostra 2:     B. Propostes opcionals. – Ara pots obrir el programa Titri (Inicio

Ara pots obrir el programa Titri (Inicio → Programas → SOFTWARE → Varios → Titri)

per veure com és i com funciona aquest tipus de programes per l'adquisició i el tractament de dades d'E.L.I.S.A.

A http://microsanitaria.googlepages.com trobaràs un enllaç a un mini-tutorial per l'anàlisi de les

dades de pràctiques amb aquest programa.

Per aprofundir més en la tècnica de l'E.L.I.S.A. pots fer un E.L.I.S.A. indirecte mitjançant un laboratori virtual “on-line” desenvolupat pel Howard Hughes Medical Institute:

desenvolupat pel Howard Hughes Medical Institute: http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/immunology (

(trobaràs un enllaç a http://microsanitaria.googlepages.com).

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

PART II: IDENTIFICACIÓ D'UN PATOGEN MITJANÇANT SEQUENCIACIÓ.

Introducció a la pràctica:

Mitjançant un laboratori virtual “on-line”, veurem com funciona la identificació de microorganismes basada en seqüències de DNA 16S. El laboratori virtual ha sigut desenvolupat pel Howard Hughes Medical Institute:

ha sigut desenvolupat pel Howard Hughes Medical Institute: Al laboratori virtual, bàsicament el que veurem és:

Al laboratori virtual, bàsicament el que veurem és:

Obtenció del ADN bacterià a partir d'una mostra d'un pacient.

Amplificació de ADN ribosòmic 16S per PCR, i purificació del producte de PCR.

Seqüenciació del ADN ribosòmic 16S amplificat.

Anàlisis de la seqüència obtinguda i identificació del microorganisme mitjançant bancs de dades.

Protocol de la pràctica:

Obrir el navegador Web Mozilla Firefox

Anar a la següent URL:

.
.

(trobaràs un enllaç a http://microsanitaria.googlepages.com ).

Fer clic sobre la imatge del laboratori virtual i seguir les instruccions que apareixen tant a la part del laboratori virtual, com en el marc explicatiu de la dreta. Apunta una explicació breu del que es fa a cada fase, al costat de les següents imatges:

A. Obtenció del DNA bacterià a partir d'un cultiu pur (“Sample Prep.”)

al costat de les següents imatges: A. Obtenció del DNA bacterià a partir d'un cultiu pur
al costat de les següents imatges: A. Obtenció del DNA bacterià a partir d'un cultiu pur

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

A. Obtenció del DNA bacterià a partir d'un cultiu pur (“Sample Prep.”)

A. Obtenció del DNA bacterià a partir d'un cultiu pur (“Sample Prep.”)

A. Obtenció del DNA bacterià a partir d'un cultiu pur (“Sample Prep.”)
A. Obtenció del DNA bacterià a partir d'un cultiu pur (“Sample Prep.”)

B. Amplificació de DNA ribosòmic 16S per PCR (“PCR Amplification”)

d'un cultiu pur (“Sample Prep.”) B. Amplificació de DNA ribosòmic 16S per PCR (“PCR Amplification”) 20
d'un cultiu pur (“Sample Prep.”) B. Amplificació de DNA ribosòmic 16S per PCR (“PCR Amplification”) 20
d'un cultiu pur (“Sample Prep.”) B. Amplificació de DNA ribosòmic 16S per PCR (“PCR Amplification”) 20

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

B. Purificació del producte de PCR (“PCR Purification”)

B. Purificació del producte de PCR (“PCR Purification”) C. Reacció de seqüenciació (“Sequencing Prep.”) 21
B. Purificació del producte de PCR (“PCR Purification”) C. Reacció de seqüenciació (“Sequencing Prep.”) 21
B. Purificació del producte de PCR (“PCR Purification”) C. Reacció de seqüenciació (“Sequencing Prep.”) 21

C. Reacció de seqüenciació (“Sequencing Prep.”)

B. Purificació del producte de PCR (“PCR Purification”) C. Reacció de seqüenciació (“Sequencing Prep.”) 21
B. Purificació del producte de PCR (“PCR Purification”) C. Reacció de seqüenciació (“Sequencing Prep.”) 21

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

C. Reacció de seqüenciació (“Sequencing Prep.”)

C. Reacció de seqüenciació (“Sequencing Prep.”)

C. Reacció de seqüenciació (“Sequencing Prep.”)
C. Reacció de seqüenciació (“Sequencing Prep.”)

D. Seqüenciació automàtica (“DNA Sequencing”)

D. Seqüenciació automàtica (“DNA Sequencing”) F. Anàlisis de la seqüència obtinguda (“Sequence
D. Seqüenciació automàtica (“DNA Sequencing”) F. Anàlisis de la seqüència obtinguda (“Sequence
F. Anàlisis de la seqüència obtinguda (“Sequence Analysis”)

F. Anàlisis de la seqüència obtinguda (“Sequence Analysis”)

F. Anàlisis de la seqüència obtinguda (“Sequence Analysis”)
F. Anàlisis de la seqüència obtinguda (“Sequence Analysis”)

Un cop obtinguda la seqüència del ADN ribosòmic 16S, per fer l'anàlisi i la identificació del microorganisme present a la mostra, tal com se'ns indica, el primer que hem de fer a continuació es copiar la seqüència obtinguda:

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària – Un cop tenim la seqüència copiada, ja podem anar a

Un cop tenim la seqüència copiada, ja podem anar a la plana web de cerca de la base de dades que vulguem. En el nostre cas farem servir la base de dades pública GenBank, accessible des de la web del NCBI (“National Center for Biotechnology Information”). El programa de cerca que farem servir a través d'aquesta web s'anomena BLAST. Per anar directament a la web del BLAST al NCBI fer servir l'enllaç que se'ns proporciona, o be introduir la següent URL:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ I triar la opció “nucleotide blast” dintre de l'apartat “Basic BLAST”.

Enganxar la seqüència prèviament copiada al quadre de text on posa “Enter accession number, gi, or FASTA sequence”, dintre de l'apartat “Enter Querry Sequence”:

”, dintre de l'apartat “ Enter Querry Sequence ”: – A continuació baixar cap a l'apartat

A continuació baixar cap a l'apartat “Choose Search Set” i seleccionar la base de dades (“Database”) “Nucleotide collection (nr/nt)”:

“ Choose Search Set ” i seleccionar la base de dades (“Database”) “ Nucleotide collection (nr/nt)

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Baixar fins al final de la pàgina i fer clic al botó “BLAST” . Esperar a que apareguin els resultats.

Apunta el microorganisme amb més probabilitat de ser el que estem intentant identificar, i torna a la finestra o pestanya del laboratori virtual per indicar quin és el microorganisme que has identificat:

per indicar quin és el microorganisme que has identificat: – Si vols repetir l'última part d'anàlisis
per indicar quin és el microorganisme que has identificat: – Si vols repetir l'última part d'anàlisis

Si vols repetir l'última part d'anàlisis de la seqüència i identificació del microorganisme aïllat a

la seqüència i identificació del microorganisme aïllat a partir d'una mostra clínica, a la web del

partir d'una mostra clínica, a la web del laboratori virtual fes clic a “Samples” i tria una altra mostra (per exemple la mostra C, que és una mostra d'orina).

ANNEX 1:

Programes utilitzats i on aconseguir-los:

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Probabilistic

Identification

of

Bacteria

http://www.som.soton.ac.uk/staff/tnb/pib.htmSanitària Probabilistic Identification of Bacteria IdBact v. 1.1, de Goran Kronvall i Daniel Wiman (Karolinska

IdBact v. 1.1, de Goran Kronvall i Daniel Wiman (Karolinska Institutet). http://www.ki.se/labmed/clim/get_copy.htmof Bacteria http://www.som.soton.ac.uk/staff/tnb/pib.htm Titri v. 5.04, de Gestur Vidarsson (University Hospital

Titri v. 5.04, de Gestur Vidarsson (University Hospital Utrecht). http://www.tripod.com/members/~gestur/Institutet). http://www.ki.se/labmed/clim/get_copy.htm v. 1.9.2, de Trevor Bryant Southampton). Howard Hughes

v.

1.9.2,

de

Trevor

Bryant

Southampton).

v. 1.9.2, de Trevor Bryant Southampton). Howard Hughes Medical Institute.
v. 1.9.2, de Trevor Bryant Southampton). Howard Hughes Medical Institute.

Howard Hughes Medical Institute. http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/immunology

Howard Hughes Medical Institute. http://www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/bacterial_id/

(University

of

Tots aquest programes i alguns dels fitxers utilitzats durant la pràctica es poden obtenir també de:

ANNEX 2:

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Laboratory Test Criteria for Diagnosis of Plague (from CDC):

http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/plague/lab-test-criteria.htm

SUSPECTED PLAGUE SHOULD BE CONSIDERED IF THE FOLLOWING CONDITIONS ARE MET:

1. Clinical symptoms that are compatible with plague, i. e., fever and lymphadenopathy in a person who resides in or recently traveled to a plague-endemic area.

2. If small gram-negative and/or bipolar-staining coccobacilli are seen on a smear taken from affected tissues, e.g.:

Bubo (bubonic plague)

Blood (septicemic plague)

Tracheal/lung aspirate (pneumonic plague)

PRESUMPTIVE PLAGUE SHOULD BE CONSIDERED WHEN ONE OR BOTH OF THE FOLLOWING CONDITIONS ARE MET:

1. If immunofluorescence stain of smear or material is positive for the presence of Yersinia pestis F1 antigen.

2. If only a single serum specimen is tested and the anti-F1 antigen titer by agglutination is >1:10.*

CONFIRMED PLAGUE IS DIAGNOSED IF ONE OF THE FOLLOWING CONDITIONS IS MET:

1. If a culture isolated is lysed by specific bacteriophage.

2. If two serum specimens demonstrate a four fold anti-F1 antigen titer difference by agglutination testing.*

3. If a single serum specimen tested by agglutination has a titer of >1:128 and the patient has no known previous plague exposure or vaccination history.*

*Agglutination testing must be shown to be specific to Y. pestis F1 antigen by hemagglutination inhibition.

References:

Bibel DJ, Chen TH. Diagnosis of plague: an analysis of the Yersin-Kitasato controversy. Bacteriol Rev

1976;40:633-51.

Campbell GL, Dennis DT. Plague and other Yersinia infections. In: Kasper DL, et al; eds. Harrison’s principles of internal medicine. 14th ed. New York: McGraw Hill, 1998:975-83.

Chu MC. Laboratory Manual of Diagnostic Test. Geneva: World Health Organization, 2000.

Gage KL. Plague. In: Colliers L, Balows A, Sussman M, Hausles WJ, eds. Topley and Wilson’s microbiology and microbiological infections, vol 3. London: Edward Arnold Press, 1998:885-903.

Gross L. How the plague bacillus and its transmission through fleas were discovered: reminiscences from my years at the Pasteur Institute in Paris. Proc Natl Acad Sci, USA, 1995;92:7609-11.

Kitasato S. The bacillus of bubonic plague. Lancet 1894; 2:428-30.

Pollitzer, R. Plague. WHO Monograph Serigraph 1954; 22:1-698.

Yersin A. La peste bubonique à Hong Kong. Ann Inst Pasteur Paris 1894; 8:662-7.

ANNEX 3:

Llicència Creative Commons:

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària

Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària Reconeixement-No comercial-Compartir mateixa llicència 2.5
Pràctiques d'informàtica de Microbiologia Sanitària Reconeixement-No comercial-Compartir mateixa llicència 2.5

Reconeixement-No comercial-Compartir

mateixa llicència 2.5 Espanya

amb

la

Sou lliure de:

Copiar, distribuir i comunicar públicament l'obramateixa llicència 2.5 Espanya amb la Sou lliure de: • Fer-ne obres derivades • Amb les

Fer-ne obres derivadesCopiar, distribuir i comunicar públicament l'obra • • Amb les condicions següents: Reconeixement. Heu de

Amb les condicions següents:

Reconeixement. Heu de reconèixer els crèdits de l'obra de la manera especificada per l'autor o el llicenciador (però no d'una manera que suggereixi que us donen suport o rebeu suport per l'ús que feu l'obra).Reconeixement.

No comercial. No podeu utilitzar aquesta obra per a finalitats comercials.suport o rebeu suport per l'ús que feu l'obra). • • Compartir amb la mateixa llicència.

Compartir amb la mateixa llicència. Si altereu o transformeu aquesta obra, o en genereu obres derivades, només podeu distribuir l'obra generada amb una llicència idèntica a aquesta.utilitzar aquesta obra per a finalitats comercials. • • • Quan reutilitzeu o distribuïu l'obra, heu

Quan reutilitzeu o distribuïu l'obra, heu de deixar ben clar els termes de la llicència de l'obra.

Alguna d'aquestes condicions pot no aplicar-se si obteniu el permís del titular dels drets d'autor.

No hi ha res en aquesta llicència que menyscabi o restringeixi els drets morals de l'autor.

Els drets derivats d'usos legítims o altres limitacions reconegudes per llei no queden afectats per l'anterior

Aquesta obra està sota una llicencia Reconeixement-No comercial-Compartir amb la mateixa llicència 2.5 Espanya de Creative Commons. Per veure una copia d'aquesta llicencia, visiti http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/es/legalcode.ca o enviï una carta a Creative Commons, 171 Second Street, Suite 300, San Francisco, California 94105, USA.

Dept. Microbiologia Facultat de Biologia Universitat de Barcelona

Av. Diagonal, 645 08028 Barcelona Telf. 93 402 14 88 Fax. 93 403 46 29