UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO BIOTECNOLOGA DE LOS PAI

ING. AGROINDUSTRIAL IX

DETERMINACIN DE BIOMASA RECUENTO EN CMARA DE NEUBAUER

I.

INTRODUCCIN En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el nmero de

microorganismos presentes en una muestra. Este conocimiento puede ser utilizado en estudio de curvas de crecimiento, anlisis de alimentos, preparaciones de inculos para fermentacin, etc. Un parmetro clave en el modelado y monitoreo del funcionamiento de plantas de agroindustriales dedicadas a procesos de fermentacin, panificacin entre otros en donde se utilicen inculo es la concentracin de biomasa. Biomasa es un trmino general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. Existen muchas maneras de medir la concentracin de biomasa, como por ejemplo masa, volumen, extensin linear de filamentos, dispersin de luz, conteo de clulas u organelas. Existen diferentes mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos o peso (biomasa) de clulas microbianas en un cultivo; los mtodos pueden ser directos e indirectos. Entre los directos se puede mencionar a la determinacin de peso seco y el recuento de clulas en cmara de Neubauer. La determinacin de peso seco es un mtodo de cuantificacin muy utilizado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y levaduras. Como los cultivos se someten a varios procesos (filtracin, lavado, secado) se pueden causar prdidas importantes de biomasa y errores en la cuantificacin. El mtodo de cuenta directa en cmara tiene la ventaja de ser muy rpido y econmico, aunque no se pueden distinguir las clulas viables y no viables. Se puede calcular el nmero de microorganismos en una muestra a partir del volumen de la cmara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la observacin y cuantificacin se dificultan en clulas muy pequeas (1 5 m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeo volumen de muestra que se utiliza (0.1 0.2 mm3).

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II. OBJETIVOS Determinar la biomasa presente en una solucin de levadura y expresarla en unidades de clulas/ml. Aprender el mtodo de recuento en la cmara de Neubauer

III. FUNDAMENTO TERICO 3.1. Medida del crecimiento El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologas. Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulas individuales, esto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el nmero total de partculas bacterianas (Franson, 1992). Existen dos formas para determinar el nmero total de microorganismos en una muestra:

Recuento microscpico de partculas Recuento electrnico de partculas

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias debido a que slo se tiene en cuenta el nmero de microorganismos viables, esto es capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:

Recuento de colonias Mtodo del nmero ms probable

Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la sntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la divisin celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimtico para utilizar los recursos del medio y formar biomasa:

Determinacin de peso hmedo Determinacin de peso seco Determinacin de nitrgeno total Determinacin qumica de un cido nucleco
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Un ltimo grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los microorganismos en los cambios qumicos de su entorno como consecuencia del incremento de la biomasa(Tortora, Funke, & Case, 2007). 3.2. Recuentos Directos Recuento microscpico: Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentadas o teidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina). La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproducibilidad en el llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o medios mnimos sin fuente de carbono) (Rodriguez, 2005) Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados (Palma, 2001). 3.3. La Cmara de Neubauer Es un instrumento utilizado en medicina y biologa para realizar el recuento de clulas en un medio lquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina, lquido cefalorraqudeo, lquido sinovial, etc.(Ames & Caedo, 2004). Esta cmara de contaje est adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas y que en el fondo de las cuales se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula de dimensiones conocidas. Se cubre la cmara con un cubrecmaras que se adhiere por simple tensin superficial. Luego se introduce el lquido a contar, al que generalmente se ha sometido a una dilucin previa con un diluyente, por capilaridad entre la cmara y el cubrecmara; puesto que tiene dos zonas esto permite hacer dos recuentos simultneamente. Para contar las clulas se observa el retculo al microscopio con el aumento adecuado y se cuentan las celulas. Con base en la cantidad de clulas contadas, conociendo el volumen de lquido que admite el campo del retculo, se calcula la concentracin de clulas por unidad de volumen de la muestra lquida inicial. La frmula de valoracin del nmero de clulas (vlida universalmente) es la siguiente: Partculas por mL=(partculas contadas) / (superficie contada (mm) x profundidad de la cmara(mm) x dilucin). (Castillo, 2004).
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Figura 1. Representacin de la cuadricula de la cmara de Neubauer con el ocular de 10x y 40x En el reticulo central, la camara de Neubauer posee un cuadrado primario que contiene nueve cuadrados secundarios cada uno de ellos divididos a su vez en 16 cuadrados terciarios, el cuadrado central contiene 25 cuadrados, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados cuaternarios. En los bordes de este cuadrado central se cuentan los hemates, utilizando slo los cuadrados de los bordes del terciario central y uno de los centrales (Aquiahuati, 2004)

IV. MATERIALES Y METODOLOGA Materiales Pipetas Lmina cubreobjetos Levadura instantnea para panificacin Agua destilada Vaso de precipitacin.

Equipos Microscopio Cmara de Neubauer.

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Metodologa Preparar una suspensin de levaduras con agua destilada y homogeneizar perfectamente la muestra. Con una pipeta llena llenar la cmara de Neubauer con la suspensin de levaduras y cubrirla con el cubreobjetos. tomar inmediatamente una muestra con una pipeta Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cmara y el cubreobjetos por el borde de la cmara. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultar la evaluacin precisa de la poblacin microbiana Observar al microscopio utilizando el aumento conveniente de acuerdo al tamao de la estructura (40x es un aumento adecuado). Contar las clulas presentes en los cuadros elegidos (generalmente se cuentan en los cuadrados de los cuatro ngulos y el centro, o en forma diagonal empezando por el primero de la parte superior izquierda. Tambin se deben contar las levaduras que estn ubicadas tocando la primera de las tres lneas que se encuentran circundando el cuadro, las que se encuentran en laparte superior y la derecha del cuadrado. Se cuentan en total 10 cuadrados, cinco en cada cmara).

Figura 2. Representacin de las cuadrculas de la cmara de Neubauer en el ocular 10x.

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V. RESULTADOS Y DISCUSIONES Los resultados del recuento de clulas de levadura se observan en la tabla 1. Tabla 1. Nmero de clulas de levaduras contabilizadas. Cuadrados Cuadriculas I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 SUMAS 3 6 3 6 6 8 5 10 6 8 8 7 8 7 5 3 99 II 8 5 4 4 7 2 5 7 7 6 5 4 8 5 8 6 91 III 7 6 8 6 4 6 5 12 6 6 8 9 8 4 9 11 115 IV 3 5 6 3 4 4 10 8 5 4 12 3 3 7 3 4 84 V 6 10 4 3 7 5 5 5 4 4 6 3 5 6 7 7 87

Tabla 2. Promedio y Coeficiente de Variabilidad del conteo de levaduras. Promedio Desviacin Estndar Coef. Variabilidad 95,2 12,4 13,04

En la tabla 2. Podemos observar que el coeficiente de variabilidad es 13% aproximadamente; esto nos indica el grado de variabilidad o dispersin que existe entre los datos. Segn Nuez (1992) si CV es menor o igual que 20% se dice que el promedio es representativo, o que los datos son homogneos y si el CV es mayor al 20%, el promedio no es representativo de los datos, o los mismos no son homogneos, es por ello que afirmamos que los datos son homogneos y el mtodo de recuento en microscopio utilizando la cmara de Neubauer es adecuado para la determinacin de biomas.
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Clculo de las levaduras / mL:

Segn Hernndez (2002) Es importante determinar al mosto la concentracin de clulas para que luego se dosifique la cantidad especifica para alcanzar una concentracin en el rango de (1,5 a 2,0) x 107cel/mL de mosto. Por lo que la concentracin halla se prximo al rango. (Muoz, 2007)El conteo en la cmara deNeubauer debe efectuar en los 25 cuadrantes de la cmara, hasta obtener un nmero de 300 clulas con el fin de tener una confianza del conteo del 90%. Es importante contar en total en total 10 cuadrados, cinco en cada cmara, es decir de la cmara de arriba y la de abajo (Aquiahuati, 2004) sin embargo en la prctica realizada solo se contaron 5 cuadrados por lo que el porcentaje de error se incrementar.

VI. CONCLUSIONES Se determin la biomasa presente en una solucin de levadura y expres en unidades de clulas/ml obtenindose un resultado de 2,4 x 107Cel/mL con un promedio de 95, 2 clulas por cada cuadro de 0,2mm x 0,2mm y un coeficiente de variabilidad de 13% aproximadamente.

VII.RECOMENDACIONES Realizando el recuento en cmara de Neubauer se observan tanto los microorganismos viables como los no viables, adems una inadecuada distribucin de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios errores. Es por ello que se recomienda otros mtodos para determinar la biomasa como es el mtodo de peso
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hmedo y peso seco, tambin se puede realizar contaje de placas, mtodo del nmero ms probable, filtros de membrana entre otros. Para realizar un recuento en cmara de Neubauer se recomienda agitar bien la dilucin con el fin de tener una muestra ms homognea y al momento de colocar la muestra sobre la cmara tener la precaucin para no derramarla sobre la placa cubreobjetos de tal manera que el conteo sea el adecuado.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Ames, T., & Caedo, V. (2004). Manual de Laboratorio para el manejo de hongos entomopatgenos. Lima: Centro Internacional de la Papa. Aquiahuati, M. (2004). Manual de prcticas: Laboratorio de microbiologia celular. Mxico: Universidad Autnoma Metropolitana. Castillo, G. (2004). Ensayos toxicolgicos y mtodos de evaluacin de calidad de aguas. Mexico: IMTA. Franson, M. (1992). Metodos Normalizados para el anlisis de aguas potables y residuales. Madrid: Ediciones Daz de Santos. Hernndez, A. (2002). Microbiologa Industrial. Costa Rica: Editorial EUNED. Muoz, A. (2007). Microbiologa. Madrid: Editorial Paraninfo. Nuz, A. (1992). Estadstica Basca para planificacin. Madrid: Siglo XXI Editores. Palma, G. (2001). Biotecnologa de la Reproduccin. Machala: Universidad Tecnolgica de Machala. Rodriguez, E. (2005). Bacteriologa General: Principios y Prcticas de laboratorio. Costa Rica: Editorial Universidad de Costa Rica. Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2007). Introduccin a la Microbiologa. Buenos Aires: Ed. Medica Panamericana.

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ANEXOS

Anexo 1. Levadura en pasta utilizado para determinar la biomasa

Anexo 2. Dilucin de la levadura y homogeneizacin de la muestra.

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Anexo 3. Cmara de Neubauer instalado en el microscopio para su observacin

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