ESTADO DE MATO GROSSO SECRETARIA DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DO ESTADO DE MATO GROSSO INSTITUTO DE CIÊNCIAS NATURAIS E TECNOLÓGICAS

CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE TANGARÁ DA SERRA

MICHELLE VECCHI

RELATÓRIO BACHARELADO I – LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA – CEPDA – UNEMAT, CAMPUS TANGARA DA SERRA – MT

TANGARÁ DA SERRA-MT JUNHO DE 2012

Introdução
O presente relatório descreve as atividades desenvolvidas no laboratório de Fitopatologia – CEPEDA – UNEMAT, campus Tangara da Serra – MT, que iniciou em 15 de fevereiro de 2012 e com termino em 15 de maio de 2012, com duração total de 120 horas, as quais são exigidas pelo curso de Ciências Biológicas, na disciplina de estagio supervisionado I, ministrado pelo orientador interno: Eduardo Bessa e pela orientadora Externo: Dejánia Vieira de Araújo. O estágio supervisionado I tem como objetivo proporcionar ao estagiário treinamento prático, aperfeiçoamento técnico, científico e preparar o aluno para o mercado de trabalho, pois oferece os recursos necessários para tal finalidade. No laboratório temos como rotina a esterilização de equipamentos, elaboração de meios de cultura,obtenção,identificação e isolamentos dos agentes causadores de doenças vegetais, a preservação deste para armazenamento na coleção própria do laboratório para ministrar as aulas práticas, teste de sanidadee de germinação de sementes, avaliações de incidência e controle de pragas em campo.

Metodologia
No período do estágio, foram realizadas as seguintes atividades:  Esterilização de equipamentos e elaboração de meios de cultura O laboratório de fitopatologia possui diversos materiais e equipamentos que precisam ser esterilizados para reutilização. Isso ocorre porque muitas vezes os trabalhos rotineiros são executados utilizando microrganismos e a presença deste contaminante pode alterar significativamente os resultados e inclusive invalidar os trabalhos o que acarreta em prejuízos financeiros e perda de tempo. O processo de higienização de materiais e equipamentos inclui a limpeza, desinfecção e esterilização, onde a forma de limpeza mais rotineira dos equipamentos utilizados é a autoclavagem, este método também é utilizado para a esterilização dos meios de cultura utilizados e para descarte de material contaminado com patógenos. A esterilização por calor úmido é efetuada em autoclave, que consiste em uma câmara com vapor de água saturado à pressão de 1atm acima da pressão atmosférica, com uma temperatura de ebulição da água de 121ºC. No laboratório é realizada a autoclavagem dos materiais com esterilização a 121ºC (1atm; pressão relativa) durante 15 minutos, de modo a assegurar a morte de todas as formas de vida bacterianas, incluindo a dos endósporos bacterianos, mais resistentes ao calor que as células vegetativas. Contudo, o tempo necessário para se esterilizar convenientemente os materiais, a esta temperatura, depende da natureza do material a esterilizar e/ou do seu volume. Para garantir que o equipamento mantenha-se estéril até a sua utilização, os mesmos são envolvidos ao papel alumínio. Os meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos, existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais. Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH, pressão osmótica, umidade, temperatura, atmosfera (aeróbia, microaeróbia ou anaeróbia), dentre outras. A elaboração de um meio de cultura vai depender da sua utilização, o mais elaborado no laboratório é o meio de cultura água + Agar + 2,4-D, utilizado nos testes de sanidade de sementes. Após a sua preparação deve ser submetido à esterilização, por forma a eliminar qualquer organismo vivo contaminante.

Obtenção dos fungos patogênicos Os isolados foram obtidos de varias amostras de tecidos vegetais, e acondicionadas em

saco plástico, encaminhadas ao laboratório de Fitopatologia da UNEMAT, campus de Tangará da Serra para que pudesse ser realizada a incubação e posteriormente o isolamento do patógeno.  Isolamento do patógeno No laboratório de Fitopatologia foi isolado o patógeno do tecido vegetal, mediante cortes no tecido com ou sem sintomas, submetidos á assepsia com álcool 92 % e hipoclorito há 2% por 1 minuto, os fragmentos foram transferidos para placas de Petri de acrílico de 15 cm de diâmetro contendo papel filtro umedecidos com água destilada e esterilizada e incubadas em temperatura de 24  2ºC e fotoperíodo de 12 horas, por um período de sete dias. Para a visualização das diferentes estruturas reprodutivas foram feitas com o auxilio de microscópio estereoscópico e ótico. Os isolados que apresentando estruturas típicas de patógeno foram transferidos para o meio de cultura BDA, Malte e SNA (ágar pobre em nutrientes), para purificação das culturas.  Caracterização dos patógenos Depois do processo de incubação e crescimento das estruturas do fungo do material, lâminas foram confeccionadas, sendo posteriormente levadas para o microscópio óptico para análise morfológica. A caracterização do patógeno foi realizada através de auxilio a literatura, onde constam as estruturas morfológicas dos patógenos.  Manutenção dos isolados em laboratório Os isolados obtidos através das amostras foram acondicionados em placas de 15 cm de diâmetro contendo meio BDA (Batata Dextrose Agar), sendo este meio mais utilizado para estimulação de crescimento de fungos em laboratório e o SNA (Systhetic nutriente-pooragar, ágar pobre em nutrientes) que estimula a reprodução e a produção de estruturas reprodutivas, conídios.  Preservação dos isolados Os isolados após o desenvolvimento em meio de cultura foram submetidosà preservação, tática utilizada para armazenamento do patógeno para futuras pesquisas e o uso deste em aula pratica, para os alunos que cursa a disciplina de fitopatologia.

Teste de sanidade Os testes de sanidade são realizados antes da implantação dos experimentos a campo,

onde é realizado pelo método do papel de filtro adaptado, utilizado oito repetições de 25 sementes que são dispostas em placas de petri de acrílico de 15 cm, previamente desinfetadas, contendo papel filtro devidamente esterilizado, umedecido com água destilada e estéril, acrescida de diclorofenoxiacetato de sódio (2,4-D) a 2% e cerca de 15 ml de meio PCNB (SOUSA, 2008). As placas então são incubadas a 25ºC ± 2ºC com fotoperíodo de 12 horas por sete dias para o desenvolvimento das estruturas reprodutivas dos possíveis fungos infestantes. Com o auxílio do microscópio estereoscópico é observado às sementes para identificação da microflora, e quando necessário, utiliza-se o microscópio ótico e bibliografia especializada para confirmar as estruturas de fungos desconhecidos (REIS e CASA, 1998). Após a identificação, são calculadas e tabuladas as porcentagens de sementes contaminadas por cada gênero fúngico de interesse para posteriores avaliações.  Teste de germinação O teste de germinação é um dos parâmetros da qualidade fisiológica da semente, tendo por objetivo determinar o potencial máximo de germinação de um lote, cujo valor poderá ser usado para comparar a qualidade de diferentes lotes e estimar o valor de semeadura no campo (ISTA, 1993). No laboratório os testes de germinação são feitos com quatro sub-amostras de 50 sementes, em substrato papel toalha (germitest) em forma de rolo, onde são mantidos em germinador à temperatura constante de 25ºC ± 2ºC. O volume de água utilizado para umedecer o substrato é equivalente a 2,5 vezes o peso do papel seco (BRASIL, 2009). A avaliaçãoé realizada aos sete dias após montar o teste, quantificando-se as plântulas normais, anormais e mortas em porcentagem. No momento da avaliação são separadas 10 plântulas ao acaso do teste de germinação onde estas são utilizadas para a determinação do comprimento e do peso seco da parte aérea e da raiz. Para isso é feito um corte com auxilio de estilete das plântulas para separar a parte aérea da parte radicular. Com a utilização de uma régua é obtido o tamanho da parte aérea e do sistema radicular.

O peso seco é obtido após secagem da parte aérea e radicular, de todos os tratamentos separadamente. A secagem é realizada em estufa de ventilação forçada, com temperatura de 65°C. Após 72 horas nessas condições, é feito a pesagem, em gramas, utilizando-se balança semi-analítica com precisão de três casas decimais. Todas estas variáveis são tabuladas para posteriores análises estatística.  Avaliações de incidência e controle de pragas/doenças Na área experimental o monitoramento de pragas nos casos específicos de lagartas desfolhadoras e percevejos, as amostragens foram realizadas com pano de batida, onde as plantas da área compreendida pelo pano são sacudidas vigorosamente sobre ele havendo, assim, a queda das pragas que são contadas. Repetindo-se este procedimento em vários pontos da área, considerando se como resultado a média de todos os pontos amostrados para se chegar ao nível de incidência. Não ocorreu em nenhum momento o ataque severo de pragas, no entanto realizou-se a aplicações preventivas de inseticida com baixos níveis de incidência de pragas juntamente com a aplicação de adubo foliar e na aplicação de fungicida. O monitoramento de doenças foi realizado com inspeções semanais para detecção de possível incidência, analisando se havia sintomas de alguma. Na cultura do algodão foi detectada a incidência de doenças foliares, no entanto não foi realizada nenhuma aplicação. No caso do experimento de Antracnose na soja a severidade dos sintomas da doença em questão foi obtida pela avaliação das lesões, determinando-se os graus de resistência das plantas e de virulência dos isolados testados através de uma escala de notas de severidade, onde eram avaliadas 20 plantas por parcela previamente marcadas, estas avaliações foram realizadas com frequência semanal.

Técnicas de segurança no trabalho
O comportamento no laboratório é um fator determinante na segurança e no desenvolvimento eficiente dos experimentos, o local de trabalho deve estar sempre limpo, e evitadoobjetos não utilizados ao redor e em torno dos equipamentos, os materiais devem serlimpos, antes e depois douso, como no laboratório de Fitopatologia trabalha-se commicrorganismos patogênicos, mesmo sendo somente em plantas, deve ter sempre cuidado para evitar uma possível contaminação, tendo sempre em mente as normas de segurançado laboratório.

Normas de Segurança no Laboratório       O jalecoé de uso obrigatório. Trabalhe com calma e prudência. Sempre lavar as mãos com água e sabão antes e após terminar o trabalho prático. Utilize com cuidado os equipamentos elétricos: verifique a voltagem antes de conectálos. Familiarize-se com os mecanismos de controle Não fumar, não comer e evite contato direto com as substâncias do laboratório, todas são potencialmente nocivas. Após o uso do microscópio, desligar a lâmpada, retirar a lâmina usada e limpar as objetivas com algodão embebido em xilol ou benzina e depois com um algodão seco ou flanela.    Na bancada de trabalho não deve haver acúmulo de objetos, nela permanecendo apenas osindispensáveis para o experimento em execução. Tenha cuidado com o manuseio da vidraria. Tenha cuidado com utilização de bicos de gás e chamas abertas. Não os mantenha acesos desnecessariamente e feche a torneira e o registro geral de gás ao final do trabalho.    Todo e qualquer material utilizado devem ser guardados nos suportes apropriados e não abandonados sobre a bancada detrabalho. As pipetas usadas, lâminas e lamínulas, e etc., devem ser colocados em recipientesapropriados contendo solução desinfetante ou detergente. Todo o material utilizado nos experimentos, como por exemplo, as placas de Petri e os tubos de ensaiocontendo meios de cultura ou soluções, deverão ser devidamente identificados para observaçõesposteriores.   O material contaminado nunca deve ser colocado na bancada, pia ou lixo, deve ser despejando ao recipiente próprio para ser esterilizado, e enfim descarta-lo. Terminado o trabalho prático, deixar a bancada em ordem.

Cronograma DATA 15/02 á 15/05 15/02 á 15/05 15/02 á 15/05 ATIVIDADE Isolamento de fungos Teste de germinação Caracterização de fungos CAREGA HORARIA 10 horas 5 horas 5 horas

15/02 á 15/05 Organização do laboratório 15/02 á 15/05 Limpeza de vidraria e sala de crescimento 15/02 á 15/05 Esterilização de matérias 15/02 á 15/05 Preparo de meio de cultura 15/02 á 15/05 Teste de sanidade 15/02 á 15/05 Levantamento bibliográfico 15/02 á 15/05 Repique de fungos 15/02 á 15/05 Avaliação da incidência de fungos no campo 15/02 á 15/05 Controle de pragas 15/02 á 15/05 Monitoria de aula pratica Total

11 horas 15 horas 10 horas 9 horas 5 horas 30 horas 10 horas 20 horas 7 horas 8 horas 145 horas

Sugestões
A Universidade por ser uma Instituição de ensino, formadora de profissionais qualificados para atuação na área agronômica, seria interessante estar desenvolvendo programas que proporcionem interação, com o objetivo de trazer os produtores até a Universidade para estarem buscando conhecimentos, além de esclarecer dúvidas e ao mesmo tempo trocando experiências com acadêmicos e facilitar o acesso dos acadêmicos a equipamentos de trabalho, com o intuito de ajudar na execução de atividades.

Conclusão
Para um profissional ser considerado um fitopatologista é preciso ter uma compreensão dos agentes que causam doenças em plantas, tais como fungos, bactérias, vírus, nematóides, fitoplasmas, protozoários, parasitas, e por agentes não vivos, tais como poluentes do ar, desequilíbrios de nutrientes, e vários fatores ambientais. Para tal aprendizado será possível através das matérias: botânica, microbiologia, fitotecnia, ciência do solo, ecologia, genética, bioquímica, entomologia, estatística, biologia molecular e fisiologia, que são ofertadas nos curso de Ciências Biologias ou Agronomia, sempre a procura de desenvolver novas formas inovadoras para controlar doenças de planta. O estágio realizado no laboratório de fitopatologia foi de suma importância, pois a realização do estágio faz com que o educando depare-se com climas, culturas, tecnologias e vivências desconhecidas. O fato de o acadêmico ter que desenvolver atividades práticas que antes foram vistas na teoria reforça ainda mais a certeza da compreensão na integra, assim

adquirindo maior responsabilidade, conhecimentos e acima de tudo auto-estima, para atuar neste ramo de trabalho.

Bibliografia

BRASIL. Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrária. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Regras para Análise de Sementes. Brasília, DF, 2009. 398p. BORGES. M. Análises microbiológicas de alimentos, UTFPR, Pato Branco, 2008. INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION.International Rules for Seed Testing. Seed Science & Technology, 21, Suplement, 1993. 288 p. MENEZES, M. Guia prático para fungos fitopatogênicos. 2° ed. UFRPE, Imprensa Universitária. Recife, 2004. NIRENBERG, H.I.; O’DONNELL, K.New fusarium species and combinations within the Giberellafujikuroi species complex.Mycologiav.90, p.434-458, 1998 REIS, E. M.; CASA, R. T. Patologia de sementes de cereais de inverno. Passo Fundo: Aldeia Norte, 1998. 88p. SEDIYAMA, T. et al.. Cultura da soja. II parte. Viçosa: UFV/Viçosa, 1989. 70p. SOUSA, M. V. Métodos de inoculação e efeitos de Fusariumoxysporumf. sp. Vasinfectumem sementes de algodoeiro. Tropical PlantPathology, Brasilia, v.33, n.1, p. 41-48, 2008.

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