II

EGE NVERSTES FEN BLMLER ENSTTS (YKSEK LSANS TEZ)

KARABA OTU (Lavandula stoechas L.) BTKSNN FARKLI IN VITRO BESN ORTAMLARINDA KLTRE ALINMASI

Serpil ORHAN Biyomhendislik Anabilim Dal Sunu Tarihi: 07.08.2007 Tez Danman: Prof. Dr. Aynur GREL

III

III

Serpil Orhan tarafndan Yksek Lisans Tezi olarak sunulan Karaba Otu (Lavandula stoechas L.) Bitkisinin Farkl In Vitro Besin Ortamlarnda Kltre Alnmas balkl bu alma E.. Lisansst Eitim ve retim Ynetmelii ile E.. Fen Bilimleri Enstits Eitim ve retim Ynergesinin ilgili hkmleri uyarnca tarafmzdan deerlendirilerek savunmaya deer bulunmu ve 07/08/2007 tarihinde yaplan tez savunma snavnda aday oybirlii/oyokluu ile baarl bulunmutur. Jri yeleri: Jri Bakan: Prof. Dr. Aynur GREL Raportr ye: Prof. Dr. Emine BAYRAM ye: Do Dr. Erdal Bedir mza . .. ..

IV

ZET KARABA OTU (Lavandula stoechas L.) BTKSNN FARKLI IN VITRO BESN ORTAMLARINDA KLTRE ALINMASI

ORHAN, Serpil Yksek Lisans Tezi, Biyomhendislik Anabilim Dal Tez Yneticisi: Prof. Dr. Aynur GREL Austos, 2007

Bu tezde, tbbi ve aromatik zelliklere sahip karaba otu bitkisine ait srgn nod eksplantlarnn farkl besin ortamlarndaki byme parametreleri incelenmitir. imlendirme, srgn oluumu ve geliimi ile kklendirme iin uygun besin ortamlar belirlenmitir. En iyi imlendirmeler (%97), 1 mg/L Benzil Amino Prin (BAP) ieren Murashige ve Skoog (1962) (MS) besin ortamnda gerekletirilmitir. imlendirilen iki adet karaba otu tohumundan elde edilen srgn nod eksplantlarndan in vitro bitki klonlar (klon 1 ve klon 2) oaltlmtr. Klon 1 bitkiciklerinin srgn nod eksplantlar 9 farkl MS ortamna aktarlm ve byme parametreleri; srgn uzunluu, srgn says, srgndeki nod says ve kk says ile kallus oluturan eksplant yzdesi incelenmitir. Klon 1 bitkiciklerine ait srgn nod eksplantlarnda, 0,1 mg/L Naftalen Asetik Asit (NAA) (ortalama 3,6 srgn/eksplant, 8,44 nod/eksplant) ve 0,5 mg/L ndol Btirik asit (IBA) (ortalama 3,44 srgn/eksplant, 8,62 nod/eksplant) ieren MS ortamlarnda en iyi srgn geliimleri salanmtr. En iyi kklenmeler ise 1 mg/L NAA (ortalama 3,44 kk/eksplant) ve 0,5 mg/L NAA (ortalama 2,29 kk/eksplant) ieren MS ortamlarnda gzlenmitir. Kltre alnan eksplantlarda en uzun boylu bitkicikler (ortalama 2,23 cm) 0,1 mg/L IBA ieren MS ortamnda elde edilmitir. Srgn nod eksplantlar, 1 mg/L BAP (%68,09) ve 0,5 mg/L BAP (%37,77) ieren MS ortamnda yksek oranda kallus oluturmulardr. Klon 2 bitkiciklerinden alnan srgn nod eksplantlar 2 farkl MS ortamna aktarlm ve elde edilen byme parametreleri klon 1 bitkilerinin byme parametreleri ile karlatrlmtr. Byme parametreleri iin

VI

VI

yaplan istatistiki deerlendirmede iki klon arasndaki farkllklar nemsiz bulunmutur. Tm kltrlerde, 4000 lux aydnlatma, 274C scaklk ve 16 saat aydnlk, 8 saat karanlk fotoperiyot kullanlmtr. Anahtar Szckler: Lavandula stoechas L., karaba otu, in vitro, klon, byme parametreleri.

VII

VII

ABSTRACT CULTIVATION of SPANISH LAVENDER (Lavandula stoechas L.) in DIFFIRENT IN VITRO NUTRIENT MEDIA

ORHAN, Serpil M.Sc. Thesis. Bioengineering Department Supervisor: Prof. Dr. Aynur GREL August, 2007

In this thesis, growth parameters of nodal shoot explants of Spanish lavender a well known aromatic and medicinal plant were investigated in different culture media. Optimum nutrient media were determined for germination, shoot formation, development and rooting. The best germination in seeds was obtained on Murashige and Skoog, (1962) (MS) medium supplemented with 1 mg/L Benzyl Amino Purine (BAP) (%97). In vitro plant lines (clone 1 and clone 2) were propagated from nodal shoot explants of two germinated seeds. Nodal shoot explants of clone 1 plantlets were transferred on 9 different MS media and growth parameters (plantlet length, shoot number, nodal segment number and root number on shoot and percentage of shoots possessing callus formation) were investigated. The best shoot development in nodal shoot explants of clone 1 plantlets was obtained on MS medium supplemented with 0,1 mg/L Naphthalene acetic acid (NAA) (3,6 average number of shoots/explant, 8,44 average number of nodal segments/explant) and 0,5 mg/L Indole Butyric acid (IBA) (3,44 average number of shoots/explant, 8,62 average number of nodal segments/explant). The best root development was obtained on MS medium supplemented with 1 mg/L NAA (3,44 average number of roots/explant) and 0,5 mg/L NAA (2.29 average number of roots/explant). The tallest plantlets (2,23 cm average plant length) were observed on MS medium supplemented with 0,1 mg/L IBA. The nodal shoot explants induced high percentage of callus formation on MS medium supplemented with 1 mg/L BAP (%68,09) and 0,5 mg/L BAP (%37,77). Nodal shoot explants of clone 2 plantlets were transferred

VIII

VIII

to 2 different MS media. Then growth parameters of clone 2 plantlets in two media were compared with those of clone 1. Between two lines there werent significant differences on growth parameters. All cultures were incubated at 27 40C under a light intensity of 4000 lux, with 16 hour photoperiod. Key Words: Lavandula stoechas L., Spanish lavender, in vitro, clone, growth parameters.

IX

IX

TEEKKR
Bu tez almasn bana veren ve her trl destei salayan, sayn Prof. Dr. Aynur GRELe, tez konusunun belirlenmesinde yardmlarn esirgemeyen ve kullandm karaba otu tohumlarn salayan anakkale On Sekiz Mart niversitesi retim yesi sayn Do. Dr. Hakan Turhana, uygulamann gerekletirilebilmesi iin laboratuar ve malzeme destei salayan ASGEN Tarm Ticaret A.. Doku Kltr retim Laboratuar yneticilerine, manevi desteklerinden dolay aileme ve arkadalarma teekkr bir bor bilirim.

NDEKLER Sayfa
ZET .................................................................................................................................. V ABSTRACT .....................................................................................................................VII TEEKKR ......................................................................................................................IX NDEKLER ................................................................................................................... X EKLLER DZN ........................................................................................................ XIII ZELGELER DZN ................................................................................................... XVI

1.

GR........................................................................................................................... 1

2.

LTERATR BLDRLER .................................................................................... 3 2.1.Bitkisel zellikler.................................................................................................. 3 2.2.Tbbi zellikleri..................................................................................................... 4 2.3.Lavandula stoechas L.deki Doku Kltr almalar ........................................ 8

3.

MATERYAL ve METOD ......................................................................................... 15 3.1.Materyal............................................................................................................... 15

XI

XI

NDEKLER (devam) Sayfa

3.2.Metod ...................................................................................................................15 3.2.1.Besin ortamlarnn hazrlanmas .....................................................................16 3.2.2.Tohum sterilizasyonu......................................................................................17 3.2.3.Tohumlarn imlendirme ortamna alnmas ..................................................17 3.2.4.Srgn nod eksplantlarnn srgn geliimi ortamlarnda kltre alnmas ...18 3.2.5.Srgn nod eksplantlarnn kk geliimi ortamlarnda kltre alnmas........19 3.2.6.Srgn nod eksplantlarndan tek tohum kkenli klonlarn oaltlmas ........19 3.2.7.Kltr koullar...............................................................................................20 3.2.8.Denemenin kurulmas ve verilerin deerlendirilmesi.....................................21

4.

BULGULAR..............................................................................................................22 4.1.Kltre alnan tohumlarda kontaminasyon durumu.............................................22 4.2.Kltre alnan tohumlarda grlen gelimeler.....................................................23 4.3.Lavandula stoechas L. bitkilerinde in vitro srgn geliimi ...............................25 4.4.Lavandula stoechas L. bitkilerinde in vitro kk geliimi ....................................27 4.5.Farkl besin ortamlarnn in vitro Lavandula stoechas L. klonu zerine etkileri.30

5.

TARTIMA ve SONU............................................................................................40

XII

XII

NDEKLER (devam) Sayfa

KAYNAKLAR DZN..................................................................................................... 43 ZGEM....................................................................................................................... 47

XIII

XIII

EKLLER DZN ekil Sayfa

2.1 (a) Lavandula stoechas yapraklar (b) Lavandula stoechas iekleri...................................................................................4 2.2 Lavandula vera DCnin in vitro oaltm potansiyeline byme dzenleyicilerinin etkisi (Andrade, 1999) .....................................................11 3.1 (a) almada kullanlan karaba otu tohumlarnn elde edildii kuru iekler (b) almada kullanlan karaba otu tohumlar .........................................................15 4.1 Tohumlarn kullanlan sterilizasyon yntemlerine gre kontaminasyon yzdeleri.............................................................................................23 4.2 Kltre alnan tohumlarda imlenme durumlar ..........................................................24 4.3 (a) MS 1BAP ortamnda kltre alnan Lavandula stoechas L. tohumlar (b) MS 1IBA ortamnda imlenen Lavandula stoechas L. tohumu ............................24 4.4 (a) ve (b) Lavandula stoechas L.de srgn geliimleri ..............................................25 4.5 Srgn ortamlarnda kltre alnan 2-3 nodlu srgn eksplantlarnda grlen gelimeler..................................................................26 4.6 Srgn geliim ortamlarna alnan 2-3 nodlu srgn eksplantlarnda kallus oluumu .......................................................................27 4.7 (a) ve (b) Lavandula stoechas L.de kk geliimleri...................................................28 4.8 Kk geliim ortamlarnda kltre alnan 2-3 nodlu srgn eksplantlarnda ortalama kk saylar ..............................................................29

XIV

XIV

EKLLER DZN (devam) ekil Sayfa

4.9 (a) ve (b) Lavandula stoechas L. bitkiciklerinin kk blgesinde kallus geliimleri................................................................................ 29 4.10 Kk geliim ortamlarna alnan 2-3 nodlu srgn eksplantlarnda kallus oluumu ....................................................................... 30 4.11 (a) In vitroda gelitirilen uzun Lavandula stoechas L. srgn (MS 0,1IBA ortamnda) (b) In vitroda gelitirilen ksa L. stoechas L. srgnleri (MS 0,5BAP ortamnda) ............................................................................................. 32 4.12 (a) ve (b) 7 nolu ortamda (MS 0,1NAA) oluan oklu srgnler (c) ve (d) 4 nolu ortamda (MS 0,1IBA) oluan srgnler (e) 9 nolu ortamda (MS 1NAA) oluan oklu srgnler (f) 5 nolu ortamda (MS 0,5 IBA) oluan tek srgn zerindeki sk nodlar ............... 33 4.13 (a) 1 Nolu ortamdaki (MS 0,1BAP) kkl bitki (b) ve (c) 9 nolu ortamdaki (MS 1NAA) kkl bitkiler (d) 8 nolu ortamdaki (MS 0,5NAA) kkl bitki........................................................ 34 4.14 (a) ve (b) 6 Nolu ortamda (MS 1IBA) kltre alnan srgn nod eksplantlarnda gelien kkler .................................................................. 35 4.15 (a) 1 nolu ortamdaki (MS 0,1BAP) kalluslu bitki (b) 2 nolu ortamdaki (MS 0,5BAP) kalluslu bitki ..................................................... 35 4.16 (a) ve (b) 3 Nolu ortamda (MS 1BAP) kltre alnan srgn nod eksplantlarnda oluan kalluslar ............................................................... 36 4.17 Dokuz farkl ortamda kltre alnan klon 1 bitkilerine ait srgn nod eksplantlarnda grlen gelimeler ....................................................................................................... 36

XV

XV

EKLLER DZN (devam) ekil

Sayfa

4.18 Dokuz farkl ortamda kltre alnan klon 1 bitkiciklerine ait srgn nod eksplantlarnn kallus oluturma yzdeleri...........................................................................................37 4.19 ki farkl ortamda kltre alnan klon 1 ve klon 2 bitkiciklerine ait srgn nod eksplantlarndaki gelimeler..........................................38 4.20 ki farkl ortamda kltre alnan klon 1 ve klon 2 bitkiciklerine ait srgn nod eksplantlarnn kallus oluturma yzdeleri....................39

XVI

XVI

ZELGELER DZN izelge Sayfa

2.1 Lavandula stoechas L. bitkisinin aroma profili*. .......................................................... 6 2.2 Hatay yresinde iki farkl lokasyondan alnan lavanta bitkilerinde uucu ya oranlar (%). .............................................................................................. 13 2.3 Farkl yrelerden alnan karaba lavanta eliklerinde kklenme oran (%). ............... 14 2.4 Farkl yrelerden alnan karaba lavanta eliklerinde IBA konsantrasyonlarna gre kk uzunluu ve kk says....................................... 14 3.1 MS (1962) besin ortamnn ierdii maddeler ve miktarlar. ...................................... 16 3.2 Tohumlara uygulanan sterilizasyon yntemleri........................................................... 17 3.3 Tohumlarn imlendirilmesinde kullanlan ortamlar. .................................................. 18 3.4 Srgn geliimi iin kullanlan besin ortamlarnn kompozisyonlar.......................... 18 3.5 Kk geliimi iin kullanlan besin ortamlar................................................................ 19 3.6 Bitki byme dzenleyicilerinin in vitro Lavandula stoechas L.e ait klon 1 bitkilerinin byme parametreleri zerine olan etkilerinin belirlenmesi iin kullanlan ortamlar.......................................................................... 20 3.7 Bitki byme dzenleyicilerinin in vitro Lavandula stoechas L.e ait klon 2 bitkilerinin byme parametreleri zerine olan etkilerinin belirlenmesi iin kullanlan ortamlar.......................................................................... 20 4.1 Tohumlarn yzeysel sterilizasyonlar sonucu belirlenen kontaminasyon yzdeleri. . 22 4.2 Kltre alnan tohumlarda imlenme durumlar.......................................................... 23 4.3 Srgn ortamlarnda kltre alnan 2-3 nodlu srgn eksplantlarnda grlen gelimeler. .................................................................................................................. 25

XVII

XVII

ZELGELER DZN (devam) izelge Sayfa

4.4 Kklendirme ortamlarnda kltre alnan 2-3 nodlu srgn eksplantlarnda grlen gelimeler ......................................................................................................28 4.5 Farkl byme dzenleyicileri ieren ortamlarn Lavandula stoechas L. klon 1 bitkilerinin byme parametrelerine etkisi31 4.6 Farkl byme dzenleyicileri ieren ortamlarn Lavandula stoechas L. klon 2 bitkilerinin byme parametrelerine etkisi31

1. GR
lkemizde doal olarak yetien ve halk arasnda karaba otu, gargan otu ya da kei otu olarak bilinen Lavandula stoechas L., Lamiaceae (Ballbabagiller) familyasna ait aromatik bir bitkidir. Yzyllardr Anadolu halk hekimliinde antiseptik ve yara iyi edici gibi etkileri bata olmak zere farkl rahatszlklarn tedavisinde kullanlmaktadr (Ayral, 1997; ztrk ve ark., 2005). Dnyada balca Gney Avrupa, Cezayir, Tunus, Kanarya Adalar, Gneybat Asya ve Suriyede yayl gsteren karaba otu, lkemizde zellikle anakkale, stanbul, stanbul-Bykada, zmit-Hereke, Balkesir-Kazda, zmir, Mula, Data, AntalyaTekirova, el-Anamur, Hatay-Samanda, Yaylada blgelerinde yetimektedir (Ayral, 1997; Yenici, 1999). Lavandula stoechas L., habitat olarak kuru tepelerde, ak ormanlarda, kiretal ve granitli topraklarda yaar. Bununla beraber, hemen hemen her eit toprakta, zellikle kuru ve ok asidik olmayan topraklarda yetimektedir. Gneli pozisyonda, ntralden alkaliye doru bir topra tercih eden bitki kireli toprakta da iyi yetimektedir. Scak ve kuru ortamlar sever, kurakla ve -5 ile -10oC arasndaki soua toleransldr (Yenici, 1999). Karaba otunun tohum olgunlama zaman Temmuz, Austos ve Eyll aylardr. lkbaharda seraya ekilen tohumlar, zerleri kapatlacak kadar gmlrler. Genellikle 13 ay iinde, 15oCde imlenmeler gerekleir. Fideler, ele alnacak kadar bydklerinde hafife kendi sakslarndan alnp serada ilk klar iin yetitirilirler. Daha sonra ilkbaharn ve don olaylarnn gemesi beklenir. Temmuz ve Austos aylarnda yar olgun dallar 710 cm ye ulatnda kesilerek kklenme ortamna alnr ve birka hafta iinde yksek oranda kklenirler. ieklenme zaman Mays, Haziran, Temmuz aylardr (Yenici, 1999). Karaba lavanta iei (Flos Lavandula romanae), L. stoechas L.nin kurutulmu iek durumlardr. Eski yazarlar tarafndan ok nem verilen bir drogdur. Ar kesici, antiseptik, yara iyi edici, yattrc (sara ve astmda), balgam sktrc, idrar yollar iltihaplarn giderici, egzama yaralarn iyi edici, sinir ve kalp kuvvetlendirici gibi etkileri nedeniyle geni bir kullanm alan bulmutur (Baytop, 1999).

Karaba uucu ya (Oleum Lavandulae romanae), karaba otu bitkisinin toprak st ksmlarndan su buhar distilasyonu ile elde edilen bir uucu yadr. Kafur, fenkon, borneol, terpinol, sineol gibi bileikler tamaktadr. Haricen ve dahilen antiseptik ve yara iyi edici olarak kullanlmaktadr (Baytop, 1999). Karaba otu, ieklenme sresinin uzun olmas nedeniyle nemli ball bitkiler listesinde yer almaktadr. Karaba otunun bal olduka ak sar renkli olup ksmen ge kristalleir. Kristalletii zaman ince granller oluturur. Baln nane kokusuna benzer bir kokusu vardr (Sral, 2002; Anonim, 2007a). Karaba otu tbbi ve aromatik amala kullanm dnda gzel kokusu ve grnm ile evre dzenleme almalar iin nemli bir potansiyele sahiptir. Ayrca insan beslenmesinden hayvan beslenmesine kadar hatta organik tarmda organik preparat (bcek karc, allelopatik etkisi, vb.) olarak ta kullanlma olanaklar olan bir bitkidir. Gnmzde doal bileiklerin neminin artmas bu gibi bitkilere duyulan ilgiyi arttrmaktadr (Ayanolu ve ark., 2000). Tbbi ve aromatik bitkilerde etken maddeler, genotip ve evreye bal olarak deikenlik gsterir. Ticari olarak bir bitkinin retilmesinde standardizasyon gereklidir. Bu nedenle, doku kltr yntemiyle ayn genetik yapya sahip karaba otu fidelerinin retilmesi nemlidir. Ayrca, karaba otu tohumlarnn ok kk olmas dorudan ekim yaplmasnda gle neden olmaktadr. Yine doku kltr yntemiyle retimde, iklim faktrleri retimi snrlamayaca iin hedeflenen bitki materyaline ulamak daha kolaydr. Bu proje ile karaba otunun (Lavandula stoechas L.) doku kltrnde baaryla retilmesi ve farkl in vitro kltr ortamlarnn bitki geliimi zerine etkisinin saptanmas amalanmtr. Deeri yeni anlalmaya balanan tbbi ve aromatik bitkilerden biri olan karaba otunun mikrooaltm, bu proje sonularnn deerlendirilmesiyle yaplabilir. Buna ilave olarak, elde edilecek bulgular, ileride gerekletirilmesi planlanan karaba otuna ait sekonder metabolitlerin hcre ve doku kltr yntemleri kullanlarak retilmesi ile ilgili almalar iin de kaynak olarak kullanlabilecektir.

2. LTERATR BLDRLER

2.1. Bitkisel zellikler

Lamiaceae (Ballbabagiller) familyas; ou tek veya ok yllk, otsu, az bir ksm sarlc bitkilerdir. Gvdeleri ounlukla drt kelidir ve genellikle aromatik yalara sahiptirler. ok geni bir familya olup 200 cins ve 3200 kadar tr vardr. Yetime merkezi Akdeniz blgesi olmakla birlikte, dnyann hemen her yerinde yayl gstermektedir. Ekonomik olarak nemli olan bu familya hem aromatik uucu yalarca zengin, hem de bahelerde ss bitkisi olarak yetiebilecek pek ok tre sahiptir. Bunlardan elde edilen uucu yalar tpta ve parfmeride kullanlmaktadr (Yenici, 1999). Lavandula cinsi Lamiaceae familyasna ait olup, ok yllk, aromatik iekler ve yeil yapraklar ieren trlere sahiptir (Anonim, 2007b). Bu trler arasnda bulunan Lavandula stoechas L., 4550 cm ykseklikte, gzel grnl, tyl, kuvvetli kokulu, al formunda ve ok yllk bir bitkidir. Zengin topraklarda yetiirken bitki ok yaprak yetitirme eilimindedir, ama az uucu ya verir. Bitki yeil yaprakl, 1- 12 arasnda deien sayda yapraklar (ekil 2.1a) tek para lineer, kenarlar alta doru kvrktr. ok sayda dala sahiptir. Dallar, 210 kadar iekli dairelerle sonlanr. Dallarn ucunda silindirik durumda, sk baaklar eklinde bulunan iekler (ekil 2.1b) siyahms mor renklidir. Gvdenin en stnde fertil kk iekler ile bcekleri eken dallarn stnde bulunan infertil ieklere ve yannda fertil ieklere sahiptir. Bitki iek durumu sapna gre iki alttre ayrlr; subsp. stoechas - iek sap: 0,52,5 cm, iek durumundan daha ksa, subsp. cariensis - iek sap: 520 cm, iek durumundan daha uzun (Ayral, 1997; Baytop, 1999; Yenici, 1999).

(a)

(b)

ekil 2.1 (a) Lavandula stoechas yapraklar (b) Lavandula stoechas iekleri

2.2. Tbbi zellikleri

Bugn alternatif tpta kullanlan pek ok bitki arasnda bulunan Lavandula trleri, hem halk ilac olarak, hem de pek ok preparatn bileimine girmesi nedeniyle nemli bir yere sahiptir (Yenici, 1999). Lavandula trlerinin ait olduu Lamiaceae familyas bitkileri, terpenoid bileikler bakmndan zengindir, ayrca uucu yalar, flavonoidler, kumarinler ve az da olsa kinoid yapda maddelerle baz basit alkaloitler tarlar. Dnyada Lavandula trleri zerinde pek ok aratrma yaplm ve yaplmaktadr. Bugn Lavandula trlerinden elde edilen droglar birok farmakopede kaytl olup eitli amalarla kullanlmaktadr (Ayral, 1997). Lavandula stoechas L. bitkisinden zellikle drog olarak pek ok eski yazar sz etmektedir. Osmanl mparatorluu dneminde bu bitkinin kolera tedavisinde kullanlmas ve eczanelerde sattrlmas ile ilgili 1848 ylnda km bir padiah emri de bulunmaktadr (Yenici, 1999). Lavandula stoechas L., bir glikozit, saponinler ve uucu ya tamaktadr. Trkiyede yetitirilen Lavandula stoechas L. bitkisinin ieriini oluturan uucu ya bileenleri ayrlmtr. eitli kromatografik yntemlerle yaplan almalarda ortalama %0,5-0,7 verimle elde edilen uucu ya balca kafur, fenkon, borneol, terpinol, sineol linalol, linalil asetat, bornil asetat ve kadinen tamaktadr (izelge 2.1). Trkiyede

yetien trlerde keton miktarnn ok yksek olduu ve bu bakmdan Avrupada yetien trlerin uucu yandan farkl olduu bilinmektedir. Uucu ya %30 kafur ve %18 fenkon tamaktadr, yani uucu yan yarsn ketonlar oluturmaktadr. Bu uucu yada linalol miktar %0,6 kadardr. Bu bakmdan Trkiyede yetimekte olan trler linalol kayna deil, kafur kayna olarak yararlanlabilecek bitkilerdir. Doal kafur dekstrojir bir maddedir. Kalp ve solunum analeptii olarak sodyum kamfoslfonat sulu zeltileri kullanlmtr. Akcier ve solunum yollarnda antiseptik bir etki meydana getirdiinden kafur tayan preparatlar buu eklinde veya kafur tayan pomatlar gs ve srta srlmek suretiyle kullanlmaktadr. Kafur elde edildikten sonra kalan uucu yadaki safrol, sabun sanayi ile vanilin ya da helyotropin sentezinde balang maddesi olarak kullanlr. Ayrca selloit sanayinde faydalanlan bir madde olarak nem tamaktadr (Ayral, 1997; Dlger ve Uurlu, 1998; Baytop, 1999; Yenici, 1999). Lavandula stoechas L. trnn yaprak ve ieklerinden elde edilen uucu yan kokusu ho olmadndan, esans parfmeri endstrisinden ziyade eczaclkta kullanlmaktadr (Ayanolu ve ark., 2000). Bitkinin Anadolu halk hekimliinde antiseptik ve yara iyi edici gibi etkileri bata olmak zere farkl rahatszlklarn tedavisinde kullanld kaytldr. ztrk ve ark., zmir yresindeki yabani Lavandula stoechas L. subsp. stoechas taksonundan elde edilen uucu yan antibakteriyel ve antifungal kapasitesini aratrmlardr. Bitkinin toprak st ksmlar distillenerek uucu ya elde edilmi ve % 1,1 orannda uucu ya ierdii tespit edilmitir. Yaplan gaz kromatografisi - ktle spektrometresi (GC-MS) analizinde saptanan 26 bileikten uucu yan % 91,63ne karlk gelen 8 tanesi tanmlanm, ana bileen % 43,47 ile kafur olarak saptanmtr. Uucu yan antibakteriyel ve antifungal etki almalar disk difzyon yntemiyle yaplm ve Proteus vulgarise (ATCC 6897) kar standart antibiyotiklerden daha kuvvetli antibakteriyel, Candida albicans (ATCC 10239) fungusuna kar Nistanine yakn dzeyde antifungal etki gsterdii belirlenmitir (ztrk ve ark, 2005). Eczaclkta bitkinin ar kesici (zellikle ba arlar), antiseptik, balgam sktrc, idrar yollar iltihaplarn giderici, egzama yaralarn iyi edici, sinir sistemini yattrc (sara ve astm iin) ve kalp kuvvetlendirici gibi etkilerinden yararlanlmaktadr. Uucu yann zayf beslenmeye, romatizmaya ve spazmlara kar kullanld bilinmektedir. Ayrca uucu yann insan kolon kanseri hcrelerine, hormona bal insan prostat

kanseri hcrelerine kar aktivite gsterdii bulunmutur (Ayral, 1997; Yenici, 1999; Ayanolu ve ark., 2000).

izelge 2.1 Lavandula stoechas L. bitkisinin aroma profili*.

Bileen Alpha-pinene Sabinene Beta-pinene Myrcene Cymenes** Multi-component*** Ocimene Fenchone Alpha-terpinolene Linalool Camphor Polycyclic ketons** Borneol Lavandulal Terpineols** Methyl thymyl ether Linalyl acetate Bornyl acetate Carvaerol Neryl/gerarylacetate Caryophyllene Bergamoteres** Germacrenes** Selinenes** Farnesenes** Bisabolenes* Cadinenes** Selinadiene Dier sesquitepenes Caryophyllene oksit Bilinmeyen diterpenler Total sesquiterpenes
* Bileiklerin isimleri ngilizce sunulmutur. **zomerler toplam ***Beta-phellandrene, cis ocimene, limonene, cineole ierebilir.

Yzde 21 0,7 0,4 0,8 0,7 20,8 33 0,8 0,6 26,2 0,6 0,2 0,3 0,5 0,2 0,3 0,2 0,4 <0,1 1,7

Karaba otu ieklerinin gs, karacier, dalak ve baz kanser tiplerinin iyilemesinde kullanld literatrde kaytldr. iekli dallar ay olarak ksrk ve bronitte, souk algnlnda, ba arsnda, ayrca kum sancs, lser, mide ve gs arlarnda ve kalp rahatszlklarnda kullanlr. Diyabete de iyi geldii sylenmektedir. eker hastalar tarafndan bitkisel ay olarak tketilmektedir. Alerjiye kar dallar kaynatlp suyunda banyo yaplr. Seboreik dermatit ve kepek nlemede yararldr (Ayral, 1997; Ayanolu ve ark., 2000; Ertu, 2002). Anadoluda di ve di eti ile ilgili hastalklarn tedavisinde halk arasnda yaygn olarak kullanlan bitkiler zerinde yaplan aratrmada karaba otunun bu amala kullanld saptanmtr (Grsoy ve Grsoy 2004). Data yarmadas (Mula) floras ve bu yrede halkn yararland bitkiler ile Bodrum yresinde halk tbbnda yararlanlan bitkiler balkl aratrmalarda bu yrelerde Lavandula stoechas L. subsp. stoechasn yaygn olarak, zellikle de iekli ksmlarndan hazrlanan infzyonun dahilen kolesterol drc olarak kullanld belirlenmitir (Ertu, 2002; Tuzlac, 2002). Karaba otu bitkisi iyi bir haarat ilacdr. Byk dozlarda kullanm ise narkotik zelliktedir ve lme bile neden olabilir (Ayral, 1997). Lavandula stoechas L., bitkisinin alkol ve su ekstrelerinin fibrinolitik sistem zerindeki etkilerinin aratrlmas iin bir alma yaplmtr. alma sonucunda karaba otu ekstrelerinin in vitro olarak fibrinolitik sistemi (kan phts iindeki fibrinin zlmesi sistemi) aktive ettii gzlenmitir. Bylece Lavandula stoechas L. bitkisinin, koroner sisteme, damar sistemine ve dolam sistemine katklar olduu fikri desteklenmitir (Yenici, 1999). L. stoechas ieklerinin metanolik sv ekstrakt (LS)nn, antispazmodik ve antikonvlsant aktiviteleri incelenmitir. LS (600mg/kg) farelerde test edildiinde pentylene tetrazole (PZT) ile oluturulan sarslmalarn, iddetini azaltp gecikmelerini salamtr. LS ayn zamanda, PTZnin letal etkisini azaltmtr. Diazepamn etkisine benzer ekilde farelerin uyku sresini uzatt tespit edilmi olup sakinletirici etkisi olduu ispatlanmtr. LS, tavandan izole edilen ince barsak preparasyonlarnda, spontan kaslmalarn doza bal (0.1 1.0 mg/ml) gevemesine neden olmutur. LSnin benzer dozlar ayn zamanda K(+)in oluturduu kaslmalar engellemitir ve bylece

kalsiyum kanallar bloke edilmitir. nce barsak preperasyonlar LS ile muamele edildiklerinde, standart bir kalsiyum kanal bloke edici madde olan verapamilin etkisine benzer ekilde etki gstermilerdir. Bu bilgi bitki ekstraktnn antikonvlsant ve antispazmodik aktivite gsterdiini bildirmektedir (Gilani et al., 2000). talyada yabani olarak yetien Lavandula stoechas L. ssp. stoechas bitkilerinin yaprak ve gvdeleri ile ieklerinden, su buhar distilasyon yntemi ile uucu yalar elde edilerek antifungal etkileri test edilmi ve Rhizoctonia solani ile Fusarium oxysporum zerinde olduka etkili, Aspergillus flavus zerinde ise daha az etkili olduu saptanmtr (Angioni et al., 2006). Domateste rkle neden olan Phytophthora infestans mantarna kar alternatif fungusid bulmak amacyla yaplan almada, baz aromatik bitkilerin toprak st paralarndan uucu yalar elde edilerek denemeler yaplmtr. Lavandula stoechas subsp. stoechasn yksek konsantrasyonlarnn (25,6 g/ml), bu fungusun etkisini inhibe ettii tespit edilmitir (Soylu et al., 2006). Karaba otu (Lavandula stoechas subsp. stoechas L.) uucu yalarnn kimyasal kompozisyonlar ve Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium ve Staphylococcus aureusa kar inhibitr etkilerinin aratrlmas amacyla yaplan bir almada, uucu yalarn gl bir antibakteriyel etki gsterdii tespit edilmitir (Dadalioglu et al., 2004). Lavandula stoechas L. antimikrobiyal aktivitesinin test edilmesi amacyla yaplan bir dier almada, elde edilen ekstraktlarn, baz Gram (-) ve (+) bakteriler (zellikle Staphlococcus aureus ATCC 6538P ve Staphlococcus epidermidis NRRL B-4877), maya kltrleri (zellikle Kluyveromyces fragilis NRRL 2415 ve Torulopsis sp.), flamentz funguslar (zellikle Botrytis cinaeriae, Fusarium oxysporium ve Trichophyton rubrum) zerine kar bir antimikrobiyal aktivite ierirken almada kullanlan aktinomisetler zerine bir antagonistik etkisinin olmad saptanmtr (Dlger ve Uurlu, 1999).

2.3. Lavandula stoechas L.deki Doku Kltr almalar

Bilimsel yaynlarda Lavandula stoechas L. ile ilgili hcre ve doku kltr konularnda ok fazla alma bulunmamaktadr. Projemize kaynak oluturmas

bakmndan dier Lavandula trlerine ait doku kltr ve oaltm almalar incelenmitir. Byme dzenleyicilerinin Lavandula dentata L. in vitro srgn oaltm ve srgn geliimi zerine etkilerinin aratrlmas amacyla yaplan bir almada, tarla koullarnda yetitirilmi olgun bitkilerden alnan koltuk alt tomurcuklar kullanlmtr. En yksek oaltma katsaylar 2,2 M benziladenin (BA) ve 2,5 M indol-3-btirik asit (IBA) ieren Murashige ve Skoog (MS) ortamnda elde edilmitir. Kk geliimi iin en iyi ortam 2,5 M naftalen asetik asit (NAA) ieren MS ortam olarak belirlenmitir. Kklenen bitkiler baarl bir ekilde topraa aktarlmtr. Ksa sre (6 ay) kltrde kalan bitkilerde normal gelime gzlenirken, uzun sre (1 yldan fazla) kltrde kalanlarda dk frekanslarda ve kaltsal olmayan morfolojik deiiklikler belirlenmitir (Echeverrrigaray et al., 2005). Lavandin (Lavandula officinalis Chaix X Lavandula latifolia Villars) eidi Grossonun in vitro oaltm metodunun tanmlanmas iin, 30 g/L skroz, 7,5 g/L agar ve byme dzenleyicileri ieren Linsmaier ve Skoog kltr ortamlar kullanlmtr. Balang materyali olarak gvde nod eksplantlar alnm ve eitli byme dzenleyicilerin etkileri karlatrlmtr: 0,2 mg/L benzil amino prin (BAP) (Ortam A); 0,2 mg/L BAP+0.5 mg/L giberellik asit (GA3) (Ortam B). Kltrler, balangta 10 mg/L BAP ieren ortamda (Ortam C) 15 gn braklm ve ardndan A ya da B ortamlarna transfer edilmilerdir (C/A; C/B). Tm koullarda oaltma katsaylar benzerdir. Ancak farkl kaynaklardan alnan eksplantlar farkl oalma katsaylar vermilerdir. 1 mg/L NAA (Ortam F) ieren ortamda kk geliimi salanmtr. Kallus geliimi iin iek paralar (tomurcuk, anak), yaprak, gvde nodu ve srgn ucu kullanlmtr. 1 mg/L 2,4-diklorofenoksi asetik asit + 0,5 mg/L kinetin (Ortam E) ieren ortamda kallus oluumu tevik edilmitir. Kalluslarn geliimi ve organogenezis de gzlenmitir. En fazla srgn rejenerasyonu ve maksimum kklenme oranlar gvde eksplantlarndan gelien kalluslardan elde edilmitir. Kkl bitkicikler d koullara kolaylkla adapte edilmilerdir (Panizza and Tognoni, 1988). Lavandula angustifolia Mill in vitro mikrooaltm iin koltuk alt tomurcuklar kullanlmtr. oaltm iin NAA, BA ve bunlarn kombinasyonlarnn kullanld Hindistan cevizi st ieren ve iermeyen MS ortamlar denenmitir. Kltrler, 16 saat aydnlk / 8 saat karanlk koullarda 45 m E m2s-1 k iddetinde srdrlmtr. 1,15 ya da 3,15 mg/L BA ieren ortamlarda en iyi gelime salanmtr. Bununla birlikte, 3,15

10

mg/L BA ieren ortamdaki srgnler kk yaprakl kompakt formda olumutur. Bu srgnler kesilip hormonsuz MS ortamna aktarldklarnda, 45 gn sonra yapraklarda ve gvdede nemli byme salanmtr. Sonrasnda ise bitkisel materyal kklenme iin kullanlmtr. Kk teviki, 0,2-0,4 mg/L IBA ieren MS ortamnda elde edilmitir. Daha sonra, srgnler sakslara transfer edilmi ve baarl bir ekilde seraya artlmlardr (Portilla et al., 1995). Aseptik koullarda yetitirilen Lavandula latifolia ve Lavandula stoechas rlerinden alnan kotiledon, hipokotil ve kk eksplantlarnn morfogenik kapasiteleri incelenmitir. Bunun iin, farkl konsantrasyonlarda ve kombinasyonlarda oksin (IAA, NAA ya da 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) ve sitokinin (BA ya da Kinetin) kullanlmtr. Denemelerin ounda kk geliimi gerekleirken IAA ya da NAA ierenler ortamlarn daha verimli olduu gzlenmitir. Denenen tm ortamlarda Lavandula stoechastan alnan eksplantlar, srgn retiminde baarsz olurken Lavandula latifoliadan alnan hipokotil ve kotiledon eksplantlar, yksek oranda tomurcuk oluturmutur (Calvo and Segura, 1988). Lavandula viridis in vitro klonal oaltm iin eksplant olarak doal ortamda gelimi yetikin bitkiler kullanlmtr. Tek nodlu eksplantlar 0,44 M BA ieren MS ortamnda kltre alnmtr. En yksek oaltma katsays (11,69 srgn/nod) 0,67 M BAP ieren MS ortamnda gzlenmitir. Srgnler Gresshoff ve Doy ortamnda kolaylkla kklenmilerdir. eker konsantrasyonunun 58,4 mMdan 87,6 mMa karlmas, kklenme frekansnda nemli bir art salamtr. Bitkiciklerin %80i baarl bir ekilde d ortama aktarlm ve normal geliim gzlenmitir (Dias et al., 2002). Byme dzenleyicilerinin, Lavandula vera D.C.nin kklenme ve srgn oaltm zerine etkilerinin, aratrlabilmesi iin mikrooaltm yaplan bitkilerden alnan nodal eksplantlar kullanlmtr. Balangta, aktif vegetatif byme dnemindeki bitkilerden alnan aksiler tomurcuklarn, 0.5 mg/L BA ieren MS ortamna alnmasyla in vitro bitkicikler elde edilmitir. Farkl byme dzenleyici kombinasyonlarnn aksiler tomurcuk bymesi zerine etkisinin aratrlabilmesi iin in vitro bitkilerden alnan nodal eksplantlar, farkl sitokininler ieren 0.2 mg/L NAA ile kombine edilen ya da edilmeyen MS ortamlarna aktarlmtr. 30 gnlk kltr sresinin ardndan sonular alnmtr. ekil 2.1de grld gibi BA ve TDZ ieren ortamda srgn uzamas ve geliiminin daha iyi olduu gzlenmitir. TDZ, sitokinin benzeri etkisiyle eksplant bana

11

srgn saysn, srgn geliimini ve srgn oluturan eksplant yzdesini arttrmtr. Deneme yaplan tm ortamlarda 20-50 gn iinde kk geliimi saptanmtr. Bitkicikler topraa baarl bir ekilde transfer edilmi, olgunlatrlm ve gelien bitkilerde somaklonal varyasyon belirtisi grlmemitir (Andrade, 1999).

ekil 2.2 Lavandula vera DCnin in vitro oaltm potansiyeline byme dzenleyicilerinin etkisi (Andrade, 1999)

Akdeniz karaba otunun (Lavandula stoechas L.) in vitro klonal oaltm iin yaplan aratrmada, d ortamda yetimi bitkilerden alnan eksplantlar kullanlmtr. In vitro kltr balangcnda ve srgn oaltm srasnda, srgn vitrifikasyonunu azaltc prosedrler gelitirilmitir. Margara N30K tuzlar ile 217,2 M adenine hemislfat (AdS) ve 0,05 M NAA ieren kltr ortamna alnan tek nodlu eksplanlardan 45 haftada srgn oaltm elde edilmitir. 5,4 M NAA ieren ortamda in vitro kklenme (%100) gereklemitir (Nobre, 1996). Yabani Lavandula trlerinin kltr iin en uygun ortamn saptanmas amacyla yaplan bir almada farkl ortam (A: 50% turbo, 25% perlit, 25% kum; B: 25% turbo,

12

25% am kabuu kompostu, 25% perlit, 25% kum; C: 50% am kabuu kompostu, 50% kum) kullanlmtr. Bunlardan C ortam aromatik bitkilerin yetitirilmesinde yaygn olarak kullanlmaktadr. Bitki geliimi iin bitki boyu, ana ve ikincil srgn saylar, gvde kalnl, kklerin ve dier paralarn ya ve kuru arlklar llmtr. Yava gelien eitlerde, substratlar arasnda fark grlmezken, hzl gelien trlerde, turbolu ortamda olduka yksek geliim oranlar gzlenmitir (Lopez et al., 1993). Lavandula stoechas L. iin uygun yetitirme koullarnn saptanmas amacyla yaplan bir almada, 4 aylk karaba otu filizleri 1:1 ya da 2:1 orannda turbo:perlit ieren ve pH 5.6-6.0 olan ortamda 6 ay kltre alnmlardr. Gbre olarak 20N-19P-19K, 2 g/L olarak haftada bir ya da iki haftada bir uygulanmtr. Bu almada 4 deneme kurulmutur. 1:1 Ortamnda haftada bir gbreleme; 2:1 ortamnda haftada 1 gbreleme; 1:1 ortamnda 2 haftada 1 gbreleme; 2:1 ortamnda 2 haftada bir gbreleme yaplmtr. 1:1 Ortamnda (turbo: perlit) haftada bir yaplan gbreleme, srgnlerin boylarnn uzamasn salamtr. 2:1 Ortamnda (turbo: perlit) haftada bir yaplan gbreleme, bitkilerin uzun dik srgnler ve tre zg daha fazla yanal srgnler oluturmalarna yol amtr. ki haftada bir yaplan gbrelemelerde bitkilerde klorozis olumutur. Bu uygulama 2:1 ortam ile kombine edildiinde srgn uzamas inhibe edilmitir ve bitkiler ak yeil, ksa ve sert bir grnm almtr (Papafotiou et al., 2000). Lavandula stoechas bitkilerinin ss bitkisi olarak kullanlma potansiyeli zerine yaplan bir almada, karaba otu bitkileri sakslarda yetitirilmitir. Denemeler, farkl evre koulunda yrtlmtr: stmasz basit bir sera, glgelik kafes ve ak hava. Biim, byme oran ve ieklenme yzdesi gibi lmler iklim verileri ile kyaslanmtr. Bitki en iyi geliimini glgelik kafes altnda gstermitir (Maloupa et al., 2000). Ik ve scaklk faktrlerinin Lavandula stoechas tohumlarnn imlenmesi zerine etkilerinin aratrlmas amacyla yaplan bir almada; tohumlar 25 gn boyunca 5, 10, 15, 20, 25, 30 ve 35oCde karanlk ve aydnlk (12 saat) koullarda kltre alnmtr. 5, 30 ve 30oCde aydnlk ya da karanlk koullarda bekletilen tohumlar imlenmemitir. 10, 15 ve 20oCde aydnlk ya da karanlk koullarda bekletilen tohumlarda imlenme artarken maksimum imlenme (%37,5) 25oCde karanlkta kltre alnan tohumlarda grlmtr. 10oCde k altnda imlenme kapasitesi en yksek orana (%96,2) km ve 25oCye doru scaklk ykseldike imlenme kapasitesi %76,2lere dmtr. Ik altnda bekletilen tohumlarda imlenme karanlktakilere gre daha erken gereklemitir.

13

Sonu olarak L. stoechas tohumlar iin 15+5 oC scaklk ile aydnlk koullar imlenme iin en iyi koullar olarak belirlenmitir (Maher et al., 2000). Hatay florasnda yetien karaba lavantann (Lavandula stoechas subsp. stoechas L.) elikle kklendirilmesi zerine farkl lokasyonlarn ve hormon dozlarnn etkisinin aratrld bir almada; biri sahil kesiminde (Ikl) dieri ise i kesimde bulunan (Narlca) iki lokasyondan alnan eliklerin kklenme durumlar incelenmitir. Her iki lokasyondan alnan bitki rneklerinin iek ve yapraklarnda uucu ya miktarlar belirlenmitir (izelge 2.2). Her iki lokasyondan da elikler ayn zamanda, ubat aynda alnmtr. Yar odunsu ve yaprakl olarak hazrlanan elikler, sera koullarnda kklendirme ortamna aktarlmlar ve on hafta sonra sklerek incelenmilerdir. Denemede kklenmeyi tevik edici olarak IBA kullanlmtr. ki farkl lokasyondan alnan eliklere, IBAnn 1000, 2000 ve 4000 ppmlik dozlar, 5 sn. sre ile uygulanm ve hi IBA uygulanmayan elikler kontrol olarak kullanlmlardr. Hormon dozlar kklenmeyi olumlu etkilemi ve her iki lokasyondan alnan eliklerde, uygulanan IBA konsantrasyonlarndaki arta bal olarak kklenme yzdesi, kk uzunluu ve kk says artmtr. Elde edilen veriler, Ikldan alnan eliklerin, Narlcaya gre daha yksek kklenme oranna sahip olduunu gstermitir. En yksek kklenme oran (% 70), Ikl kynden alnan ve 4000 ppm IBA uygulanan eliklerden elde edilmitir (izelge 2.3), (Ayanolu ve ark., 2000).

izelge 2.2 Hatay yresinde iki farkl lokasyondan alnan lavanta bitkilerinde uucu ya oranlar (%).

Lokasyon Ikl Narlca

Yaprak 0,78 1,12

iek 1,10 0,88

14

izelge 2.3 Farkl yrelerden alnan karaba lavanta eliklerinde kklenme oran (%).

IBA Konsantrasyonu 0 1000 ppm 2000 ppm 4000 ppm Ortalama

Lokasyonlar Ikl 30,0 46,6 36,6 70,0 45,8 Narlca 0,0 6,6 36,6 33,3 19,1 Ortalama 15,0 26,6 36,6 51,6

almada, kk uzunluuna ait en yksek deerler, 11,12 cm ile Ikldan alnan ve 4000 ppm IBA konsantrasyonuna tabi tutulan eliklerden alnmtr (izelge 2.4). Genel olarak, Ikldan alnan eliklerin kk uzunluklar, Narlcadan alnan eliklere gre daha uzun olmutur. Kk says bakmndan ise, en yksek deerler 12,24 adet/elik ile Ikl yresinden alnan ve 4000 ppm IBA konsantrasyonu uygulanan eliklerden elde edilmitir (izelge 2.4). Genel olarak, Ikl yresinden alnan eliklerin kk saylar, Narlca yresinden alnan eliklere gre daha fazla olmutur (Ayanolu ve ark., 2000).

izelge 2.4 Farkl yrelerden alnan karaba lavanta eliklerinde IBA konsantrasyonlarna gre kk uzunluu ve kk says.

IBA Konsantrasyonu 0 1000 ppm 2000 ppm 4000 ppm Ortalama

Kk Uzunluu (cm) Lokasyonlar Ikl 4,94 6,66 6,80 11,12 7,38 Narlca 0,00 1,28 4,14 3,14 2,14 Ortalama 2,47 3,97 5,47 7,13

Kk Says (adet/elik) Lokasyonlar Ikl 6,97 9,60 9,75 12,24 9,64 Narlca 0,00 3,00 8,53 6,83 4,59 Ortalama 3,48 6,30 9,14 9,54

15

3. MATERYAL ve METOD

3.1. Materyal
anakkale On Sekiz Mart niversitesi Ziraat Fakltesi Tarla Bitkileri Blmne ait deneme alannda, 20042005 yllarnda kltr yaplan karaba otu bitkilerine ait tohumlar materyal olarak kullanlmtr (ekil 3.1).

(a)

(b)

ekil 3.1 (a) almada kullanlan karaba otu tohumlarnn elde edildii kuru iekler (b) almada kullanlan karaba otu tohumlar

3.2. Metod
Aratrmada, karaba otu bitkilerinden alnan tohumlarnn yzey sterilizasyonlar, farkl yntemler kullanlarak yaplmtr. Steril tohumlar, deiik hormon kombinasyonlarna sahip MS (Murashige ve Skoog, 1962) ortamnda kltre alnmlardr. Besin ortamlarnn hazrlanmas, tohumlarn sterilizasyonu, imlendirilmesi ve eksplantlarn kltre alnmas ile ilgili yntemler aada ayrntl bir ekilde sunulmutur.

16

3.2.1.

Besin ortamlarnn hazrlanmas

Aratrmada mineral maddeler, vitaminler, bitki byme dzenleyicileri ve gelrite ieren MS (Murashige ve Skoog, 1962) besin ortamlar kullanlmtr (izelge 3.1).

izelge 3.1 MS (1962) besin ortamnn ierdii maddeler ve miktarlar.

Maddeler NH4NO3 KNO3 MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O H3BO3 KH2PO4 Na2MoO4.2H2O CaCl2.2H2O KI CoCl2.6H2O myo-Inositol Tritriplex(Na2EDTA) FeSO4.7H2O Nikotinik asit Pridoksin-HCl Tiamin-HCl

MS Besin Ortamndaki Miktarlar (mg/L) 1650 1900 370 22,3 8,6 0,025 6,2 170 0,25 440 0,83 0,025 100 37,3 27,8 0,5 0,5 0,1

imlenme, srgn oluumu ve geliimi ve kklendirme almalar iin bitki byme dzenleyicilerinin farkl kombinasyonlarn ieren MS ortamlar denenmitir. Aratrmada kullanlan MS 1BAP ortamnn (izelge 3.2) hazrlanmas iin nceden oluturulmu stok zeltilerden 1 litre iin gerekli olan miktarlar alnarak, behere aktarldktan sonra 1 mg BAP eklenmitir. Ortama 30 g skroz ilave edilip, hacim destile su ile 1 litreye tamamlanmtr. Skroz iyice eritildikten sonra seyreltilmi NaOH ve HCl kullanlarak pH=5,8 e ayarlanmtr. 2,5 g/L gelrite ilave edildikten sonra srekli kartrlarak kaynatlan ortam, scak olarak kapakl deney tplerine 10ar mL olmak zere dklmtr. Azlar kapatlan tpler, otoklavda 121 0Cde 15 dakika sterilize

17

edilmilerdir. Aratrmada kullanlan dier besin ortamlarnn hazrlanmas srasnda da ayn ilemler uygulanmtr.

3.2.2.

Tohum sterilizasyonu

Karaba otu tohum rnekleri, ncelikle sabunlu su ile iyice ykanp akan eme suyuyla durulanmtr. Tohumlarn sterilizasyonlarnda 2 farkl yntem kullanlmtr. %70lik etil alkolde 1 dakika bekletilen tohumlar, daha sonra %30luk ticari sodyum hipokloritte (NaOCl) 20 ve 25 dakika tutulmulardr (izelge 3.2). Bu ilemlerin ardndan, 3 kez steril distile suda alkalanan tohumlar, steril filtre kad zerine braklm, fazla sularndan arndrlmlardr.

izelge 3.2 Tohumlara uygulanan sterilizasyon yntemleri.

Uygulama Etil alkol uygulamas NaOCl uygulamas

I %70lik 1 dakika % 30luk 20 dakika

II %70lik 1 dakika % 30luk 25 dakika

3.2.3.

Tohumlarn imlendirme ortamna alnmas

Tohumlarn imlendirilmesinde, gelrite ieren MS ortam ve su ile slatlm pamuklu ortamlar kullanlmtr. Sterilizasyon prosedr uygulanan tohumlar, her bir tpte bir tohum bulunacak ekilde, imlendirme ortamlarnda kltre alnmlardr. Skroz ve bitki byme dzenleyicilerinin ierikleri izelge 3.3de verilmitir.

18

izelge 3.3 Tohumlarn imlendirilmesinde kullanlan ortamlar.

Ortam 1 2 3 4 MS MS 1BAP MS 1IBA Nemli Pamuk

Skroz 30 g/L 30 g/L 30 g/L -

Bitki Byme Dzenleyicileri 1 mg/L BAP 1 mg/L IBA -

3.2.4. alnmas

Srgn nod eksplantlarnn srgn geliimi ortamlarnda kltre

In vitro koullarda imlendirilen karaba otu tohumlarndan gelien steril im bitkilerinden elde edilen, 2-3 nodlu srgn eksplantlar, her bir tpte bir eksplant olacak ekilde, srgn geliimi ortamlar ieren tplere aktarlmtr. Srgn geliimi iin 3 farkl MS ortam kullanlmtr. Yar kat besin ortamlarnn skroz ve bitki byme dzenleyicilerinin ierikleri izelge 3.4de verilmitir.

izelge 3.4 Srgn geliimi iin kullanlan besin ortamlarnn kompozisyonlar.

Ortam 1 2 3 MS 1BAP MS 2BAP MS 5BAP

Skroz 30 g/L 30 g/L 30 g/L

Bitki Byme Dzenleyicileri 1 mg/L BAP 2 mg/L BAP 5 mg/L BAP

19

3.2.5. alnmas

Srgn nod eksplantlarnn kk geliimi ortamlarnda kltre

Tohum kkenli bitkiciklerden elde edilen 2-3 nodlu srgn nod eksplantlar, kklendirme ortamlarna alnmtr. Kk geliimi iin kullanlan 4 farkl besin ortamnn skroz ve bitki byme dzenleyicilerinin ierikleri izelge 3.5de verilmitir.

izelge 3.5 Kk geliimi iin kullanlan besin ortamlar.

Ortam 1 2 3 4 MS 0,1IBA MS 1IBA MS 2IBA MS 1NAA

Skroz 30 g/L 30 g/L 30 g/L 30 g/L

Bitki Byme Dzenleyicileri 0,1 mg/L IBA 1 mg/L IBA 2 mg/L IBA 1 mg/L NAA

3.2.6. Srgn oaltlmas

nod

eksplantlarndan

tek

tohum

kkenli

klonlarn

1 mg/L BAP ieren MS ortamnda imlendirilen tohumlardan bir tanesi seilmi ve elde edilen im bitkisi (klon 1) srasyla MS 0,1IBA, MS 1BAP, MS 0,1IBA ve MS 1BAP ortamlarnda er hafta sreyle 4 kez altkltre alnarak oaltlmtr. Bu altkltrler sonucu elde edilen klon 1 bitkiciklerinden kesilen 2-3 nodlu srgn eksplantlar, 9 farkl ortamda (izelge 3.6) kltre alnm ve byme parametreleri kaydedilmitir. Yine MS 1BAP ortamnda imlendirilen tohumlardan, bir dieri seilmi ve elde edilen im bitkisi (klon 2) srasyla MS 0,1IBA ve MS 1BAP ortamlarnda er hafta sreyle 2 kez altkltre alnarak oaltlmtr. Altkltrler sonucu elde edilen klon 2 bitkiciklerinden kesilen 2-3 nodlu srgn eksplantlar, 2 farkl ortamda (izelge 3.7) kltre alnm ve byme parametreleri incelenmitir.

20

izelge 3.6 Bitki byme dzenleyicilerinin in vitro Lavandula stoechas L.e ait klon 1 bitkilerinin byme parametreleri zerine olan etkilerinin belirlenmesi iin kullanlan ortamlar.

Ortam 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MS 0,1BAP MS 0,5BAP MS 1BAP MS 0,1IBA MS 0,5IBA MS 1IBA MS 0,1NAA MS 0,5NAA MS 1NAA

Skroz 30 g/L 30 g/L 30 g/L 30 g/L 30 g/L 30 g/L 30 g/L 30 g/L 30 g/L

Bitki Byme Dzenleyicileri 0,1 mg/LBAP 0,5 mg/L BAP 1 mg/L BAP 0,1 mg/L IBA 0,5 mg/L IBA 1 mg/L IBA 0,1 mg/L NAA 0,5 mg/L NAA 1 mg/L NAA

izelge 3.7 Bitki byme dzenleyicilerinin in vitro Lavandula stoechas L.e ait klon 2 bitkilerinin byme parametreleri zerine olan etkilerinin belirlenmesi iin kullanlan ortamlar.

Ortam 3 6 MS 1BAP MS 1IBA

Skroz 30 g/L 30 g/L

Bitki Byme Dzenleyicileri 1 mg/LBAP 1 mg/L IBA

Aratrmada incelenen byme parametreleri; ortalama bitki boyu (cm), srgn nod eksplant bana ortalama srgn says (adet), srgn nod eksplant bana ortalama nod says (adet), srgn nod eksplant bana ortalama kk says (adet) ve srgn nod eksplantlarnn ortalama kallus oluturma yzdeleridir.

3.2.7.

Kltr koullar

Tm kltrler, fluoresan nda 4000 lux aydnlatma altnda, 16 saat aydnlk / 8 saat karanlk fotoperiyotta ve 274C scaklkta tutulmulardr.

21

3.2.8.

Denemenin kurulmas ve verilerin deerlendirilmesi

Aratrmamz, tohumlardan gelitirilen bitkiciklerden elde edilen srgn nod eksplantlarnda, srgn ve kk geliiminin incelendii, n denemeler ile, tek tohumdan gelitirilen klonlarda (klon 1 ve klon 2), byme parametrelerinin incelendii, klon denemeleri olarak iki ayr deneme eklinde kurulmutur. Tek faktr olarak besin ortamlarnn (izelge 3.4; 3.5; 3.6; 3.7) ele alnd n denemeler ile klon denemeleri, 3 tekerrrl olarak, tesadf parselleri deneme desenine gre oluturulmu ve deerlendirilmitir. Karaba otu bitkisinde, klonlar aras farkllklarn saptanabilmesi iin, denemelerden elde edilen byme parametreleri, birinci faktr olarak klonlarn (klon 1 ve klon 2); ikinci faktr olarak besin ortamlarnn (izelge 3.7) ele alnd 2 faktrl tesadf parselleri deneme deseninde incelenmitir. Tm deerlendirmelerde farkllklarn nem dzeylerinin ve boyutlarnn saptanabilmesi iin asgari nemli fark (AF=LSD) test yntemi kullanlmtr (Akgz, 1998). almada, oransal olarak ifade edilen verilerin deerlendirilmesinde 0 deerleri ieren verilere log transformasyonu uygulanmtr. Bu transformasyon tipinde sfr deerlerinin her birine 1 deeri eklendikten sonra transformasyon yaplmtr. Orijinal verilerin 1den kk olduu durumlarda tm veriler sabit bir say (100) ile arplarak negatif sonu nlenmi ve 10 tabanl logaritma uygulanmtr (Akgz, 1988).

22

4. BULGULAR

4.1. Kltre alnan tohumlarda kontaminasyon durumu

almada, toplam 360 tohum imlendirilmek zere kltre alnmtr. Kullanlan 4 farkl ortamda (izelge 3.2) grlen kontaminasyon yzdelerinin ortalamalar izelge 4.1de gsterilmitir. Drt farkl ortamda tohum sterilizasyonu bakmndan yaplan istatistiki deerlendirmede, ortamlar arasndaki farkn ve uygulanan yntemler arasndaki farkn nemsiz olduu tespit edilmitir.

izelge 4.1 Tohumlarn yzeysel sterilizasyonlar sonucu belirlenen kontaminasyon yzdeleri.

Uygulamalar 1 %30luk Ticari NaOClde 20 dakika Ortamlar

MS MS 1BAP MS 1IBA Pamuk Ort.

2 %30luk NaOClde 25 dakika

Tek. I 3,3 6,7 6,7 10,0 6,7

Tek. II 10,0 3,3 3,3 0,0 4,2

Tek. III 6,7 3,3 0,0 3,3 3,3

Ort. 6,7 4,4 3,3 4,4 4,7

Tek. I 0,0 0,0 3,3 0,0 0,8

Tek. II 3,3 0,0 0,0 3,3 1,7

Tek. III 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Ort. 1,1 0,0 1,1 1,1 0,8

Uygulanan yntemlerin tohumlarda kontaminasyon oluum yzdeleri zerinde istatistiksel adan bir fark bulunmam olsa da %0,8 deeri ile % 30luk ticari NaOCl de 25 dakika olan uygulamann daha etkili olduu saptanmtr. Tohumlarn ayn deriimdeki zeltide 20 dakika bekletildii dier uygulamada ok farkl sonular elde edilmemesine ramen, kontaminasyon yzdesi daha yksek bulunmutur (ekil 4.1).

23

Kontamisnasyon Yzdesi (%)

100 80 60 40 20 0 1 Uygulama Numaras 2 4,7

0,8

ekil 4.1 Tohumlarn kullanlan sterilizasyon yntemlerine gre kontaminasyon yzdeleri

4.2. Kltre alnan tohumlarda grlen gelimeler

imlenen tohum says iin yaplan istatistiki deerlendirme sonucunda, ortamlar arasndaki fark % 1 seviyesinde nemli bulunmutur (F = 194,184). statistiki adan ilk grupta yer alan ortamda (MS 1BAP) imlenen tohum says ortalama 29,7 adettir. Bu ortam, 8,3 ortalama ile 1 mg/L IBA ieren MS ortam takip etmitir. Daha dk ortalamalara sahip olan nemli pamuk (5,7) ve MS (5,3) ortamlar ise ikinci grupta yer almlardr (LSD= 9,681) (izelge 4.2).

izelge 4.2 Kltre alnan tohumlarda imlenme durumlar.

imlenen tohum says (adet) Ortamlar

MS MS 1BAP MS 1IBA Nemli Pamuk

Tek. I 7 30 8 6

Tek. II 5 30 8 8

Tek. III 4 29 9 3 5,3

Ort. B A B B 29,7 8,3 5,7

Her bir tekerrrde kltre alnan tohum says 30 adettir.

24

imlenen Tohum Says (Adet)

30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 MS MS 1BAP MS 1IBA Nemli Pamuk imlendirme Ortamlar

ekil 4.2 Kltre alnan tohumlarda imlenme durumlar

imlendirme ortamlar ierisinde, 1 mg/L BAP ieren MS ortam imlenme yzdesi (%99) bakmndan en verimli ortam olarak saptanmtr (ekil 4.2). Ancak bu ortamda imlenen tohumlardan gelien im bitkilerinin kk ksmlarnda ok hzl kallus oluumlar grlmtr. Bu nedenle bu bitkicikler imlenmenin hemen ardndan srgn geliimi ortamlarna aktarlmtr.

(a)

(b)

ekil 4.3 (a) MS 1BAP ortamnda kltre alnan Lavandula stoechas L. tohumlar (b) MS 1IBA ortamnda imlenen Lavandula stoechas L. tohumu

25

4.3. Lavandula stoechas L. bitkilerinde in vitro srgn geliimi

imlendirme ortamlarnda kltre alnan tohumlardan gelien im bitkilerine ait nodal eksplantlar, srgn geliimi ortamlarna (izelge 3.3) aktarlmtr. Bu eksplantlarda 3 hafta sonra yaplan gzlemler sonucunda belirlenen srgn saylar bakmndan yaplan istatistiki deerlendirmeye gre, ortamlar arasnda farkllklar %1 seviyesinde nemli bulunmutur (F=168,753). En yksek srgn says deeri (2,80), MS 1BAP ortamndan elde edilirken, en dk deerler (1,42), 5 mg/L BAP ieren MS ortamndan elde edilmitir (LSD=0,357) (ekil 4.4a ve b, izelge 4.3).

(a)

(b)

ekil 4.4 (a) ve (b) Lavandula stoechas L.de srgn geliimleri

izelge 4.3 Srgn ortamlarnda kltre alnan 2-3 nodlu srgn eksplantlarnda grlen gelimeler.

Ortam

Ortalama Srgn Says* (adet)

Tek. I Tek. II Tek. III Ort.

Ortalama Nod Says** (adet)

Tek. I Tek. II Tek. III Ort.

Kallus Oluturan Eksplant Yzdesi*** (%)

Tek. I Tek. II Tek. III Ort.

MS 1BAP MS 2BAP MS 5BAP

2,80 1,73 1,53

2,87 1,80 1,40

2,73 1,87 1,33

2,80 1,80 1,42

A B C

4,80 2,87 1,73

4,73 2,73 1,67

4,93 2,93 1,60

4,82 2,84 1,67

A B C

60 80 100

73 73 100

73 87 100

69 80 100

C B A

Kltre alnan nodal eksplant says 15 adettir. * 3. haftada tohum kkenli nod eksplantlarnn ortalama srgn saylar. ** 3. haftada tohum kkenli nod eksplanlarnda oluan ortalama nod saylar. ***3. haftada tohum kkenli nod eksplantlarnn kallus oluturma yzdeleri.

26

Srgn geliimi iin kltre alnan tohum kkenli nodal eksplantlarda 3 hafta sonra yaplan gzlemler sonucunda elde edilen srgnlerde belirlenen nod saylar bakmndan yaplan istatistiki deerlendirmeye gre, ortamlar arasnda farkllklar % 1 seviyesinde nemli bulunmutur (F =1031,734). Buna gre 1 mg/L BAP ieren MS ortam 4,820 deeri ile birinci grupta yer alrken, MS 2BAP ortam 2,843 deeri ile ikinci grubu oluturmutur (LSD: 0,323). Srgn geliimi iin farkl oranlarda BAP ieren MS ortamlarnn kullanld almada srgn ve nod says bakmndan en iyi sonular 1mg/L BAP ieren MS ortamndan elde edilmitir (ekil 4.5).

Ortalama Srgn Says Srgn, Nod Says (adet) 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 MS 1BAP

Ortalama Nod Says

MS 2BAP Besin Ortamlar

MS 5BAP

ekil 4.5 Srgn ortamlarnda kltre alnan 2-3 nodlu srgn eksplantlarnda grlen gelimeler

Nodal eksplantlardan srgn geliimi iin kullanlan ortamlarn tmnde kallus oluumlar tespit edilmitir (izelge 4.3). Besin ortamlarnda kallus oluturan eksplant yzdesi bakmndan yaplan istatistiki deerlendirmede, ortamlar arasndaki farkn %1 seviyesinde nemli olduu bulunmutur (F=21,506). Bu zellik bakmndan en yksek deere sahip MS 5BAP ortam %100 deeri ile birinci grupta yer alrken, %69 deeri ile MS 1BAP ortam son grubu oluturmutur (LSD: 22,275). Yaplan gzlemlerde BAP ieren ortamlarda kltre alnan eksplantlarda ilk haftadan itibaren kalluslar tespit edilmitir. Ortamdaki BAP orannn artyla birlikte kallus oluturan eksplant yzdesi de artmtr (ekil 4.6).

27

Kallus oluturan eksplant yzdesi 100,00 Kallus Oluturan Eksplant Yzdesi 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 MS 1BAP MS 2BAP Ortamlar MS 5BAP

ekil 4.6 Srgn geliim ortamlarna alnan 2-3 nodlu srgn eksplantlarnda kallus oluumu

4.4. Lavandula stoechas L. bitkilerinde in vitro kk geliimi

Aratrmada kk oluumu iin yaplan n denemede byme dzenleyicileri tipi ve konsantrasyonlar bakmndan farkl 4 MS ortam kullanlmtr (izelge 3.4). Kklendirme ortamna alnan eksplantlarda 3 hafta sonra yaplan gzlemler sonucunda belirlenen kk saylar bakmndan yaplan istatistiki deerlendirmede, ortamlar arasndaki farkllklar %1 seviyesinde nemli bulunmutur (F=425,419). Kk says bakmndan en yksek deere sahip MS 1NAA ortam 3,113 deeri ile ilk grupta yer alrken bunu 2,000 deeri ile ikinci grupta yer alan MS 1IBA ortam izlemitir (LSD: 0,299) (ekil 4.7a ve b, izelge 4.4).

28

(a)

(b)

ekil 4.7 (a) ve (b) Lavandula stoechas L.de kk geliimleri

izelge 4.4 Kklendirme ortamlarnda kltre alnan 2-3 nodlu srgn eksplantlarnda grlen gelimeler

Ortamlar

Ortalama Kk Says* (adet)

Kallus Oluturan Eksplant Yzdesi**

Tek. I Tek. II Tek. III

MS 0,1IBA MS 1IBA MS 2IBA MS 1NAA

Ort.

Tek. I Tek. II Tek. III 0,00 6,67 20,00 33,33 0,00

Ort. 4,44 BC 17,78 AB 35,56 A 0,00 C

1,93 1,00 0,60 3,27

2,07 0,73 0,47 3,00

2,00 0,80 0,53 3,07

2,00 B 6,67

0,84 D 20,00 13,33 0,53 C 26,67 46,67 3,11 A 0,00 0,00

Kltre alnan nodal eksplant says 15 adettir. * 3. haftada tohum kkenli nod eksplantlarnn ortalama kk saylar. **3. haftada tohum kkenli nod eksplantlarnn kallus oluturma yzdeleri.

Nodal eksplantlardan kk geliimi iin kullanlan ortamlarda kallus oluumlar gzlenmitir (izelge 4.4; ekil 4.9 a ve b; 4.10). Kk geliim ortamlarnda kallus oluturan eksplant says bakmndan yaplan istatistiki deerlendirmede, ortamlar arasndaki farkn %1 seviyesinde nemli olduu bulunmutur (F=19,878). Bu zellik bakmndan en yksek deere sahip MS 2IBA ortam %35,56 deeri ile birinci grupta yer almtr (LSD: 0.821).

29

Ortalama Kk Says (adet)

3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 MS 0,1IBA MS 1IBA MS 2IBA MS 1NAA Ortamlar

ekil 4.8 Kk geliim ortamlarnda kltre alnan 2-3 nodlu srgn eksplantlarnda ortalama kk saylar

(a)

(b)

ekil 4.9 (a) ve (b) Lavandula stoechas L. bitkiciklerinin kk blgesinde kallus geliimleri

30

Kallus Oluturan Eksplant Yzdesi Kallus Oluturan Eksplant Yzdesi 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 MS 0,1IBA MS 1IBA MS 2IBA MS 1NAA Ortamlar

ekil 4.10 Kk geliim ortamlarna alnan 2-3 nodlu srgn eksplantlarnda kallus oluumu

4.5. Farkl besin ortamlarnn in vitro Lavandula stoechas L. klonu zerine etkileri
1 mg/L BAP ieren MS ortamnda imlenen Lavandula stoechas L. tohumlarndan, kallus oluturmayan, uzun boylu ve 3-4 nod tayan 2 tanesi seilmi ve bu iki tohumdan klon 1 ve klon 2 bitkicikleri oaltlmtr. oaltma ilemi iin, ilk olarak, imlenen tohumlar MS 0,1IBA ortamna aktarlmlardr. Bu ortamda gelien oklu srgnler kesilerek MS 1BAP ortamna transfer edilmilerdir. Bundan sonra srasyla MS 0,1IBA ve MS 1BAP ortamlarnda altkltrler yaplarak denemenin kurulabilmesi iin yeterli srgn nod saysna ulalmtr. Aratrmada, klon 1 bitkiciklerine ait nodal eksplantlar, byme dzenleyicilerinin farkl konsantrasyonlarn ieren 9 farkl MS ortamna, klon 2 bitkiciklerine ait nodal ekplantlar da 2 farkl MS ortamna alnmtr (izelge 3.5 ve 3.6). hafta sonunda bu bitkiciklere ait eitli byme parametreleri kaydedilmitir (izelge 4.5 ve 4.6 ). Aratrmada her bir tekerrr iin kltre alnan srgn nod eksplant says 15 adettir.

izelge 4.5 Farkl byme dzenleyicileri ieren ortamlarn Lavandula stoechas L. klon 1 bitkilerinin byme parametrelerine etkisi.

izelge 4.6 Farkl byme dzenleyicileri ieren ortamlarn Lavandula stoechas L. klon 2 bitkilerinin byme parametrelerine etkisi.

31

32

hafta sonra klon 1 bitkicikleri iin ortalama bitkicik boyu deeri asndan yaplan istatistiki deerlendirmede, ortamlar arasndaki farkn % 1 seviyesinde nemli olduu saptanmtr (F = 6,266). En yksek deerler, 2,23 cm boy uzunluu ile MS 0,1IBA ortamnda (4 nolu ortam) ve bunu takiben MS 0,1BAP ve MS 0,5BAP (2,04 cm) ortamlarnda (1 ve 2 nolu ortam) elde edilmitir (LSD=0.238) (izelge 4.5) (ekil 4.11).

(a)

(b)

ekil 4.11 (a) In vitroda gelitirilen uzun Lavandula stoechas L. srgn (MS 0,1IBA ortamnda) (b) In vitroda gelitirilen ksa L. stoechas L. srgnleri (MS 0,5BAP ortamnda)

Dokuz farkl modifiye MS ortamnda kltre alnan klon 1 bitkileri iin hafta sonra ortalama srgn says asndan yaplan istatistiki deerlendirmede, ortamlar arasnda %1 nemliliinde farkllklar bulunmutur (F=34,735). Bu zellik bakmndan en yksek deere sahip MS 0,1NAA ortam (7 nolu ortam) 3,600 deeri ile birinci grupta yer alrken bunu 3,447 deeri ile ikinci grupta yer alan MS 0,5IBA ortam (5 nolu ortam) izlemitir (LSD: 0,186) (izelge 4.5) (ekil 4.12a ve b). hafta sonra klon 1 bitkileri iin ortalama nod says asndan yaplan istatistiki deerlendirmede, ortamlar arasnda farkn %1 seviyesinde nemli olduu grlmtr (F=249,424). Bu zellik iin en yksek deer (8,62), birinci grupta yer alan MS 0,5IBA ortamndan (5 nolu ortam) elde edilirken, en dk deer (4.82), 1 mg/L BAP ieren 3 nolu ortamdan elde edilmitir (LSD=0,297) (izelge 4.5) (ekil 4.12f).

33

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

ekil 4.12 (a) ve (b) 7 nolu ortamda (MS 0,1NAA) oluan oklu srgnler (c) ve (d) 4 nolu ortamda (MS 0,1IBA) oluan srgnler (e) 9 nolu ortamda (MS 1NAA) oluan oklu srgnler (f) 5 nolu ortamda (MS 0,5 IBA) oluan tek srgn zerindeki sk nodlar

34

hafta sonra klon 1 bitkileri iin ortalama kk says asndan yaplan istatistiki deerlendirmede ortamlar arasnda %1 nemliliinde farkllklar bulunmutur (F=342,323). Bu zellik bakmndan en yksek deer ortalama 3,444 adet kk says ile MS 1NAA ortamndan (9 nolu ortam) elde edilmitir. Bunu 2,289 kk says deeri ile MS 0,5 NAA (8 nolu ortam) ortam izlemitir (LSD=0,050) (izelge 4.5) (ekil 4.13;14).

(a)

(b)

(c)

(d)

ekil 4.13 (a) 1 Nolu ortamdaki (MS 0,1BAP) kkl bitki (b) ve (c) 9 nolu ortamdaki (MS 1NAA) kkl bitkiler (d) 8 nolu ortamdaki (MS 0,5NAA) kkl bitki

35

(a)

(b)

ekil 4.14 (a) ve (b) 6 Nolu ortamda (MS 1IBA) kltre alnan srgn nod eksplantlarnda gelien kkler

Klon 1 bitkileri iin 3 hafta sonra kallus oluturan eksplant yzdesi asndan yaplan istatistiki deerlendirmede ortamlar arasndaki fark %1 seviyesinde nemli bulunmutur (F=28,728). Kallus oluturan eksplant yzdesi bakmndan en yksek deerler %68,889 ile MS 1BAP (3 nolu ortamdan) elde edilmitir. Birinci grupta bulunan bu ortam; %37,778 deeri ile MS 0,5BAP ortam ve %20,000 deeri ile MS 0,1BAP ortam takip etmitir ve bu iki ortam ayn grupta yer almtr (LSD= 0,568) (izelge 4.5) (ekil 4.15; 16).

(a)

(b)

ekil 4.15 (a) 1 nolu ortamdaki (MS 0,1BAP) kalluslu bitki (b) 2 nolu ortamdaki (MS 0,5BAP) kalluslu bitki

36

(a)

(b)

ekil 4.16 (a) ve (b) 3 Nolu ortamda (MS 1BAP) kltre alnan srgn nod eksplantlarnda oluan kalluslar

Dokuz farkl ortamda kltre alnan klon 1 bitkileri iin 3 hafta sonra ortalama boy uzunluu, ortalama srgn says, ortalama nod says ve ortalama kk says bakmndan en olumlu sonular IBA ve NAAnn farkl konsantrasyonlarn ieren 4,5,6,7,8 ve 9 nolu ortamlardan alnmtr ( ekil 4.15).

Ortalama Bitki Boyu (cm) Ortalama Nod Says (adet) 10,00 Byme Parametreleri 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 1 2 3 4

Ortalama Srgn Says (adet) Ortalama Kk Says (adet)

Ortam Numaralar

ekil 4.17 Dokuz farkl ortamda kltre alnan klon 1 bitkilerine ait srgn nod eksplantlarnda grlen gelimeler

37

Klon 1 bitkileri iin kallus oluturan eksplant yzdesi deerlerine bakldnda, ortalama nod says ve ortalama kk says bakmndan olumlu sonularn alnmad BAPn farkl konsantrasyonlarn ieren 1, 2 ve 3 nolu ortamlarn daha etkili olduu grlmtr (ekil 4.16).

Kallus Oluturan Eksplant Yzdesi 100,00 Kallus Oluturan Eksplant Yzdesi 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ortam Numaralar

ekil 4.18 Dokuz farkl ortamda kltre alnan klon 1 bitkiciklerine ait srgn nod eksplantlarnn kallus oluturma yzdeleri

ki farkl modifiye MS ortamnda (MS 1BAP ve MS 1IBA) kltre alnan klon 2 bitkilerine ait eksplantlarn 3 hafta sonundaki byme parametreleri ayn ortamlarda kltre alnan klon 1 bitkilerine ait eksplantlarn byme parametreleri ile karlatrlmtr. hafta sonra klon 1 ve klon 2 bitkicikleri iin ortalama boy uzunluu ve srgn says asndan yaplan istatistiki deerlendirmede, klonlar ve ortamlar arasndaki farkn nemsiz olduu bulunmutur. Klon 1 eksplantlarnn dokuz farkl ortama alnd dier denemede 3 hafta sonra yaplan istatistiki deerlendirmede ortalama boy uzunluu ve srgn says deerleri bakmndan MS 1BAP ve MS 1IBA (3 ve 6 nolu ortamlar) ortamlar ayn grupta bulunmutur (izelge 4.5). Bu bilgi klon 1 ve klon 2 bitkiciklerinde boy uzunluu ve srgn says deerleri iin ortamlar arasndaki farkn nemsiz olduu bilgisini destekler niteliktedir.

38

hafta sonra iki farkl klona ait bitkicikler iin ortalama nod says asndan yaplan istatistiki deerlendirmede klonlar arasndaki fark nemsiz bulunurken ortamlar arasndaki farkn %1 deerinde nemli olduu bulunmutur (F=2256,286). Bu zellik iin ortalama 7,635 nod says deeri ile MS 1IBA ortam daha etkilidir ve klon 1 bitkileri iin yaplan dier denemede alnan sonular (izelge 4.5) bunu desteklemektedir (LSD=0,140). ki farkl klona ait bitkicikler iin hafta sonra ortalama kk says asndan yaplan istatistiki deerlendirmede klonlar arasndaki fark nemsiz bulunmu ancak ortamlar arasnda %1 nemliliinde farklar saptanmtr (F=477,019). Bu zellik iin 0,867 adet kk says deeri ile MS 1IBA ortamnn daha etkili olduu grlmtr (LSD=0.045). hafta sonra iki farkl klona ait bitkicikler iin kallus oluturan eksplant yzdesi asndan yaplan istatistiki deerlendirmede klonlar arasndaki fark nemsiz bulunmutur. Ortamlar arasndaki fark ise %1 seviyesinde nemlilik gstermitir (F=160,102). Bu zellik iin daha etkili olan ortam %70,000 deeri ile MS 1BAP ortam olarak belirlenmitir (LSD=15.958).

Ortalama Bitki Boyu (cm) Ortalama Nod Says (adet) 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 1 3 2 Byme Parametreleri

Ortalama Srgn Says (adet) Ortalama Kk Says (adet)

1 6

Ortam Numaralar

ekil 4.19 ki farkl ortamda kltre alnan klon 1 ve klon 2 bitkiciklerine ait srgn nod eksplantlarndaki gelimeler

39

Kallus Oluturan Eksplant Yzdesi Kallus Oluturan Eksplant Yzdesi 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 Klon 1 3 Ortam Numaralar Klon 2 Klon 1 6 Klon 2

ekil 4.20 ki farkl ortamda kltre alnan klon 1 ve klon 2 bitkiciklerine ait srgn nod eksplantlarnn kallus oluturma yzdeleri

40

5. TARTIMA ve SONU
Karaba otu tohumlarnn yzeysel sterilizasyonunda, tohumlar sterilizasyon zeltisinde daha uzun sre bekletildiklerinde tohum kabuklar eriyerek uzaklamtr. Ak sar renkli bu tohumlar kltr ortamlarnda daha hzl imlenmilerdir. Karaba otu tohumlarnn, in vitro koullarda imlendirilmesi iin yaplan denemelerde, en ideal imlendirme ortamlarnn, 1 mg/L BAP ieren MS ortamlar olduu saptanmtr. Tohumlar bu ortamlarda %97 orannda imlenmilerdir. En iyi imlenmelerin gelitii bu ortamda bitkiciklerin kallus oluturma yzdeleri de olduka yksektir. Bu ortamda imlendirilen tohumlardan gelien steril im bitkileri, imlenmenin hemen ardndan 1 hafta iinde kk blgelerinde youn kallus oluturmulardr. Bu nedenle imlendirmenin hemen ardndan bitkiciklerin srgn geliimi ortamlarna aktarlmas gerekmitir. Lavandula trlerinin tohum ve odunsu gvde elikleri ile oaltm olduka yavatr ve eliklerin kklenme oranlar dktr. Bu nedenle vegetatif oaltma alternatif olarak koltuk alt tomurcuklar ile mikrooaltm nerilmitir (Andrade et al., 1999). Srgn geliimi iin yaplan n denemelerde BAPn farkl konsantrasyonlarn ieren MS ortamlar kullanlmtr. BAP ieren tm ortamlarda hzl ve youn kallus oluumuna rastlanmtr. Kallus oluumunun grld eksplantlarda gelien srgnlerin yaps normal formundan farkl olarak cams ve byk yaprakldr. Bunun yannda bu eksplantlarda ortalama srgn ve nod saylar da daha azdr. Nobre (1996)nin Lavandula stoechas ile yapt almada da benzer sonular alnmtr. Nobre (1996) yapt almada, BAnn, oaltma katsaysna etkisinin olmadn ve BAnn yksek konsantrasyonlarn ieren ortamlarda, srgnlerde camslamalarn grldn bildirmitir. Klon 1 bitkiciklerinden elde edilen eksplantlarda, byme parametrelerinin incelenmesi iin kurulan denemede, BAP, IBA ve NAAnn farkl konsantrasyonlarn ieren MS ortamlar kullanlmtr. Elde edilen bulgulara gre, bu byme dzenleyicilerinin dk konsantrasyonlarn ieren MS ortamlarnda en iyi srgn geliimi gereklemitir. Srgn ve nod says bakmndan en iyi byme dzenleyicisi olan NAAn, en ideal konsantrasyonunun, %3,6 ortalama srgn says ve %8,44 ortalama nod says ile 0,1 mg/L olduu saptanmtr.

41

Lavandula stoechas L.de in vitro kk oluumu iin IBAnn farkl konsantrasyonlar (0,1; 1 ve 2 mg/l) ile 1 mg/l NAA ieren MS ortamlarnn kullanld n denemelerde kk says bakmndan en iyi ortamlarn MS 1NAA ortam ile 0,1mg/l IBA ieren MS ortam olduu tespit edilmitir. Klon 1 bitkiciklerinin byme parametrelerinin saptanmas iin kurulan denemede de IBA ve NAAnn farkl konsantrasyonlarn ieren MS ortamlar kullanlmtr. n denemelerden alnan sonulara benzer ekilde kk geliimi iin en ideal ortamlarn NAA ieren ortamlar olduu tespit edilmitir. Kk geliim ortamlarndan, kallus oluturan eksplant says yksek olanlarda, kk saylarnn dk olduu grlmtr. Bu durum kalluslarn genellikle bitkiciklerin besin ortamna deen alt ksmlarnda olumasndan kaynaklanmtr. Kallus oluumu nedeniyle kk oluumu engellenmitir. ki farkl karaba otu tohumundan bitki klonlar (klon 1 ve klon 2) oluturulmutur. ncelikle tohumlar 1 mg/L BAP ieren MS ortamnda imlendirilmitir. imlendirmenin hemen ardndan bitkicikler 0,1 mg/L IBA ieren MS ortamna alnmtr. 3 hafta kltrde bekletilen bitkiciklerin srgn nod eksplantlar, 1 mg/L BAP ieren MS ortamna aktarlmtr. Klon denemeleri iin yeterli materyale ulamak amacyla yaplan altkltrlemelerde srayla IBA ve BAP ortamlar kullanlmtr. Altkltrlemeler srekli BAPl ortamlarda yapldnda yksek oranda kallus oluumu ve kallus oluturan bitkiciklerden alnan srgn nod eksplantlarnda camslama sorunlar ile karlalmtr. Yine altkltrlemeler srekli IBAl ortamlarda yapldnda bitkiciklerde sararmalar meydana gelmitir. Bu sorunlarn zm iin altkltrlemeler srayla BAPl ve IBAl ortamlarda yaplmtr. Klon 1 bitkiciklerinden elde edilen srgn nod eksplantlarnn farkl ortamlardaki byme parametrelerinin karlatrlmas iin 9 MS ortam kullanlmtr. Elde edilen bulgulara gre, byme parametresi olarak ele alnan ortalama boy uzunluu, ortalama srgn says, ortalama nod says, ortalama kk says ve kallus oluturan eksplant yzdeleri ortamlara gre farkllk gstermitir. Klon 1 ve klon 2 bitkiciklerinden elde edilen srgn nod eksplantlarnn in vitro ortamlardaki byme parametreleri karlatrldnda klonlar arasnda nemli farkllklarn olmad gzlenmitir. Farkl klonlara ait bitkicikler byme parametreleri asndan farkllk gstermese de ierdikleri kimyasal kompozisyonlar farkl olabilmektedir. Bundan sonra yaplacak almalarda farkl klonlara ait bitkilerin etken maddeler iin analiz edilmesi ve bu zellik bakmndan deerlendirilmesi gerekmektedir.

42

Aratrmamzda hem srgn oluumu ve geliimi hem de kklenme asndan nemli bulgular elde edilmi olup, Lavandula stoechas L. iin mikrooaltm protokol oturtulmutur. Mikrooaltm prosedrnn hzlandrlmas iin bundan sonra yaplacak almalarda, byme dzenleyicilerinin farkl kombinasyonlar ile yeni denemeler kurularak, oaltma katsaylarnn arttrlmas salanmaldr. Lavandula stoechas L.nin ierdii nemli sekonder metabolitlerin hcre kltr yntemiyle retimi amacyla yaplacak aratrmalarda, tez almasndan elde ettiimiz kallus oluturan eksplant yzdesine ait bulgular kaynak olarak kullanlabilecektir. Bu amala yaplacak almalarda kallus oluum oranlarnn arttrlmas iin kltr ortamlar ve bileimleri zerinde deiiklikler yaplmal ve sspanse kltrde kullanlmak zere uygun karakterli kalluslarn oluumu salanmaldr.

43

KAYNAKLAR DZN
Akgz, N., 1988, Tarmda Aratrma ve Deneme Metodlar, Ege niversitesi Ziraat Fakltesi Yaynlar No:478, zmir, 181-189s. Anonim, 2007a, http://www.tarimkredi.org.tr/modules.php?name=Content&pa=showpa ge&pid=59 Anonim, 2007b, http://wwweski.tubitak.gov.tr/tubives/index.php?com=11700 Andrade, L. B., , Echeverrigaray, S., Fracaro, F., Pauletti, G. F., Rota L., 1999, The effect of growth regulators on shoot propagation and rooting of common lavender (Lavandula vera DC), Plant Cell, Tissue and Organ Culture 56:7983. Angioni, A., Barra, A., Coroneo, V., Dessi, S., Cabras, P., 2006, Chemical composition, seasonal variability, and antifungal activity of Lavandula stoechas L. ssp. stoechas essential oils from stem/leaves and flowers, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 14;54(12):4364-70. Ayanolu ve ark.,, F., Mert, A., Kaya, A., 2000, Hatay florasnda yetien karaba lavantann (Lavandula stoechas subsp. stoechas L.) elikle kklendirilmesi zerine farkl lokasyonlarn ve hormon dozlarnn etkisi, Turk J Agric For 24, 607-610 Tbitak. Ayral, N. M., 1997, Lavandula stoechas ssp. stoechas Bitkisinin Uucu Yann ve Uucu Olmayan Organik Bileenlerinin ncelenmesi ve Biyolojik Aktivitelerinin Belirlenmesi, Yksek Lisans Tezi, Marmara niversitesi Fen Bilimleri Enstits, 176 s. Baytop, T., 1999, Trkiyede Bitkiler ile Tedavi. Nobel Tp Kitabevleri, stanbul, 520 s. Calvo, M.C., Segura, J., 1998, In vitro morphogenesis from explants of Lavandula latifolia and Lavandula stoechas seedlings, Scientia Horticulturae Volume 36, Issues 1-2, Pages 131-137.

44

KAYNAKLAR DZN (devam)

Dadalioglu, I., Evrendilek, GA., 2004, Chemical compositions and antibacterial effects of essential oils of Turkish oregano (Origanum minutiflorum), bay laurel (Laurus nobilis), Spanish lavender (Lavandula stoechas L.), and fennel (Foeniculum vulgare) on common foodborne pathogens., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 29;52(26):8255-60. Dias, M.C, Almeida, R., Romano, A., 2002, Rapid clonal multiplication of Lavandula viridis L'Hr through in vitro axillary shoot proliferation, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Springer Netherlands, Volume 68, Number 1, Pages 99-102. Dlger, B., Uurlu, E., 1998, Lavandula stoechas L.(Karaba)n antimikrobiyal aktivitesi, C. Tp Fakltesi Dergisi 20 (2) : 99-105. Echeverrrigaray, S., Basso, R., Andrade, L., 2005, Micropropagation of Lavandula dentata from axillary buds of field-grown adult plants, Biologia Plantarum, Volume 49, Number 3, Pages 439-442. Ertu, F., 2002, Bodrum Yresinde Halk Tbbnda Yararlanlan Bitkiler, Bitkisel la Hammaddeleri Toplants, Bildiriler, ISBN 975-94077-2-8. Gilani, AH., Aziz, N., Khan, MA., Shaheen, F., Jabeen, Q., Siddiqui, BS., Herzig, JW., 2000, Ethnopharmacological evaluation of the anticonvulsant, sedative and antispasmodic activities of Lavandula stoechas L., Journal of Ethnopharmacology, 71(1-2):161-7. Grsoy, V. O., Grsoy, K. U., 2004, Anadoluda di ve di eti ile ilgili hastalklarn tedavisinde halk arasnda yaygn olarak kullanlan bitkiler, kullanm ekilleri ve bitkisel zellikleri, Cumhuriyet niversitesi Di Hekimlii Fakltesi Dergisi Cilt:7 Say:1. Lopez, D., Carazo, N., Boadas, J., 1993, Growth of four native lavandula species in different substrates, ISHS Acta Horticulturae 342: International Symposium on Horticultural Substrates other than Soil in situ.

45

KAYNAKLAR DZN (devam)

Maher, J., Gerasopoulos, D., Maloupa, E., 2000, Temperature and light effects on germination of Lavandula stoechas seeds, ISHS Acta Horticulturae 541: IV International Symposium on New Floricultural Crops. Maloupa, E., Zervaki, D., Marnasidis, A., 2000, Introduction of the mediterranean native species Thymus mastichina, Lotus cytisoides, Lavandula stoechas, Centranthus ruber, Limonium pectinatum and Limonium sineise into commercial floricultre, ISHS Acta Horticulture 541: IV International Symposium On New Floricultural Crops. Murashige, T., Sooog, F., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures, Physiol. Plant. 15, 473-497. Nobre, J., 1996, In vitro cloning and micropropagation of Lavandula stoechas from fieldgrown plants, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Springer Netherlands, Volume 46, Number 2, Pages 151-155. ztrk, B., Konyalolu, S., Kantarc, G., etinkol, D., 2005, zmir yresindeki yabani Lavandula stoechas L. subsp. stoechas taksonundan elde edilen uucu yan bileimi, antibakteriyel, antifungal ve antioksidan kapasitesi ISSN 1300 0225, Anadolu Ege Tarmsal Aratrma Enstits Dergisi, 2005. Panizza, M., Tognoni, F., 1988, Clonal propagation, callus formation and plant regeneration of lavandin, Scientia Horticulturae, Volume 37, Issues 1-2, Pages 157163. Papafotiou, M., Garavelos, E., Chronopoulos, J., 2000, Effect of growing medium and fertilisation on growth habit and colour of Lavandula stoechas L., ISHS Acta Horticulture 541: IV International Symposium On New Floricultural Crops. Portilla, G., Eltran, J. B., Vega, A., 1995 Micropopagation of lavender (Lavandula angustifolia) from axillary buds, Investigacion Agricola, Vol. 15 - ISSN 03045617.

46

KAYNAKLAR DZN (devam)

Sral, R., Deveci, M., 2002, Bal ars (Apis mellifera L.) iin nemli olan bitkilerin Trakya blgesinde incelenmesi, Uluda Arclk Dergisi 2(1):17-26. Soylu, EM., Soylu, S., Kurt, S., 2006, Antimicrobial activities of the essential oils of various plants against tomato late blight disease agent Phytophthora infestans, Mycopathologia, 161(2):119-28. Tuzlac, E., 2002, Data yarmadas (Mula) floras ve bu yrede halkn yararland bitkiler, Bitkisel la Hammaddeleri Toplants, Bildiriler, Eskiehir, ISBN 97594077-2-8. Vokou, D., Chalkos, D., Karamanlidou, G., Yiangou, M., 2002, Activation of soil respiration and shift of the microbial population balance in soil as a response to Lavandula stoechas essential oil, Journal of Chemical Ecology, 28(4):755-68. Yenici, N., 1999, Lavandula stoechas Bitkisinin zellikleri ve Fibrinolitik Sisteme Etkisinin Aratrlmas, Yksek Lisans Tezi, Marmara niversitesi Fen Bilimleri Enstits, 37 s.

47

ZGEM
02.09.1983 Ktahya doumlu Serpil Orhan orta ve lise renimini zmirde tamamladktan sonra 2001 ylnda Ege niversitesi Mhendislik Fakltesi Biyomhendislik blmn kazand. 2005 ylnda lisans renimini tamamlayarak mezun oldu. 2005 ylnda Ege niversitesi Mhendislik Fakltesi Biyomhendislik blmnde yksek lisansa balad.