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Mémoire de magester Biochimie Appliquée N°2 UNIVERSITE BATNA

Mémoire de magester Biochimie Appliquée N°2 UNIVERSITE BATNA

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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET

POPULAIRE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE -EL HADJ LAKHDER -BATNA
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE


MEMOIRE
Pour l’obtention du diplôme de
MAGISTER
En Biologie
Option : Biochimie Appliquée

Présenté par
DJEMAI ZOUGHLACHE SOUMIA

THEME





Devant le jury :
* M
me
HAMBABA L. Maître de conférences, université de Batna Présidente
* M
r
YAHIA M. Maître de conférences, université de Batna Rapporteur
* M
r
LAROUI S. Maître de conférences, université de Batna Examinateur
* M
me
ZAAMA D. Maître de conférences, université de Constantine Examinatrice
*M
r
YAHIA A. Maître de conférences, université d’Oum Examinateur
El Bouagui

Année Universitaire : 2008/2009
Etude de l’activité biologique des extraits
du fruit de Zizyphus lotus L.

Remerciement


Avant toute chose, je remercie Dieu, le tout puissant, pour m’avoir donnée la force
et la patience.
J’exprime d’abord mes profonds remerciements et ma vive connaissance à M
r

YAHIA M, Maître de conférences à la faculté des sciences Université de Batna
pour avoir encadré et dirigé ce travail avec une grande rigueur scientifique, sa
disponibilité, ses conseils et la confiance qu’il m’accordé m’ont permet de réaliser
ce travail.
J’exprime mes vifs remerciements à M
me
HAMBABA L, Maître de conférences à
l’Université de Batna pour sa précieuse aide et ses conseils, et pour l’honneur
qu’elle nous a fait en acceptant de présider le jury de ce mémoire
Je tiens à exprimer également ma profonde reconnaissance au M
r
ABDEDDAIM
M, Maître assistant- chargé de cours de l’Université de Batna tout d’abord pour
m’avoir fait confiance et pour m’avoir inspiré le sujet ensuite pour ses orientations
judicieuses.
Je tiens à exprimer ma très grande considération et ma vive reconnaissance à M
me

ZAAMA D, Maître de conférences Université de Constantine pour l’honneur
qu’elle nous a fait en acceptant de faire partie de jury.
Mes remerciements à M
r
YAHIA A, Maître de conférences Université de Oum
ElBougui d’avoir bien voulu accepter de juger ce travail.
Mes remerciements vont également à M
r
LAROUI S, Maître de conférences
Université de Batna d’avoir accepter de faire partie du jury.
J’exprime mes vifs remerciements aux M
r
ABERKANE M-CH et M
r
AYACHI qui
nous permet de réaliser une grande partie de mon travail au sein de leurs
laboratoires.










En guise de reconnaissance, je dédie ce travail
à mes chers parents, à ma famille
ainsi qu’à toutes mes amies.

Sommaire
Liste des tableaux
Liste des Figures
Introduction générale

Partie I
Etude bibliographique

Chapitre I. Généralités sur le Zizyphus lotus
I-1-Description botanique du Zizyphus lotus …………………………………………..1
I-2-Classification botanique…………………………………………………………… 1
I-3-Répartition géographique…………………………………………………………. 2
I-4-Composition biochimique du Zizyphus lotus……………………………………… 3
I-5-Activités biologiques et thérapeutiques du Zizyphus lotus……………………… 4
I.5.1. Activités anti-inflammatoires et analgésiques………………………… 4
I.5.2. Activités anti-fongiques et anti-mollusques …………………………….4
I.5.3. Activités anti-ulcérogéniques……………………………………………4
I.5.4. Autres activités ………………………………………………………….5

Chapitre II. Les composés phénoliques
II.1. les flavonoїdes………………………………………………………………… 7
II.1.1.Localisation et distribution…………………………………………… 7
II.1.2.Structure chimique et classification………………………………….. 7
II.1.3.Activités biologiques des flavonoїdes……………………………….. 8
II.2. Les tanins……………………………………………………………………… 12
II.2.1. Localisation et distribution………………………………………….. 12
II.2.2.structure chimique et classification………………………………….. 12
II.2.3.Activités biologiques et thérapeutiques des tanins…………………. 14
Chapitre III : Les espèces réactives oxygénées et stress oxydant
III.1.les espèces réactives oxygénées……………………………………………… 19
III.2. Sources des espèces réactives oxygénées…………………………………… 20
III.2.1.sources exogènes……………………………………………………. 20
III.2.2. Sources endogènes………………………………………………… 21
III. 3. Stress oxydant……………………………………………………………… 23
III.4. Les antioxydants……………………………………………………………. 23
III.4.1. Les antioxydants enzymatiques…………………………………….. 23
III.4.2. les antioxydants non enzymatiques………………………………… 24

Partie II
Etude Expérimental
Chapitre I. Matériel et méthodes
I.1. Matériel…………………………………………………………………………25
I.1. 1. Matériel végétal………………………………………………………… 25
I.2. Méthodes………………………………………………………………………. 25
I.2.1. Détermination de la teneur en eau…………………………………… 25
I.2.2. Détermination de la teneur en cendre………………………………… 26
I.2.3. Préparation des extraits à partir des fruits du Zizyphus lotus …………. 26
I.2.3.1. Extractions avec des solvants à polarité croissante…………………. 26
I.2.3.2. Extrait aqueux ……………………………………………………….. 26
I.2.4. Analyse des extraits du Zizyphus lotus………………………………… 27
I.2.4.1. Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus………………….. 27
I.2.4.1.1.Tests préliminaires………………………………………………… 27
I.2.4.1. 2.Chromatographie sur couche mince……………………………… 28
I.2.4.1. 3.Chromatographie liquide à haute performance HPLC –RP-C18…. 28
I.2.4.2. Analyse quantitative des extraits du Zizyphus lotus………………… 29
I.2.4.2.1. Dosage des polyphénols…………………………………………… 29
I.2.4.2.2. Dosage des flavonoїdes……………………………………………. 29
I.2.4.2.3. Dosage des tanins condensés………………………………………. 30
I.2.5. Tests des activités biologiques…………………………………………. 30
I.2.5.1. Activité antimicrobienne……………………………………………... 30
I.2.5.2. Tests d’activité antioxydante………………………………………….31
I.2.5.2.1. Test du blanchissement du β carotène………………………………31
I.2.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH…………………………………... 32
I.2.5.2.3. Analyses statistiques……………………………………………….. 32


Chapitre II. Résultats et discussion
II.1. Détermination de la teneur en eau dans les fruits du Zizyphus lotus………….33
II.2. Détermination de la teneur en cendre dans les fruits du Zizyphus lotus………33
II.3. Préparation des extraits à partir des fruits du Zizyphus lotus……………………34
II.4. Analyse des extraits du Zizyphus lotus……………………………………………. 35
II.4.1.Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus ……………………... 35
II.4.1.1.Test préliminaire………………………………………………………. 35
II.4.1.2. Analyses chromatographiques………………………………………….36
II.4.1.2.1. Chromatographie sur couche mince………………………………… 36
II.4.1.2.2. Chromatographie liquide à haute performance HPLC –RP-C18…… 39
II.4.2. Analyse quantitative des extraits des fruits du Zizyphus lotus…………...44
II.5. Activités biologiques......................................................................................... 49
II.5.1. Activité antimicrobienne des extraits du Zizyphus lotus ………………...49
II.5.2. Activité antioxydante…………………………………………………… 52
II.5.2.1. Test du blanchissement du β-carotène…………………………………52
II.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH………………………………………56
Conclusion générale
Références bibliographiques










Liste des abréviations

AAR : Activité antioxydante relative
ANOVA : Analyse de variance
APR : Pouvoir antiradicalaire
AQ: Extrait aqueux
ATTC : Collection du type Américain de culture
BHT: Butylated hydroxytoluen
BAW: n-Butanol/Acide acétique/eau
CCM: Chromatographie sur couche mince
DMSO: Diméthylsulfoxyde
DPPH:1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
EC
50
: Concentration effective à 50%
EDCM: Extrait dichlorométhanique
ET: extrait éthérique
HPLC: Chromatographie liquide à haute performance
IC
50
: Concentration inhibitrice à 50%
MET:Extrait méthanolique
Mg EAG/g d’extrait: milligramme d’équivalent acide gallique par gramme d’extrait
Mg ECT/g d’extrait : milligramme d’équivalent catéchine par gramme d’extrait
Mg EQ/g d’extrait : milligramme d’équivalent quercétine par gramme d’extrait
MO : Matière organique
RF : Rapport frontal
SD : Standard déviation
TR : Temps de rétention
UV : Ultrat violet





Liste des tableaux




N
0
du tableau Titre du Tableau Page
Tableau1. Teneur de la pulpe du jujubier frais en métabolite primaire……………….. 3
Tableau 2. Composition en métabolites secondaires des différents organes de
Zizyphus lotus ................................................................................................

3
Tableau 3. Principales espèces réactives oxygénées …………………………………... 19
Tableau 4. La teneur en eau et de matière sèche des fruits du Zizyphus lotus ............... 33
Tableau 5. La teneur en cendre et de matière organique des fruits du Zizyphus lotus 33
Tableau 6. Aspects, couleurs et rendement des divers extraits du fruit du Zizyphus
lotus................................................................................................................

34
Tableau 7. Résultats des testes préliminaires des flavonoides et des tanins sur les
différents extraits du Zizyphus lotus...............................................................

35
Tableau 8. Rapports frontaux et couleurs après révélation des standards……………... 38
Tableau 9. Temps de rétention des standards testés …………………………………… 41
Tableau 10. Les standards détectés dans les différents extraits du Zizyphus lotus............ 41
Tableau 11. Dosage des polyphénols totaux, des flavonoides et des tanins condensés
dans les différents extraits du fruit du Zizyphus lotus………………………

45
Tableau 12. Diamètres des zones d’inhibition de la croissance microbienne obtenus par
différents extraits du Zizyphus lotus ..............................................................

49
Tableau 13. Activité antiradicalaire des extraits du fruit du Zizyphus lotus……………..

57


Listes des figures







N
0
de
figure
Titres des figures
Page
Figure 1. Les différentes parties du Zizyphus lotus……………………………... 1
Figure 2. Aire de répartition du Zizyphus lotus L en Algérie…………………... 2
Figure 3. Quelques structures des composés phénoliques……………………… 6
Figure 4. Squelette de base des flavonoides.......................................................... 7
Figure 5. Eléments essentiels pour l’activité antioxydante des flavonoides......... 10
Figure 6. Piégeage des espèces réactives oxygénées par les flavonoides............. 10
Figure 7. Structure des tanins condensés et leur monomère……………………. 13
Figure 8. Structure des tanins hydrolysables et les acides associés…………….. 14
Figure 9. Les différentes espèces réactives oxygénées…………………………. 20
Figure10. Origine et réponse cellulaire aux ROS……………………………….. 24
Figure 11. Différentes parties du fruit du Zizyphus lotus……………………........ 25
Figure 12. Différentes étapes d’extraction par épuisement successive du matériel
végétal…………………………………………………………………

27
Figure 13. La réaction entre la vanilline est les tanins condensés.......................... 30
Figure 14. Chromatographie sur couche mince des extraits polaires des fruits
du Zizyphus lotus après révélation par la vanilline sulfurique...............


36
Figure 15. Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du
Zizyphus lotus (Observation sous la lampe UV (254nm))………….....


37
Figure16. Chromatographie sur couche mince des extraits apolaires des fruits
du Zizyphus lotus (Révélation par la vanilline sulfurique)……………


37
Figure 17. Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du
Zizyphus lotus (Révélation par une solution de DPPH)……………….


38
Figure 18. Chromatogrammes des différents standards testés dans l’HPLC 40
Figure 19. Chromatogrammes obtenus pour l’extrait éthérique du Zizyphus
lotus.......................................................................................................

42
Figure 20. Chromatogrammes obtenus pour l’extrait du dichlorométhane du
Zizyphus lotus…………………………………………………………


43
Figure 21. Chromatogrammes obtenus pour l’extrait méthanolique du Zizyphus
lotus……………………………………………………………………

43
Figure 22. Chromatogrammes obtenus pour l’extrait aqueux du Zizyphus lotus… 44
Figure 23. Droite d’étalonnage de l’acide gallique…............................................. 46
Figure 24. Droite d’étalonnage de la quercétine………………………………….
.
47
Figure 25. Droite d’étalonnage de la catéchine....................................................... 47
Figure 26. Corrélation linéaire entre la quantité en polyphénols totaux et la
quantité des flavonoides des différents extraits du fruit Zizyphus
lotus (p≤0,05)………………………………………………………….


48






Figure 27. Corrélation linéaire entre la quantité en polyphénols totaux et la
quantité des tanins condensés des différents extraits du fruit Zizyphus
lotus (p≤0,05).........................................................................................



48
Figure 28. Structure de la paroi bactérienne……………………………………... 50
Figure 29. Zones d’inhibitions obtenues par différents extraits.............................. 51
Figure 30.
Figure 31.

Figure 32.
Structure chimique de β-carotène……………………………………..
Cinétique de blanchissement du β-carotène à 490 nm en absence et
en présence des extraits du Zizuphus lotus, du BHT............................
Activité antioxydante relative des extraits du fruit du Zizyphus lotus,
du BHT dans le système carotène /acide linoléique………………...


52

54

54
Figure 33. Corrélation linéaire entre la teneur en polyphénols et le pourcentage
de l’activité antioxydante relative…………………….......................

55
Figure 34. Corrélation linéaire entre la teneur en tanins et le pourcentage
de l’activité antioxydante relative……………………………………..


55
Figure 35. Réaction d’un antioxydant avec le DPPH............................................. 56
Figure 36. Activité antiradicalaire des extraits polaires (MET, AQ) des fruits
du Zizyphus lotus……………………………………………………..

59
Figure 37. Activité antiradicalaire des extraits apolaires (DCM, ET) des fruitsdu
Zizyphus lotus………………………………………………………….


59
Figure 38. Activité antiradicalaire des standards la quercétine , le BHT,la rutine
et la vitamine C………………………………………………………..


60
Figure 39. Corrélation linéaire entre la teneur en flavonoides et le pouvoir
antiradicalaire (p≤0,01)……………………………………………….


60

Introduction générale

Les plantes médicinales représentent une source inépuisable des substances et
composés naturels bioactifs. En effet, les métabolites secondaires font et restent
l’objet de nombreuses recherches in vivo comme in vitro, notamment la recherche de
nouveaux constituants naturels tels que les composés phénoliques.
Récemment le développement de la résistance microbienne aux antibiotiques, et
la toxicité des antioxydants synthétiques, a conduit de chercher des substances
naturelles dotées d’activité antimicrobienne et antioxydante.
Les radicaux libres (RL) en général et les espèces réactives de l’oxygène (ROS)
en particulier sont impliqués dans plusieurs pathologies humaines allant de
l’inflammation au cancer tout en passant par les maladies cardio-vasculaires,
l’arthrite rhumatoïde, le diabète et le processus d’apoptose ; en plus de leur action
directe en réagissant avec la plupart des macromolécules.
Dans ce contexte s’inscrit ce présent travail de recherche, dont le but principal est
d’étudier les activités antimicrobiennes et antioxydantes des différents extraits du fruit
du Zizyphus lotus (Sedra), plante largement utilisée dans la médecine traditionnelle
comme adoucissant dans le traitement de la gorge et les irritations broncho-
pulmonaires, un émollient dans le traitement des furoncles. D’ailleurs, elle possède
plusieurs activités thérapeutiques : anti-inflammatoire, analgésique, anti-
ulcérogénique, antifongique et antidiabétique

Dans ce présent travail, nous avons fixé les objectifs suivants :
Analyse qualitative des différents extraits aqueux et organiques du fruit du
Zizyphus lotus en utilisant la CCM et l’HPLC
Analyse quantitative du contenu en polyphénols, et en flavonoides et tanins
des différents extraits du fruit du Zizyphus lotus.
Etude de l’activité antimicrobienne des différents extraits du fruit du
Zizyphus lotus
Etude de l’activité antioxydante des différents extraits du fruit du Zizyphus
lotus, en utilisant deux méthodes (Test de blanchissement du β-carotène et
test au DPPH).





















Chapitre I
Généralités sur le Zizyphus lotus

Chapitre I Généralités sur le Zizyphus lotus


1
I.1. Description botanique du Zizyphus lotus
Le Zizyphus lotus (jujubier) est un arbuste fruitier, épineux appartenant à la famille
des Rhamnacées (Rsaissi et Bouchache, 2002). Communément appelé en Afrique du Nord
″Sedra″ (Borgi et al ., 2007(a)). Il forme des touffes de quelques mètres de diamètres pouvant
atteindre 2m de haut.
Ses feuilles sont courtement pétiolées, glabres, caduques alternées et ovales à marges
entières. Chaque feuille porte à sa base deux stipules transformées en épine inégale et
vulnérable. Les fleurs sont jaunes, pentamètres et groupées en inflorescence cymeuses. Les
fruits sont des drupes à noyaux soudés, l’endocarpe mucilagineux appelé ″Nbeg″ (Figure 1)
(Rsaissi et Bouchache, 2002).











Figure 1. Les différentes parties du Zizyphus lotus (Rsaissi et Bouchache, 2002)


I.2. Classification botanique
Embranchement : Spermatophytes.
Sous embranchement : Angiospermes.
Sous classe : Dicotylédone.
Ordre : Celastrales
Famille : Rhamnacées.
Genre : Zizyphus.
Espèce : Zizyphus lotus L. (Quezel et Santa, 1962).

Chapitre I Généralités sur le Zizyphus lotus


2
I.3. Répartition géographique
Dans le monde
Le genre Zizyphus renferme environ 50 espèces des régions tropicales et subtropicales
des deux hémisphères. L’une entre elles, Zizyphus lotus, est spontanée dans le sud d’Espagne
et du Portugal, en Sicile, en Grèce (Bross ,2000). On le rencontre aussi dans les steppes
désertiques d’Afrique du Nord et Asie Mineure (Paris et Dillemann, 1960).
En Algérie
Le Zizyphus lotus est répandu dans toute l’Algérie sauf le Tell Algéro-constantinois
(Quezel et Santa, 1962).


Aire de Zizyphus lotus L.

Figure 2. Aire de répartition du Zizyphus lotus L en Algérie (Quezel et Santa, 1962).








Chapitre I Généralités sur le Zizyphus lotus


3
I.4. Composition biochimique du Zizyphus lotus
Les études phytochimiques menée sur le Zizyphus lotus montrent la présence de métabolites
primaires et secondaires.
a) métabolite primaire
Tableau 1. Teneur de la pulpe du jujubier frais en métabolite primaire (Catoire et al ., 1999).

La fraction de la pulpe du fruit Le pourcentage
sucres 20% à 32%
lipides 0,1% à 0,3%
protides 0,8% à 2,1%

b) métabolites secondaires
Le Zizyphus lotus est connu par son contenu en molécules biologiquement actives tels que
les polyphénols (flavonoides, tanins), les triterpènes, les antrachinones, les alcaloïdes
(cyclopeptides et isoquinolides), les saponosides (Borgi et Chouchane, 2006 ; Catoire et al.,
1994).

Tableau 2. Composition en métabolites secondaires des différents organes du Zizyphus lotus :

Organe végétal Composition chimique Références
Fruits -flavonoides, tanins saponines, alcaloïdes
(Borgi et al .,2007 (b))



Feuilles

-flavonoides, tanins, alcaloïdes.
-saponines de type dammarane :
-jujuboside B
-jujubogenin glycoside
-dérivé sulfaté de jujubasaponine IV

(Borgi et al .,2007 (b))

(Macuek et al .,2004)


Ecorce des racines

-flavonoides, saponines de type damarane.
-tanins.
-alcaloïde cyclopeptidiques lotusines A-G

(Borgi et al .,2007(a))

(Borgi et al .,2007(b))
(Le crouéour, 2002)

Chapitre I Généralités sur le Zizyphus lotus


4
I.5. Activités biologiques et thérapeutiques du Zizyphus lotus
Les différentes espèces du Zizyphus sont largement utilisées dans le traitement de
certaines maladies comme : les troubles digestives, la faiblesse, les affections du foie,
l’obésité, les troubles urinaires, le diabète, les infections cutanées, la fièvre, la diarrhée et
l’insomnie (Abu-Zarga et al .,1995,Abdel-Zaher et al ., 2005 ; Suksamrarn et al ., 2005). Les
recherches actuelles sur les différentes activités pharmacologiques de Zizyphus lotus ont
ressorti plusieurs effets de grande importance pour la médecine moderne. Parmi ces effets on
souligne les plus importants :

I.5.1. Activités anti-inflammatoires et analgésiques
Les flavonoïdes et les saponines de l’écorce des racines du Zizyphus lotus ont montré une
activité anti-inflammatoire significative (Borgi et Chouchane, 2006).
Le Zizyphus lotus inhibe la production de monoxyde d’azote (NO), cette activité apparaît
potentiellement avec l’extrait méthanolique de l’écorce des racines qui est la source possible
de l’agent anti-inflammatoire dans la réaction de l’hypersensibilité retardée induite par
oxazolone (Borgi et al ., 2008).
Les feuilles du Zizyphus lotus possèdent des effets analgésiques attribués à leur contenu en
principes actifs ; les flavonoides et les saponines (Borgi et al ., 2007 (a). Borgi et al ., 2008).
Toutes ces activités confirment l’usage traditionnel de cette plante dans certaines
maladies inflammatoires et douloureuses (Borgi et al ., 2007(a)).

I.5.2. Activités anti-fongiques et anti-mollusques
Les différents extraits (éthéré, chloroformique, extrait d’acétate d’éthyle et méthanolique)
de Zizyphus lotus se sont avérés très actifs in vitro vis-à-vis de neufs souches des
champignons pathogènes et des mollusques Balinus truncatus (hôtes intermédiaires et
vecteurs de la transmission de la bilharziose) (Lahlou et al ., 2002).

I.5.3. Activités anti-ulcérogéniques
Le Zizyphus lotus (les feuilles, l’écorce des racines) possède une importante activité anti-
ulcérogénique attribuée à la présence des tanins et des flavonoïdes connus par leur effets
gastroprotecteur (Borgi et al ., 2007(b)).



Chapitre I Généralités sur le Zizyphus lotus


5
I.5.4. Autres activités
Les fruits de Zizyphus lotus sont décrits comme adoucissant, et entrent dans le traitement de
la gorge et les irritations broncho-pulmonaires. De même, la poudre des feuilles sèches et des
fruits est appliquée dans le traitement des furoncles (Borgi et al ., 2007(a)). D’ailleurs l’écorce
des racines du Zizyphus lotus est utilisée dans la médecine traditionnelle dans le traitement du
diabète (Ghedira et al .,1995).

















Chapitre II
Les composés phénoliques

Chapitre II Les composés phénoliques

6
Les composants phénoliques sont des métabolites secondaires caractérisés par la
présence d’un cycle aromatique portant des groupements hydroxyles libres ou engagés
avec des glucides.
Ils sont présents dans toutes les parties des végétaux supérieures (racines, tiges,
feuilles, fleurs, pollens, fruits, graines et bois) ; et sont impliqués dans de nombreux
processus physiologiques comme la croissance cellulaire, la rhizogénèse, la germination
des graines et la maturation des fruits (Boizot et Charpentier, 2006).
Les principaux classes des composants phénoliques sont les acides phénoliques
(acide caféique, acide hydroxycinnamique, acide ferulique, acide chlorogenique…), les
flavonoides, les tanins, et les coumarines (King et Young, 1999 ; Tapiero et al ., 2002).
Les composants phénoliques sont des molécules biologiquement actives (King et
Young, 1999), ils sont largement utilisés en thérapeutique comme vasoconstricteurs, anti-
inflammatoires, inhibiteurs enzymatiques, antioxydants et antiradicalaires, antimicrobiens,
(Bahorun, 1997 ; Cetkovic et al ., 2008) (Figure 3).

Figure 3. Quelques structures des composants phénoliques (Gervaise ,2004).


Chapitre II Les composés phénoliques

7
II.1. Les flavonoїdes
Les flavonoides désignent une très large gamme de composés naturels appartenant à
la famille des polyphénols (Marfak, 2003).
Ces molécules sont considérées comme des pigments quasiment universels des végétaux ;
ils sont responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois des feuilles (Bruneton,
1999). Ils existent le plus souvent à l’état naturel sous forme d’hétérosides (Ghestem et al .,
2001)

II.1.2. Localisation et distribution
Les flavonoїdes sont amplement répandus dans le règne végétal (graines, fleurs,
fruits, feuilles) (Dacosta, 2003). On les trouve aussi chez les Psylotales, les Fougères,
Angiospermes, Asteraceae …etc.
Les formes hétérosidiques des flavonoїdes hydrosolubles s’accumulent dans les
vacuoles, et selon les espèces se concentrent dans l’épiderme des feuilles, ou se
répartissent entre l’épiderme et le mésophile. Dans le cas des fleures, ils sont concentrés
dans les cellules épidermiques (Bruneton, 1999).

II.1.3. Structure chimique et classification

Les flavonoїdes sont des dérivés benzo-γ-pyran (Skerget et al ., 2004). Leur structure
de base est celle d’un diphénylpropane à 15 atomes de carbone (C
6
-C
3
-C
6
), constitué de
deux noyaux aromatiques (ou anneaux) que désignent les lettres A et B, reliés par un
hétérocycles oxygénés, qui désigne la lettre C (figure 4) (Dacosta, 2003).

Figure 4 : Squelette de base des flavonoides (Girotti-Chanu, 2006).

La classe des flavonoїdes comporte à elle seule plus de 4000 substances qui ont été
isolées et identifiées à partir des milliers des plante (Forkmann et Martens, 2001), qu’en
divise en plusieurs catégories : Les flavones, les flavonols et les dihydroflavonols, les
Chapitre II Les composés phénoliques

8
isoflavonoides, les biflavonoides, les flavanones, les flavanols, les flavanediols
(leucocyanidines), les anthocyanidines, les chalcones et les dihydrochalcones, les aurones
(Dacosta, 2003).

II.1.4. Activités biologiques des flavonoїdes
Les flavonoïdes sont des composants naturels hautement actifs. Plusieurs études ont
démontré une large gamme des effets biochimiques et pharmacologiques de ces molécules.

a) Activité anti-inflammatoire des flavonoides
De nombreux travaux semblent indiquer que les flavonoides possèdent des propriétés
anti-inflammatoires (Milane, 2004). Sous l’action de la cyclooxygénase (CO) et la
lipooxygénase (LO), l’acide arachidonique se métabolise respectivement en
prostaglandines, et leucotriènes induisant ainsi des phénomènes inflammatoires (Marfak,
2003 ; Formica et Regelson, 1995). Les flavonoїdes inhibent la synthèse des eicosanoїdes
par inhibition de l’activité de LO et CO, aussi ils provoquent l’inhibition de la
perooxydation non enzymatique des acides gras poly insaturés nécessaires pour l’activation
de ces oxygénases ce qui provoque un effet anti-inflammatoire (Formica et Regelson
,1995).
Par ailleurs, les flavonoїdes ont un effet polliatif sur l’inflammation dû à ses effets
inhibiteurs sur la synthèse des leucotriènes et la libération de l’histamine, et ses activités
comme piégeurs de superoxyde (Formica et Regelson ,1995)

b) Flavonoїdes comme inhibiteurs enzymatiques
Les favonoїdes sont des inhibiteurs enzymatiques, ils inhibent plusieurs enzymes
intervenant dans divers mécanismes biologiques.
Il inhibent l’histidine décarboxylase, l’élastase , la hyaluronidase ce qui permettrait
de conserver l’intégrité de la substance fondamentale de la gaine vasculaire ; ils inhibent
aussi d’ une manière non spécifique la catéchol-O-méthyltransferase ,ce qui augmenterait
la quantité de la catécholamine disponible et donc provoquerait une élévation de la
résistance vasculaire.
En plus, les flavonoides inhibent la phosphodiestérase de l’AMP
C
ce qui pourrait
expliquer leur activité anti-agrégante plaquettaire ; aussi, ils inhibent l’aldose réductase
qu’est impliquée dans la pathogénie de la cataracte (Bruneton, 1999).
Chapitre II Les composés phénoliques

9
Par ailleurs, les flavonoїdes peuvent inhiber la promotion de tumeur à travers un
effet inhibiteur sur la phosphoxylase C et la protéine kinase (Formica et Regelson, 1995).

c) Flavonoїdes et les maladies cardiovasculaires
Les flavonoїdes sont des composés veinoactifs, ils sont capables de diminuer la
perméabilité des capillaires sanguins et de renfoncer leur résistance .Cette action est
appelée « vitaminique P » (Bruneton, 1999).
D’ailleurs, ils ont un effet protecteur des maladies cordiovasculaires.Ils induisent la
vasodilatation et provoquent la relaxation des muscles lisses cardiovasculaires ce qui
engendre une activité anti-hypertensive et des effets antiarrhythmiques.En plus les
flavonoїdes protègent LDL de l’oxydation et par conséquent empêchent la formation des
plaques athérosclerotiques, aussi, ils ont des effets antithrombotiques à travers
l’empêchement de l’agrégation plaquettaire (Formica et Regelson, 1995).

d) Activité antioxydante des flavonoides
Les flavonoides possèdent une forte activité antioxydante qu’est le principe de
plusieurs activités biologiques douées par ces molécules (Saija et al ., 1995).
L’activité du piégeage des radicaux libres est l’un des mécanismes importants de
l’activité antioxydante, pour les flavonoides, ce mécanisme est lié à leur structure et de
l’arrangement des groupements hydroxyles (Sokol-Letowska A et al ., 2007).
Des études faites sur la capacité des flavonoides à piéger les radicaux libres ont
montré que les composés les plus actifs sont ceux qui combinent les trois critères suivants :
La structure ortho dihydroxy sur le cycle B (groupement catéchol) qui confère la
stabilité au radical flavonoxy et participe à la délocalisation des électrons.
La double liaison C
2
-C
3
en conjugaison avec la fonction 4-oxo
La présence du groupe 3OH en combinaison avec la double liaison C
2
-C
3.

A titre d’exemple, la quercétine satisfait à tous ces critères et par conséquent, elle est
le composé le plus actif de la famille des flavonoides (figure 5) (Marfak, 2003).
Chapitre II Les composés phénoliques

10

Figure 5. Eléments essentiels pour l’activité antioxydante des flavonoides
(Marfak, 2003)
La propriété antiradicalaire des flavonoides est dirigée principalement vers HO
·
et
O
2
-
aussi les radicaux peroxyl et alkoxyl.
En plus, comme ces composants présentent une forte affinité pour les ions du fer
(catalysent plusieurs processus conduisant à l’apparition des radicaux libres), leur activité
antiperoxydative peut être aussi attribuée à une capacité concomitante de chélation du fer
(Saija et al .,1995).
Par ailleurs, l’inhibition des enzymes présente un autre mécanisme de l’activité
antioxydante, les flavonoides peuvent agir sur l’activité de la xanthine oxydase et par
conséquent, peuvent faire régresser la maladie de la goutte en réduisant à la fois les
concentrations d’acide urique et celle du radical superoxyde dans les tissus humains.
Une étude faite a montré que les flavonoides sont aussi des bons inhibiteurs d’autres
enzymes responsables de la production des radicaux libres comme la cyclooxygénase et la
lipooxygénase (figure 6) (Marfak, 2003).

Figure 6. Piégeage des espèces réactives oxygénées par les flavonoides (Marfak, 2003)

e) Effet anticancéreux des flavonoїdes
Certains flavonoides possèdent une activité antitumeurale et anticancérogenique
significative .Par blocage de la production de la tumeur de la peau, la quercétine peut être
considérée effectif dans la prévention du cancer de la peau.
Chapitre II Les composés phénoliques

11
L’inhibition de la glyoxylase I par la quercétine peut être expliquée son activité
anticancerogène, comme le système glyoxylase joue un rôle dans la production de D
lactate et la régénération du glutathion ,des facteurs importants dans l’induction du tumeur
et la croissance (Formica et Regelson,1995).
D’ailleurs, la quercétine inhibe la croissance cellulaire en empêchant certaines
phases du cycle cellulaire et en bloquant les sites récepteurs des hormones (Marfak, 2003).

f) Activité antimicrobienne des flavonoїdes
Les flavonoides possèdent des propriétés antimicrobiennes (Petit et al ., 2007). Ils
sont capables d’agir au niveau de la synthèse des protéines virales. Mucsi et Pragai en
1985 ont également montré une corrélation entre l’effet inhibiteur de certains flavonoides
sur divers virus d’herpès et leur capacité à augmenter les taux intracellulaires en AMP
C

dans les cellules infectées .Des travaux ont mis en évidence un impact des flavonoides sur
le rétrovirus HIV responsable du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), aussi les
flavonoides se sont avérés de bons inhibiteurs de transcriptase reverse.
Autre étude a montré que, les flavonoides pouvaient avoir une action plus sélective
en interagissant avec une glycoprotéine de surface du virus HIV, empêchant ainsi la liaison
du virus à la cellule hôte .Enfin, les flavonoides seraient susceptibles d’inhiber l’intégrase
rétrovirale du virus HIV-1.Cette enzyme permet l’intégration du génome viral à celui de la
cellule hôte.
Théoriquement, les flavonoides pourraient exercer des effets antibactériens puisqu’ils
sont de puissants inhibiteurs in vitro de l’ADN gyrase. D’autre part, une étude a montré
l’effet bactéricide de différentes flavanones sur un Staphylococcus aureus.
Une étude récente a montré l’effet antibactérien de certains flavonoides isolés de
Dorstenia barteri (Mbaveng et al ., 2008).
L’activité antifongique des flavonoides est aussi établie, une étude faite sur Dianthus
caryophyllus a monté l’efficacité de ses flavonoides sur des souches fongiques (Galeotti et
al ., 2008).
Le mécanisme des effets antimicrobiens des polyphénols est sans doute très
complexe .parmi les hypothèses avancées, il faut citer :
L’inhibition des enzymes extracellulaires microbiennes.
Séquestration de substrat nécessaire à la croissance microbienne ou la chélation
de métaux tels que le fer.
L’inhibition du métabolisme microbien (Milane, 2004).
Chapitre II Les composés phénoliques

12
g) Autres activités des flavonoïdes
A côté des activités citées précédemment, les flavonoides possèdent d’autres
activités :
Activité anti-allergique, antihépatotoxique, anti-ostéoporotique (Ielpo et al ., 2000),
activité hypocholestérolémiante (Formica et Regelson,1995), activité antidiabétique
(Marfak,2003), activité antimitotique,antiprotozoaires et activité anxiolytique (Cabrera et
al.,2007).

II.2. Les tanins
Les tanins sont des métabolites secondaires polyphénoliques (Khanbabaee et Ree,
2001), hydrosolubles de masse molaire entre 500-2000D. Leur structure chimique leur
confère une capacité très développée de se fixer sur des molécules telles que les alcaloïdes,
la gélatine, les polysaccharides, et essentiellement les protéines (Zimmer et Cordesse,
1996 ; Bruneton, 1999). Parmi les caractéristiques des tanins le goût astringence qui est
une sensation tactile due à la précipitation des protéines salivaires et qui crée une sensation
d’assèchement dans la bouche (Peronny, 2005).
Le rôle biologique des tanins dans la plante est lié à sa propre protection contre les
infections ,les insectes et les animaux herbivores (Khanbabaee et Ree,2001),en plus de la
protection contre les attaques fongiques et bactériennes (Peronny,2005).

II.2.1. Localisation et distribution
Les tanins sont très répandus dans le règne végétal, ils sont particulièrement
abondants chez les Conifères, les Fagacée, les Rosacée (Ghestem et al ., 2001).
Tous les organes végétaux peuvent en renfermer (l’écorce, le bois, les feuilles, les
fruits, les racines, les graines) (Khanbabaee et Ree ,2001).Les tanins sont présents dans une
variété de plantes utilisées dans l’alimentation notamment les céréales et les légumineuses
(sorgho,millet,orge,haricots secs, petits pois, caroube et les fruits comme (pomme,mûre
,canneberge, datte,raisin,aubépine, pêche poire,kaki,prune,framboise et fraise
(Peronny,2005).
II.2.2. structure chimique et classification
A la base de leur caractéristique structurale, il est possible de diviser les tanins en 2
groupes :
Tanins condensés (proanthocyanidines).
Chapitre II Les composés phénoliques

13
Tanins hydrolysables.

a)Tanins condensés (proanthocyanidines)
Ce sont des polymères ou oligomères flavanique, constitués d’unités flavan-3-ols, le
plus souvent épicatéchine et catéchine, avec un degré de polymérisation entre deux et plus
de 50 unités (Khanbabaee et Ree ,2001) .Ces unités liées entre elles par une seule liaison
carbone-carbone C
4
-C
8
ou C
4
-C
6
dans le type B des proanthocyanidines ;ou par une liaison
interflavanique double (C
4-
C
8
ou C
4-
C
6
) et (C
2
-O-C
7
) dans le type A (figure7)
(Bruneton,1999 ; Xie et Dixon,2005 ;Vivas et al ., 2006).












Figure 7. Structure des tanins condensés et leur monomère (Peronny, 2005).

b) Tanins hydrolysables
Ce sont des oligo ou des polyesters d’un sucre (ou d’un polyol apparenté) et d’un
nombre variable d’acide phénolique. Le sucre est très généralement le glucose .L’acide
phénolique est soit l’acide gallique dans le cas des tanins galliques, soit l’acide
hexahydroxydiphénique (HHDP) et ses dérivés dans le cas des tanins éllagiques (Figure 8)
(Bruneton, 1999)
Chapitre II Les composés phénoliques

14


Figure 8. Structure des tanins hydrolysables et les acides associés (Peronny, 2005).

II.2.3. Activités biologiques et thérapeutiques des tanins
Les tanins sont des molécules biologiquement actives, douées d’activités
pharmacologiques remarquables et des effets significatifs sur la santé humaine (Chavan et
al ., 2001 ; Okuda, 2005).

a) Activités antimicrobiennes des tanins
L’activité antimicrobienne des tanins est importante. La croissance de plusieurs
bactéries, virus, champignons et levures est inhibée par les tanins (Chung et Wei, 2001).
-Activité antibactérienne
De nombreuses études ont montré l’activité antibactérienne des tanins .Ces
molécules ont été rapportées comme bactériostatique ou bactéricide sur plusieurs souches
bactériennes :Aeromonas sobria, Bacillus anthracis, bolulinum, Desuomaculum
nigrificans , Klebsiella pneumonia, Plesiomonas shigelloides , Pseudomonas aeruginosa,
Pseud maltophila , solanacearum , Staphilococcus aureus , Staph epidermis ,
Streptococcus lactis , Strept mutans , Strept pneumonia , Strept sobrinus …etc.
Chapitre II Les composés phénoliques

15
Chung et ses collaborateurs ont trouvé que l’acide tannique a inhibé la croissance
des bactéries des aliments comme :Alealigenes faecalis, Enterobacter aerogenes ,
Escherichia coli, K pneumonia , Proteus vulgaris , Pseud fluorescens ,Salmonella
enteritidis, S paratyphi,Staph aureus, Strept faecalis, Strept pyogenes et Yersinia
enterocolitica.
Les bactéries intestinales humaines comme :Bacteroides fragilis , Clostridium
clostridiiforme, C perfringens , C paraputrficum, Enterobacter cloacae , Escherichia coli
et Salmonella typhimurium sont inhibées par l’acide tannique (Chung et Wei, 2001).

-Activité antivirale
L’activité antivirale des tanins est due à la fixation des molécules des tanins à
l’enveloppe protéique du virus ou la membrane de la cellule hôte et par conséquent
l’inhibition de l’adsorption et la pénétration virale ; cependant, dans certains cas la fixation
cause seulement des changements mineurs à la surface virale, la pénétration reste mais
l’enlèvement de l’enveloppe virale est inhibé. Plusieurs types de virus sont inactivés par les
tanins, le virus Herpes simplex (HSV-1 ,HSV-2) est inhibé par les tanins hydrolysables et
les tanins condensés galloylés de plusieurs extraits des plantes (De Bruyne et al.,1999).
Les tanins ont aussi rapportés d’inactiver le virus tobacco mosaique, et poliovirus.
L’acide tannique est capable d’inhiber la réplication du virus d’influenza, Coxsackievirus,
echovirus, reovirus, virus d’herpes (Chung et Wei, 2001).
Les oligomères proanthocyanidins présentent une activité antivirale contre le virus
respiratoire syncytial (RSV), virus d’influenza A (FLU-A) et le virus para influenza (PIV),
en outre l’hépatite A et B.
Les tanins ont un autre effet inhibiteur de la réplication virale ,c’est l’inhibition de la
transcriptase inverse des rétrovirus comme virus (HIV) ; cette inhibition est influencée par
la galloylation, l’étendue de l’oligomérisation ,la différence de la liaison inter-flavan, la
stéréochimie de la fonction 3 hydroxyle (De Bruyne et al.,1999).

Activité antifongique et anti-levure
Plusieurs types de champignons sont inhibés par les tanins .Les champignons
filamenteux comme Aspergillus niger ,Botrytis cinerea ,Chaetomium cupreum ,
Collectotrichum graminicola, Coniphora olivacea ,Coriolus versicolor, Crinepellis
perniciosa , Fomes annosus , Gloeophyllum trabeum, Merulius lacrymans, Penicillium,
Chapitre II Les composés phénoliques

16
Poria monticola ,Trametes hirsuta et Trichaderma viride sont inhibés par les tanins de
différentes préparations .
De même, différentes levures incluant Saccharomyces crevisiae sont aussi sensitives
aux tanins (Chung et Wei, 2001).

b) Activité thérapeutique due à l’astringence
Par voie externe, les tanins imperméabilisent les couches les plus externes de la peau
et des muqueuses, protégeant ainsi les couches sous-jacentes ; elles ont également un effet
vasoconstricteur sur les petits vaisseaux superficiels.
En limitant les pertes en fluides et en empêchant les agressions extérieurs, les tanins
favorisent la régénération des tissus en cas de blessures superficielles ou de brûlure
(Bruneton, 1999). Sur les blessures, les tanins induisent la cicatrisation par différents
mécanismes cellulaires, en favorisant la contraction de blessure, l’augmentation de la
formation des vaisseaux capillaires et des fibroblastes ; et induisant la prolifération des
kératinocytes (Lopes et al ,2005).
Par voie interne, ils exercent un effet antidiarrhéque (Bruneton, 1999), qui est du à
l’inhibition de la motilité intestinale (De Bruyne et al. 1999).

c) Inhibition enzymatique
La fixation des tanins avec les protéines peut être engendrée l’inhibition de plusieurs
enzymes (De Bruyne et al ., 1999). Le blocage de la 5-lipoxygénase par géraniine,
corilagine , inhibition de l’enzyme de conversion de l’angiotensine , de l’activation de la
hyaluronidase ,des glucosyltransferases des microorganismes impliqués dans la
cariogenèse ;inhibition des topoisomérases par la sanguiine H6 ou l’acide chébulagique ;
inhibition de la protéines kinase C par les tanins éllagiques et les tanins complexes
(Bruneton,1999 ) ; inhibition de α –amylase salivaire humaine qui joue un rôle dans la
formation des caries dentaires (Kandra et al ., 2004).
D’ailleurs, les dimères procyanidoliques ont une activité inhibitrice sur l’histidine
décarboxylase et l’élastase (Bruneton, 1999).





Chapitre II Les composés phénoliques

17
d) Activité antioxydante des tanins
Les tanins ont de grandes capacités antioxydantes dues à leurs noyaux phénols
(Peronny, 2005) .Elles ont la particularité d’inhiber la peroxydation des lipides, en agissant
comme donneur de proton et accepteur de radicaux libres, stoppant ainsi le mécanisme
d’auto oxydation (Perret, 2001).
Les tanins hydrolysables et condensés sont 15 à 30 fois plus efficace que les phénols
simples (Peronny, 2005).De même, il a été démontré in vitro que les tanins sont plus
actives que les vitamines .Des études faites montèrent que les procyanidines B
1
et B
3
sont
des antioxydants pour l’acide linoléique, et ils ont une activité antioxydante supérieure à
celle de l’acide ascorbique et l’α tocophérol.
Dans une autre étude faite sur la propriété du piégeage radicalaire, il a été remarqué
que les procyanidines dimériques peuvent emprisonner 8 radicaux pyroxyles alors que
l’acide ascorbique emprisonne un seul radical, et l’α tocophérol emprisonne deux radicaux.
Uchida et ses collaborateurs suggèrent que les tanins condensés galloylés ont une
action de piégeage radicalaire sur le radical 1-1 diphényl-2-picrylhydrazyl (DPPH) aussi
sur l’anion superoxyde et OH
·
, ·OOH.
Plusieurs propriétés structurales des tanins augmentent leur activité antioxydante :
La galloylation, préférablement en position 3´ augmente la capacité du piégeage pour les
deux O
2
·
et OH
·
, aussi le piégeage de O
2
·
est plus important pour les dimères procyanidines
couplés par une liaison (4→8) que les dimères liés par (4→6) (De Bruyne et al ., 1999).

e) Activité anti cancérogénique des tanins
Le potentiel anticarcinogénique des tanins peut être lié à leur propriété antioxydante
qui apparaît importante dans la protection cellulaire des dommages oxydatifs.
Plusieurs études montèrent l’activité anticancérogéniques des tanins, Migamato et
ses collaborateurs montèrent l’activité anti tumorale de plusieurs oligomères des tanins
hydrolysables incluant : agrimoniin, oenothein B et coiiariin A contre la sarcoma (Chung et
Wei, 2001).Une étude faite sur la plante Eugenia jambos a été suggérée que les tanins
hydrolysables de cette plante induisent l’apoptose sur les cellules humaines leucémiques ce
qui présente un autre mécanisme d’activité antioxydante des tanins (Yang et al .,2000).
Autre étude faite sur les tanins de sorghum suggère l’activité anticancérogénique des
tanins de sorghum sur les cellules humaines de mélanome (Awika et Rooney, 2004).


Chapitre II Les composés phénoliques

18
f) Autres activités biologiques des tanins
Les tanins ont une activité anti inflammatoire .Tits et ses collaborateurs montèrent
une importante activité anti inflammatoire des prodelphinidines isolés de Ribes nigrum.
Les effets cardiaques et vasculaires des tanins sont aussi démontrés, Calixto et ses
collaborateurs dénotèrent que l’acide tannique affecte la disponibilité du calcium pour la
contraction des muscles lisses et cardiaques .En effet par fixation de l’acide tannique avec
le Ca
++
, l’acide tannique présente un effet hypotensif.
D’ailleurs des études faites montèrent l’effet d’inhibition d’agrégation plaquettaire
dans le plasma humain et le plasma du rat par deux procyanidines trimériques et un dimère
thioether.
Outre ces activités, les tanins présentent une activité antiulcéreuse et antiparasitaire,
en effet, la consommation des plantes à tanins peut affecter la biologie de certaines espèces
de parasites intestinaux (Peronny, 2005).







Chapitre III
Les espèces réactives oxygénées et
stress oxydant

Chapitre III Les espèces réactives oxygénées et le stress oxydant
19
III.1. Les espèces réactives oxygénées
La vie en aérobie se traduit au niveau cellulaire par l’existence d’une chaîne respiratoire
mitochondriale (Curtay et Robin ,2000) ; au niveau de laquelle l’oxygène est normalement
transformé en eau .Cette réaction de réduction implique quatre électrons, et est rendue grâce à un
système complexe de protéines et d’enzymes (cytochromes). Elle permet d’apporter à la cellule toute
l’énergie nécessaire sous forme d’adénosine triphosphate (ATP) pour assurer ses fonctions vitales.
Ce processus mitochondrial n’est toutefois pas parfait, car 2 à 5% de l’oxygène est transformé en
espèces réactives oxygénées (ERO) ou reactive oxygen species (ROS) (Gueye, 2007) ; qui sont des
formes variées de l’oxygène active, elles incluent les radicaux libres comme l’anion superoxyde
(O
2
. -
) et le radical hydroxyle (
.
OH), et les espèces non radicalaires qui sont des oxydants et/ou
facilement transformées en radicaux comme le peroxyde d’hydrogène (H
2
O
2
) (Halliwell et
Whiteman, 2004) (tableau 3).

Tableau 3. Principales espèces réactives oxygénées (Antwerpen, 2006).

Espèces réactives oxygénées (ROS)
Radicalaires Non radicalaires
.
OH Radical hydroxyle
RO
.
Radical alkoxyl


ROO
.
Radical peroxyl
O
2
.
Anion superoxyde
NO
.
Radical oxynitrique
H
2
O
2
Peroxyde d’hydrogène
ROOH Peroxyde organique
HOCl Acide hypichloreux

1
O
2
Oxygène singulet
ONOO
־
Peroxynitrite

Les radicaux libres oxygénés sont des espèces chimiques (atomes ou molécules) qui possèdent
un ou plusieurs électrons célibataires (électron non apparié) sur leur couche externe (Gueye, 2007).
Cela leur confère une grande réactivité chimique (Dacosta, 2003).
Leur hyperréactivité les engage dans des réactions de dénaturation des constituants cellulaires
de type peroxydation avec les glucides, les lipides, les protéines et l’ADN, formants des produits très
instables .Ceux ci donnent lieu à des réactions en chaîne générant de nouveaux radicaux libres
(Curtay et Robin, 2000).
L’espèce réactive primaire de l’oxygène est l’anion superoxyde (O
2
· ־
) qui résulte de la
réduction univalente de l’oxygène moléculaire.Une grande partie de l’anion superoxyde est
Chapitre III Les espèces réactives oxygénées et le stress oxydant
20
transformée en peroxyde d’hydrogène (H
2
O
2
) sous l’effet d’une enzyme, le superoxyde dismutase
(Milane, 2004).
A son tour, le peroxyde d’hydrogène selon la réaction de Fenton peut se décomposer en
présence de cuivre cuivreux ou fer ferreux pour donner une espèce hautement réactive et a durée de
vie très courte, le radical hydroxyle (
·
OH) (figure 9) (Nzengue,2008).




Figure 9. Les différentes espèces réactives oxygénées (Nzengue, 2008).


III.2. Sources des espèces réactives oxygénées
Les ROS sont produits dans l’organisme par de nombreux mécanismes tant exogènes ou
endogènes (Figure 10).
III.2.1. Sources exogènes
L’organisme humain est soumis à l’agression de différents agents capables de donner naissance
à des espèces réactives oxygénées.
Les rayonnements UV induisent la synthèse de radicaux libres (O
2
·־
,
·
OH ,
1
O
2
) et des
molécules génératrices de radicaux libres (H
2
O
2
) par l’intermédiaire d’agents photosensibilisants.
Chapitre III Les espèces réactives oxygénées et le stress oxydant
21
Les radiations ionisantes provoquent également la génération de radicaux libres dérivés de
l’oxygène.
L’ingestion d’alcool est suivie de la formation des radicaux libres selon divers mécanismes .La
xanthine oxydase et l’aldéhyde oxydase peuvent oxyder le principal métabolite de l’éthanol,
l’acétaldéhyde, avec production d’O
2
·

־
.
L’éthanol stimule également la production d’anion superoxyde par induction de la synthèse
des NADPH oxydase, NADPH cytochrome réductase, et du cytochrome P450.D’autre part, Schisler
et Singh (1989) ont montré que l’alcool pouvait diminuer l’activité des enzymes de protection (SOD-
GSH-Px).De même, les concentrations sériques en sélénium et vitamine E sont abaissées chez les
alcooliques et corrélées avec une atteinte hépatique plus ou moins sévère.
Des toxiques tels que monoxyde d’azote (NO) et le dioxyde d’azote (NO
2
), présents dans notre
environnement (suies, goudron, tabac, polluants industriels) participent à la genèse de radicaux
libres, ils sont responsables d’une auto-oxydation des acides gras polyinsaturés des alvéoles
pulmonaires. NO, NO
2
peuvent aussi réagir avec le peroxyde d’hydrogène produit par les
macrophages au niveau des alvéoles pulmonaires et donner naissance à des radicaux
·
OH .
La fumée de cigarette joue un rôle majeur dans la formation de ces espèces radicalaires, elle
contient NO, NO
2
et des fortes concentrations en composés insaturés, et stimule par son action
irritante les macrophages des alvéoles pulmonaires (Milane, 2004).
D’autres facteurs peuvent conduire à la formation des ROS : les xénobiotiques (toxines,
pesticides, herbicides) et médicaments, en plus des aliments qui peuvent contenir des oxydants
(Curtay et Robin, 2000 ; Diallo, 2005).

III.2.2. Sources endogènes
L’une des sources majeurs des ROS est la chaîne respiratoire mitochondriale .Cette production
résulte de l’addition d’un électron à l’oxygène moléculaire.Une telle réaction est catalysée par le
cytochrome oxydase mitochondrial.
O
2
+ é O
2
· ־
(Marfak, 2003).
Autres chaînes du transport d’électrons (ex : peroxymes et microsomes) contribuent également
à la production du O
2
· ־
dans la cellule aérobiose .Les cytochromes P
450
et b
5
de la chaîne du
transport d’électron des microsomes peuvent produire des ROS quand ils interrompent le cycle
redox normal et détournent le flux d’électrons vers l’O
2
(Sevanian et al .,1990).
Chapitre III Les espèces réactives oxygénées et le stress oxydant
22
D’autre part les ROS peuvent se produire au cours des processus pathologiques ou la
production du radical répond à une stimulation et intervient dans le processus
inflammatoire (NADPH oxydase et xanthine oxydase) (Antwerpen, 2006).
Les cellules phagocytaires activées sont le siège d’un phénomène appelé ˝explosion
oxydative˝, consistant en l’activation du complexe NADPH oxydase, enzyme capable d’utiliser
l’oxygène moléculaire pour produire de grandes quantités d’anions superoxydes au niveau de la
membrane cellulaire. Ce mécanisme lorsqu’il est contrôlé est capital dans la lutte infectieuse car il
permet la phagocytose des bactéries et des corps étrangères (Favier, 2003). D’ailleurs le système
xanthine/xanthine oxydase permet aussi la production de l’anion superoxyde :

Xanthine + 2O
2
+H
2
O xanthine oxydase acide urique +2O
2
· ־
+2H
+
(Marfak, 2003).

Une autre espèce réactive oxygénée produite au cours de l’inflammation est le peroxyde
d’hydrogène (H
2
O
2
) ; en vue de réagir directement ou de produire l’acide hypochloreux par
l’intervention de myéloperoxydase.Cette espèce (HClO) est caractérisée par un pouvoir oxydant
nettement plus élevé que le H
2
O
2
.

H
3
+
O +H
2
O
2
+Cl
־
myéloperoxydase HClO +2H
2
O ( Antwepen, 2006).

Le monoxyde d’azote est produit aussi par un système enzymatique NO synthétase (NOS), à
des fins de médiation par les neurones, les cellules endothéliales ou les macrophages (Favier, 2003).
D’autres systèmes sont capables de produire les ROS, citon par exemple : les réactions
catalysées par les lipooxygénases et cyclooxygénases dans la voie de synthèse des leucotriènes,
thromboxanes et prostaglandines (Babior et al ., 2002) ; les aldéhydes oxydases ou les protéines
hémiques qui peuvent oxyder leur fer (I) en fer (III) avec production du radical O
2
· ־

(Antwerpen,2006).
C’est ainsi l’autooxydation des monoamines (dopamine, épinéphrine, et norépinéphrine) ; et
l’hémoglobine en présence de traces de métaux peut également être à l’origine de la production des
ROS (Gueye, 2007).





Chapitre III Les espèces réactives oxygénées et le stress oxydant
23
III.3. Stress oxydant
Dans les circonstances normales, les ROS sont produites en faible quantité comme médiateurs
tissulaires ou des résidus des réactions énergétiques ou de défense. Cette production physiologique
est parfaitement maîtrisée par des systèmes de défense, d’ailleurs adaptifs par rapport au niveau de
radicaux présents.
Dans ce cas, la balance antioxydant/prooxydant est en équilibre. Si tel n’est pas le cas que ce
soit par déficit en antioxydants ou par la suite d’une surproduction énormes de radicaux, l’excès de
ces radicaux conduit au stress oxydant (Favier,2003 ; Haliwell et Whiteman ,2004).La production
excessive de radicaux libres provoque des lésions directes de molécules biologiques (oxydation de
l’ADN, des protéines , des lipides, des glucides), mais aussi des lésions secondaires dues au
caractère cytotoxique et mutagène des métabolites libérées notamment lors de l’oxydation des
lipides.
En faisant apparaître des molécules biologiques anormales et en surexprimant certains gènes,
le stress oxydant sera la principale cause initiale de plusieurs maladies : cancer, cataracte, sclérose
latérale amyotrophique, syndrome de détresse respiratoire aigu, oèdeme pulmonaire, vieillissement
accéléré, maladies cardiovasculaires...etc. (Favier, 2003).

III. 4. Les antioxydants
Les antioxydants sont l’ensemble de molécules susceptibles d’inhiber directement la
production, de limiter la propagation ou de détruire les espèces réactives de l’oxygène. Ils peuvent
agir en réduisant ou en dismutant ces espèces, en les piégeant pour former des composés stables, en
séquestrant le fer libre, ou en générant du glutathion (Favier, 2003 ; Dan, 2008).
De nombreux antioxydants interviennent, il s’agit principalement des systèmes enzymatiques
et non enzymatiques (Figure10) (Souley Amadou, 2004 ; Yoo et al ., 2008)

III.4.1. Les antioxydants enzymatiques
Cette ligne de défense est constituée principalement de trois enzymes.Il s’agit de la superoxyde
dismutase (SOD), de la catalase et de glutathion peroxydase (GP
X
).
Ces enzymes ont une action complémentaire sur la cascade radicalaire au niveau du
superoxyde et du peroxyde d’hydrogène, conduisant finalement à la formation d’eau et d’oxygène
moléculaire.
2O
2
· ־
+2H
+
superoxyde dismutase H
2
O
2
+O
2


Chapitre III Les espèces réactives oxygénées et le stress oxydant
24

2H
2
O
2
Catalase

2H
2
O +O
2

H
2
O
2
+2GSH Glutathion perooxydase 2H2O +GSSG
(Lehucher-Michel et al ., 2001)


III.4.2. Les antioxydants non enzymatiques
Ce groupe des antioxydants renferme les protéines de séquestration des métaux, qui agissent
en diminuant la disponibilité d’agents pro oxydants, comme Fe
2+
/Fe
3+
ou Cu
2+
/Cu
+
(ex : la
transferrine, la ferritine, l’albumine, caeruloplasmine…etc.).
D’autre part, il y a des molécules à faible poids moléculaire qui agissent soit comme
cofacteurs des enzymes citées soit comme antioxydant propre (Antwerpen, 2006).
Les antioxydants à action directe sont capables de donner des électrons à l’oxygène radicalaire
afin qu’ils puissent le piéger, l’empêcher ainsi d’attaquer les structures biologiques. Ils peuvent agir
comme agents réducteurs capables de passer leurs électrons aux ROS et les éliminer (Kohen et
Nyska, 2002). Ces molécules proviennent soit de sources endogènes (glutathion, mélatonine, acide
urique, la mélanine…), soit de sources exogènes apportés par l’alimentation (ex : les caroténoïdes, la
vitamine E, la vitamine C (Curtay et Robin, 2000), les composés phénoliques (Yoo et al ., 2008) et
surtout les acides phénoliques, les flavonoides, les tanins, les coumarine (Siddhuraju,2007).


Figure 10. Origine et réponse cellulaire aux ROS (Petropoulos, 2003)
































Chapitre I
Matériel et méthodes


Chapitre 1 Matériel et méthodes


25
Matériel et méthodes
I.1. Matériel
I.1. 1. Matériel végétal
Il est constitué des fruits du Zizyphus lotus (Figure11), récoltés des régions de Batna en
Septembre Octobre 2007, 2008.
Les fruits ont été d’abord dénoyautés, ensuite la partie comestible a été séchée à l’ombre à
l’abri de la lumière, à température ambiante.
Après séchage, la partie comestible a été broyée pour obtenir une poudre fine, qui a servi
pour la préparation des différents extraits.



Figure11. Différentes parties du fruit du Zizyphus lotus

I.2. Méthodes
I.2.1. Détermination de la teneur en eau
Pour déterminer la teneur en eau, on fait une dessiccation de la matière fraîche à la
température de 103±2C
0
dans une étuve isotherme ventilée à la pression atmosphérique
jusqu’à une mesure pratiquement constante (Audigie et al .,1987).
La teneur en eau est la différence entre le poids de l’échantillon avant et après la dessiccation
lorsque leur poids soit constant.
H% = M
1
- M
2 x100
P
H% : taux d’humidité ou teneur en eau.
M
1
: masse en g de la capsule avec l’échantillon avant la déshydratation.
Chapitre 1 Matériel et méthodes


26
M
2
: masse en g de la capsule avec l’échantillon après la déshydratation.
P : masse en g de la prise d’essai.

I.2.2. Détermination de la teneur en cendre :
La teneur en matière minérale est conventionnellement le résidu de la substance après
minéralisation de la matière sèche des échantillons .Elle est obtenue par incinération à 500-
600C
0
(Pinta, 1980 ; AOAC, 1984).
MO% = M
1
- M
2 x 100

P
MO% : matière organique.
M
1
: masse en g de la capsule et la matière sèche avant l’incinération.
M
2
: masse en g de la capsule avec les cendres.
P : masse en g de la prise d’essai.
La teneur en cendre est déterminée comme suit : cendre%=100-MO%

I.2.3. Préparation des extraits à partir des fruits du Zizyphus lotus :
Selon la méthode de Diallo et al (2004), différents types d’extraits ont été préparés à partir
des fruits pulvérisés (Figure 12).
I.2.3.1. Extractions avec des solvants à polarité croissante :
250 g de poudre ont été extraits avec 2000ml d’éther de pétrole et placés sous agitation
pendant 24h. Après filtration sur papier Whatmann, le marc est ensuite mis en agitation avec
2000 ml de dichlorométhane pendant 24 h, puis 2000 ml de méthanol pendant aussi 24h.
Les 3 types extraits ont été concentrés sous vide au Rotavapor.
I.2.3.2. Extrait aqueux :
Une macération aqueuse a également été effectuée sur 50 g de poudre avec 500 ml d’eau
distillée et placés sous agitation pendant 24 h. Après filtration, l’extrait a été lyophilisé.

Chapitre 1 Matériel et méthodes


27
Matériel végétale sec broyé
•Extraction à froid par
l’éther de pétrole (24h)
• Décantation
• .Filtration
Extrait Etheropétrolique
Résidu végétal sec
• Extraction par le dichlorométhane
• Décantation
• Filtration
Résidu végétal sec
Extrait Dichlorométhanique
•Extraction par le méthanol
• Décantation
• Filtration
Résidu végétal sec
Extrait Méthanolique
Filtrat
Filtrat
• Concentration à T=40°C
Filtrat
• Concentration à T=35°C
• Concentration à T=50°C


Figure 12. Différentes étapes d’extraction par épuisement successive du matériel végétal.

I.2.4. Analyse des extraits du Zizyphus lotus
I.2.4.1. Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus
I.2.4.1.1.Tests préliminaires
Mise en évidence des flavonoїdes
A 3 ml de chaque extrait, on ajoute 5 ml d’ HCl (acide chlorhydrique), puis quelques
morceaux du magnésium.En présence des flavonoides (flavone aglycone), une couleur rouge
est apparue (Ciulcl, 1982).
Mise en évidence des tanins :
L’ajout de trichlorure du fer (FeCl
3
) 1%, permet de détecter la présence ou non des tanins.
La couleur vire au bleu noir en présence des tanins galliques, et au bleu verdâtre en présence
des tanins catéchiques (tanins condensés) (Dohou et al ., 2003).
Chapitre 1 Matériel et méthodes


28
I.2.4.1. 2.Chromatographie sur couche mince
Pour une caractérisation partielle des extraits du Zizyphus lotus, on utilise la
chromatographie sur couche mince, cette technique de séparation basée sur l’utilisation d’une
phase mobile (solvant) le long d’une phase stationnaire (gel de silice), dont la séparation
dépend des phénomènes d’adsorption et de partage.
L’analyse des extraits du Zizyphus lotus a été réalisée sur des plaques de gel de silice avec
indicateur de fluorescent (20x20cm, 60 F254), selon la méthode de Diallo et al (2004) avec
quelques modifications,les quatre extraits ont été dissous dans leur solvant d’origine.
L’analyse des extraits polaires (AQ, MET) est effectuée par un système de séparation BAW
(butanol/acide acétique/eau) avec des proportions (60/15/35). Alors pour les extraits apolaires
(DCM, ET) on utilise le système (éther de pétrole/acétate d’éthyle) avec les proportions (8/2).
5 µl de chaque extrait (10mg/ml) et de standard (2mg/ml), sont déposés et les plaques sont
ensuite introduites dans la chambre de migration préalablement saturée par la vapeur de la
phase mobile. Après migration, les plaques sont séchées, puis visualisées par 3 systèmes de
révélation :
• Révélation physique sous UV à 254nm.
• Révélation physique sous UV à 366nm.
• Révélation chimique par une solution de vanilline sulfurique.
• Révélation chimique par une solution éthanolique du DPPH à 2,4% pour la
détection des extraits ayant une activité antioxydante (Juma et Majinda, 2004).
Les rapports frontaux (RF) des spots issus de la séparation sont calculés (le rapport frontal est
le rapport entre la distance parcourue par la tache et celle du solvant) et comparés à ceux des
témoins permettant ainsi l’identification de différents extraits.

I.2.4.1. 3.Chromatographie liquide à haute performance HPLC –RP-C18
Pour analyser les différents extraits du Zizyphus lotus l’HPLC -RP-C18 a été utilisé.
La chromatographie liquide à haute performance à phase inverse est une technique de
séparation, dans laquelle la phase mobile est un liquide polaire (solvant), et la phase
stationnaire est une colonne (125 x 4,6mm) étroitement emballée par des particules C18
(apolaire), ces particules ayant un diamètre moins de 10µm, ce qui nécessite de pomper la
phase mobile à travers la colonne à haute pression. La pompe garde un débit précis de sorte
que le temps de rétention de chaque pic peut être employé pour identifier des pics de
l’échantillon à tester.
Chapitre 1 Matériel et méthodes


29
Ceci est fait par comparaison des chromatogrammes des standards avec celui de
l’échantillon.
Dans notre analyse, nous avons utilisé une élution isocratique dans laquelle une seule source
du solvant utilisée pour éluer les composons à travers la colonne .La phase mobile utilisée est
un mélange méthanol /eau (60/40), le débit de la phase mobile est 0,5 ml/min. La température
est réglée à 40 C
0
. Le détecteur utilisé est un détecteur UV à une longueur d’onde 254nm
(Kuntie et al ., 2007).

I.2.4.2. Analyse quantitative des extraits du Zizyphus lotus :
I.2.4.2.1. Dosage des polyphénols
Les polyphénols sont estimés par la méthode de Folin Ciocalteu (Wong et al ., 2006).Ce
dosage repose sur le réactif de Folin Ciocalteu qui est constitué d’un mélange d’acide
phosphotungstique et d’acide phosphomolybdique. L’oxydation des phénols réduit, ce réactif
en un mélange d’oxyde bleus de tungstène et de molybdène .l’intensité de la couleur est
proportionnelle au taux de composés phénoliques oxydés ( Boizot et Charpentier,2006).
200 µl de chaque extrait (dissous dans le méthanol pour les extraits organiques, et l’eau
distillée pour l’extrait aqueux) sont ajoutés à1 ml du réactif de Folin Ciocalteu dilué 10 fois,
après 4 min, 800 µl d’une solution de carbonate du sodium (75g/l) sont ajoutés. L’absorbance
est mesurée à 765 nm après 2h d’incubation. Les concentrations des polyphénols sont
déduites à partir des gammes d’étalonnage établies avec l’acide gallique (0-200µg/ml) et sont
exprimées en microgramme d’équivalent d’acide gallique par milligramme d’extrait (µg
EAG/mg).

I.2.4.2.2. Dosage des flavonoїdes
La méthode du trichlorure d’aluminium (Bahorun et al .,1996) est utilisée pour quantifier
les flavonoїdes dans les différents extraits du Zizyphus lotus .1 ml de chaque échantillon et du
standard ( préparés dans le méthanol pour les extraits organiques et l’eau distillée pour
l’extrait aqueux )avec dilutions convenables sont ajoutés à 1 ml d’AlCl
3
(2 % dans le
méthanol). Après 10 min d’incubation, l’absorbance est lue à 430 nm. Les concentrations des
flavonoїdes sont déduites à partir des gammes d’étalonnage établies avec la quercétine (0-
35µg/ml), et sont exprimées en microgramme d’équivalent de quercétine par milligramme
d’extrait (µg EQ/mg).


Chapitre 1 Matériel et méthodes


30
I.2.4.2.3. Dosage des tanins condensés
Le dosage des tanins condensés dans les extraits du Zizyphus lotus est effectué selon la
méthode de Broadhurst et Jones (1978), modifiée par Heimler et al. (2006). Le principe de ce
dosage est basé sur la fixation du groupement aldéhydique de vanilline sur le carbone 6 du
cycle A de la catéchine pour former un complexe chromophore rouge qui absorbe à 500nm
(Schofield et al .,2001) (Figure 13).



Vanilline Couleur rouge
Figure13. La réaction entre la vanilline est les tanins condensés (Schofield et al ., 2001).-

Pour 400µl de chaque échantillon ou standard, on ajoute 3ml d’une solution de vanilline
(4% dans le méthanol), et 1,5 ml d’acide hydrochlorique concentré. Le mélange est incubé
durant 15 min et l’absorbance est lue à 500nm.
Les concentrations des tanins condensés sont déduites à partir des gammes d’étalonnage
établies avec la catéchine (0-300µg/ml), et sont exprimées en microgramme d’équivalent
catéchine par milligramme d’extrait (µg E CT/mg).

I.2.5. Tests des activités biologiques
I.2.5.1. Activité antimicrobienne
Souches microbiennes testées
Les souches microbiennes utilisées sont :Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
,Escherichia coli (ATCC 25922) ,Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) Salmonella
thyphimurium ,Klebsiella pneumonia ATB (1476), Candida albicans.


Chapitre 1 Matériel et méthodes


31
Test antimicrobien
Afin d’évaluer l’activité antimicrobienne des extraits des fruits obtenus, nous avons utilisé
la méthode de diffusion en milieu gélosé.
Le principe de cette méthode est d’utiliser des disques de papier Whatmann de 6mm de
diamètre. Les disques ont été imprégnés dans différentes solutions (1g/ml) des extraits dissous
dans le DMSO (dimethylsulfoxide) pour les extraits organiques, et dans l’eau distillée stérile
pour l’extrait aqueux (Un disque imbibé par le DMSO a été employé en tant que contrôle
négative).Puis déposés à la surface d’un milieu écouvillonné par une suspension microbienne
d’une densité optique de 0,5McFarlend. Nous avons utilisé pour les souches bactériennes le
milieu Muller Hinton, et le milieu Saboroud pour la levure. A la fin de la durée d’incubation
(18-24h pour les souches bactériennes et 48h pour la levure à37
o
c), les diamètres des zones
d’inhibition ont été mesurés (Choi et al ., 2006).

I.2.5.2. Tests d’activité antioxydante :
I.2.5.2.1. Test du blanchissement du β carotène
L’activité antioxydante des extraits du Zizyphus lotus est mesurée selon la méthode de
Khartal et al (2007).Dans ce test la capacité antioxydante est déterminée en mesurant
l’inhibition de la dégradation oxydative de β carotène (décoloration) par les produits
d’oxydation de l’acide linoléique.
L’émulsion de β- carotène /acide linoléique est préparée par solubilisation de 3 mg de β
carotène dans 1 ml du chloroforme ,25µl de l’acide linoléique et 200mg de tween 40 sont
additionnés, le chloroforme est complètement évaporé au rotavapeur, par la suite 100ml d’eau
oxygénée est ajouté, l’émulsion résultante est agitée vigoureusement.
350µl de solution d’extrait ou antioxydant de référence (BHT) (solubilisé dans le méthanol
sauf l’extrait aqueux dans l’eau distillée (2mg/ml)) sont additionnés à 25 ml de l’émulsion
précédente.
La cinétique de décoloration de l’émulsion en présence et en absence d’antioxydant
(contrôle négatif dans lequel l’échantillon est remplacée par 350µl de méthanol) est suivie à
490nm à des intervalles de temps régulières pendant 48heures .L’activité antioxydante
relative des extraits (AAR) est calculée selon l’équation suivante :
AAR=Abs
t=48h
(échantillon)/Abs
t=48h
(BHT) x100



Chapitre 1 Matériel et méthodes


32
I.2.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH :
Afin d’étudier l’activité antiradicalaire des différents extraits, nous avons utilisé la méthode
basée sur le DPPH (diphényl picryl hydrayl) comme un radical relativement stable ,selon le
protocole décrit par Mansouri et al (2005).Dans ce test les antioxydants réduisent le diphényl
picryl hydrayl ayant une couleur violette en un composé jaune , le diphényl picryl hydrazine ,
dont l’intensité de la couleur est inversement proportionnelle à la capacité des antioxydants
présents dans le milieu a donné des protons (Sanchez-Moreno,2002).
La solution de DPPH est préparée par solubilisation de 2,4 mg de DPPH dans 100ml de
méthanol .50µl des solutions d’extraits ou standard (quercétine) sont ajoutés à 1,95ml de
DPPH, le mélange est laissé à l’obscurité pendant 30min, et la décoloration par rapport au
contrôle négatif contenant uniquement la solution de DPPH est mesurée à 517nm.
L’activité antiradicalaire est estimée selon l’équation suivante :
% d’activité antiradicalaire= [(Abs
517
contrôle-Abs
517
échantillon)/Abs
517
controle] x100
Les concentrations des extraits dans le milieu réactionnel sont comprises entre 0-
12,5mg/ml, 0-4mg/ml,0-2,5mg/ml,0-1mg/ml pour les extraits :ET , DCM, MET, AQ
respectivement. Alors que pour les antioxydants standard (Rutine, Quercétine, BHT) sont
comprises entre 0à50µg/ml et entre 0à25µg/ml pour la vitamine C.

I.2.5.2.3. Analyses statistiques
Les résultats des tests effectués sont exprimés en moyenne ±SD. Les sigmoїdes de l’activité
antiradicalaire des différents standards et extraits sont effectués par le logiciel (Graph Pad
Prism V 5,00).
La différence entre les extraits et les contrôles et la détermination des taux de signification
sont effectués par test ANOVA suivi du test Tukey.





















Chapitre II
Résultats et discussion


Chapitre II Résultats et discussion
33
II.1. Détermination de la teneur en eau dans les fruits du Zizyphus lotus
Afin de déterminer la teneur en eau dans les fruits du Zizyphus lotus, nous avons
utilisé la méthode d’Audigie et al (1987), dont le but est d’exprimer les résultats des
constituants biochimiques par rapport à la matière sèche.
Tableau 4. La teneur en eau et de matière sèche des fruits du Zizyphus lotus




Les valeurs représentent la moyenne de 30 essais ±SD
Comparativement aux valeurs trouvées chez d’autres variétés du même genre
d’occurrence, le Zizyphus mauritiana (Grosskinsky, 1999), Zizyphus spina christi
(Anthony, 2005) et Zizyphus jujuba (Catoire et al ., 1994), dont la teneur en eau est
comprise entre 46 à 85%,la valeur que nous avons obtenue pour Zizyphus lotus est
nettement faible (8,96±0,73%).
Ce ci s’explique probablement par sa conservation pendant de longues durées,
et même la différence des conditions climatiques et la répartition géographique.
II.2. Détermination de la teneur en cendre dans les fruits du Zizyphus lotus
La teneur en cendre du Zizyphus lotus a été déterminée après incinération, la
cendre grisâtre obtenue représente les diverses substances minérales.
Tableau 5. La teneur en cendre et de matière organique des fruits du Zizyphus lotus




Les valeurs représentent la moyenne de 30 essais ±SD
Selon Murdock (2002), la teneur en éléments minéraux de ce fruit est (0,82% de
matière sèche), qui est une valeur inférieure à celle de notre échantillon (3,5%).
Teneur en eau (g/100g) Teneur en matière sèche (g/100g)

8,96±0,73

91,03±0,73
Teneur en cendre (g/100g) Teneur en matière organique
(g/100g)

3,5±0,31

96,5±0,31
Chapitre II Résultats et discussion
34
II.3. Préparation des extraits à partir des fruits du Zizyphus lotus
La préparation des extraits à partir des fruits du Zizyphus lotus a été effectuée
selon la méthode de Diallo et al. (2004) modifiée. Cette méthode est basée sur
l’utilisation des solvants à polarité croissante (Ether de pétrole
→Dichlorométhane→Méthanol), avec la préparation d’une macération aqueuse à
10%. De ce fait, quatre différents extraits ont été obtenus.
L’extrait éthérique (ET), qui représente l’extrait le plus apolaire, et le plus
riche en matière grasse.
L’extrait dichlorométhanique (DCM), représente l’extrait moyennement
apolaire
L’extrait méthanolique (MET) représente l’extrait polaire
L’extrait (AQ), représente l’extrait le plus polaire.
La couleur, l’aspect ainsi que le rendement de chaque extrait par rapport au
poids du fruit sec sont représentés dans le tableau 6 ci-dessous.
Tableau 6. Aspects, couleurs et rendement des divers extraits du fruit Zizyphus lotus
Extrait Aspect Couleur Rendement
ET
DCM
MET
AQ
Huileux
Huileux
Pâteux
poudre
Vert
Vert noir
Marron foncé
Marron clair
0,36%
0,28%
6,4%
40,4%

Les résultats obtenus montrent que parmi les quatre extraits, l’extrait (AQ)
représente le rendement le plus élevé (40,4%), suivi par l’extrait méthanolique 6,4%,
alors les extraits apolaires possèdent les rendements bas, dont l’extrait éthérique
(0,36%) suivi par l’extrait dichlorométhanique(0,28%).
Chapitre II Résultats et discussion
35
L’utilisation de différents solvants à polarité différente permet de séparer des
composés selon leur degré de solubilité dans le solvant d’extraction. Cette méthode
d’extraction menée à température ambiante et sous agitation contenue, permet
d’extraire le maximum des composants bioactifs et de prévenir leur dénaturation ou
modification probable, dont la température élevée provoque l’inactivation des
composés phénoliques, la diminution de leur extractibilité dans le solvant, aussi
affecte leur quantification (Hagermann et al ., 2000).
II.4. Analyse des extraits du Zizyphus lotus :
II.4.1.Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus
II.4.1.1.Tests préliminaires
Tableau 7. Résultats des testes préliminaires des flavonoides et des tanins
sur les différents extraits du Zizyphus lotus

A l’égard des résultats obtenus, la présence des flavonoïdes et des tanins dans
les fruits du Zizyphus lotus est évidente, ce qui est en accord avec les résultats obtenus
par Borgi et al. (2007(b)).
Extraits Métabolite testé Couleur résulte Résultats
ET
DCM
MET
AQ

Flavonoїde
-
-
Couleur rouge
Couleur rouge
-
-
+
+
ET
DCM
MET
AQ

Tanins
-
-
Bleu verdâtre
Bleu verdâtre
-
-
+
+
Chapitre II Résultats et discussion
36
Les extraits polaires montrent une présence des flavonoides plus importante que
les extraits apolaires, ce ci peut être attribué à la différence du degré de polarité des
flavonoїdes, dont les flavonoides polaires représentent la fraction la plus élevée.
L’apparition de la couleur bleu verdâtre reflète la présence des tanins
catéchiques (condensés) dans les extraits polaires, alors son absence total dans les
extraits apolaires. Les mêmes résultats sont trouvés par Borgi et al. (2007(b)), qui ont
effectué le test préliminaire des tanins sur différents extraits obtenus à partir des
différents organes du Zizyphus lotus, dont ses résultats ont révélé la présence des
tanins dans les extraits polaires (aqueux et méthanolique), et leur absence dans
l’extrait chloroformique (solvant équivalent du point de vue polarité au
dichlorométhane utilisé dans le présent travail).
II.4.1.2. Analyses chromatographiques
II.4.1.2.1. Chromatographie sur couche mince
Pour une caractérisation partielle des différents extraits du Zizyphus lotus, une
chromatographie sur couche mince (CCM) a été réalisée. Les standards utilisés sont
des composés phénoliques. La rutine (Rut), quercétine (Que), catéchine (Cat) sont des
flavonoides, l’acide tannique (At) et l’acide gallique (Ag) sont des acides
phénoliques. Le système de migration utilisé (BAW) butanol-acide acétique- eau
(60/15/35) permet seulement de séparer l’extrait MET. Alors pour les extraits DCM et
ET, le système de migration (Ether de pétrole/acétate d’éthyle) (8/2) a été employé

MET AQ Ag At Que Rut Cat
Figure 14. Chromatographie sur couche mince des extraits polaires des fruits du
Zizyphus lotus après révélation par la vanilline sulfurique
Chapitre II Résultats et discussion
37

MET AQ Ag At Que Rut Cat
Figure 15. Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du Zizyphus
lotus (Observation sous la lampe UV (254nm))










ET DCM ET DCM
Figure 16. Chromatographie sur couche mince des extraits apolaires des fruits du
Zizyphus lotus (Révélation par la vanilline sulfurique)


Chapitre II Résultats et discussion
38

AQ MET Rut Que ET DCM
Figure 17. Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du
Zizyphus lotus (Révélation par une solution de DPPH)

Tableau 8. Rapports frontaux et couleurs après révélation des standards








Après révélation, deux taches apparaissent pour l’extrait MET, elles sont visibles
sous les révélateurs (vanilline sulfurique, UV 254nm et UV366nm) (Figure 14,15).
La mesure des rapports frontaux de chacune des taches révèle que l’une des
tache correspond à la quercétine (RF=0,93) et l’autre à la rutine (RF=0,52), ceci est en
Standards Couleur après révélation
(vanilline sulfurique)
RF
Catechine Rouge 0,87
Quercétine Jaune orange 0,93
Rutine orange 0,52
Acide gallique Mauve 0,86
Acide tannique Mauve 0,83
Chapitre II Résultats et discussion
39
accord avec les résultas obtenus par Kriventsov et Krakhanova (1970) qui ont montré
la présence des polyphénols et de la rutine dans les fruits du Zizyphus lotus.
Alors pour le système (Ether de pétrole/acétate d’éthyle) (8/2), plusieurs taches
apparaissent pour les extraits apolaires (ET, DCM) avec des couleurs mauves, et
roses, témoignant probablement la présence des stérols et terpènes (Figure 16).
La révélation de la plaque par la solution éthanolique de DPPH est une CCM de
criblage qui permet l’obtention d’une vue préliminaire sur l’activité antioxydante des
différents extraits testés. Les substances actives sont visualisées comme des taches
jaunes sur un fond violet (Figure 17).
Globalement, l’intensité des taches jaunes est plus dense dans les extraits polaires
(AQ, MET) par rapport aux extraits apolaires (ET, DCM) qui ne présentent aucune
tache jaune. Notant toutefois qu’un résultat négatif obtenu pour un extrait testé ne doit
pas exclure la présence de substances actives dans cet extrait.
L’une des taches apparaissent pour l’extrait MET, une tache jaune correspondante
à la rutine (RF=0,52), ce qui confirme le résultat obtenu sous la révélation par la
vanilline sulfurique, alors nous avons remarqué l’absence de la tache qui est
normalement correspondante à la quercétine, ceci peut être attribué à la faible
concentration de la quercétine présent dans l’échantillon testé. Alors pour l’extrait AQ
une tache jaune apparue, ayant un (RF=0,93) correspondant à la quercétine qui
n’apparaît pas sous les autres révélateurs.
II.4.2.2. Chromatographie liquide à haute performance HPLC –RP-C18
L’HPLC-RP C18 permet d’identifier la présence de quelques substances dans
chacun des quatre extraits étudiés, par comparaison entre le temps de rétention des
standards (Figure18) et les chromatogrammes des extraits.





Chapitre II Résultats et discussion
40





Acide gallique Acide tannique






Acide caféique Catéchine






Rutine Quercétine

Figure 18. Chromatogrammes des différents standards testés par l’HPLC

Minutes
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
V
o
l
t
s
0
1
2
V
o
l
t
s
0
1
2
0
,
7
0
0

1
,
3
2
5
1
,
6
7
5
3
,
1
7
5
ChannelA
soumia
1062
RetentionTime
Minutes
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
V
o
l
t
s
0,0
0,5
1,0
1,5
V
o
l
t
s
0,0
0,5
1,0
1,5

1
,
1
0
8
1
,
3
0
8
1
,
6
4
2
2
,
0
7
5
ChannelA
soumia
1064
RetentionTime
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
V
o
l
t
s
0
1
2
3
V
o
l
t
s
0
1
2
3

1
,
9
9
2
3
,
1
0
8
4
,
6
0
0
5
,
1
0
0
ChannelA
soumia
1139
RetentionTime
Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
V
o
l
t
s
0,0
0,1
0,2
V
o
l
t
s
0,0
0,1
0,2
0
,
7
5
0
1
,
0
2
5
1
,
2
1
7
1
,
4
3
3
1
,
7
4
2
2
,
6
7
5
3
,
2
7
5
3
,
8
5
8
4
,
3
1
7
4
,
7
2
5
6
,
1
8
3
ChannelA
soumia
1047
RetentionTime
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14
V
o
l
t
s
0,0
0,5
1,0
1,5
V
o
l
t
s
0,0
0,5
1,0
1,5
0
,
8
2
5
1
,
1
0
8
1
,
3
7
5
1
,
6
2
5
1
,
8
5
0
3
,
3
3
3
1
2
,
6
8
3
1
3
,
7
9
2
ChannelA
soumia
1036
RetentionTime
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14
V
o
l
t
s
0
1
2
V
o
l
t
s
0
1
2
0
,
7
2
5
0
,
9
4
2
1
,
2
2
5
1
,
3
5
8
1
,
6
8
3
2
,
9
5
0
3
,
3
0
0
ChannelA
soumia
1137
RetentionTime
Chapitre II Résultats et discussion
41
Tableau 9. Temps de rétention des standards testés
Standards (TR) min
Quercétine
Rutine
Catechine
Acide cafféique
Acide tannique
Acide gallique
6,5
3,3
1,7
1,9
1,64
1,67

Les résultats obtenus sont montrés dans le tableau suivant :
Tableau 10. Les standards détectés dans les différents extraits du Zizyphus lotus
Quercétine Rutine Catechine A.cafféique A.gallique Atannique
ET - - + + - -
DCM - - + + - -
MET - - - + - -
AQ + - + - - -

L’analyse des différents extraits par l’HPLC permet d’identifier la présence de la
catéchine et l’acide caféique dans les extraits apolaires (ET, DCM) (Figure 19,20)
Alors pour l’extrait MET (figure 21), l’acide caféique est le seul composant
détecté, ceci est correspondant au résultat obtenu par Capanoglu et al. (2006) qui a
réalisé l’HPLC sur le Zizyphus vulgaris
Pour l’extrait aqueux (Figure 22), deux composants sont détectés, la catéchine et la
quercétine qui est apparu précédemment après révélation par la solution du DPPH.
Chapitre II Résultats et discussion
42
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14
V
o
l
t
s
0,000
0,002
0,004
V
o
l
t
s
0,000
0,002
0,004
0
,
6
8
3

1
,
5
7
5
1
,
8
3
3
2
,
0
8
3
2
,
3
5
8
2
,
6
7
5
3
,
0
0
0
3
,
2
9
2
3
,
6
6
7
4
,
1
1
7
4
,
5
7
5
5
,
2
5
8
6
,
0
0
8
6
,
5
0
8
7
,
2
2
5
8
,
3
7
5
9
,
0
3
3
1
0
,
3
6
7
1
1
,
3
3
3
1
2
,
2
3
3
1
4
,
7
4
2
Channel A
soumia
1003
Retention Time

S
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
V
o
l
t
s
0,000
0,002
0,004
V
o
l
t
s
0,000
0,002
0,004

1
,
6
7
5
1
,
9
6
7
2
,
2
4
2 2
,
5
3
3
2
,
8
7
5
3
,
2
3
3
3
,
5
4
2
3
,
9
5
0
4
,
4
4
2
4
,
9
3
3
5
,
6
6
7
5
,
9
5
8
7
,
0
3
3
7
,
6
2
5
9
,
5
4
2
1
0
,
8
5
0
1
2
,
9
1
7
1
5
,
4
5
0
1
6
,
3
9
2
Channel A
soumia
1004
RetentionTime

Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
V
o
l
t
s
0,000
0,002
0,004
V
o
l
t
s
0,000
0,002
0,004

1
,
6
5
8
1
,
9
4
2
2
,
2
4
2
2
,
5
0
0
3
,
1
8
3
3
,
4
8
3
3
,
8
8
3
4
,
3
7
5
4
,
8
7
5
5
,
5
7
5
6
,
3
4
2
6
,
9
0
8
7
,
6
5
0
9
,
4
7
5
9
,
8
7
5
9
,
9
9
2
1
0
,
7
9
2
1
1
,
0
4
2
1
2
,
7
3
3
1
5
,
3
0
8
1
6
,
2
0
8
1
6
,
8
3
3
1
7
,
1
0
8
Channel A
soumia
1005
Retention Time
Figure 19.Chromatogrammes obtenus pour l’extrait éthérique du Zizyphus lotus
Chapitre II Résultats et discussion
43
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
V
o
l
t
s
0,0000
0,0025
0,0050
V
o
l
t
s
0,0000
0,0025
0,0050

1
,
4
9
2
1
,
9
8
3
2
,
2
0
0
2
,
8
6
7
3
,
5
0
8
3
,
9
3
3
4
,
3
8
3
5
,
0
5
0
5
,
4
5
8
5
,
5
7
5
6
,
2
5
8
6
,
8
8
3
1
1
,
6
0
8
1
3
,
8
7
5
Channel A
soumia
1006
Retention Time

Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
V
o
l
t
s
-0,00025
0,00000
0,00025
0,00050
V
o
l
t
s
-0,00025
0,00000
0,00025
0,00050

1
,
3
8
3
1
,
7
6
7
1
,
9
6
7
2
,
1
5
8
3
,
6
6
7
3
,
8
5
8
4
,
0
3
3
8
,
4
0
0
Channel A
soumia
1010
Retention Time
Figure 20.Chromatogrammes obtenus pour l’extrait du dichlorométhane du Zizyphus
lotus
Minutes
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
V
o
l
t
s
0,00
0,05
0,10
0,15
V
o
l
t
s
0,00
0,05
0,10
0,15

1
,
6
9
2
2
,
0
0
8
2
,
1
4
2
2
,
4
5
8
3
,
9
3
3
Channel A
soumia
cafeine011
Retention Time




Minutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
V
o
l
t
s
0,0
0,1
0,2
0,3
V
o
l
t
s
0,0
0,1
0,2
0,3

1
,
5
4
2
1
,
6
5
0
2
,
0
9
2
2
,
7
2
5
7
,
5
7
5
9
,
9
0
0
Channel A
soumia
1211
Retention Time

Figure 21. Chromatogrammes obtenus pour l’extrait méthanolique du Zizyphus lotus
Chapitre II Résultats et discussion
44

Minutes
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
V
o
l
t
s
0,0
0,1
0,2
0,3
V
o
l
t
s
0,0
0,1
0,2
0,3
0
,
5
0
8

1
,
4
7
5
1
,
7
0
8
3
,
6
2
5
Channel A
soumia
1191
Retention Time

Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14
V
o
l
t
s
0,0
0,1
0,2
V
o
l
t
s
0,0
0,1
0,2

1
,
0
8
3
1
,
5
4
2
1
,
7
7
5
2
,
8
0
8
4
,
2
9
2
6
,
5
5
8
Channel A
soumia
1066
Retention Time

Figure 22. Chromatogrammes obtenus pour l’extrait aqueux du Zizyphus lotus
II.4.2. Analyse quantitative des extraits des fruits du Zizyphus lotus
Afin de caractériser les différents extraits préparés à partir des fruits du Zizyphus
lotus ,un dosage des polyphénols totaux , des flavonoides et des tanins a été effectué.
Le choix du dosage de ces substances réside dans le fait que la majorité des propriétés
antioxydantes des plantes leur sont attribués.
La méthode du dosage des polyphénols totaux est celle de Folin –Ciocalteu (Li et al .,
2007). L’acide gallique a été utilisé comme standard .Tandis que celui des flavonoides
a été réalisé selon la méthode de trichlorure d’aluminium (Bahorun et al ., 1996) ,en
utilisant comme standard la quercétine, enfin celui des tanins condensés a été
effectué selon la méthode de vanilline (Broadhurst et Jones 1978), modifiée par
Heimler et al. (2006), en utilisant la catechine comme standard. Les résultats sont
représentés dans le tableau11 et les gammes d’étalonnage dans les figures 23, 24,25

Chapitre II Résultats et discussion
45
Tableau 11.Dosage des polyphénols totaux, des flavonoides et des tanins condensés
dans les différents extraits du fruit du Zizyphus lotus

(a)
µg d’équivalent d’acide gallique par milligramme d’extrait.

(b)
µg d’équivalent de quercétine par milligramme d’extrait.
(c)
µg d’équivalent de catéchine par milligramme d’extrait.
Les valeurs représentent la moyenne de 3 à 4 mesures ± SD.
Les résultats du dosage des polyphénols totaux montrent que les extraits
polaires (méthanolique et aqueux) sont les extraits les plus riches en polyphénols,
dont les valeurs sont très proches (5±0,00 versus 5,8±1,24). D’autre part les extraits
apolaires (éthérique et du dichlorométhanique) ont montré des valeurs voisines
(2,34±0,54 versus 1,99±0,12).
Dans une étude faite sur cinq variétés du jujube chinois (Zizyphus jujuba), Li et
al. (2007) ont dosé les polyphénols totaux par la méthode de Folin-Ciocalteu dans des
extraits polaires obtenus par extraction à base méthanol/eau (4 :1 v/v) ; le résultat
obtenu pour l’un des cinq variétés (Zizyphus jujuba Sanbianhong) (5,18±0,29 µg
EAG/mg d’extrait) est presque similaire à celui obtenu avec l’extrait aqueux du
Zizyphus lotus (5,18±1,24 µg/mg d’extrait).
La détermination quantitative des flavonoides totaux par la méthode du
trichlorure d’aluminium révèle que l’extrait aqueux est l’extrait le plus riche en
flavonoides avec une teneur de (1,82±0,26µg EQ/mg d’extrait), suivi par l’extrait
méthanolique (0,83±0,17 µg EQ/mg d’extrait). Par la suite vient les extraits apolaires
(ET, DCM), dont l’extrait dichlorométhanique avec une teneur de (0,71±±0,5µg
EQ/mg d’extrait), suivi par l’extrait éthérique (0,64±0,4 µg EQ/mg d’extrait).
Extrait Polyphénols
(a)
Flavonoïdes
(b)
Tanins
©
ET 2,34±0,54 0,64±0,4 -
DCM 1,99±0,12 0,71±0,5 -
MET 5±0,00 0,83±0,17 4,57±0,94
AQ 5,8±1,24 1,82±0,26 6,77±1,95

Chapitre II Résultats et discussion
46
Capanoglu et al. (2006) ont dosé les flavonoides dans l’extrait méthanolique du
Zizyphus vulgaris, où ils ont trouvé une valeur supérieure (5,93µg/ml) à celle trouvée
dans l’extrait méthanolique du Zizyphus lotus (0,83 µg/ml).
En tenant compte de la polarité des extraits, il apparaît que la teneur en
flavonoides dans le Zizyphus lotus augmente avec la polarité de l’extrait
(AQ>MET>DCM>ET). Pawliska et al. (2009) a fait une étude sur deux espèces
Zizyphus jujuba et Zizyphus spina-christi, dont ils ont attribué la différence de teneur
en flavonoides entre les fruits, non seulement à l’espèce, mais aussi aux conditions de
croissance, comme le sol, les conditions enviromentales et géographiques durant le
développement du fruit, le dégrée de maturation et la différence génétique.
Le dosage des tanins condensés montrent la haute teneur de ces molécules dans
les extraits polaires (méthanolique et aqueux), dont l’extrait aqueux représente
l’extrait le plus riche (6,77±1,95 µg ECT/mg d’extrait), suivi par l’extrait
méthanolique (4,57±0,94 µg ECT/mg d’extrait)
L’examen de ces résultats permet de mettre en évidence une corrélation linéaire
significative (R
2
=0,79 p≤0,05) entre la teneur des extraits en flavonoïdes et en
composés phénoliques (Figure 26). De même, une corrélation linéaire significative
(R
2
=0,98, p≤0,05) entre la teneur des extraits en tanins condensés et en composés
phénoliques (Figure 27).
Ceci apparaît logique, où les flavonoides et les tanins représentent les composés
prépondérants des polyphénols.

y = 0,0116x + 0,0375
R
2
= 0,9985
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 50 100 150 200 250
C oncentrations en (ug/ml)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

à

7
6
5
n
m
Figure 23. Droite d’étalonnage de l’acide gallique (moyenne ± SD de deux essais)
Chapitre II Résultats et discussion
47
y = 0,0661x + 0,0112
R
2
= 0,9984
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 10 20 30 40 50
concentrations (ug/ml)
a
b
s
o
r
b
a
n
c
e

à

4
3
0
n
m
Figure 24. Droite d’étalonnage de la quercétine (moyenne ± SD de deux essais)
y = 0,0021x + 0,004
R
2
= 0,9975
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 100 200 300 400
c onc entrations (ug/ml)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

à

5
0
0
n
m

Figure 25. Droite d’étalonnage de la catéchine (moyenne ± SD de deux essais)







Chapitre II Résultats et discussion
48
R
2
=0,7948


0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
0
2
4
6
8
quantité en flavonoides (ug EQ/mg)
Q
u
a
n
t
i
t
é

e
n

p
o
l
y
p
h
é
n
o
l
s

t
o
t
a
u
x

(
u
g

E
A
G
/
m
g
)

Figure 26. Corrélation linéaire entre la quantité en polyphénols totaux et la quantité
des flavonoides des différents extraits du fruit Zizyphus lotus (p≤0,05)



R
2
=0,9855

0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
Quantité en tanins (µg E CT/mg)
O
u
a
n
t
i
t
é

e
n

p
o
l
y
p
h
é
n
o
l
s

(
µ
g

E
A
G
/
m
g
)

Figure 27.Corrélation linéaire entre la quantité en polyphénols totaux et la quantité
des tanins condensés des différents extraits du fruit Zizyphus lotus (p≤0,05)
Chapitre II Résultats et discussion
49
II.5. Activités biologiques
II.5.1. Activité antimicrobienne des extraits du Zizyphus lotus
L’activité antimicrobienne des différents extraits des fruits du Zizyphus lotus a
été évaluée par la méthode de diffusion en milieu gélosé, en mesurant les diamètres
des zones d’inhibition de la croissance microbienne (Figure 29).
Tableau 12. Diamètres des zones d’inhibition de la croissance microbienne obtenus
par différents extraits du Zizyphus lotus
Les valeurs sont une moyenne de 3 à 4 essais±SD (les zones sont mesurées en mm)
Tous les extraits du Zizyphus lotus se sont révélés actifs avec un degré
différent, lié au contenu des extraits aux substances à activité antimicrobienne.
Ghédira (1995) a montré qu’un alcaloïde de cette espèce présente une activité
antibactérienne significative, sans négliger l’effet synergique des autres molécules à
effet antimicrobien.
D’après les résultats obtenus, il apparaît que toutes les souches microbiennes
testées sont inhibées au moins par l’un des extraits, ce qui confirme le spectre large de
l’activité antimicrobienne de ce fruit.
L’extrait éthérique du Zizyphus lotus semble avoir l’effet inhibiteur le plus
puissant, parmi les quatre extraits, en présentant des zones d’inhibition de croissance
avec toutes les souches microbiennes sauf Salmonella thyphimurium, de même cet
extrait montre la plus grande zone d’inhibition, qui est apparue avec Escherichia coli
(une zone d’inhibition > 45mm), supérieure à toutes les zones obtenues après test des
antibiotiques sur la même souche (Amoxilline 22mm, Cefoxitine 26mm).
Extraits Staphylococcus
aureus
Escherichia
coli
Pseudomona
aeruginosa
Klebsiella
pneumonia
Salmonella
thyphimurium
Candida
albicans
ET 22,07±0,81 45,72±0 10,32±1,65 17,16±0 - 9±0
DCM 14,13±0,58 - - - - -
MT 16,45±0,49 6,29±0,05 9,76±1,81 - - -
AQ 17,41±1,71 - - - 7±0 12±0
Chapitre II Résultats et discussion
50
Cette activité de l’extrait éthérique peut s’expliquer par l’effet antimicrobien
puissant des composés apolaires de l’extrait éthérique .Une étude faite par Nasif
(2002) sur les graines du Zizyphus spina christi a montré que les acides gras de la
fraction lipidique présentent une forte activité contre E coli. L’extrait (DCM) a
montré seulement une activité avec Staphylococcus aureus.
Les extraits polaires du Zizyphus lotus ont montré une activité antimicrobienne
avec toutes les souches microbiennes sauf Klebsiella pneumonia, l’extrait
méthanolique a montré des zones d’inhibition avec trois souches bactériennes
(Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa), alors l’extrait
(AQ) a une activité avec Staphylococcus aureus, Salmonella thyphimurium et
Candida albicans.
Il est apparaît que le Staphylococcus aureus (gram positive) est la bactérie la
plus susceptible par comparaison avec les autres souches (gram négative) ; ceci peut
être attribué à la différence de la structure entre les bactéries gram positives et les
bactéries gram négatives. La paroi cellulaire des bactéries gram positives est
constituée par une seule couche alors que la paroi cellulaire des gram négatives a une
structure multicouche liée par une membrane cellulaire externe (Ali-Shtayeh et al .,
1998) (Figure 28)

Gram+ Gram-
Figure28 .Structure de la paroi bactérienne (Ali-Shtayeh et al ., 1998)
Chapitre II Résultats et discussion
51

Zones d’inhibitions de l’extrait MET sur Staph a Zones d’inhibition de l’extrait ET sur Staph a

Zones d’inhibitions de l’extrait ET sur Pseudo a Zones d’inhibition de l’extrait AQ sur Staph a

Zones d’inhibitions de l’extrait ET sur E coli Zones d’inhibitions de l’extrait AQ sur Candida a

Zones d’inibitions de l’exrait ET sur Klebsiella p
Figure 29. Zones d’inhibitions obtenues par différents extraits du Zizyphus lotus
Chapitre II Résultats et discussion
52
II.5.2. Activité antioxydant
II.5.2.1.Test du blanchissement du β-carotène
Dans ce test, l’oxydation de l’acide linoléique génère des radicaux peroxydes, et
des hydroperoxydes diène conjugués (Kaur et Kapoor, 2002). Ces radicaux libres vont
par la suite oxyder le β-carotène hautement insaturé (Figure 30) qui perd ses doubles
liaisons entraînant ainsi la disparition de sa couleur rouge, qui est suivi
spéctrophotométriquement à 490 nm. Cependant la présence d’un antioxydant
pourrait neutraliser les radicaux libres dérivés de l’acide linoléique, et donc prévenir
l’oxydation et le blanchissement du β-carotène (Yanishilieva et Marinova ,1995 ;
Yang et al ., 2008)

Figure 30. Structure chimique de β-carotène (Diallo, 2005)
La cinétique du blanchissement du β-carotène en absence et présence des
extraits du Zizyphus lotus, du BHT et les activités antioxydantes relatives (AAR) sont
représentés dans (Figure 31,32).
D’après ces résultats, il est évident que le BHT et les extraits testés inhibent
d’une manière significative (p≤0,01) l’oxydation couplée de l’acide linoléique et du β-
carotène par rapport au contrôle négatif qui représente (100%) de la peroxydation.
L’extrait aqueux (AQ) montre la plus grande activité inhibitrice, dont son
activité antioxydante relative est 85,05%, mais cette activité reste significativement
inférieure (p≤0,001) à celle du BHT (100%) utilisé comme contrôle positif.
Une activité antioxydante intermédiaire a été obtenue qu’avec l’extrait
méthanolique (MET) (69,24%) qui a une activité significativement supérieure (p≤
0,001) à celle de l’extrait éthérique (36,48%).
Chapitre II Résultats et discussion
53
L’activité de ce dernier est statistiquement similaire à celle de l’extrait du
dichlorométhane (33,9%) qui représente l’extrait le moins actif.
En comparaison avec BHT, l’extrait aqueux (AQ) est 1,7fois moins actif que le
BHT, l’extrait du dichlorométhane (DCM) est 2 fois moins actif que l’extrait
méthanolique, et 2,5 fois moins actif que l’extrait aqueux , et presque 3 fois moins
actif que le BHT.
Le test de blanchissement de β-carotène a été réalisé par Kamiloglu et al. (2009)
sur les extraits méthanoliques de 50 génotypes du Zizyphus jujube , où la moyenne de
l’activité antioxydante obtenue est 73% qui est une valeur modérément supérieure à
celle obtenue de l’extrait méthanolique du Zizyphus lotus (69,24%).
En effet, une corrélation linéaire remarquable et significative (R
2
=0, 99, p≤0,05)
a été mise en évidence entre l’ARR (activité antioxydante relative) des extraits du
Zizyphus lotus et leur teneurs en composés phénoliques (Figure 33). Ce ci est en
accord avec les résultats obtenus par Yang et al. (2002) qui ont rapporté qui il y a une
corrélation entre le contenu en composants phénoliques et la capacité antioxydante.
D’ailleurs, il y a une autre corrélation significative (R
2
=0, 99, p≤0,05), entre
l’AAR et la teneur en tanins condensés des différents extraits du Zizyphus lotus
(Figure 34), alors cette corrélation est non significative entre l’AAR et la teneur en
flavonoides des différents extraits.
Ces résultats nous permettent de déduire le rôle important des polyphénols des
extraits du Zizyphus lotus, et précisément les tanins condensés dans l’activité
antioxydante relative, où leur noyau phénolique leur confère une activité
antioxydante puissante (Peronny, 2005).
D’une manière générale, ces résultats sont en accord avec la littérature qui
suggère que l’activité antioxydante des extraits végétaux dépend du type du solvant
d’extraction et de sa polarité, dont la distribution des substances à activité
antioxydante entre les différents extraits dépend de polarité des extraits (Kang et al .,
2003).


Chapitre II Résultats et discussion
54
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 10 20 30 40 50 60
temps (h)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

à

4
9
0

n
m
BHT
ET
DMC
Met
AQ
CON-
Figure 31. Cinétique de blanchissement du β-carotène à 490 nm en absence et en
présence des extraits du Zizuphus lotus, du BHT, (chaque valeur représente la
moyenne de trois essais)


Figure 32. Activité antioxydante relative des extraits du fruit du Zizyphus lotus, du
BHT dans le système carotène /acide linoléique (les valeurs sont la moyenne de trois
mesures ± SD), les barres avec des lettres différentes indiquent des activités
significativement différentes (p ≤ 0,05).
B
H
T
E
T
D
C
M
M
E
T
A
Q
c
o
n
t
r
o
l
e

(
-
)
0
50
100
150
a
b
b
c
d
e
%

a
c
t
i
v
i
t
é

a
n
t
i
o
x
y
d
a
n
t
e

r
e
l
a
t
i
v
e
Chapitre II Résultats et discussion
55
R
2
=0,9913

0 2 4 6 8
0
20
40
60
80
100
teneur en polyphénols (µg EAG/mg)
%

a
c
t
i
v
i
t
é

a
n
t
i
o
x
y
d
a
n
t
e

r
e
l
a
t
i
v
e

Figure 33. Corrélation linéaire entre la teneur en polyphénols et le
pourcentage de l’activité antioxydante relative (p≤0,05).

R
2
=0,99


0 2 4 6 8
0
20
40
60
80
100
teneur en tanins(µg ECT/mg)
%
a
c
t
i
v
i
t
é

a
n
t
i
o
x
y
d
a
n
t
e

r
e
l
a
t
i
v
e

Figure 34. Corrélation linéaire entre la teneur en tanins et le pourcentage
de l’activité antioxydante relative (p≤0,05).



Chapitre II Résultats et discussion
56
II.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH
L’activité antioxydante des différents extraits du Zizyphus lotus vis-à-vis le
radical DPPH a été évaluée spectrophotométriquement en suivant la réduction de ce
radical qui s’accompagne par son passage de la couleur violette à la couleur jaune à
517 nm (Figure 35).

Diphenylpicrylhydrazyl +Antioxydant-OH → Diphenylpicrylhydrazine+Antioxydant-O
.

(Couleur violet) (Couleur jaune)

Figure 35. Réaction d’un antioxydant avec le DPPH (Molineux ,2004).

Le DPPH (diphenylpicrylhydrazyl) est un radical libre organique, toujours utilisé
comme un réactif pour évaluer l’activité antiradicalaire des antioxydants (Oyaizu,
1996).
Le DPPH est caractérisé par son adaptation à plusieurs échantillons dans une
courte durée, aussi il est assez sensible pour détecter les ingrédients actifs à des basses
concentrations, à cet effet, il a été employé pour le criblage des activités
antiradicalaires des extraits végétaux (Yi et al ., 2008).
Les profiles d’activité antiradicalaire obtenu (Figure 36,37) révèlent que les
extraits du Zizyphus lotus possèdent une activité antiradicalaire dose dépendante, les
IC
50
sont déterminés pour les extraits polaires (MET et AQ) seulement car les extraits
apolaires n’atteignant pas 50% d’activité (Tableau13) Pour mieux caractériser le
pouvoir antiradicalaire, deux autres paramètres sont introduits :
-Calcul de l’ EC
50
qui prend en considération la concentration de DPPH dans le
milieu réactionnel [concentration effective à 50%, EC
50
= (IC
50
/mg de DPPH/ml)]
-Calcul du pouvoir antiradicalaire (APR) qui est inversement proportionnel à
l’EC
50
) (Prakash et al ., 2007).

Chapitre II Résultats et discussion
57
Tableau 13. Activité antiradicalaire des extraits du fruit du Zizyphus lotus
IC
50
(µg /ml)

EC
50
(µg /µg DPPH)

APR

BHT
Rutine
4,47 ± 1,00
1,25±0,01
0,21± 0,04
0,06±0,00
4,77± 1,09
16±0,18
Quercétine
Vitamine C
0,44±0,00
1,44±0,07
0,02 ± 0,00
0,07±0,00
50 ±0 00
13,86±0,74
MET 195± 35,35 9,75± 1,76 0,1 ±0,01
AQ 55±35,35 2,75±1,76 0,45±0,28
DCM - - -
ET - - -

Les valeurs représentent la moyenne de deux essais ± SD
A des fins comparative, quatre antioxydants standards sont utilisés, le BHT, la
rutine, la quercétine et la vitamine C (Figure 38), ils ont montré une activité
antiradicalaire puissante avec des IC
50
de l’ordre de 4,47µg/ml et 1,25 µg/ml, 0,44
µg/ml, 1,44µg/ml et des APR de l’ordre de 4,77, 16, 50 et 13,86 respectivement. La
valeur de EC
50
de la vitamine C est similaire à celle rapportée auparavant
(EC
50
=0,07µg/µg DPPH) par Siddhurajuet et Manian (2007).
Baydar et al. (2007) ont rapporté que la rutine a montré une grande efficacité
antiradicalaire vis-à-vis le radical DPPH par rapport le BHT, ce qui est en accord avec
les résultats du présent travail, dont la rutine possède un pouvoir antiradicalaire 4 fois
supérieure à celui du BHT.
Parmi les quatre extraits du Zizyphus lotus, l’extrait aqueux représente l’extrait
le plus actif, avec une IC
50
de l’ordre 55µg /ml et un APR de 0,45 suivi par l’extrait
MET avec une IC
50
195µg/ml et un APR de 0,1.
Par contre les extraits apolaires (ET, DCM) montrent une très faible activité
antiradicalaire, dont le pourcentage de l’activité antiradicalaire n’atteint même pas
50%, ce qui montre que les antioxydants apolaires sont inactifs vis-à-vis du DPPH.
Chapitre II Résultats et discussion
58
Globalement ces résultats confirment les résultats de la CCM de criblage ou les
extraits polaires apparaissent les plus actifs.
En comparaison avec les antioxydants standards, tous les extraits testés s’avèrent
moins actifs .Le BHT ayant l’APR le plus faible entre les standards est 10,6 fois plus
actif que l’extrait aqueux et 47,7 plus actif que l’extrait méthanolique.
Li et al. (2005) ont évalué l’activité antiradicalaire vis-à-vis le radical DPPH des
extraits méthanoliques de cinq variétés du Zizyphus jujuba , où l’effet antiradicalaire
obtenu est entre 17,8 à 69,1% pour une concentration de 0,5 mg/ml .Cependant pour
la même concentration l’extrait AQ et MET du Zizyphus lotus ont montré un effet
antiradicalaire supérieure 83,56 et 83,14 % respectivement.
L’examen de ces résultats permet de mettre en évidence une corrélation linéaire
significative (R
2
=0,98, p≤0,01) entre la teneur des extraits en flavonoides et le
pouvoir antiradicalaire (APR) (Figure 39). En effet, les flavonoides sont reconnus
comme des substances potentiellement antioxydantes ayant la capacité de piéger les
espèces radicalaires et les formes réactives de l’oxygène.
Il est évident que la forte activité des extraits AQ et MET est attribuée à leur
richesse aux composés phénoliques, flavonoides et tanins, dont l’extrait AQ possède
la plus forte teneur en molécules dosés (polyphénols, flavonoides et tanins), suivi par
l’extrait MET. Une étude faite par Kang et al. (2003) a suggéré que les molécules
polaires présentes dans les extraits végétaux contribuent à l’augmentation de l’activité
antiradicalaire.







Chapitre II Résultats et discussion
59


0 1 2 3
0
20
40
60
80
100
MET
Concentration (mg/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t
é

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

Figure 36. Activité antiradicalaire des extraits polaires (MET, AQ) des fruits
du Zizyphus lotus (Chaque valeur représente la moyenne de deux essais)


DCM
0 1 2 3
0
10
20
30
Concentrat ion (mg/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t
é

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

Figure 37. Activité antiradicalaire des extraits apolaires (DCM, ET) des fruits du
Zizyphus lotus (Chaque valeur représente la moyenne de deux essais)

AQ
0.0 0.5 1.0 1.5
0
20
40
60
80
100
Concentration (mg/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t
é

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e
ET
0 5 10 15
0
5
10
15
20
25
Concentrat ion (mg/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t
é

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e
Chapitre II Résultats et discussion
60

Quercétine
0 20 40 60
0
20
40
60
80
100
concentration(µg/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t
é

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e
BHT
0 20 40 60
0
20
40
60
80
100
Concentration (µg/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t
é

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e


Rutine
0 20 40 60
0
20
40
60
80
100
Concentration en (µg/ml)
%
A
c
t
i
v
i
t
é

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

Vitamine C
0 10 20 30
0
20
40
60
80
100
Concentration en ug/ml
%
A
c
t
i
v
i
t
é

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

Figure 38. Activité antiradicalaire des standards la quercétine , le BHT,la rutine
et la vitamine C (Chaque valeur représente la moyenne de deux essais)
R
2
=0,98

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
teneur en flavonoideµg EQ/mg)
P
o
u
v
o
i
r

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

Figure 39. Corrélation linéaire entre la teneur en flavonoides et le pouvoir
antiradicalaire (p≤0,01).

Chapitre II Résultats et discussion
61









Conclusion

L’utilisation des plantes médicinales en phytothérapie a reçu un grand intérêt
dans la recherche biomédicale ; une telle thérapie prévient l’apparition des effets
secondaires observés lors de l’utilisation des médicaments de synthèse chimique.
L’étude des propriétés microbiologiques et antioxydantes des extraits du fruit du
Zizyphus lotus nous a permis d’obtenir des résultats intéressants.
Dans un premier temps, l’analyse qualitative de chaqu’un des quatre extraits
obtenus du fruit du Zizyphus lotus, a mis en évidence la présence des flavonoides, des
tanins dans les extraits polaires, et leur absence dans les extraits apolaires, alors que
l’analyse effectuée par chromatographie sur couche mince a montré la présence de la
rutine et la quercétine dans l’extrait méthanolique.
L’analyse des différents extraits du Zizyphus lotus par HPLC a révélé la présence
de quelques composés phénoliques dans les extraits, telles que dans les extraits
apolaires, la catéchine et l’acide caféique. Dans l’extrait aqueux cette analyse montre
la présence de quercétine et catéchine, alors dans l’extrait méthanolique l’acide
caféique est présent.
L’analyse quantitative des extraits du Zizyphus lotus est représentés par le dosage
spectrale des trois substances biactives : les polyphénols, les flavonoides et les tanins.
Les extraits polaires (méthanolique et aqueux) sont les extraits aux teneurs
considérables en métabolites dosés, dont l’extrait aqueux est l’extrait le plus riche,
alors les extraits apolaires (ethérique et dichlorométhanique) sont les extraits en
teneurs faibles.
Le test de l’activité antimicrobienne des différents extraits a montré que tous les
extraits testés sont actifs .D’ailleurs toutes les souches microbiennes testées (bactéries
et levures) sont inhibées au moins par l’un des extraits dont l’extrait ethérique qui a
plus d’activité (une zone d’inhibition supérieure à 45mm), supérieure à l’antibiotique
testé.
L’une des technique utilisée pour étudier l’activité antioxydante des différents
extraits est la méthode du blanchissement du β-carotène qui a révélé que les extraits
polaires les plus riches en composés phénoliques sont les extraits les plus actifs, dont
l’extrait aqueux à montré la plus grande activité, alors les extraits apolaires sont moins
actifs.


Le criblage préliminaire des extraits en CCM a permis de localiser le pouvoir
piégeur du DPPH dans les extraits polaires (AQ, MET) qui sont les extraits les plus
riches en composés phénoliques. Effectivement, le test au DPPH révèle que ces deux
extraits sont les plus actifs comme piégeur du radical DPPH dont l’extrait aqueux qui
a l’effet antiradicalaire le plus puissant, suivi par l’extrait méthanolique, alors que les
extraits apolaires ont montré une activité antiradicalaires faible.
En fin, l’ensemble de ces résultats obtenus in-vitro ne constitue qu’une première
étape dans la recherche de substances et source naturelle biologiquement active.Des
essais complémentaires seront nécessaires et devront pouvoir confirmer les
performances mises en évidences.

















Références bibliographiques

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Résumé

Les extraits naturels issus des végétaux contiennent une variété de
molécules biologiquement actives. Dans ce contexte, nous avons tenté d’évaluer
l’activité antimicrobienne et antioxydante des différents extraits préparés à partir du
fruit du Zizyphus lotus, L’analyse qualitative de ces extraits par CCM et HPLC a
révélé la présence des flavonoides et des tanins dans différents extraits , ce ci est
confirmé par une analyse quantitative basée sur le dosage, des composés
phénoliques,des flavonoides et des tanins dont les extraits polaires qui sont les plus
riches en ces molécules , où la teneur en composés phénoliques est (5,8µg EAG/mg
d’extrait) pour l’extrait aqueux , et (5µg EAG/mg d’extrait) pour l’extrait
méthanolique. L’évaluation de l’activité antimicrobienne des différents extraits a
révélé une puissante activité des différents extraits, surtout l’extrait ethérique qui est
responsable d’une grande zone d’inhibition de la souche bactérienne E. coli (>45mm).
L’étude de l’activité antioxydante par la méthode du blanchissement du β-
carotène et le test du DPPH a révélé le pouvoir antioxydant des extraits polaires (AQ,
MET) suite a une comparaison avec les extraits apolaires (ET, DCM), dont l’extrait
aqueux représente l’extrait le plus actif, avec une activité antioxydante relative de
85,05% et une IC
50
de l’ordre de 55µg/ml. A partir de ces résultats, on peut dire que
les extraits les plus riches en composés phénoliques sont les extraits à pouvoir
antioxydant puissant.
Mots clés : Zizyphus lotus, activité antimicrobienne, activité antioxydante, composés
phénoliques, flavonoides, tanins.
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Remerciement
Avant toute chose, je remercie Dieu, le tout puissant, pour m’avoir donnée la force et la patience. J’exprime d’abord mes profonds remerciements et ma vive connaissance à Mr YAHIA M, Maître de conférences à la faculté des sciences Université de Batna pour avoir encadré et dirigé ce travail avec une grande rigueur scientifique, sa disponibilité, ses conseils et la confiance qu’il m’accordé m’ont permet de réaliser ce travail. J’exprime mes vifs remerciements à Mme HAMBABA L, Maître de conférences à l’Université de Batna pour sa précieuse aide et ses conseils, et pour l’honneur qu’elle nous a fait en acceptant de présider le jury de ce mémoire Je tiens à exprimer également ma profonde reconnaissance au Mr ABDEDDAIM M, Maître assistant- chargé de cours de l’Université de Batna tout d’abord pour m’avoir fait confiance et pour m’avoir inspiré le sujet ensuite pour ses orientations judicieuses. Je tiens à exprimer ma très grande considération et ma vive reconnaissance à Mme ZAAMA D, Maître de conférences Université de Constantine pour l’honneur qu’elle nous a fait en acceptant de faire partie de jury. Mes remerciements à Mr YAHIA A, Maître de conférences Université de Oum ElBougui d’avoir bien voulu accepter de juger ce travail. Mes remerciements vont également à Mr LAROUI S, Maître de conférences Université de Batna d’avoir accepter de faire partie du jury. J’exprime mes vifs remerciements aux Mr ABERKANE M-CH et Mr AYACHI qui nous permet de réaliser une grande partie de mon travail au sein de leurs laboratoires.

En guise de reconnaissance, je dédie ce travail à mes chers parents, à ma famille ainsi qu’à toutes mes amies.

1.5.1. 14 Chapitre III : Les espèces réactives oxygénées et stress oxydant III.2.2. Activités anti-fongiques et anti-mollusques ……………………………. Activités anti-inflammatoires et analgésiques………………………… 4 I.2.4.3.1 I-2-Classification botanique…………………………………………………………… 1 I-3-Répartition géographique………………………………………………………….2. Les composés phénoliques II. 12 II.4 I.2.Localisation et distribution…………………………………………… 7 II. Sources des espèces réactives oxygénées…………………………………… 20 III. 20 III. 2 I-4-Composition biochimique du Zizyphus lotus……………………………………… 3 I-5-Activités biologiques et thérapeutiques du Zizyphus lotus……………………… 4 I. Localisation et distribution………………………………………….1. Sources endogènes………………………………………………… III.5.1.Structure chimique et classification………………………………….sources exogènes…………………………………………………….les espèces réactives oxygénées……………………………………………… 19 III.structure chimique et classification………………………………….Activités biologiques et thérapeutiques des tanins…………………...1.5..Sommaire Liste des tableaux Liste des Figures Introduction générale Partie I Etude bibliographique Chapitre I.2. 3. 7 II.2. 12 II. les flavonoїdes………………………………………………………………… 7 II. 8 II.Activités biologiques des flavonoїdes……………………………….1.2. Autres activités ………………………………………………………….5.1.3. Stress oxydant……………………………………………………………… 21 23 .2.1.2.2.5 Chapitre II. Généralités sur le Zizyphus lotus I-1-Description botanique du Zizyphus lotus …………………………………………..1.3.. Activités anti-ulcérogéniques……………………………………………4 I. Les tanins……………………………………………………………………… 12 II.

III.1.4..Chromatographie sur couche mince……………………………… 28 I.5.3.4.2.2. Analyses statistiques………………………………………………. Méthodes……………………………………………………………………….2.2.5. Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus………………….2.1. Extractions avec des solvants à polarité croissante………………….4.4.2.2.1. 29 I..5.2. Matériel et méthodes I.3. 32 .2.4.1. Les antioxydants…………………………………………………………….1. Matériel…………………………………………………………………………25 I.2..4.4.2.2.2.2. Effet scavenger du radical DPPH………………………………….4. 27 I. Les antioxydants enzymatiques……………………………………..2.2.III.2..2..2.2.2. 26 I.2.Chromatographie liquide à haute performance HPLC –RP-C18….1.3.31 I. Extrait aqueux ………………………………………………………. Analyse des extraits du Zizyphus lotus………………………………… 27 I. 25 I. Matériel végétal………………………………………………………… 25 I.5. 26 I.2.4.2.1. Détermination de la teneur en eau…………………………………… 25 I. Préparation des extraits à partir des fruits du Zizyphus lotus …………. les antioxydants non enzymatiques………………………………… 23 23 24 Partie II Etude Expérimental Chapitre I. Test du blanchissement du β carotène………………………………31 I. Dosage des tanins condensés……………………………………….1.4. 1.1..5.2.Tests préliminaires………………………………………………… 27 I.5. 32 I.2. Tests des activités biologiques…………………………………………. 30 I. 30 I. Dosage des flavonoїdes…………………………………………….1.4.1.1. 2. Activité antimicrobienne……………………………………………. Tests d’activité antioxydante………………………………………….2.2.3. 26 I. 30 I.3.1.. Analyse quantitative des extraits du Zizyphus lotus………………… 29 I. III.4.2. Détermination de la teneur en cendre………………………………… 26 I.2.2.2.2. 3.2. 28 I. Dosage des polyphénols…………………………………………… 29 I.

Activités biologiques..... Chromatographie liquide à haute performance HPLC –RP-C18…… 39 II.....1..1.4.2.... 35 II...Test préliminaire……………………………………………………….36 II.......5. Détermination de la teneur en eau dans les fruits du Zizyphus lotus…………. Résultats et discussion II...1...49 II..... 35 II..Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus ……………………....5.4.4.... Analyse quantitative des extraits des fruits du Zizyphus lotus…………..1.4.....33 II.. 35 II....2. Analyse des extraits du Zizyphus lotus…………………………………………….2...2........... Chromatographie sur couche mince………………………………… 36 II...5.1..Chapitre II.. Activité antioxydante…………………………………………………… 52 II...2...3..1.. Test du blanchissement du β-carotène…………………………………52 II.1.44 II...2..5..2...1.1... 49 II.4.....4.. Préparation des extraits à partir des fruits du Zizyphus lotus……………………34 II... Effet scavenger du radical DPPH………………………………………56 Conclusion générale Références bibliographiques .2...2. Détermination de la teneur en cendre dans les fruits du Zizyphus lotus………33 II.4. Activité antimicrobienne des extraits du Zizyphus lotus ………………... Analyses chromatographiques…………………………………………....5....2.1....

Liste des abréviations AAR : Activité antioxydante relative ANOVA : Analyse de variance APR : Pouvoir antiradicalaire AQ: Extrait aqueux ATTC : Collection du type Américain de culture BHT: Butylated hydroxytoluen BAW: n-Butanol/Acide acétique/eau CCM: Chromatographie sur couche mince DMSO: Diméthylsulfoxyde DPPH:1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EC50: Concentration effective à 50% EDCM: Extrait dichlorométhanique ET: extrait éthérique HPLC: Chromatographie liquide à haute performance IC50: Concentration inhibitrice à 50% MET:Extrait méthanolique Mg EAG/g d’extrait: milligramme d’équivalent acide gallique par gramme d’extrait Mg ECT/g d’extrait : milligramme d’équivalent catéchine par gramme d’extrait Mg EQ/g d’extrait : milligramme d’équivalent quercétine par gramme d’extrait MO : Matière organique RF : Rapport frontal SD : Standard déviation TR : Temps de rétention UV : Ultrat violet .

............................................................. Tableau 10.... Tableau 7......... Tableau 11....... des flavonoides et des tanins condensés dans les différents extraits du fruit du Zizyphus lotus……………………… Diamètres des zones d’inhibition de la croissance microbienne obtenus par différents extraits du Zizyphus lotus .......... Tableau 4......... Activité antiradicalaire des extraits du fruit du Zizyphus lotus……………. La teneur en eau et de matière sèche des fruits du Zizyphus lotus ......... Page 3 3 19 33 33 34 35 38 41 41 45 49 57 ............................................ Tableau 12.. Tableau 5................... Temps de rétention des standards testés …………………………………… Les standards détectés dans les différents extraits du Zizyphus lotus.. Dosage des polyphénols totaux........... Tableau 13... Principales espèces réactives oxygénées …………………………………............ Résultats des testes préliminaires des flavonoides et des tanins sur les différents extraits du Zizyphus lotus........... La teneur en cendre et de matière organique des fruits du Zizyphus lotus Aspects........................... Tableau 9.............. Tableau 6.. Titre du Tableau Teneur de la pulpe du jujubier frais en métabolite primaire……………….... Tableau 2.......Liste des tableaux N0 du tableau Tableau1....... couleurs et rendement des divers extraits du fruit du Zizyphus lotus................................................ Rapports frontaux et couleurs après révélation des standards…………….............. Tableau 3................................. Composition en métabolites secondaires des différents organes de Zizyphus lotus ...... Tableau 8..........

....... Droite d’étalonnage de l’acide gallique…............. Chromatographie sur couche mince des extraits polaires des fruits du Zizyphus lotus après révélation par la vanilline sulfurique......................... Corrélation linéaire entre la quantité en polyphénols totaux et la quantité des flavonoides des différents extraits du fruit Zizyphus lotus (p≤0................. Droite d’étalonnage de la catéchine. Droite d’étalonnage de la quercétine…………………………………...... Figure 15. Figure 9... Structure des tanins condensés et leur monomère……………………...... Différentes parties du fruit du Zizyphus lotus…………………….... Figure 24.. ...... 43 44 46 47 47 48 ......... Figure 14... Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du Zizyphus lotus (Révélation par une solution de DPPH)………………........ Chromatogrammes obtenus pour l’extrait du dichlorométhane du Zizyphus lotus………………………………………………………… 43 Figure 21......... Figure 7........ Figure 25. Chromatogrammes obtenus pour l’extrait méthanolique du Zizyphus lotus…………………………………………………………………… Figure 22.... La réaction entre la vanilline est les tanins condensés................Listes des figures N0 de figure Figure 1............ Figure 8.. Quelques structures des composés phénoliques……………………… Squelette de base des flavonoides........... 38 Figure 18......... Chromatogrammes des différents standards testés dans l’HPLC 40 Figure 19...... Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du Zizyphus lotus (Observation sous la lampe UV (254nm))…………........................................................ 37 Figure16... Structure des tanins hydrolysables et les acides associés……………... Figure 5... Figure 26.............. Figure 6.......................05)………………………………………………………….. Figure 2.. Titres des figures Page 1 2 6 7 10 10 13 14 20 24 25 27 30 36 Les différentes parties du Zizyphus lotus……………………………. Chromatogrammes obtenus pour l’extrait éthérique du Zizyphus lotus.... Piégeage des espèces réactives oxygénées par les flavonoides... Aire de répartition du Zizyphus lotus L en Algérie…………………......................... Les différentes espèces réactives oxygénées…………………………. Origine et réponse cellulaire aux ROS……………………………….. Figure 12... 42 Figure 20......... Figure 4. Figure 3. Eléments essentiels pour l’activité antioxydante des flavonoides. Figure 11....... Différentes étapes d’extraction par épuisement successive du matériel végétal………………………………………………………………… Figure 13.......... Figure10............. Chromatogrammes obtenus pour l’extrait aqueux du Zizyphus lotus… Figure 23. Chromatographie sur couche mince des extraits apolaires des fruits du Zizyphus lotus (Révélation par la vanilline sulfurique)…………… 37 Figure 17....

.. 56 Figure 36...... du BHT dans le système carotène /acide linoléique……………….............. du BHT....... Structure de la paroi bactérienne…………………………………….................... Activité antioxydante relative des extraits du fruit du Zizyphus lotus... Activité antiradicalaire des extraits apolaires (DCM.... Cinétique de blanchissement du β-carotène à 490 nm en absence et en présence des extraits du Zizuphus lotus.................. 55 Figure 35..... 60 Figure 39.................. Corrélation linéaire entre la teneur en polyphénols et le pourcentage de l’activité antioxydante relative…………………….....05).. Corrélation linéaire entre la teneur en tanins et le pourcentage de l’activité antioxydante relative……………………………………... 59 Figure 37.... AQ) des fruits du Zizyphus lotus……………………………………………………. Corrélation linéaire entre la teneur en flavonoides et le pouvoir antiradicalaire (p≤0..... Figure 31.. 48 Figure 28......01)……………………………………………….. Figure 32.. Figure 29. Activité antiradicalaire des extraits polaires (MET. Activité antiradicalaire des standards la quercétine .................. Zones d’inhibitions obtenues par différents extraits.. 59 Figure 38.... 55 Figure 34............... 50 51 52 54 54 Figure 33.... le BHT..... Corrélation linéaire entre la quantité en polyphénols totaux et la quantité des tanins condensés des différents extraits du fruit Zizyphus lotus (p≤0. Structure chimique de β-carotène……………………………………........ 60 ........ Réaction d’un antioxydant avec le DPPH....... ET) des fruitsdu Zizyphus lotus…………………………………………………………..........la rutine et la vitamine C……………………………………………………….......Figure 27............................. Figure 30....

Les radicaux libres (RL) en général et les espèces réactives de l’oxygène (ROS) en particulier sont impliqués dans plusieurs pathologies humaines allant de l’inflammation au cancer tout en passant par les maladies cardio-vasculaires. anti- ulcérogénique. et en flavonoides et tanins des différents extraits du fruit du Zizyphus lotus. l’arthrite rhumatoïde. D’ailleurs. en utilisant deux méthodes (Test de blanchissement du β-carotène et test au DPPH). les métabolites secondaires font et restent l’objet de nombreuses recherches in vivo comme in vitro. a conduit de chercher des substances naturelles dotées d’activité antimicrobienne et antioxydante.Introduction générale Les plantes médicinales représentent une source inépuisable des substances et composés naturels bioactifs. et la toxicité des antioxydants synthétiques. Dans ce contexte s’inscrit ce présent travail de recherche. dont le but principal est d’étudier les activités antimicrobiennes et antioxydantes des différents extraits du fruit du Zizyphus lotus (Sedra). elle possède plusieurs activités thérapeutiques : anti-inflammatoire. un émollient dans le traitement des furoncles. plante largement utilisée dans la médecine traditionnelle comme adoucissant dans le traitement de la gorge et les irritations bronchopulmonaires. Récemment le développement de la résistance microbienne aux antibiotiques. En effet. nous avons fixé les objectifs suivants : Analyse qualitative des différents extraits aqueux et organiques du fruit du Zizyphus lotus en utilisant la CCM et l’HPLC Analyse quantitative du contenu en polyphénols. antifongique et antidiabétique Dans ce présent travail. Etude de l’activité antimicrobienne des différents extraits du fruit du Zizyphus lotus Etude de l’activité antioxydante des différents extraits du fruit du Zizyphus lotus. . analgésique. notamment la recherche de nouveaux constituants naturels tels que les composés phénoliques. en plus de leur action directe en réagissant avec la plupart des macromolécules. le diabète et le processus d’apoptose .

.

Chapitre I Généralités sur le Zizyphus lotus .

Ses feuilles sont courtement pétiolées. 2007(a)). 2002) I. Communément appelé en Afrique du Nord ″Sedra″ (Borgi et al . Figure 1. glabres. 2002). 1962).. Les fleurs sont jaunes. 2002).Chapitre I I. Les fruits sont des drupes à noyaux soudés.2. Description botanique du Zizyphus lotus Généralités sur le Zizyphus lotus Le Zizyphus lotus (jujubier) est un arbuste fruitier. Sous embranchement : Angiospermes. (Quezel et Santa. Il forme des touffes de quelques mètres de diamètres pouvant atteindre 2m de haut. Sous classe : Dicotylédone.1. Ordre : Celastrales Famille : Rhamnacées. caduques alternées et ovales à marges entières. Chaque feuille porte à sa base deux stipules transformées en épine inégale et vulnérable. l’endocarpe mucilagineux appelé ″Nbeg″ (Figure 1) (Rsaissi et Bouchache. épineux appartenant à la famille des Rhamnacées (Rsaissi et Bouchache. Les différentes parties du Zizyphus lotus (Rsaissi et Bouchache. 1 . Espèce : Zizyphus lotus L. Genre : Zizyphus. Classification botanique Embranchement : Spermatophytes. pentamètres et groupées en inflorescence cymeuses.

1962). en Sicile. Aire de Zizyphus lotus L. 1962).Chapitre I I. Figure 2. est spontanée dans le sud d’Espagne et du Portugal.2000). 1960). On le rencontre aussi dans les steppes désertiques d’Afrique du Nord et Asie Mineure (Paris et Dillemann. en Grèce (Bross . 2 . En Algérie Le Zizyphus lotus est répandu dans toute l’Algérie sauf le Tell Algéro-constantinois (Quezel et Santa. L’une entre elles. Zizyphus lotus.3. Répartition géographique Dans le monde Généralités sur le Zizyphus lotus Le genre Zizyphus renferme environ 50 espèces des régions tropicales et subtropicales des deux hémisphères. Aire de répartition du Zizyphus lotus L en Algérie (Quezel et Santa.

1% b) métabolites secondaires Le Zizyphus lotus est connu par son contenu en molécules biologiquement actives tels que les polyphénols (flavonoides. Catoire et al.Chapitre I I..2007(b)) (Le crouéour. les triterpènes.2004) (Borgi et al . Composition biochimique du Zizyphus lotus Généralités sur le Zizyphus lotus Les études phytochimiques menée sur le Zizyphus lotus montrent la présence de métabolites primaires et secondaires. 1994). alcaloïdes. alcaloïdes Références (Borgi et al . Composition en métabolites secondaires des différents organes du Zizyphus lotus : Organe végétal Fruits Composition chimique -flavonoides. La fraction de la pulpe du fruit sucres lipides protides Le pourcentage 20% à 32% 0. 1999).2007 (b)) -flavonoides. 2002) 3 . -saponines de type dammarane : -jujuboside B Feuilles -jujubogenin glycoside -dérivé sulfaté de jujubasaponine IV (Macuek et al ...1% à 0..8% à 2. Tableau 2. tanins. les saponosides (Borgi et Chouchane...2007(a)) -tanins..4. tanins). a) métabolite primaire Tableau 1. 2006 . tanins saponines.3% 0.2007 (b)) -flavonoides. les alcaloïdes (cyclopeptides et isoquinolides). les antrachinones. Teneur de la pulpe du jujubier frais en métabolite primaire (Catoire et al . (Borgi et al . Ecorce des racines -alcaloïde cyclopeptidiques lotusines A-G (Borgi et al . saponines de type damarane.

Activités anti-inflammatoires et analgésiques Les flavonoïdes et les saponines de l’écorce des racines du Zizyphus lotus ont montré une activité anti-inflammatoire significative (Borgi et Chouchane. les affections du foie. 2007(a)). 2008). chloroformique.3.1995. Toutes ces activités confirment l’usage traditionnel de cette plante dans certaines maladies inflammatoires et douloureuses (Borgi et al ... Le Zizyphus lotus inhibe la production de monoxyde d’azote (NO). l’obésité.5. I. la diarrhée et l’insomnie (Abu-Zarga et al .. Activités anti-ulcérogéniques Le Zizyphus lotus (les feuilles. cette activité apparaît potentiellement avec l’extrait méthanolique de l’écorce des racines qui est la source possible de l’agent anti-inflammatoire dans la réaction de l’hypersensibilité retardée induite par oxazolone (Borgi et al . 2005 . Suksamrarn et al .. Les feuilles du Zizyphus lotus possèdent des effets analgésiques attribués à leur contenu en principes actifs . 2006).Chapitre I Généralités sur le Zizyphus lotus I.. la faiblesse.. les flavonoides et les saponines (Borgi et al . l’écorce des racines) possède une importante activité antiulcérogénique attribuée à la présence des tanins et des flavonoïdes connus par leur effets gastroprotecteur (Borgi et al . le diabète.Abdel-Zaher et al . Activités biologiques et thérapeutiques du Zizyphus lotus Les différentes espèces du Zizyphus sont largement utilisées dans le traitement de certaines maladies comme : les troubles digestives. 2007 (a). extrait d’acétate d’éthyle et méthanolique) de Zizyphus lotus se sont avérés très actifs in vitro vis-à-vis de neufs souches des champignons pathogènes et des mollusques Balinus truncatus (hôtes intermédiaires et vecteurs de la transmission de la bilharziose) (Lahlou et al .2. I.. Les recherches actuelles sur les différentes activités pharmacologiques de Zizyphus lotus ont ressorti plusieurs effets de grande importance pour la médecine moderne.. Parmi ces effets on souligne les plus importants : I.5. 4 . 2007(b)). 2005).5. les infections cutanées. la fièvre. les troubles urinaires. 2002). Borgi et al ..5. Activités anti-fongiques et anti-mollusques Les différents extraits (éthéré. 2008).1.

4. 5 . De même.5. 2007(a)).Chapitre I I...1995). Autres activités Généralités sur le Zizyphus lotus Les fruits de Zizyphus lotus sont décrits comme adoucissant. la poudre des feuilles sèches et des fruits est appliquée dans le traitement des furoncles (Borgi et al . et entrent dans le traitement de la gorge et les irritations broncho-pulmonaires. D’ailleurs l’écorce des racines du Zizyphus lotus est utilisée dans la médecine traditionnelle dans le traitement du diabète (Ghedira et al .

Chapitre II Les composés phénoliques .

la germination des graines et la maturation des fruits (Boizot et Charpentier. 1999). graines et bois) .Chapitre II Les composés phénoliques Les composants phénoliques sont des métabolites secondaires caractérisés par la présence d’un cycle aromatique portant des groupements hydroxyles libres ou engagés avec des glucides. fruits. Quelques structures des composants phénoliques (Gervaise . Ils sont présents dans toutes les parties des végétaux supérieures (racines. 6 . acide chlorogenique…). 1999 . la rhizogénèse. fleurs.. Cetkovic et al . antiinflammatoires. Tapiero et al . et sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques comme la croissance cellulaire. antioxydants et antiradicalaires. tiges. ils sont largement utilisés en thérapeutique comme vasoconstricteurs. acide hydroxycinnamique. Figure 3. pollens. 1997 . les flavonoides.. et les coumarines (King et Young.2004). les tanins. feuilles. inhibiteurs enzymatiques. Les composants phénoliques sont des molécules biologiquement actives (King et Young. acide ferulique. Les principaux classes des composants phénoliques sont les acides phénoliques (acide caféique. (Bahorun. 2002). 2006). antimicrobiens. 2008) (Figure 3).

fleurs. Leur structure de base est celle d’un diphénylpropane à 15 atomes de carbone (C6-C3 -C6). 1999). Ils existent le plus souvent à l’état naturel sous forme d’hétérosides (Ghestem et al . et selon les espèces se concentrent dans l’épiderme des feuilles. Dans le cas des fleures. qui désigne la lettre C (figure 4) (Dacosta. constitué de deux noyaux aromatiques (ou anneaux) que désignent les lettres A et B. Les flavonoїdes Les flavonoides désignent une très large gamme de composés naturels appartenant à la famille des polyphénols (Marfak. 2004). On les trouve aussi chez les Psylotales. ils sont concentrés dans les cellules épidermiques (Bruneton. Localisation et distribution Les flavonoїdes sont amplement répandus dans le règne végétal (graines. Ces molécules sont considérées comme des pigments quasiment universels des végétaux . feuilles) (Dacosta. 2003).3.1. Angiospermes..Chapitre II Les composés phénoliques II. Les formes hétérosidiques des flavonoїdes hydrosolubles s’accumulent dans les vacuoles. les 7 . qu’en divise en plusieurs catégories : Les flavones. 2001) II. 2001). les Fougères. reliés par un hétérocycles oxygénés.1. ou se répartissent entre l’épiderme et le mésophile. La classe des flavonoїdes comporte à elle seule plus de 4000 substances qui ont été isolées et identifiées à partir des milliers des plante (Forkmann et Martens. 1999).2.1. 2003). Figure 4 : Squelette de base des flavonoides (Girotti-Chanu. Structure chimique et classification Les flavonoїdes sont des dérivés benzo-γ-pyran (Skerget et al . II. 2003). les flavonols et les dihydroflavonols. des fruits et parfois des feuilles (Bruneton.. ils sont responsables de la coloration des fleurs. fruits. Asteraceae …etc. 2006).

1999). ils inhibent aussi d’ une manière non spécifique la catéchol-O-méthyltransferase . Activités biologiques des flavonoїdes Les flavonoïdes sont des composants naturels hautement actifs. 2004). et ses activités comme piégeurs de superoxyde (Formica et Regelson . l’élastase . les aurones (Dacosta.Chapitre II Les composés phénoliques isoflavonoides. les flavonoides inhibent la phosphodiestérase de l’AMPC ce qui pourrait expliquer leur activité anti-agrégante plaquettaire . Par ailleurs. les flavanones. les anthocyanidines. ils inhibent l’aldose réductase qu’est impliquée dans la pathogénie de la cataracte (Bruneton.1. aussi ils provoquent l’inhibition de la perooxydation non enzymatique des acides gras poly insaturés nécessaires pour l’activation de ces oxygénases ce qui provoque un effet anti-inflammatoire (Formica et Regelson . les chalcones et les dihydrochalcones. Formica et Regelson. 8 . 1995). Sous l’action de la cyclooxygénase (CO) et la lipooxygénase (LO). Il inhibent l’histidine décarboxylase. les flavanediols (leucocyanidines). En plus. II. aussi.1995). 2003 . a) Activité anti-inflammatoire des flavonoides De nombreux travaux semblent indiquer que les flavonoides possèdent des propriétés anti-inflammatoires (Milane.1995) b) Flavonoїdes comme inhibiteurs enzymatiques Les favonoїdes sont des inhibiteurs enzymatiques. les biflavonoides. Plusieurs études ont démontré une large gamme des effets biochimiques et pharmacologiques de ces molécules.ce qui augmenterait la quantité de la catécholamine disponible et donc provoquerait une élévation de la résistance vasculaire. 2003). les flavanols.4. et leucotriènes induisant ainsi des phénomènes inflammatoires (Marfak. ils inhibent plusieurs enzymes intervenant dans divers mécanismes biologiques. les flavonoїdes ont un effet polliatif sur l’inflammation dû à ses effets inhibiteurs sur la synthèse des leucotriènes et la libération de l’histamine. l’acide arachidonique se métabolise respectivement en prostaglandines. la hyaluronidase ce qui permettrait de conserver l’intégrité de la substance fondamentale de la gaine vasculaire . Les flavonoїdes inhibent la synthèse des eicosanoїdes par inhibition de l’activité de LO et CO.

1995). La double liaison C2-C3 en conjugaison avec la fonction 4-oxo La présence du groupe 3OH en combinaison avec la double liaison C2-C3. ils sont capables de diminuer la perméabilité des capillaires sanguins et de renfoncer leur résistance . ce mécanisme est lié à leur structure et de l’arrangement des groupements hydroxyles (Sokol-Letowska A et al . 9 . 2003).. L’activité du piégeage des radicaux libres est l’un des mécanismes importants de l’activité antioxydante.En plus les flavonoїdes protègent LDL de l’oxydation et par conséquent empêchent la formation des plaques athérosclerotiques. la quercétine satisfait à tous ces critères et par conséquent. ils ont des effets antithrombotiques à travers l’empêchement de l’agrégation plaquettaire (Formica et Regelson. les flavonoїdes peuvent inhiber la promotion de tumeur à travers un effet inhibiteur sur la phosphoxylase C et la protéine kinase (Formica et Regelson. 2007). aussi. D’ailleurs. Des études faites sur la capacité des flavonoides à piéger les radicaux libres ont montré que les composés les plus actifs sont ceux qui combinent les trois critères suivants : La structure ortho dihydroxy sur le cycle B (groupement catéchol) qui confère la stabilité au radical flavonoxy et participe à la délocalisation des électrons. 1995). elle est le composé le plus actif de la famille des flavonoides (figure 5) (Marfak. pour les flavonoides.. A titre d’exemple.Chapitre II Les composés phénoliques Par ailleurs.Ils induisent la vasodilatation et provoquent la relaxation des muscles lisses cardiovasculaires ce qui engendre une activité anti-hypertensive et des effets antiarrhythmiques. 1995). c) Flavonoїdes et les maladies cardiovasculaires Les flavonoїdes sont des composés veinoactifs. 1999). ils ont un effet protecteur des maladies cordiovasculaires.Cette action est appelée « vitaminique P » (Bruneton. d) Activité antioxydante des flavonoides Les flavonoides possèdent une forte activité antioxydante qu’est le principe de plusieurs activités biologiques douées par ces molécules (Saija et al .

peuvent faire régresser la maladie de la goutte en réduisant à la fois les concentrations d’acide urique et celle du radical superoxyde dans les tissus humains.. Piégeage des espèces réactives oxygénées par les flavonoides (Marfak. Une étude faite a montré que les flavonoides sont aussi des bons inhibiteurs d’autres enzymes responsables de la production des radicaux libres comme la cyclooxygénase et la lipooxygénase (figure 6) (Marfak. 2003) e) Effet anticancéreux des flavonoїdes Certains flavonoides possèdent une activité antitumeurale et anticancérogenique significative .aussi les radicaux peroxyl et alkoxyl. Figure 6. 2003). les flavonoides peuvent agir sur l’activité de la xanthine oxydase et par conséquent. Eléments essentiels pour l’activité antioxydante des flavonoides (Marfak. 2003) La propriété antiradicalaire des flavonoides est dirigée principalement vers HO· et O2. la quercétine peut être considérée effectif dans la prévention du cancer de la peau. En plus. comme ces composants présentent une forte affinité pour les ions du fer (catalysent plusieurs processus conduisant à l’apparition des radicaux libres). l’inhibition des enzymes présente un autre mécanisme de l’activité antioxydante. Par ailleurs.1995). leur activité antiperoxydative peut être aussi attribuée à une capacité concomitante de chélation du fer (Saija et al .Par blocage de la production de la tumeur de la peau. 10 .Chapitre II Les composés phénoliques Figure 5.

les flavonoides pouvaient avoir une action plus sélective en interagissant avec une glycoprotéine de surface du virus HIV. une étude faite sur Dianthus caryophyllus a monté l’efficacité de ses flavonoides sur des souches fongiques (Galeotti et al . 2004). 2007). Théoriquement. f) Activité antimicrobienne des flavonoїdes Les flavonoides possèdent des propriétés antimicrobiennes (Petit et al . les flavonoides seraient susceptibles d’inhiber l’intégrase rétrovirale du virus HIV-1.Chapitre II Les composés phénoliques L’inhibition de la glyoxylase I par la quercétine peut être expliquée son activité anticancerogène. L’activité antifongique des flavonoides est aussi établie.parmi les hypothèses avancées. L’inhibition du métabolisme microbien (Milane.. Le mécanisme des effets antimicrobiens des polyphénols est sans doute très complexe .des facteurs importants dans l’induction du tumeur et la croissance (Formica et Regelson. Une étude récente a montré l’effet antibactérien de certains flavonoides isolés de Dorstenia barteri (Mbaveng et al . Séquestration de substrat nécessaire à la croissance microbienne ou la chélation de métaux tels que le fer. 2008). aussi les flavonoides se sont avérés de bons inhibiteurs de transcriptase reverse. Autre étude a montré que. une étude a montré l’effet bactéricide de différentes flavanones sur un Staphylococcus aureus. Mucsi et Pragai en 1985 ont également montré une corrélation entre l’effet inhibiteur de certains flavonoides sur divers virus d’herpès et leur capacité à augmenter les taux intracellulaires en AMPC dans les cellules infectées ..1995). D’ailleurs. 2008). la quercétine inhibe la croissance cellulaire en empêchant certaines phases du cycle cellulaire et en bloquant les sites récepteurs des hormones (Marfak.Cette enzyme permet l’intégration du génome viral à celui de la cellule hôte. 2003). 11 .. empêchant ainsi la liaison du virus à la cellule hôte . D’autre part. les flavonoides pourraient exercer des effets antibactériens puisqu’ils sont de puissants inhibiteurs in vitro de l’ADN gyrase. comme le système glyoxylase joue un rôle dans la production de D lactate et la régénération du glutathion .Des travaux ont mis en évidence un impact des flavonoides sur le rétrovirus HIV responsable du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA). il faut citer : L’inhibition des enzymes extracellulaires microbiennes. Ils sont capables d’agir au niveau de la synthèse des protéines virales.Enfin.

2.2005). 12 . activité antidiabétique (Marfak.haricots secs. II.2. 2001).prune.2005). Bruneton. 2001).Chapitre II g) Autres activités des flavonoïdes Les composés phénoliques A côté des activités citées précédemment. datte.aubépine. II.. II. 2000).2. petits pois.Les tanins sont présents dans une variété de plantes utilisées dans l’alimentation notamment les céréales et les légumineuses (sorgho.en plus de la protection contre les attaques fongiques et bactériennes (Peronny.. 2005).2007). il est possible de diviser les tanins en 2 groupes : Tanins condensés (proanthocyanidines). caroube et les fruits comme (pomme. pêche poire.2001).canneberge.mûre . hydrosolubles de masse molaire entre 500-2000D.les insectes et les animaux herbivores (Khanbabaee et Ree. les graines) (Khanbabaee et Ree . les polysaccharides.1995).antiprotozoaires et activité anxiolytique (Cabrera et al. activité antimitotique. les fruits. Tous les organes végétaux peuvent en renfermer (l’écorce. les Rosacée (Ghestem et al .framboise et fraise (Peronny.2001). anti-ostéoporotique (Ielpo et al .orge. Localisation et distribution Les tanins sont très répandus dans le règne végétal. antihépatotoxique.2003).. les Fagacée. activité hypocholestérolémiante (Formica et Regelson.raisin.1. le bois. ils sont particulièrement abondants chez les Conifères.2. les feuilles.millet. et essentiellement les protéines (Zimmer et Cordesse. les flavonoides possèdent d’autres activités : Activité anti-allergique. structure chimique et classification A la base de leur caractéristique structurale. Leur structure chimique leur confère une capacité très développée de se fixer sur des molécules telles que les alcaloïdes.kaki. les racines. Les tanins Les tanins sont des métabolites secondaires polyphénoliques (Khanbabaee et Ree. 1996 . 1999). Parmi les caractéristiques des tanins le goût astringence qui est une sensation tactile due à la précipitation des protéines salivaires et qui crée une sensation d’assèchement dans la bouche (Peronny. Le rôle biologique des tanins dans la plante est lié à sa propre protection contre les infections . la gélatine.

2001) . 1999) 13 .Chapitre II Tanins hydrolysables.Vivas et al .ou par une liaison interflavanique double (C4-C8 ou C4-C6) et (C2-O-C7) dans le type A (figure7) (Bruneton. Structure des tanins condensés et leur monomère (Peronny. soit l’acide hexahydroxydiphénique (HHDP) et ses dérivés dans le cas des tanins éllagiques (Figure 8) (Bruneton. Xie et Dixon.2005 . 2006).L’acide phénolique est soit l’acide gallique dans le cas des tanins galliques. 2005). Le sucre est très généralement le glucose . Figure 7. b) Tanins hydrolysables Ce sont des oligo ou des polyesters d’un sucre (ou d’un polyol apparenté) et d’un nombre variable d’acide phénolique. avec un degré de polymérisation entre deux et plus de 50 unités (Khanbabaee et Ree .. le plus souvent épicatéchine et catéchine. constitués d’unités flavan-3-ols.Ces unités liées entre elles par une seule liaison carbone-carbone C4-C8 ou C4-C6dans le type B des proanthocyanidines . Les composés phénoliques a)Tanins condensés (proanthocyanidines) Ce sont des polymères ou oligomères flavanique.1999 .

Streptococcus lactis . virus. Plesiomonas shigelloides . Pseud maltophila .2. 2005). Pseudomonas aeruginosa. II.. Strept mutans . bolulinum. Activités biologiques et thérapeutiques des tanins Les tanins sont des molécules biologiquement actives. solanacearum . Strept sobrinus …etc. a) Activités antimicrobiennes des tanins L’activité antimicrobienne des tanins est importante. 2001). Klebsiella pneumonia. Bacillus anthracis. 14 . champignons et levures est inhibée par les tanins (Chung et Wei. Strept pneumonia . -Activité antibactérienne De nombreuses études ont montré l’activité antibactérienne des tanins .3. Desuomaculum nigrificans . 2001 . Okuda. Staph epidermis . douées d’activités pharmacologiques remarquables et des effets significatifs sur la santé humaine (Chavan et al . La croissance de plusieurs bactéries.Ces molécules ont été rapportées comme bactériostatique ou bactéricide sur plusieurs souches bactériennes :Aeromonas sobria. 2005). Staphilococcus aureus .Chapitre II Les composés phénoliques Figure 8. Structure des tanins hydrolysables et les acides associés (Peronny.

virus d’influenza A (FLU-A) et le virus para influenza (PIV). Coxsackievirus. Enterobacter cloacae .. cette inhibition est influencée par la galloylation. 2001). Escherichia coli et Salmonella typhimurium sont inhibées par l’acide tannique (Chung et Wei. Collectotrichum graminicola. Gloeophyllum trabeum.Les champignons filamenteux comme Aspergillus niger . S paratyphi. dans certains cas la fixation cause seulement des changements mineurs à la surface virale. Les bactéries intestinales humaines comme :Bacteroides fragilis .HSV-2) est inhibé par les tanins hydrolysables et les tanins condensés galloylés de plusieurs extraits des plantes (De Bruyne et al. K pneumonia . Activité antifongique et anti-levure Plusieurs types de champignons sont inhibés par les tanins . Strept pyogenes et Yersinia enterocolitica. 2001).Chapitre II Les composés phénoliques Chung et ses collaborateurs ont trouvé que l’acide tannique a inhibé la croissance des bactéries des aliments comme :Alealigenes faecalis.la différence de la liaison inter-flavan.Staph aureus. Les tanins ont un autre effet inhibiteur de la réplication virale . le virus Herpes simplex (HSV-1 . en outre l’hépatite A et B. l’étendue de l’oligomérisation . virus d’herpes (Chung et Wei.Salmonella enteritidis. L’acide tannique est capable d’inhiber la réplication du virus d’influenza. Fomes annosus . Pseud fluorescens . cependant. la stéréochimie de la fonction 3 hydroxyle (De Bruyne et al. C paraputrficum.1999). reovirus.c’est l’inhibition de la transcriptase inverse des rétrovirus comme virus (HIV) . Clostridium clostridiiforme. echovirus. Penicillium. 15 . et poliovirus. Strept faecalis. Merulius lacrymans. -Activité antivirale L’activité antivirale des tanins est due à la fixation des molécules des tanins à l’enveloppe protéique du virus ou la membrane de la cellule hôte et par conséquent l’inhibition de l’adsorption et la pénétration virale .Botrytis cinerea . Les tanins ont aussi rapportés d’inactiver le virus tobacco mosaique. Coniphora olivacea . Plusieurs types de virus sont inactivés par les tanins.Chaetomium cupreum . Proteus vulgaris . Enterobacter aerogenes .Coriolus versicolor. la pénétration reste mais l’enlèvement de l’enveloppe virale est inhibé.1999). Escherichia coli. Les oligomères proanthocyanidins présentent une activité antivirale contre le virus respiratoire syncytial (RSV).. C perfringens . Crinepellis perniciosa .

1999). les tanins induisent la cicatrisation par différents mécanismes cellulaires.Trametes hirsuta et Trichaderma viride sont inhibés par les tanins de différentes préparations .2005). De même. l’augmentation de la formation des vaisseaux capillaires et des fibroblastes . différentes levures incluant Saccharomyces crevisiae sont aussi sensitives aux tanins (Chung et Wei.1999 ) . les tanins favorisent la régénération des tissus en cas de blessures superficielles ou de brûlure (Bruneton. 2004).. En limitant les pertes en fluides et en empêchant les agressions extérieurs. protégeant ainsi les couches sous-jacentes . ils exercent un effet antidiarrhéque (Bruneton. qui est du à l’inhibition de la motilité intestinale (De Bruyne et al.. inhibition de la protéines kinase C par les tanins éllagiques et les tanins complexes (Bruneton.des glucosyltransferases des microorganismes impliqués dans la cariogenèse . 16 . elles ont également un effet vasoconstricteur sur les petits vaisseaux superficiels. 1999). 1999). et induisant la prolifération des kératinocytes (Lopes et al .inhibition des topoisomérases par la sanguiine H6 ou l’acide chébulagique . D’ailleurs. 1999). Sur les blessures. en favorisant la contraction de blessure. c) Inhibition enzymatique La fixation des tanins avec les protéines peut être engendrée l’inhibition de plusieurs enzymes (De Bruyne et al . les tanins imperméabilisent les couches les plus externes de la peau et des muqueuses. inhibition de α –amylase salivaire humaine qui joue un rôle dans la formation des caries dentaires (Kandra et al . corilagine . 2001). inhibition de l’enzyme de conversion de l’angiotensine . b) Activité thérapeutique due à l’astringence Par voie externe.Chapitre II Les composés phénoliques Poria monticola . les dimères procyanidoliques ont une activité inhibitrice sur l’histidine décarboxylase et l’élastase (Bruneton. 1999). de l’activation de la hyaluronidase . Le blocage de la 5-lipoxygénase par géraniine. Par voie interne.

2005) . et ils ont une activité antioxydante supérieure à celle de l’acide ascorbique et l’α tocophérol. Plusieurs propriétés structurales des tanins augmentent leur activité antioxydante : La galloylation. et l’α tocophérol emprisonne deux radicaux. Autre étude faite sur les tanins de sorghum suggère l’activité anticancérogénique des tanins de sorghum sur les cellules humaines de mélanome (Awika et Rooney.Des études faites montèrent que les procyanidines B1 et B3 sont des antioxydants pour l’acide linoléique. il a été remarqué que les procyanidines dimériques peuvent emprisonner 8 radicaux pyroxyles alors que l’acide ascorbique emprisonne un seul radical. e) Activité anti cancérogénique des tanins Le potentiel anticarcinogénique des tanins peut être lié à leur propriété antioxydante qui apparaît importante dans la protection cellulaire des dommages oxydatifs. en agissant comme donneur de proton et accepteur de radicaux libres. 17 . préférablement en position 3´ augmente la capacité du piégeage pour les deux O2· et OH·. Plusieurs études montèrent l’activité anticancérogéniques des tanins.. aussi le piégeage de O2· est plus important pour les dimères procyanidines couplés par une liaison (4→8) que les dimères liés par (4→6) (De Bruyne et al . 2001).Elles ont la particularité d’inhiber la peroxydation des lipides. Dans une autre étude faite sur la propriété du piégeage radicalaire.. 2004). Uchida et ses collaborateurs suggèrent que les tanins condensés galloylés ont une action de piégeage radicalaire sur le radical 1-1 diphényl-2-picrylhydrazyl (DPPH) aussi sur l’anion superoxyde et OH·. stoppant ainsi le mécanisme d’auto oxydation (Perret. 2005). 2001). oenothein B et coiiariin A contre la sarcoma (Chung et Wei. Migamato et ses collaborateurs montèrent l’activité anti tumorale de plusieurs oligomères des tanins hydrolysables incluant : agrimoniin.De même. ·OOH. 1999).Chapitre II d) Activité antioxydante des tanins Les composés phénoliques Les tanins ont de grandes capacités antioxydantes dues à leurs noyaux phénols (Peronny. il a été démontré in vitro que les tanins sont plus actives que les vitamines .Une étude faite sur la plante Eugenia jambos a été suggérée que les tanins hydrolysables de cette plante induisent l’apoptose sur les cellules humaines leucémiques ce qui présente un autre mécanisme d’activité antioxydante des tanins (Yang et al . Les tanins hydrolysables et condensés sont 15 à 30 fois plus efficace que les phénols simples (Peronny.2000).

En effet par fixation de l’acide tannique avec le Ca++ . les tanins présentent une activité antiulcéreuse et antiparasitaire. l’acide tannique présente un effet hypotensif.Tits et ses collaborateurs montèrent une importante activité anti inflammatoire des prodelphinidines isolés de Ribes nigrum.Chapitre II f) Autres activités biologiques des tanins Les composés phénoliques Les tanins ont une activité anti inflammatoire . Outre ces activités. 2005). Les effets cardiaques et vasculaires des tanins sont aussi démontrés. D’ailleurs des études faites montèrent l’effet d’inhibition d’agrégation plaquettaire dans le plasma humain et le plasma du rat par deux procyanidines trimériques et un dimère thioether. Calixto et ses collaborateurs dénotèrent que l’acide tannique affecte la disponibilité du calcium pour la contraction des muscles lisses et cardiaques . en effet. la consommation des plantes à tanins peut affecter la biologie de certaines espèces de parasites intestinaux (Peronny. 18 .

Chapitre III Les espèces réactives oxygénées et stress oxydant .

et est rendue grâce à un système complexe de protéines et d’enzymes (cytochromes).Une grande partie de l’anion superoxyde est 19 . Principales espèces réactives oxygénées (Antwerpen. les lipides. Elle permet d’apporter à la cellule toute l’énergie nécessaire sous forme d’adénosine triphosphate (ATP) pour assurer ses fonctions vitales. Non radicalaires H2O2 Peroxyde d’hydrogène OH . les protéines et l’ADN. ROOH Peroxyde organique HOCl Acide hypichloreux 1 ROO.OH). formants des produits très instables . 2007). L’espèce réactive primaire de l’oxygène est l’anion superoxyde (O2· ‫ )־‬qui résulte de la réduction univalente de l’oxygène moléculaire.Cette réaction de réduction implique quatre électrons. Cela leur confère une grande réactivité chimique (Dacosta. car 2 à 5% de l’oxygène est transformé en espèces réactives oxygénées (ERO) ou reactive oxygen species (ROS) (Gueye. Leur hyperréactivité les engage dans des réactions de dénaturation des constituants cellulaires de type peroxydation avec les glucides.Chapitre III III. Radical peroxyl Anion superoxyde Radical oxynitrique NO. Ce processus mitochondrial n’est toutefois pas parfait. Radical hydroxyle Radical alkoxyl RO O2 .2000) . O2 Oxygène singulet ONOO‫ ־‬Peroxynitrite Les radicaux libres oxygénés sont des espèces chimiques (atomes ou molécules) qui possèdent un ou plusieurs électrons célibataires (électron non apparié) sur leur couche externe (Gueye. - ) et le radical hydroxyle (.1.Ceux ci donnent lieu à des réactions en chaîne générant de nouveaux radicaux libres (Curtay et Robin. qui sont des formes variées de l’oxygène active. et les espèces non radicalaires qui sont des oxydants et/ou facilement transformées en radicaux comme le peroxyde d’hydrogène (H2O2) (Halliwell et Whiteman. Espèces réactives oxygénées (ROS) Radicalaires . 2006). Tableau 3. 2003). 2000). 2004) (tableau 3). 2007) . Les espèces réactives oxygénées Les espèces réactives oxygénées et le stress oxydant La vie en aérobie se traduit au niveau cellulaire par l’existence d’une chaîne respiratoire mitochondriale (Curtay et Robin . au niveau de laquelle l’oxygène est normalement transformé en eau . elles incluent les radicaux libres comme l’anion superoxyde (O2 .

Sources des espèces réactives oxygénées Les ROS sont produits dans l’organisme par de nombreux mécanismes tant exogènes ou endogènes (Figure 10).1O2) et des molécules génératrices de radicaux libres (H2O2) par l’intermédiaire d’agents photosensibilisants.Chapitre III Les espèces réactives oxygénées et le stress oxydant transformée en peroxyde d’hydrogène (H2O2) sous l’effet d’une enzyme. 20 .2. Les différentes espèces réactives oxygénées (Nzengue. 2004). Figure 9. le peroxyde d’hydrogène selon la réaction de Fenton peut se décomposer en présence de cuivre cuivreux ou fer ferreux pour donner une espèce hautement réactive et a durée de vie très courte. III. le radical hydroxyle (·OH) (figure 9) (Nzengue.1. III.2008). Les rayonnements UV induisent la synthèse de radicaux libres (O2·‫· .2.־‬OH . 2008). Sources exogènes L’organisme humain est soumis à l’agression de différents agents capables de donner naissance à des espèces réactives oxygénées. le superoxyde dismutase (Milane. A son tour.

D’autres facteurs peuvent conduire à la formation des ROS : les xénobiotiques (toxines. NO.2.Cette production résulte de l’addition d’un électron à l’oxygène moléculaire. ־‬ L’éthanol stimule également la production d’anion superoxyde par induction de la synthèse des NADPH oxydase.Les cytochromes P450 et b5 de la chaîne du transport d’électron des microsomes peuvent produire des ROS quand ils interrompent le cycle redox normal et détournent le flux d’électrons vers l’O2 (Sevanian et al . Sources endogènes L’une des sources majeurs des ROS est la chaîne respiratoire mitochondriale . Diallo. tabac. 2004). NADPH cytochrome réductase. et du cytochrome P450.De même. les concentrations sériques en sélénium et vitamine E sont abaissées chez les alcooliques et corrélées avec une atteinte hépatique plus ou moins sévère.La xanthine oxydase et l’aldéhyde oxydase peuvent oxyder le principal métabolite de l’éthanol. Schisler et Singh (1989) ont montré que l’alcool pouvait diminuer l’activité des enzymes de protection (SODGSH-Px). NO2 peuvent aussi réagir avec le peroxyde d’hydrogène produit par les macrophages au niveau des alvéoles pulmonaires et donner naissance à des radicaux ·OH . ils sont responsables d’une auto-oxydation des acides gras polyinsaturés des alvéoles pulmonaires. Des toxiques tels que monoxyde d’azote (NO) et le dioxyde d’azote (NO2). O2 + é à la production du O2 · ‫־‬ O2 · ‫( ־‬Marfak. 2000 . NO2 et des fortes concentrations en composés insaturés.D’autre part. L’ingestion d’alcool est suivie de la formation des radicaux libres selon divers mécanismes . 2005). et stimule par son action irritante les macrophages des alvéoles pulmonaires (Milane. La fumée de cigarette joue un rôle majeur dans la formation de ces espèces radicalaires. polluants industriels) participent à la genèse de radicaux libres.. herbicides) et médicaments. goudron. en plus des aliments qui peuvent contenir des oxydants (Curtay et Robin. pesticides. l’acétaldéhyde.1990). III. présents dans notre environnement (suies.Une telle réaction est catalysée par le cytochrome oxydase mitochondrial.Chapitre III Les espèces réactives oxygénées et le stress oxydant Les radiations ionisantes provoquent également la génération de radicaux libres dérivés de l’oxygène.2. 21 . Autres chaînes du transport d’électrons (ex : peroxymes et microsomes) contribuent également dans la cellule aérobiose . 2003). avec production d’O2· ‫. elle contient NO.

consistant en l’activation du complexe NADPH oxydase. les aldéhydes oxydases ou les protéines hémiques qui peuvent oxyder leur fer (I) en fer (III) avec production du radical O2· (Antwerpen. Xanthine + 2O2 +H2O xanthine oxydase Une autre espèce réactive oxygénée produite au cours de l’inflammation est le peroxyde d’hydrogène (H2O2) . et norépinéphrine) . D’ailleurs le système xanthine/xanthine oxydase permet aussi la production de l’anion superoxyde : acide urique +2O2· ‫2+ ־‬H+ (Marfak. enzyme capable d’utiliser l’oxygène moléculaire pour produire de grandes quantités d’anions superoxydes au niveau de la membrane cellulaire.2006). à des fins de médiation par les neurones.Cette espèce (HClO) est caractérisée par un pouvoir oxydant nettement plus élevé que le H2O2. D’autres systèmes sont capables de produire les ROS. 2006). Le monoxyde d’azote est produit aussi par un système enzymatique NO synthétase (NOS).. 2002) . C’est ainsi l’autooxydation des monoamines (dopamine. 2006). 2003). et l’hémoglobine en présence de traces de métaux peut également être à l’origine de la production des ROS (Gueye. 2007). Ce mécanisme lorsqu’il est contrôlé est capital dans la lutte infectieuse car il permet la phagocytose des bactéries et des corps étrangères (Favier. citon par exemple : les réactions catalysées par les lipooxygénases et cyclooxygénases dans la voie de synthèse des leucotriènes. épinéphrine.Chapitre III Les espèces réactives oxygénées et le stress oxydant D’autre part les ROS peuvent se produire au cours des processus pathologiques ou la production du radical répond à une stimulation et intervient dans le processus inflammatoire (NADPH oxydase et xanthine oxydase) (Antwerpen. H3+O +H2O2 +Cl‫־‬ myéloperoxydase HClO +2H2O ( Antwepen. thromboxanes et prostaglandines (Babior et al . 2003). les cellules endothéliales ou les macrophages (Favier. 2003). ‫־‬ 22 . en vue de réagir directement ou de produire l’acide hypochloreux par l’intervention de myéloperoxydase. Les cellules phagocytaires activées sont le siège d’un phénomène appelé ˝explosion oxydative˝.

Ils peuvent agir en réduisant ou en dismutant ces espèces. cataracte. 2008). en séquestrant le fer libre.2004). oèdeme pulmonaire. syndrome de détresse respiratoire aigu. Ces enzymes ont une action complémentaire sur la cascade radicalaire au niveau du superoxyde et du peroxyde d’hydrogène. Si tel n’est pas le cas que ce soit par déficit en antioxydants ou par la suite d’une surproduction énormes de radicaux.. les ROS sont produites en faible quantité comme médiateurs tissulaires ou des résidus des réactions énergétiques ou de défense. En faisant apparaître des molécules biologiques anormales et en surexprimant certains gènes.4. il s’agit principalement des systèmes enzymatiques et non enzymatiques (Figure10) (Souley Amadou.1. Dans ce cas.etc. maladies cardiovasculaires. De nombreux antioxydants interviennent.2003 . III. de limiter la propagation ou de détruire les espèces réactives de l’oxygène.Il s’agit de la superoxyde dismutase (SOD). conduisant finalement à la formation d’eau et d’oxygène moléculaire. le stress oxydant sera la principale cause initiale de plusieurs maladies : cancer. en les piégeant pour former des composés stables.3. Yoo et al .Chapitre III III. 2008) III. des protéines . 2003 . la balance antioxydant/prooxydant est en équilibre. Les antioxydants enzymatiques Cette ligne de défense est constituée principalement de trois enzymes. mais aussi des lésions secondaires dues au caractère cytotoxique et mutagène des métabolites libérées notamment lors de l’oxydation des lipides. 2O2· ‫2+־‬H+ superoxyde dismutase H2O2 +O2 23 .. Haliwell et Whiteman . (Favier.. 2003). des lipides. 4. Les antioxydants Les antioxydants sont l’ensemble de molécules susceptibles d’inhiber directement la production. Dan. vieillissement accéléré. sclérose latérale amyotrophique.La production excessive de radicaux libres provoque des lésions directes de molécules biologiques (oxydation de l’ADN. l’excès de ces radicaux conduit au stress oxydant (Favier. Cette production physiologique est parfaitement maîtrisée par des systèmes de défense. de la catalase et de glutathion peroxydase (GPX). 2004 . ou en générant du glutathion (Favier. Stress oxydant Les espèces réactives oxygénées et le stress oxydant Dans les circonstances normales. des glucides). d’ailleurs adaptifs par rapport au niveau de radicaux présents.

l’albumine. l’empêcher ainsi d’attaquer les structures biologiques.. comme Fe2+/Fe3+ ou Cu2+/Cu+ transferrine. acide urique.2007)..2. soit de sources exogènes apportés par l’alimentation (ex : les caroténoïdes. D’autre part. mélatonine. 2008) et surtout les acides phénoliques. 2003) 24 . la vitamine E. 2006). caeruloplasmine…etc. les tanins. la vitamine C (Curtay et Robin. les coumarine (Siddhuraju. la mélanine…).4. Origine et réponse cellulaire aux ROS (Petropoulos. 2001) III. Ces molécules proviennent soit de sources endogènes (glutathion. les flavonoides. qui agissent en diminuant la disponibilité d’agents pro oxydants. Les antioxydants non enzymatiques Ce groupe des antioxydants renferme les protéines de séquestration des métaux. il y a des molécules à faible poids moléculaire qui agissent soit comme cofacteurs des enzymes citées soit comme antioxydant propre (Antwerpen. les composés phénoliques (Yoo et al . 2002). 2000). (ex : la Figure 10. Ils peuvent agir comme agents réducteurs capables de passer leurs électrons aux ROS et les éliminer (Kohen et Nyska.Chapitre III Les espèces réactives oxygénées et le stress oxydant 2H2O2 H2O2 +2GSH Catalase 2H2O +O2 2H2O +GSSG Glutathion perooxydase (Lehucher-Michel et al . la ferritine. Les antioxydants à action directe sont capables de donner des électrons à l’oxygène radicalaire afin qu’ils puissent le piéger.).

.

Chapitre I Matériel et méthodes .

on fait une dessiccation de la matière fraîche à la température de 103±2C0 dans une étuve isotherme ventilée à la pression atmosphérique jusqu’à une mesure pratiquement constante (Audigie et al . M1 : masse en g de la capsule avec l’échantillon avant la déshydratation. qui a servi pour la préparation des différents extraits.M2 x100 P H% : taux d’humidité ou teneur en eau. Différentes parties du fruit du Zizyphus lotus I. Après séchage. La teneur en eau est la différence entre le poids de l’échantillon avant et après la dessiccation lorsque leur poids soit constant. Détermination de la teneur en eau Pour déterminer la teneur en eau. la partie comestible a été broyée pour obtenir une poudre fine. à température ambiante. Méthodes I. 1. 2008.2. Les fruits ont été d’abord dénoyautés. récoltés des régions de Batna en Septembre Octobre 2007. H% = M1 ..1. Matériel végétal Il est constitué des fruits du Zizyphus lotus (Figure11).1987).Chapitre 1 Matériel et méthodes Matériel et méthodes I. ensuite la partie comestible a été séchée à l’ombre à l’abri de la lumière. 25 .2.1.1. Matériel I. Figure11.

Après filtration sur papier Whatmann. Matériel et méthodes I. MO% = M1 .3.2.2.Elle est obtenue par incinération à 500600C0 (Pinta. La teneur en cendre est déterminée comme suit : cendre%=100-MO% x 100 I. Après filtration. P : masse en g de la prise d’essai. Détermination de la teneur en cendre : La teneur en matière minérale est conventionnellement le résidu de la substance après minéralisation de la matière sèche des échantillons .3. Extrait aqueux : Une macération aqueuse a également été effectuée sur 50 g de poudre avec 500 ml d’eau distillée et placés sous agitation pendant 24 h. M2 : masse en g de la capsule avec les cendres. puis 2000 ml de méthanol pendant aussi 24h. Préparation des extraits à partir des fruits du Zizyphus lotus : Selon la méthode de Diallo et al (2004). I.2. I. différents types d’extraits ont été préparés à partir des fruits pulvérisés (Figure 12). le marc est ensuite mis en agitation avec 2000 ml de dichlorométhane pendant 24 h.Chapitre 1 M2 : masse en g de la capsule avec l’échantillon après la déshydratation.2.2. 1980 . l’extrait a été lyophilisé. M1 : masse en g de la capsule et la matière sèche avant l’incinération.1. P : masse en g de la prise d’essai.M2 P MO% : matière organique. Les 3 types extraits ont été concentrés sous vide au Rotavapor. 26 . 1984).3. Extractions avec des solvants à polarité croissante : 250 g de poudre ont été extraits avec 2000ml d’éther de pétrole et placés sous agitation pendant 24h.2. AOAC.

puis quelques morceaux du magnésium. Mise en évidence des tanins : L’ajout de trichlorure du fer (FeCl3) 1%.2..Chapitre 1 Matériel et méthodes Matériel végétale sec broyé •Extraction à froid par l’éther de pétrole (24h) • Décantation • .2.Tests préliminaires Mise en évidence des flavonoїdes A 3 ml de chaque extrait.4. Différentes étapes d’extraction par épuisement successive du matériel végétal. Analyse des extraits du Zizyphus lotus I.En présence des flavonoides (flavone aglycone).4. 1982).4.Filtration Résidu végétal sec • Extraction par le dichlorométhane • Décantation • Filtration Filtrat • Concentration à T=40°C Extrait Etheropétrolique Résidu végétal sec •Extraction par le méthanol • Décantation • Filtration Filtrat • Concentration à T=35°C Extrait Dichlorométhanique Résidu végétal sec Filtrat • Concentration à T=50°C Extrait Méthanolique Figure 12. 2003).1. on ajoute 5 ml d’ HCl (acide chlorhydrique). permet de détecter la présence ou non des tanins. I.2. Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus I. 27 . La couleur vire au bleu noir en présence des tanins galliques. et au bleu verdâtre en présence des tanins catéchiques (tanins condensés) (Dohou et al .1.1. une couleur rouge est apparue (Ciulcl.

ces particules ayant un diamètre moins de 10µm. selon la méthode de Diallo et al (2004) avec quelques modifications. puis visualisées par 3 systèmes de révélation : • • • • Révélation physique sous UV à 254nm. Alors pour les extraits apolaires (DCM. dont la séparation dépend des phénomènes d’adsorption et de partage.1. 60 F254). les plaques sont séchées. Après migration.Chromatographie sur couche mince Matériel et méthodes Pour une caractérisation partielle des extraits du Zizyphus lotus.4. L’analyse des extraits du Zizyphus lotus a été réalisée sur des plaques de gel de silice avec indicateur de fluorescent (20x20cm. 3. Révélation physique sous UV à 366nm. MET) est effectuée par un système de séparation BAW (butanol/acide acétique/eau) avec des proportions (60/15/35). et la phase stationnaire est une colonne (125 x 4. dans laquelle la phase mobile est un liquide polaire (solvant). Révélation chimique par une solution éthanolique du DPPH à 2.Chapitre 1 I. La pompe garde un débit précis de sorte que le temps de rétention de chaque pic peut être employé pour identifier des pics de l’échantillon à tester.les quatre extraits ont été dissous dans leur solvant d’origine. Révélation chimique par une solution de vanilline sulfurique. sont déposés et les plaques sont ensuite introduites dans la chambre de migration préalablement saturée par la vapeur de la phase mobile. 5 µl de chaque extrait (10mg/ml) et de standard (2mg/ml).4.1. L’analyse des extraits polaires (AQ. La chromatographie liquide à haute performance à phase inverse est une technique de séparation. 28 . 2004).6mm) étroitement emballée par des particules C18 (apolaire). ET) on utilise le système (éther de pétrole/acétate d’éthyle) avec les proportions (8/2). cette technique de séparation basée sur l’utilisation d’une phase mobile (solvant) le long d’une phase stationnaire (gel de silice). on utilise la chromatographie sur couche mince. 2.4% pour la détection des extraits ayant une activité antioxydante (Juma et Majinda. I.Chromatographie liquide à haute performance HPLC –RP-C18 Pour analyser les différents extraits du Zizyphus lotus l’HPLC -RP-C18 a été utilisé.2.2. Les rapports frontaux (RF) des spots issus de la séparation sont calculés (le rapport frontal est le rapport entre la distance parcourue par la tache et celle du solvant) et comparés à ceux des témoins permettant ainsi l’identification de différents extraits. ce qui nécessite de pomper la phase mobile à travers la colonne à haute pression.

2. 2007).2. Le détecteur utilisé est un détecteur UV à une longueur d’onde 254nm (Kuntie et al .2006). et sont exprimées en microgramme d’équivalent de quercétine par milligramme d’extrait (µg EQ/mg).Chapitre 1 Matériel et méthodes Ceci est fait par comparaison des chromatogrammes des standards avec celui de l’échantillon.4.5 ml/min. 2006). Analyse quantitative des extraits du Zizyphus lotus : I.1996) est utilisée pour quantifier les flavonoїdes dans les différents extraits du Zizyphus lotus . L’oxydation des phénols réduit. 29 .2. La température est réglée à 40 C0..4.. Dosage des flavonoїdes La méthode du trichlorure d’aluminium (Bahorun et al . L’absorbance est mesurée à 765 nm après 2h d’incubation. ce réactif en un mélange d’oxyde bleus de tungstène et de molybdène .Ce dosage repose sur le réactif de Folin Ciocalteu qui est constitué d’un mélange d’acide phosphotungstique et d’acide phosphomolybdique. après 4 min. le débit de la phase mobile est 0. I.2.1 ml de chaque échantillon et du standard ( préparés dans le méthanol pour les extraits organiques et l’eau distillée pour l’extrait aqueux )avec dilutions convenables sont ajoutés à 1 ml d’AlCl3 (2 % dans le méthanol). 200 µl de chaque extrait (dissous dans le méthanol pour les extraits organiques.. Dosage des polyphénols Les polyphénols sont estimés par la méthode de Folin Ciocalteu (Wong et al .2. l’absorbance est lue à 430 nm. Les concentrations des flavonoїdes sont déduites à partir des gammes d’étalonnage établies avec la quercétine (035µg/ml). I.La phase mobile utilisée est un mélange méthanol /eau (60/40). nous avons utilisé une élution isocratique dans laquelle une seule source du solvant utilisée pour éluer les composons à travers la colonne .2. Après 10 min d’incubation. Les concentrations des polyphénols sont déduites à partir des gammes d’étalonnage établies avec l’acide gallique (0-200µg/ml) et sont exprimées en microgramme d’équivalent d’acide gallique par milligramme d’extrait (µg EAG/mg).4.2.l’intensité de la couleur est proportionnelle au taux de composés phénoliques oxydés ( Boizot et Charpentier. Dans notre analyse.1. 800 µl d’une solution de carbonate du sodium (75g/l) sont ajoutés. et l’eau distillée pour l’extrait aqueux) sont ajoutés à1 ml du réactif de Folin Ciocalteu dilué 10 fois.

I.Escherichia coli (ATCC 25922) .3. La réaction entre la vanilline est les tanins condensés (Schofield et al . 2001).4.2001) (Figure 13). Dosage des tanins condensés Matériel et méthodes Le dosage des tanins condensés dans les extraits du Zizyphus lotus est effectué selon la méthode de Broadhurst et Jones (1978).5 ml d’acide hydrochlorique concentré.5. et sont exprimées en microgramme d’équivalent catéchine par milligramme d’extrait (µg E CT/mg). Le mélange est incubé durant 15 min et l’absorbance est lue à 500nm..2.Chapitre 1 I. Vanilline Couleur rouge Figure13.2. et 1.Klebsiella pneumonia ATB (1476). Le principe de ce dosage est basé sur la fixation du groupement aldéhydique de vanilline sur le carbone 6 du cycle A de la catéchine pour former un complexe chromophore rouge qui absorbe à 500nm (Schofield et al .Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) Salmonella thyphimurium . Tests des activités biologiques I. (2006). Activité antimicrobienne Souches microbiennes testées Les souches microbiennes utilisées sont :Staphylococcus aureus (ATCC 25923) . on ajoute 3ml d’une solution de vanilline (4% dans le méthanol). 30 . Les concentrations des tanins condensés sont déduites à partir des gammes d’étalonnage établies avec la catéchine (0-300µg/ml).2..1.5. modifiée par Heimler et al.2.- Pour 400µl de chaque échantillon ou standard. Candida albicans.

2.5.2. 2006). Les disques ont été imprégnés dans différentes solutions (1g/ml) des extraits dissous dans le DMSO (dimethylsulfoxide) pour les extraits organiques. et le milieu Saboroud pour la levure. et dans l’eau distillée stérile pour l’extrait aqueux (Un disque imbibé par le DMSO a été employé en tant que contrôle négative). Tests d’activité antioxydante : I.2. Nous avons utilisé pour les souches bactériennes le milieu Muller Hinton.Chapitre 1 Test antimicrobien Matériel et méthodes Afin d’évaluer l’activité antimicrobienne des extraits des fruits obtenus.Puis déposés à la surface d’un milieu écouvillonné par une suspension microbienne d’une densité optique de 0.L’activité antioxydante relative des extraits (AAR) est calculée selon l’équation suivante : AAR=Abst=48h (échantillon)/Abs t=48h (BHT) x100 31 .25µl de l’acide linoléique et 200mg de tween 40 sont additionnés.5. l’émulsion résultante est agitée vigoureusement. Le principe de cette méthode est d’utiliser des disques de papier Whatmann de 6mm de diamètre. Test du blanchissement du β carotène L’activité antioxydante des extraits du Zizyphus lotus est mesurée selon la méthode de Khartal et al (2007). I. par la suite 100ml d’eau oxygénée est ajouté. les diamètres des zones d’inhibition ont été mesurés (Choi et al . A la fin de la durée d’incubation (18-24h pour les souches bactériennes et 48h pour la levure à37oc).Dans ce test la capacité antioxydante est déterminée en mesurant l’inhibition de la dégradation oxydative de β carotène (décoloration) par les produits d’oxydation de l’acide linoléique.carotène /acide linoléique est préparée par solubilisation de 3 mg de β carotène dans 1 ml du chloroforme .1. L’émulsion de β.2. le chloroforme est complètement évaporé au rotavapeur.5McFarlend. nous avons utilisé la méthode de diffusion en milieu gélosé.. 350µl de solution d’extrait ou antioxydant de référence (BHT) (solubilisé dans le méthanol sauf l’extrait aqueux dans l’eau distillée (2mg/ml)) sont additionnés à 25 ml de l’émulsion précédente. La cinétique de décoloration de l’émulsion en présence et en absence d’antioxydant (contrôle négatif dans lequel l’échantillon est remplacée par 350µl de méthanol) est suivie à 490nm à des intervalles de temps régulières pendant 48heures .

5mg/ml. AQ respectivement.0-1mg/ml pour les extraits :ET . Alors que pour les antioxydants standard (Rutine.2.2. Les sigmoїdes de l’activité antiradicalaire des différents standards et extraits sont effectués par le logiciel (Graph Pad Prism V 5. nous avons utilisé la méthode basée sur le DPPH (diphényl picryl hydrayl) comme un radical relativement stable . L’activité antiradicalaire est estimée selon l’équation suivante : % d’activité antiradicalaire= [(Abs517 contrôle-Abs517 échantillon)/Abs517controle] x100 Les concentrations des extraits dans le milieu réactionnel sont comprises entre 012.2.2002). Effet scavenger du radical DPPH : Matériel et méthodes Afin d’étudier l’activité antiradicalaire des différents extraits. le diphényl picryl hydrazine . La différence entre les extraits et les contrôles et la détermination des taux de signification sont effectués par test ANOVA suivi du test Tukey. le mélange est laissé à l’obscurité pendant 30min.50µl des solutions d’extraits ou standard (quercétine) sont ajoutés à 1. DCM.5mg/ml.Chapitre 1 I.0-2.5. I. MET.2.00). 32 .4 mg de DPPH dans 100ml de méthanol .5. La solution de DPPH est préparée par solubilisation de 2.selon le protocole décrit par Mansouri et al (2005).Dans ce test les antioxydants réduisent le diphényl picryl hydrayl ayant une couleur violette en un composé jaune . dont l’intensité de la couleur est inversement proportionnelle à la capacité des antioxydants présents dans le milieu a donné des protons (Sanchez-Moreno.95ml de DPPH. Analyses statistiques Les résultats des tests effectués sont exprimés en moyenne ±SD.2. BHT) sont comprises entre 0à50µg/ml et entre 0à25µg/ml pour la vitamine C. et la décoloration par rapport au contrôle négatif contenant uniquement la solution de DPPH est mesurée à 517nm. Quercétine.3. 0-4mg/ml.

Chapitre II Résultats et discussion

Chapitre II

Résultats et discussion

II.1. Détermination de la teneur en eau dans les fruits du Zizyphus lotus Afin de déterminer la teneur en eau dans les fruits du Zizyphus lotus, nous avons utilisé la méthode d’Audigie et al (1987), dont le but est d’exprimer les résultats des constituants biochimiques par rapport à la matière sèche. Tableau 4. La teneur en eau et de matière sèche des fruits du Zizyphus lotus Teneur en eau (g/100g) Teneur en matière sèche (g/100g)

8,96±0,73

91,03±0,73

Les valeurs représentent la moyenne de 30 essais ±SD

Comparativement aux valeurs trouvées chez d’autres variétés du même genre d’occurrence, le Zizyphus mauritiana (Grosskinsky, 1999), Zizyphus spina christi (Anthony, 2005) et Zizyphus jujuba (Catoire et al ., 1994), dont la teneur en eau est comprise entre 46 à 85%,la valeur que nous avons obtenue pour Zizyphus lotus est nettement faible (8,96±0,73%). Ce ci s’explique probablement par sa conservation pendant de longues durées, et même la différence des conditions climatiques et la répartition géographique. II.2. Détermination de la teneur en cendre dans les fruits du Zizyphus lotus La teneur en cendre du Zizyphus lotus a été déterminée après incinération, la cendre grisâtre obtenue représente les diverses substances minérales. Tableau 5. La teneur en cendre et de matière organique des fruits du Zizyphus lotus Teneur en cendre (g/100g) Teneur en matière organique (g/100g) 96,5±0,31

3,5±0,31

Les valeurs représentent la moyenne de 30 essais ±SD

Selon Murdock (2002), la teneur en éléments minéraux de ce fruit est (0,82% de matière sèche), qui est une valeur inférieure à celle de notre échantillon (3,5%).
33

Chapitre II

Résultats et discussion

II.3. Préparation des extraits à partir des fruits du Zizyphus lotus La préparation des extraits à partir des fruits du Zizyphus lotus a été effectuée selon la méthode de Diallo et al. (2004) modifiée. Cette méthode est basée sur l’utilisation des solvants à polarité croissante (Ether de pétrole

→Dichlorométhane→Méthanol), avec la préparation d’une macération aqueuse à 10%. De ce fait, quatre différents extraits ont été obtenus. L’extrait éthérique (ET), qui représente l’extrait le plus apolaire, et le plus riche en matière grasse. L’extrait dichlorométhanique (DCM), représente l’extrait moyennement apolaire L’extrait méthanolique (MET) représente l’extrait polaire L’extrait (AQ), représente l’extrait le plus polaire. La couleur, l’aspect ainsi que le rendement de chaque extrait par rapport au poids du fruit sec sont représentés dans le tableau 6 ci-dessous. Tableau 6. Aspects, couleurs et rendement des divers extraits du fruit Zizyphus lotus Extrait ET DCM MET AQ Aspect Huileux Huileux Pâteux poudre Couleur Vert Vert noir Marron foncé Marron clair Rendement 0,36% 0,28% 6,4% 40,4%

Les résultats obtenus montrent que parmi les quatre extraits, l’extrait (AQ) représente le rendement le plus élevé (40,4%), suivi par l’extrait méthanolique 6,4%, alors les extraits apolaires possèdent les rendements bas, dont l’extrait éthérique (0,36%) suivi par l’extrait dichlorométhanique(0,28%).

34

4. (2007(b)). la diminution de leur extractibilité dans le solvant. permet d’extraire le maximum des composants bioactifs et de prévenir leur dénaturation ou modification probable.1. 35 . aussi affecte leur quantification (Hagermann et al . ce qui est en accord avec les résultats obtenus par Borgi et al. 2000).Chapitre II Résultats et discussion L’utilisation de différents solvants à polarité différente permet de séparer des composés selon leur degré de solubilité dans le solvant d’extraction. Résultats des testes préliminaires des flavonoides et des tanins sur les différents extraits du Zizyphus lotus Extraits ET DCM MET AQ ET DCM MET AQ Métabolite testé Couleur résulte Résultats + + + + Flavonoїde Couleur rouge Couleur rouge - Tanins Bleu verdâtre Bleu verdâtre A l’égard des résultats obtenus.4.. Cette méthode d’extraction menée à température ambiante et sous agitation contenue.4. II. dont la température élevée provoque l’inactivation des composés phénoliques. Analyse des extraits du Zizyphus lotus : II.1. la présence des flavonoïdes et des tanins dans les fruits du Zizyphus lotus est évidente.Tests préliminaires Tableau 7.1.Analyse qualitative des extraits du Zizyphus lotus II.

Chapitre II

Résultats et discussion

Les extraits polaires montrent une présence des flavonoides plus importante que les extraits apolaires, ce ci peut être attribué à la différence du degré de polarité des flavonoїdes, dont les flavonoides polaires représentent la fraction la plus élevée. L’apparition de la couleur bleu verdâtre reflète la présence des tanins catéchiques (condensés) dans les extraits polaires, alors son absence total dans les extraits apolaires. Les mêmes résultats sont trouvés par Borgi et al. (2007(b)), qui ont effectué le test préliminaire des tanins sur différents extraits obtenus à partir des différents organes du Zizyphus lotus, dont ses résultats ont révélé la présence des tanins dans les extraits polaires (aqueux et méthanolique), et leur absence dans l’extrait chloroformique (solvant équivalent du point de vue polarité au dichlorométhane utilisé dans le présent travail). II.4.1.2. Analyses chromatographiques II.4.1.2.1. Chromatographie sur couche mince Pour une caractérisation partielle des différents extraits du Zizyphus lotus, une chromatographie sur couche mince (CCM) a été réalisée. Les standards utilisés sont des composés phénoliques. La rutine (Rut), quercétine (Que), catéchine (Cat) sont des flavonoides, l’acide tannique (At) et l’acide gallique (Ag) sont des acides phénoliques. Le système de migration utilisé (BAW) butanol-acide acétique- eau (60/15/35) permet seulement de séparer l’extrait MET. Alors pour les extraits DCM et ET, le système de migration (Ether de pétrole/acétate d’éthyle) (8/2) a été employé

MET AQ

Ag At

Que

Rut

Cat

Figure 14. Chromatographie sur couche mince des extraits polaires des fruits du Zizyphus lotus après révélation par la vanilline sulfurique
36

Chapitre II

Résultats et discussion

MET AQ

Ag

At

Que

Rut

Cat

Figure 15. Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du Zizyphus lotus (Observation sous la lampe UV (254nm))

ET

DCM

ET

DCM

Figure 16. Chromatographie sur couche mince des extraits apolaires des fruits du Zizyphus lotus (Révélation par la vanilline sulfurique)

37

Chapitre II

Résultats et discussion

AQ MET Rut Que

ET

DCM

Figure 17. Chromatographie sur couche mince des extraits des fruits du Zizyphus lotus (Révélation par une solution de DPPH)

Tableau 8. Rapports frontaux et couleurs après révélation des standards
Standards Couleur après révélation (vanilline sulfurique) RF

Catechine Quercétine Rutine Acide gallique Acide tannique

Rouge Jaune orange orange Mauve Mauve

0,87 0,93 0,52 0,86 0,83

Après révélation, deux taches apparaissent pour l’extrait MET, elles sont visibles sous les révélateurs (vanilline sulfurique, UV 254nm et UV366nm) (Figure 14,15). La mesure des rapports frontaux de chacune des taches révèle que l’une des tache correspond à la quercétine (RF=0,93) et l’autre à la rutine (RF=0,52), ceci est en

38

Chromatographie liquide à haute performance HPLC –RP-C18 L’HPLC-RP C18 permet d’identifier la présence de quelques substances dans chacun des quatre extraits étudiés. II. Les substances actives sont visualisées comme des taches jaunes sur un fond violet (Figure 17). Notant toutefois qu’un résultat négatif obtenu pour un extrait testé ne doit pas exclure la présence de substances actives dans cet extrait.2.2.4. ceci peut être attribué à la faible concentration de la quercétine présent dans l’échantillon testé. La révélation de la plaque par la solution éthanolique de DPPH est une CCM de criblage qui permet l’obtention d’une vue préliminaire sur l’activité antioxydante des différents extraits testés. ayant un (RF=0. 39 . alors nous avons remarqué l’absence de la tache qui est normalement correspondante à la quercétine. Alors pour le système (Ether de pétrole/acétate d’éthyle) (8/2). MET) par rapport aux extraits apolaires (ET. par comparaison entre le temps de rétention des standards (Figure18) et les chromatogrammes des extraits.52). plusieurs taches apparaissent pour les extraits apolaires (ET. DCM) avec des couleurs mauves. l’intensité des taches jaunes est plus dense dans les extraits polaires (AQ. L’une des taches apparaissent pour l’extrait MET. ce qui confirme le résultat obtenu sous la révélation par la vanilline sulfurique. Alors pour l’extrait AQ une tache jaune apparue. Globalement.Chapitre II Résultats et discussion accord avec les résultas obtenus par Kriventsov et Krakhanova (1970) qui ont montré la présence des polyphénols et de la rutine dans les fruits du Zizyphus lotus.93) correspondant à la quercétine qui n’apparaît pas sous les autres révélateurs. DCM) qui ne présentent aucune tache jaune. témoignant probablement la présence des stérols et terpènes (Figure 16). et roses. une tache jaune correspondante à la rutine (RF=0.

0 CneA hn al suia o m 16 04 1 .675 3.0 1 1 3.317 4.858 4.175 0 .183 0 0 1 1.675 0 0 .642 2.750 1.5 1.300 0 .0 4 .225 1.375 1.0 1 .308 1.992 2 3 4 5 Mte in s u 6 7 8 9 1 0 0 1 1.0 2 .683 13.108 1.5 2 1 .950 3.5 Mte in s u 1 .5 5 .5 4 .0 2 .5 3 .433 3.5 0 2 .333 0 .5 0 .5 5 .108 4.700 3.325 1.217 1.075 0 .942 1.0 0 .5 2 RetioTe ennim t Volts Volts Volts RetioTe ennim t 1 .0 CnlA hn ae suia o m 16 0 3 2 1 .850 12.683 2.792 0 .0 0 2.1 0 .5 4 .108 1.5 0.600 5.825 1.0 4 .100 1 1 0 .0 1 .742 0 .5 0 1 0 1 2 1 4 1 0 1 2 1 4 Rutine Quercétine Figure 18.0 0 .025 1.5 CnlA hn ae sm oia u 17 1 3 2 Rnnim etioTe te Volts Volts Volts Volts 1 .5 Mte in s u 0 .2 3 CnlA hn ae suia om 14 07 0 .0 0 .625 1. Chromatogrammes des différents standards testés par l’HPLC 40 .0 1 .0 3 .275 3.0 2 .5 0.0 2 3 4 5 Mte in s u 6 7 8 9 1 0 Acide caféique Catéchine 1 Rnnim .Chapitre II CnlA hn ae suia om 16 02 Résultats et discussion 1 .0 3 .0 0 2 0 .5 3 .725 0.0 Acide gallique Acide tannique 3 CnlA hn ae suia om 13 19 0 .0 4 6 8 Mte in s u 0 0 2 4 6 8 Mte ins u 0.358 1.5 e toTe tei 1 .1 0.0 Volts 1 1 1.725 6.2 RetioTe ennim t RetioTe ennim t Volts Volts Volts Volts 2 2 0 .

7 1. la catéchine et la quercétine qui est apparu précédemment après révélation par la solution du DPPH.Chapitre II Tableau 9.9 1. l’acide caféique est le seul composant détecté. Temps de rétention des standards testés Standards Quercétine Rutine Catechine Acide cafféique Acide tannique Acide gallique (TR) min 6.20) Alors pour l’extrait MET (figure 21). 41 .67 Résultats et discussion Les résultats obtenus sont montrés dans le tableau suivant : Tableau 10.64 1.cafféique A. (2006) qui a réalisé l’HPLC sur le Zizyphus vulgaris Pour l’extrait aqueux (Figure 22). deux composants sont détectés.3 1.gallique Atannique + + + + + + - L’analyse des différents extraits par l’HPLC permet d’identifier la présence de la catéchine et l’acide caféique dans les extraits apolaires (ET. DCM) (Figure 19. ceci est correspondant au résultat obtenu par Capanoglu et al. Les standards détectés dans les différents extraits du Zizyphus lotus Quercétine ET DCM MET AQ + Rutine Catechine A.5 3.

000 2 4 6 8 10 12 M inutes 14 16 18 20 22 24 Figure 19.000 0 1.992 0.375 0.004 Volts 9.233 14.004 Volts Retention Time 1.000 2 4 6 8 10 M inutes 12 14 16 18 20 Channel A soum ia 1005 0.675 3.875 5.000 0 1.358 2.667 4.375 4.850 12.002 0.042 12.000 3.875 3.008 6.004 5.933 5.002 0.875 9.833 2.658 16.625 9.500 3.575 0.225 0.308 0.367 0.533 2.004 C an A h nel soum ia 1004 R etentionTim e 1.002 12.000 2 4 6 Minutes 8 10 12 14 S 0.942 2.002 15.542 10.917 0.117 4.650 0.083 2.033 7.342 6.450 0.508 7.292 3.908 7.242 2.258 11.004 Volts Retention Tim e 1.233 3.108 0.683 6.883 4.442 4.242 2.483 3.Chromatogrammes obtenus pour l’extrait éthérique du Zizyphus lotus 42 Volts Volts .733 15.475 9.792 11.542 3.002 0.183 3.950 4.575 8.004 Volts 7.967 2.675 16.208 16.033 0.833 17.392 0.Chapitre II Résultats et discussion Channel A soum ia 1003 0.958 0.000 0 1.742 9.575 6.667 5.002 10.333 10.

158 Volts 8.492 1.200 Channel A soumia 1006 0.258 6.15 Channel A soumia cafeine011 0.00025 1.5 1.900 0.0 0 1 1.933 4.0 2.15 Retention Time 2.542 1.0050 Retention Time 2.858 4.00000 0.0 3.00025 0 1 2 3 4 5 Minutes 6 7 8 9 10 Figure 20.725 0.033 Retention Time 1.383 5.1 2.875 0.967 2.0000 1.5 Minutes 3.575 6.867 3.3 Retention Time 0.5 4. Chromatogrammes obtenus pour l’extrait méthanolique du Zizyphus lotus 43 Volts Volts .983 13.05 0.092 Volts 7.458 0.Chromatogrammes obtenus pour l’extrait du dichlorométhane du Zizyphus lotus 0.0000 0 2 4 6 8 10 12 Minutes 14 16 18 20 22 24 0.667 3.0 1.767 -0.008 2.575 0.883 2.5 5.933 0.0050 Volts 0.00 0.2 0.0025 0.692 3.383 Channel A soumia 1010 0.0 4.00 2.00050 1.2 2.05 2.5 1.10 0.0 0.3 Channel A soumia 1211 0.650 9.0 0.142 0.10 Volts 0.400 0.Chapitre II Résultats et discussion 0.00050 0.0025 11.1 0.00000 -0.050 5.00025 3.458 5.508 3.00025 Volts Volts 0.0 2 3 4 5 Minutes 6 7 8 9 10 Figure 21.608 0.

2 Volts 0.475 3.0 0 1. L’acide gallique a été utilisé comme standard . Les résultats sont représentés dans le tableau11 et les gammes d’étalonnage dans les figures 23.0 0.558 0.0 1. La méthode du dosage des polyphénols totaux est celle de Folin –Ciocalteu (Li et al . en utilisant la catechine comme standard.un dosage des polyphénols totaux .5 Minutes 1.0 2. Analyse quantitative des extraits des fruits du Zizyphus lotus Afin de caractériser les différents extraits préparés à partir des fruits du Zizyphus lotus . modifiée par Heimler et al.1 0.292 0..0 0.. (2006). Le choix du dosage de ces substances réside dans le fait que la majorité des propriétés antioxydantes des plantes leur sont attribués. 24.4.0 3.808 4.0 4.708 Channel A soum ia 1191 0.5 5.1 0. enfin celui des tanins condensés a été effectué selon la méthode de vanilline (Broadhurst et Jones 1978).0 2. Chromatogrammes obtenus pour l’extrait aqueux du Zizyphus lotus II.542 6.3 Retention Time 0.775 Channel A soum ia 1066 Retention Time 0.625 0.1 0.508 0.2 Volts 0.2.2 1.5 4.Chapitre II Résultats et discussion 0.25 44 Volts .1 2.3 0.0 2 4 6 Minutes 8 10 12 14 Figure 22.2 Volts 1. 2007). des flavonoides et des tanins a été effectué.0 0.en utilisant comme standard la quercétine. 1996) .083 1.5 3.Tandis que celui des flavonoides a été réalisé selon la méthode de trichlorure d’aluminium (Bahorun et al .5 1.

(2007) ont dosé les polyphénols totaux par la méthode de Folin-Ciocalteu dans des extraits polaires obtenus par extraction à base méthanol/eau (4 :1 v/v) .34±0.00 5. DCM).26µg EQ/mg d’extrait).54 1.83±0.57±0.54 versus 1. Par la suite vient les extraits apolaires (ET.82±0.99±0. dont l’extrait dichlorométhanique avec une teneur de (0. Dans une étude faite sur cinq variétés du jujube chinois (Zizyphus jujuba). Les valeurs représentent la moyenne de 3 à 4 mesures ± SD.64±0.82±0. des flavonoides et des tanins condensés dans les différents extraits du fruit du Zizyphus lotus Extrait ET DCM MET AQ Polyphénols (a) 2.8±1.71±±0.64±0. Les résultats du dosage des polyphénols totaux montrent que les extraits polaires (méthanolique et aqueux) sont les extraits les plus riches en polyphénols.4 µg EQ/mg d’extrait).8±1.12 5±0.4 0.18±1.00 versus 5.12). 45 . Li et al.5 0.18±0.5µg EQ/mg d’extrait).71±0.77±1. le résultat obtenu pour l’un des cinq variétés (Zizyphus jujuba Sanbianhong) (5.17 µg EQ/mg d’extrait). suivi par l’extrait éthérique (0.17 1.94 6.24 µg/mg d’extrait). suivi par l’extrait méthanolique (0. µg d’équivalent de catéchine par milligramme d’extrait. D’autre part les extraits apolaires (éthérique et du dichlorométhanique) ont montré des valeurs voisines (2.Chapitre II Résultats et discussion Tableau 11.99±0.24).83±0.34±0.Dosage des polyphénols totaux.26 Tanins© 4. µg d’équivalent de quercétine par milligramme d’extrait.95 (a) (b) (c) µg d’équivalent d’acide gallique par milligramme d’extrait. La détermination quantitative des flavonoides totaux par la méthode du trichlorure d’aluminium révèle que l’extrait aqueux est l’extrait le plus riche en flavonoides avec une teneur de (1.24 Flavonoïdes (b) 0.29 µg EAG/mg d’extrait) est presque similaire à celui obtenu avec l’extrait aqueux du Zizyphus lotus (5. dont les valeurs sont très proches (5±0.

05) entre la teneur des extraits en tanins condensés et en composés phénoliques (Figure 27). le dégrée de maturation et la différence génétique.94 µg ECT/mg d’extrait) L’examen de ces résultats permet de mettre en évidence une corrélation linéaire significative (R2=0. non seulement à l’espèce. 2. (2009) a fait une étude sur deux espèces Zizyphus jujuba et Zizyphus spina-christi.0116x + 0. les conditions enviromentales et géographiques durant le développement du fruit. Le dosage des tanins condensés montrent la haute teneur de ces molécules dans les extraits polaires (méthanolique et aqueux). (2006) ont dosé les flavonoides dans l’extrait méthanolique du Zizyphus vulgaris. Pawliska et al. dont l’extrait aqueux représente l’extrait le plus riche (6.9985 150 200 250 C onc e ntra tions e n (ug /ml) Figure 23. Droite d’étalonnage de l’acide gallique (moyenne ± SD de deux essais) 46 . mais aussi aux conditions de croissance.95 µg ECT/mg d’extrait).93µg/ml) à celle trouvée dans l’extrait méthanolique du Zizyphus lotus (0. suivi par l’extrait méthanolique (4.5 1 0.79 p≤0.98. où les flavonoides et les tanins représentent les composés prépondérants des polyphénols.5 A b s o rb an c e à 765n m 2 1. dont ils ont attribué la différence de teneur en flavonoides entre les fruits.77±1. il apparaît que la teneur en flavonoides dans le Zizyphus lotus augmente avec la polarité de l’extrait (AQ>MET>DCM>ET). p≤0. comme le sol.5 0 0 50 100 y = 0. De même. où ils ont trouvé une valeur supérieure (5.0375 R 2 = 0.83 µg/ml). une corrélation linéaire significative (R2=0.05) entre la teneur des extraits en flavonoïdes et en composés phénoliques (Figure 26). Ceci apparaît logique.Chapitre II Résultats et discussion Capanoglu et al. En tenant compte de la polarité des extraits.57±0.

Droite d’étalonnage de la quercétine (moyenne ± SD de deux essais) 0.5 absorbance à 430nm 2 1.Chapitre II Résultats et discussion 3 2.7 A b s o rb an c e à 500n m 0.5 1 0.1 0 0 100 y = 0.0021x + 0.5 0 0 10 20 30 40 50 c onc e ntra tions (ug /m l) y = 0.4 0.004 R 2 = 0.5 0.9975 200 c onc entra tions (ug /m l) 300 400 Figure 25.3 0.0661x + 0.0112 R 2 = 0.9984 Figure 24. Droite d’étalonnage de la catéchine (moyenne ± SD de deux essais) 47 .6 0.2 0.

0 0.7948 Résultats et discussion Quantité en polyphénols totaux (ug EAG/mg) 8 6 4 2 0 0.5 1.5 quantité en flavonoides (ug EQ/mg) 2.05) 48 .0 1.Chapitre II R2=0. Corrélation linéaire entre la quantité en polyphénols totaux et la quantité des flavonoides des différents extraits du fruit Zizyphus lotus (p≤0.05) R2=0.Corrélation linéaire entre la quantité en polyphénols totaux et la quantité des tanins condensés des différents extraits du fruit Zizyphus lotus (p≤0.9855 Ouantité en polyphénols (µg EAG/mg) 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 Quantité en tanins (µg E CT/mg) Figure 27.0 Figure 26.

Chapitre II II. lié au contenu des extraits aux substances à activité antimicrobienne. de même cet extrait montre la plus grande zone d’inhibition. qui est apparue avec Escherichia coli (une zone d’inhibition > 45mm).32±1.71 45.65 - 17. ce qui confirme le spectre large de l’activité antimicrobienne de ce fruit.05 - 9.5.81 - 7±0 12±0 Les valeurs sont une moyenne de 3 à 4 essais±SD (les zones sont mesurées en mm) Tous les extraits du Zizyphus lotus se sont révélés actifs avec un degré différent. supérieure à toutes les zones obtenues après test des antibiotiques sur la même souche (Amoxilline 22mm. il apparaît que toutes les souches microbiennes testées sont inhibées au moins par l’un des extraits. L’extrait éthérique du Zizyphus lotus semble avoir l’effet inhibiteur le plus puissant. Cefoxitine 26mm).1.29±0.16±0 - - 9±0 - 6. en présentant des zones d’inhibition de croissance avec toutes les souches microbiennes sauf Salmonella thyphimurium.49 17.58 16. D’après les résultats obtenus. parmi les quatre extraits. Activités biologiques Résultats et discussion II.45±0.81 14. Activité antimicrobienne des extraits du Zizyphus lotus L’activité antimicrobienne des différents extraits des fruits du Zizyphus lotus a été évaluée par la méthode de diffusion en milieu gélosé.72±0 - 10. Tableau 12.41±1. Ghédira (1995) a montré qu’un alcaloïde de cette espèce présente une activité antibactérienne significative. 49 . en mesurant les diamètres des zones d’inhibition de la croissance microbienne (Figure 29).5.07±0.76±1. Diamètres des zones d’inhibition de la croissance microbienne obtenus par différents extraits du Zizyphus lotus Extraits Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomona aeruginosa Klebsiella pneumonia Salmonella thyphimurium Candida albicans ET DCM MT AQ 22.13±0. sans négliger l’effet synergique des autres molécules à effet antimicrobien.

La paroi cellulaire des bactéries gram positives est constituée par une seule couche alors que la paroi cellulaire des gram négatives a une structure multicouche liée par une membrane cellulaire externe (Ali-Shtayeh et al .Chapitre II Résultats et discussion Cette activité de l’extrait éthérique peut s’expliquer par l’effet antimicrobien puissant des composés apolaires de l’extrait éthérique . Les extraits polaires du Zizyphus lotus ont montré une activité antimicrobienne avec toutes les souches microbiennes sauf Klebsiella pneumonia. 1998) (Figure 28) Gram+ Gram- Figure28 . l’extrait méthanolique a montré des zones d’inhibition avec trois souches bactériennes (Staphylococcus aureus. Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa).. 1998) 50 . Salmonella thyphimurium et Candida albicans. alors l’extrait (AQ) a une activité avec Staphylococcus aureus.Une étude faite par Nasif (2002) sur les graines du Zizyphus spina christi a montré que les acides gras de la fraction lipidique présentent une forte activité contre E coli. ceci peut être attribué à la différence de la structure entre les bactéries gram positives et les bactéries gram négatives. L’extrait (DCM) a montré seulement une activité avec Staphylococcus aureus.Structure de la paroi bactérienne (Ali-Shtayeh et al . Il est apparaît que le Staphylococcus aureus (gram positive) est la bactérie la plus susceptible par comparaison avec les autres souches (gram négative) ..

Chapitre II Résultats et discussion Zones d’inhibitions de l’extrait MET sur Staph a Zones d’inhibition de l’extrait ET sur Staph a Zones d’inhibitions de l’extrait ET sur Pseudo a Zones d’inhibition de l’extrait AQ sur Staph a Zones d’inhibitions de l’extrait ET sur E coli Zones d’inhibitions de l’extrait AQ sur Candida a Zones d’inibitions de l’exrait ET sur Klebsiella p Figure 29. Zones d’inhibitions obtenues par différents extraits du Zizyphus lotus 51 .

32).2.. Structure chimique de β-carotène (Diallo. 52 . dont son activité antioxydante relative est 85. 2002).2. Une activité antioxydante intermédiaire a été obtenue qu’avec l’extrait méthanolique (MET) (69. il est évident que le BHT et les extraits testés inhibent d’une manière significative (p≤0. L’extrait aqueux (AQ) montre la plus grande activité inhibitrice.Chapitre II II.01) l’oxydation couplée de l’acide linoléique et du βcarotène par rapport au contrôle négatif qui représente (100%) de la peroxydation. Activité antioxydant II.5.Test du blanchissement du β-carotène Résultats et discussion Dans ce test.1. mais cette activité reste significativement inférieure (p≤0.001) à celle du BHT (100%) utilisé comme contrôle positif.001) à celle de l’extrait éthérique (36. 2008) Figure 30. Yang et al . Cependant la présence d’un antioxydant pourrait neutraliser les radicaux libres dérivés de l’acide linoléique. l’oxydation de l’acide linoléique génère des radicaux peroxydes.1995 .05%.48%). 2005) La cinétique du blanchissement du β-carotène en absence et présence des extraits du Zizyphus lotus. Ces radicaux libres vont par la suite oxyder le β-carotène hautement insaturé (Figure 30) qui perd ses doubles liaisons entraînant ainsi la disparition de sa couleur rouge. D’après ces résultats. et des hydroperoxydes diène conjugués (Kaur et Kapoor. du BHT et les activités antioxydantes relatives (AAR) sont représentés dans (Figure 31.5. et donc prévenir l’oxydation et le blanchissement du β-carotène (Yanishilieva et Marinova .24%) qui a une activité significativement supérieure (p≤ 0. qui est suivi spéctrophotométriquement à 490 nm.

l’extrait aqueux (AQ) est 1.. une corrélation linéaire remarquable et significative (R2=0.Chapitre II Résultats et discussion L’activité de ce dernier est statistiquement similaire à celle de l’extrait du dichlorométhane (33.05) a été mise en évidence entre l’ARR (activité antioxydante relative) des extraits du Zizyphus lotus et leur teneurs en composés phénoliques (Figure 33). l’extrait du dichlorométhane (DCM) est 2 fois moins actif que l’extrait méthanolique.5 fois moins actif que l’extrait aqueux . En comparaison avec BHT. Ce ci est en accord avec les résultats obtenus par Yang et al. où la moyenne de l’activité antioxydante obtenue est 73% qui est une valeur modérément supérieure à celle obtenue de l’extrait méthanolique du Zizyphus lotus (69. il y a une autre corrélation significative (R2=0.9%) qui représente l’extrait le moins actif. (2009) sur les extraits méthanoliques de 50 génotypes du Zizyphus jujube . et 2. où leur noyau phénolique leur confère une activité antioxydante puissante (Peronny.7fois moins actif que le BHT. 99. Le test de blanchissement de β-carotène a été réalisé par Kamiloglu et al. D’ailleurs. 2005). entre l’AAR et la teneur en tanins condensés des différents extraits du Zizyphus lotus (Figure 34). et presque 3 fois moins actif que le BHT. 53 . p≤0. (2002) qui ont rapporté qui il y a une corrélation entre le contenu en composants phénoliques et la capacité antioxydante.24%). 99. et précisément les tanins condensés dans l’activité antioxydante relative. dont la distribution des substances à activité antioxydante entre les différents extraits dépend de polarité des extraits (Kang et al . alors cette corrélation est non significative entre l’AAR et la teneur en flavonoides des différents extraits. p≤0.05). ces résultats sont en accord avec la littérature qui suggère que l’activité antioxydante des extraits végétaux dépend du type du solvant d’extraction et de sa polarité. En effet. Ces résultats nous permettent de déduire le rôle important des polyphénols des extraits du Zizyphus lotus. 2003). D’une manière générale.

Cinétique de blanchissement du β-carotène à 490 nm en absence et en présence des extraits du Zizuphus lotus.05).Chapitre II Résultats et discussion 1.2 0 0 10 20 30 temps (h) 40 50 60 ET DMC Met AQ CON- Figure 31. (chaque valeur représente la moyenne de trois essais) 150 % activité antioxydante relative a 100 d c 50 b b e 0 T M ET ET Q B H C M A Figure 32.4 1. Activité antioxydante relative des extraits du fruit du Zizyphus lotus. du BHT. co nt ro le D (-) 54 .2 Absorbance à 490 nm 1 BHT 0. du BHT dans le système carotène /acide linoléique (les valeurs sont la moyenne de trois mesures ± SD).4 0.6 0.8 0. les barres avec des lettres différentes indiquent des activités significativement différentes (p ≤ 0.

05).99 100 %activité antioxydante relative 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 teneur en tanins(µg ECT/mg) Figure 34. Corrélation linéaire entre la teneur en polyphénols et le pourcentage de l’activité antioxydante relative (p≤0. R2=0.Chapitre II R2=0. 55 .9913 100 Résultats et discussion % activité antioxydante relative 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 teneur en polyphénols (µg EAG/mg) Figure 33.05). Corrélation linéaire entre la teneur en tanins et le pourcentage de l’activité antioxydante relative (p≤0.

2008).2004). Diphenylpicrylhydrazyl +Antioxydant-OH (Couleur violet) → Diphenylpicrylhydrazine+Antioxydant-O. 56 . Réaction d’un antioxydant avec le DPPH (Molineux .5. 2007).2. les IC50 sont déterminés pour les extraits polaires (MET et AQ) seulement car les extraits apolaires n’atteignant pas 50% d’activité (Tableau13) Pour mieux caractériser le pouvoir antiradicalaire.2.37) révèlent que les extraits du Zizyphus lotus possèdent une activité antiradicalaire dose dépendante. toujours utilisé comme un réactif pour évaluer l’activité antiradicalaire des antioxydants (Oyaizu.Chapitre II II. Le DPPH est caractérisé par son adaptation à plusieurs échantillons dans une courte durée. deux autres paramètres sont introduits : -Calcul de l’ EC50 qui prend en considération la concentration de DPPH dans le milieu réactionnel [concentration effective à 50%... Les profiles d’activité antiradicalaire obtenu (Figure 36. Effet scavenger du radical DPPH Résultats et discussion L’activité antioxydante des différents extraits du Zizyphus lotus vis-à-vis le radical DPPH a été évaluée spectrophotométriquement en suivant la réduction de ce radical qui s’accompagne par son passage de la couleur violette à la couleur jaune à 517 nm (Figure 35). 1996). il a été employé pour le criblage des activités antiradicalaires des extraits végétaux (Yi et al . EC50= (IC50/mg de DPPH/ml)] -Calcul du pouvoir antiradicalaire (APR) qui est inversement proportionnel à l’EC50) (Prakash et al . (Couleur jaune) Figure 35. aussi il est assez sensible pour détecter les ingrédients actifs à des basses concentrations. Le DPPH (diphenylpicrylhydrazyl) est un radical libre organique. à cet effet.

35 55±35.18 50 ±0 00 13.04 0.75± 1. 1.21± 0. ce qui montre que les antioxydants apolaires sont inactifs vis-à-vis du DPPH.77± 1.75±1.44µg/ml et des APR de l’ordre de 4.44±0. (2007) ont rapporté que la rutine a montré une grande efficacité antiradicalaire vis-à-vis le radical DPPH par rapport le BHT.00 1.09 16±0.00 0.00 9. dont le pourcentage de l’activité antiradicalaire n’atteint même pas 50%. la rutine.1 ±0.01 0.00 1.45 suivi par l’extrait MET avec une IC50 195µg/ml et un APR de 0.86 respectivement.47 ± 1.44 µg/ml.07±0.47µg/ml et 1.00 0.45±0. DCM) montrent une très faible activité antiradicalaire.74 0. quatre antioxydants standards sont utilisés. Parmi les quatre extraits du Zizyphus lotus. avec une IC50 de l’ordre 55µg /ml et un APR de 0. Activité antiradicalaire des extraits du fruit du Zizyphus lotus IC50 (µg /ml) BHT Rutine Quercétine Vitamine C MET AQ DCM ET 4.76 2.1.86±0. Par contre les extraits apolaires (ET. 50 et 13. ils ont montré une activité antiradicalaire puissante avec des IC50 de l’ordre de 4.25±0. 57 . ce qui est en accord avec les résultats du présent travail.35 EC50 (µg /µg DPPH) 0. 0.02 ± 0. la quercétine et la vitamine C (Figure 38).07µg/µg DPPH) par Siddhurajuet et Manian (2007). le BHT.07 195± 35. dont la rutine possède un pouvoir antiradicalaire 4 fois supérieure à celui du BHT.28 - Les valeurs représentent la moyenne de deux essais ± SD A des fins comparative.Chapitre II Résultats et discussion Tableau 13.25 µg/ml. La valeur de EC50 de la vitamine C est similaire à celle rapportée auparavant (EC50=0.44±0.01 0.06±0. 16. Baydar et al. l’extrait aqueux représente l’extrait le plus actif.76 APR 4.77.

8 à 69. En effet.01) entre la teneur des extraits en flavonoides et le pouvoir antiradicalaire (APR) (Figure 39). les flavonoides sont reconnus comme des substances potentiellement antioxydantes ayant la capacité de piéger les espèces radicalaires et les formes réactives de l’oxygène.Chapitre II Résultats et discussion Globalement ces résultats confirment les résultats de la CCM de criblage ou les extraits polaires apparaissent les plus actifs. 58 .6 fois plus actif que l’extrait aqueux et 47. flavonoides et tanins.Cependant pour la même concentration l’extrait AQ et MET du Zizyphus lotus ont montré un effet antiradicalaire supérieure 83. dont l’extrait AQ possède la plus forte teneur en molécules dosés (polyphénols. où l’effet antiradicalaire obtenu est entre 17.14 % respectivement. (2005) ont évalué l’activité antiradicalaire vis-à-vis le radical DPPH des extraits méthanoliques de cinq variétés du Zizyphus jujuba . Une étude faite par Kang et al.5 mg/ml .56 et 83. (2003) a suggéré que les molécules polaires présentes dans les extraits végétaux contribuent à l’augmentation de l’activité antiradicalaire. tous les extraits testés s’avèrent moins actifs . En comparaison avec les antioxydants standards.98. suivi par l’extrait MET. L’examen de ces résultats permet de mettre en évidence une corrélation linéaire significative (R2=0. Il est évident que la forte activité des extraits AQ et MET est attribuée à leur richesse aux composés phénoliques. Li et al.Le BHT ayant l’APR le plus faible entre les standards est 10.1% pour une concentration de 0. flavonoides et tanins).7 plus actif que l’extrait méthanolique. p≤0.

5 1. Activité antiradicalaire des extraits apolaires (DCM.0 80 60 40 20 0 0.5 0 1 2 3 Concentration (mg/ml) Concentration (mg/ml) Figure 36. Activité antiradicalaire des extraits polaires (MET. ET) des fruits du Zizyphus lotus (Chaque valeur représente la moyenne de deux essais) 59 .0 1.Chapitre II Résultats et discussion AQ 100 100 MET %Activité antiradicalaire %Activité antiradicalaire 80 60 40 20 0 0. AQ) des fruits du Zizyphus lotus (Chaque valeur représente la moyenne de deux essais) ET 25 %Activité antiradicalaire 20 15 10 5 0 0 5 10 15 Concentration (mg/ml) %Activité antiradicalaire 30 DCM 20 10 0 0 1 2 3 Concentration (mg/ml) Figure 37.

5 1.3 0.0 0. le BHT.01). Activité antiradicalaire des standards la quercétine .2 0.0 1. 60 .0 teneur en flavonoideµg EQ/mg) Figure 39.la rutine et la vitamine C (Chaque valeur représente la moyenne de deux essais) R2=0.0 0.1 0.4 0.98 0.5 2. Corrélation linéaire entre la teneur en flavonoides et le pouvoir antiradicalaire (p≤0.5 P ouvoir antiradicalaire 0.Chapitre II Résultats et discussion Quercétine 100 %Activité antiradicalaire 80 60 40 20 0 0 20 40 concentration(µg/ml) 60 BHT 100 %Activité antiradicalaire 80 60 40 20 0 0 20 40 Concentration (µg/ml) 60 Rutine 100 %Activité antiradicalaire 100 80 60 40 20 0 Vitamine C % Activité antiradicalaire 80 60 40 20 0 0 20 40 Concentration en (µg/ml) 60 0 10 20 30 Concentration en ug/ml Figure 38.

Chapitre II Résultats et discussion 61 .

et leur absence dans les extraits apolaires. alors les extraits apolaires sont moins actifs. Le test de l’activité antimicrobienne des différents extraits a montré que tous les extraits testés sont actifs . la catéchine et l’acide caféique. telles que dans les extraits apolaires. supérieure à l’antibiotique testé.D’ailleurs toutes les souches microbiennes testées (bactéries et levures) sont inhibées au moins par l’un des extraits dont l’extrait ethérique qui a plus d’activité (une zone d’inhibition supérieure à 45mm). L’analyse des différents extraits du Zizyphus lotus par HPLC a révélé la présence de quelques composés phénoliques dans les extraits. des tanins dans les extraits polaires. L’analyse quantitative des extraits du Zizyphus lotus est représentés par le dosage spectrale des trois substances biactives : les polyphénols. alors les extraits apolaires (ethérique et dichlorométhanique) sont les extraits en teneurs faibles. a mis en évidence la présence des flavonoides. alors dans l’extrait méthanolique l’acide caféique est présent. une telle thérapie prévient l’apparition des effets secondaires observés lors de l’utilisation des médicaments de synthèse chimique. alors que l’analyse effectuée par chromatographie sur couche mince a montré la présence de la rutine et la quercétine dans l’extrait méthanolique. L’une des technique utilisée pour étudier l’activité antioxydante des différents extraits est la méthode du blanchissement du β-carotène qui a révélé que les extraits polaires les plus riches en composés phénoliques sont les extraits les plus actifs. dont l’extrait aqueux à montré la plus grande activité. les flavonoides et les tanins. dont l’extrait aqueux est l’extrait le plus riche. Dans un premier temps. L’étude des propriétés microbiologiques et antioxydantes des extraits du fruit du Zizyphus lotus nous a permis d’obtenir des résultats intéressants. Dans l’extrait aqueux cette analyse montre la présence de quercétine et catéchine. Les extraits polaires (méthanolique et aqueux) sont les extraits aux teneurs considérables en métabolites dosés.Conclusion L’utilisation des plantes médicinales en phytothérapie a reçu un grand intérêt dans la recherche biomédicale . . l’analyse qualitative de chaqu’un des quatre extraits obtenus du fruit du Zizyphus lotus.

le test au DPPH révèle que ces deux extraits sont les plus actifs comme piégeur du radical DPPH dont l’extrait aqueux qui a l’effet antiradicalaire le plus puissant. MET) qui sont les extraits les plus riches en composés phénoliques. suivi par l’extrait méthanolique. l’ensemble de ces résultats obtenus in-vitro ne constitue qu’une première étape dans la recherche de substances et source naturelle biologiquement active.Le criblage préliminaire des extraits en CCM a permis de localiser le pouvoir piégeur du DPPH dans les extraits polaires (AQ. . Effectivement.Des essais complémentaires seront nécessaires et devront pouvoir confirmer les performances mises en évidences. En fin. alors que les extraits apolaires ont montré une activité antiradicalaires faible.

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ET )‫ى‬ ‫تا‬ ‫( ر‬Met‫ و‬AQ) .ا‬ ‫ا‬ ‫ا . L’étude de l’activité antioxydante par la méthode du blanchissement du βcarotène et le test du DPPH a révélé le pouvoir antioxydant des extraits polaires (AQ. tanins. Mots clés : Zizyphus lotus. où la teneur en composés phénoliques est (5.ا ط‬ .Résumé Les extraits naturels issus des végétaux contiennent une variété de molécules biologiquement actives. ce ci est confirmé par une analyse quantitative basée sur le dosage. nous avons tenté d’évaluer l’activité antimicrobienne et antioxydante des différents extraits préparés à partir du fruit du Zizyphus lotus. flavonoides.و ه ا أآ‬ ‫ا‬ ‫غ‬ ‫ات و ا‬ ‫و د ا‬ ‫آ‬ ‫ا‬ ‫ذات ا‬ ‫ا‬ ‫غ‬ ‫ات و ا‬ ‫و ا‬ ‫ب آ ا آ تا‬ ‫أ‬ ‫ا‬ ‫ا‬ ‫ا‬ ‫ا‬ ‫أن‬ ‫ا آ ت‬ ‫تا آ‬ ‫ا‬ ‫وا‬ ‫تا‬ ‫أن ا‬ ‫ت‬ ‫ا‬ ‫( و ا‬ / ‫ا‬ ‫و ام‬ 5. activité antimicrobienne. avec une activité antioxydante relative de 85. A partir de ces résultats. et (5µg EAG/mg d’extrait) pour l’extrait méthanolique. composés phénoliques.ا‬ ‫.‫ا آ ة‬ : ‫ا تا‬ ‫غ‬ ‫ات.des flavonoides et des tanins dont les extraits polaires qui sont les plus riches en ces molécules . MET) suite a une comparaison avec les extraits apolaires (ET. des composés phénoliques.ml/µg 55= 50IC ‫و‬ ‫%50.05% et une IC50 de l’ordre de 55µg/ml. coli (>45mm).8µg EAG/mg d’extrait) pour l’extrait aqueux . surtout l’extrait ethérique qui est responsable d’une grande zone d’inhibition de la souche bactérienne E. dont l’extrait aqueux représente l’extrait le plus actif. on peut dire que les extraits les plus riches en composés phénoliques sont les extraits à pouvoir antioxydant puissant. ‫تا‬ ‫ع ا‬ ‫آ ه و‬ ‫ا‬ ‫تا‬ ‫يا‬ ‫ت را‬ ‫ا آ ة‬ ‫و توا‬ ‫ا‬ ‫ا ط‬ ‫هاا ق و‬ (Zizyphus lotus) ‫ا‬ ‫ آ و‬HPLC ‫و‬ ‫تا‬ ‫ا ا‬ ‫ آ و‬CCM ‫ت ا‬ ‫ا‬ ‫ا‬ ‫ا‬ ‫ت .ا‬ ‫ا آ ة .( / ‫ا‬ ‫و ام‬ 5) ‫ا‬ ‫ت.ا آ ت ا‬ ‫و ت .Coli ‫و‬ ‫ي ا يا‬ ‫ا‬ ‫ت‬ ‫ا‬ ‫ آ‬DPPH ‫ آ رو و ا ر‬β ‫ال‬ ‫ا آ ة‬ ‫درا ا‬ ‫ط رب‬ AQ) ‫ا‬ ‫ا‬ ‫ا‬ (DCM. L’analyse qualitative de ces extraits par CCM et HPLC a révélé la présence des flavonoides et des tanins dans différents extraits . Dans ce contexte. activité antioxydante. ‫ا‬ . L’évaluation de l’activité antimicrobienne des différents extraits a révélé une puissante activité des différents extraits. DCM).8) ‫ا‬ ‫ا‬ ‫آ ا آ ت ا‬ .و‬ ‫ا‬ ‫تا‬ ‫ا‬ ‫و ت‬ ‫ا‬ ‫ا ط‬ .08 ا‬ ‫رة‬ ‫تا آ‬ ‫ه ا‬ ‫آ تا‬ ‫تا آ‬ ‫ل ه ا را ان ا‬ ‫ا ل‬ .45 mm ‫ أآ‬E.

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