PRACTICA Nº 2: TECNICAS DE CONCENTRACION POR SEDIMENTACION Una de las maneras de diagnosticar las parasitosis de localización gastrointestinal y glándulas anexas

, es mediante la aplicación de técnicas coproparasitológicas de enriquecimiento (de sedimentación y flotación), que permiten concentrar huevos, quistes y larvas en el menor volumen de materia fecal, determinar su presencia e identificarlos correctamente. La recuperación de estas formas parasitarias plantea un problema de difícil solución a todo microscopista. Si bien es posible preparar frotis fecales a partir de heces frescas o material fecal conservado en SAF o formol, los métodos de concentración permiten que los quistes de protozoos y huevos de helmintos no pasen inadvertidos cuando están presentes en escaso número. Técnicas de Sedimentación:  La sedimentación de parásitos intestinales en heces se logra por centrifugación ligera o por gravedad del material fecal, conduciendo a la recuperación de todos los protozoarios, huevos y larvas, especialmente huevos de tremátodos.  Concentra bien estas formas y elimina bastantes detritus orgánicos. Aunque se inactivan las formas móviles de los protozoarios, se mantiene la integridad de los organismos.  Es efectivo aún en heces con cantidades excesivas de grasas y pueden observarse la mayoría de los quistes de protozoarios, así como huevecillos y larvas de helmintos, incluyendo los huevos con opérculo y tiene una eficacia moderada para los huevos de Esquistosoma.  La técnica es útil para examinar heces que contienen substancias grasas que interfieren en los métodos de flotación.  La técnica de sedimentación concentra los parásitos presentes en la muestra fecal. La técnica incluye tamizar primeramente las heces para separar los residuos grandes, tratar con formol para matar y preservar los organismos, y adicionar un solvente como éter o acetato de etilo para disolver las grasas.  Sin embargo, durante la sedimentación, aparte de concentrarse los parásitos, se quedan reunidos también algunos otros materiales, abundando los artefactos durante la observación. Debido a que se usan varios reactivos resulta antieconómica, no obstante su eficacia.  Las técnicas de sedimentación, se utilizan para la observación de quistes de protozoos, huevos y larvas de helmintos, pero la desventaja de estas técnicas consiste en que los preparados contienen más residuos que los procesados por flotación. En este caso, el acetato de etilo se usa para extraer los residuos y las grasas de las heces y llevar los parásitos al fondo de la suspensión. Estas técnicas entonces son recomendadas por ser fáciles de realizar, tener baja probabilidad de errores técnicos y recuperar un amplio rango de organismos. Métodos físicos • Dilución minuciosa heces en líquido o solución de densidad: • Inferior a la de los parásitos (Técnicas de sedimentación) • Superior (Técnicas de flotación)

Ventajas: • Realización muy simple

• Precisan poco material Inconvenientes: • Procesos largos • Exigen mucha manipulación • No aplicables a series grandes de muestras

TÉCNICA DE BAERMAN MODIFICADA EN COPA POR LUMBRERAS:

 Homogeneizar la muestra de heces. Adicionar una copa para sedimentación con una gasa mojada (o una malla de diámetro calibrados, según el tamaño del parásito que busquemos).Colocar heces sobre la rejilla con la gasa.

 Verte por las paredes solución salina fisiológica hasta cubrir las heces. Se deja reposar 30 a 45 minutos, se elimina el sobrenadante y extraer el Sedimento.

Observación al microscopio.

RESULTADOS 1. Se observan huevos embrionados de Hymenolepis nana y quistes tetranucleados de Giardia lamblia. 2. No hay concentración de estructuras parasitarias.

Ventaja: Con ella se recuperan larvas de Strongyloides y Trofozoitos de Protozoos de las muestras fecales. Inconveniente: No concentra las formas parasitarias y lleva mucho tiempo. Recomendado: Para larvas de Strongyloides y trofozoitos de Balantidium. TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN RÁPIDA:  Se emulsionan heces junto a un volumen de agua 10-20 veces superior, en un matraz.

 Se filtra a través de una gasa mojada (o una malla de diámetro calibrados, según el tamaño del parásito que busquemos), a una copa cónica que se llena con agua hasta 2.5 cm del borde. Se agita para suspender uniformemente.  Se deja reposar 10 minutos, se elimina el sobrenadante y se vuelve a llenar de agua. Se repite 3- 4 veces hasta que el sobrenadante aparezca claro.

Extraer el Sedimento. Observación al microscopio.

RESULTADOS 1. Se observan huevos embrionados de Hymenolepis nana y huevos larvados de Trichuris trichura. 2. Presencia de Huevos operculados por su gran densidad. Ventaja: Con ella se recuperan todos los huevos de helmintos, larvas de Nematodos y quistes de Protozoo de las muestras fecales sin distorsión. Inconveniente: No concentra las formas parasitarias y lleva mucho tiempo. Recomendado: Para huevos de trematodos y operculados de cestodos (de gran densidad). TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN DE RITCHIE

 Mezclar heces con 10 ml de solución salina. Se filtra a través de dos capas de gasa quirúrgica en un tubo de centrífuga de 15 ml  Se centrifuga 5 min. A 1500 r.p.m.. El sedimento se vuelve a suspender y centrifugar en solución salina.  Se lava el sedimento y se mezcla con 10 ml de formalina al 10 % (= formol al 4%), se deja reposar 5 mint. (Así se matan y preservan los Protozoos, larvas y mayor parte de huevos).

 Se agrega 3 ml de éter (cuidado con las llamas, vapores explosivos), y se coloca un tapón (no soluble en éter). Se invierte y agita con fuerza y centrifugar 1 minuto a 1.500 r.p.m. (Aquí se extraen las grasas de las heces y disminuye el volumen de las mismas). Se quita con cuidado el tapón (Atención, al salir los vapores de éter pueden arrastras y salpicar de restos fecales). Puede sustituirse el éter por acetato de etilo, que no es inflamable, además aumenta la obtención de huevecillos de Himenolepis nana y de quistes de Giardia lamblia.  Se invierte totalmente el tubo desde la centrifugadora con un movimiento suave, pero en un solo tiempo. Se mezcla una gota del sedimento fecal y una tintura de Iodo en el portaobjetos.  Se coloca un cubreobjetos y se pasa al microscopio, buscándose los parásitos. También debe de observarse sin teñir, ya que los quistes se ven mejor de ésta manera.

RESULTADOS 1. 2. Se observan quiste tetranucleados de Giardia lamblia. Concentración de quistes.

Ventaja: Muy útil para la concentración de quistes, huevos y larvas, puede aplicarse a muestras fijadas. Recomendado: Aumenta la obtención de huevecillos de Himenolepis nana y de quistes de Giardia lamblia.

Eter Restos fecales Formalina

Sedimento (Parásitos)

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