BAB I. Pendahuluan Flavonoid adalah golongan fenol alam yang tersebar luas dalam tumbuhan.

Menurut perkiraan , kira-kira 2% dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuhan atau sekitar 1.000.000.000 ton per tahun diubah menjadi flavonoid atau senyawa yang berkaitan dengannya. Diduga flavonoid sudah ada di alam ini telah cukup lama, yang terdapat pada ganggang hijau lebih 1 milyar tahun silam. Tidak ada senyawa yang begitu menyolok seperti flavonoid yang memberi keindahan dan kesemarakan pada bunga dan buah-buahan di alam, misalnya flavin memberi warna kuning atau jingga, antosianin warna merah, ungu atau biru dan secara biologis dia memainkan peranan penting dalam proses penyerbukan pada tanaman oleh serangga. Pada mulanya para ahli tertarik pada antosian, yang merupakan pigmen tumbuhan flavonoid. Kemudian diketahui pula bahwa dalam buah-buahan, sayur-sayuran dan bijibijian mengandung berbagai jenis senyawa flavonoid. Disamping sebagai pigmen tumbuhan, flavonoid diketahui pula berperan dalam pertumbuhan, pertahanan diri dari serangan hama dan penyakit, tabir surya, dan sinyal kimia untuk berkomunikasi dengan lingkungannya. Bagi manusia golongan senyawa ini memberi manfaat yang cukup banyak seperti, antioksidan, antiinflamasi, immunostimulan, antikanker, antivirus dan antimikroba.. Tanin yang termasuk golongan senyawa ini telah lama digunakan sebagai penyamak kulit dan pewarna kain. Berbagai komoditi penting seperti teh, coklat dan anggur, mutunya sangat ditentukan oleh warna maupun rasa yang berasal dari flavonoid yang terdapat didalamnya.

Istilah flavonid yang diberikan untuk senyawa-senyawa fenol ini berasal dari kata flavon, yakni nama dari salah satu jenis flavonoid yang terbesar jumlahnya dan juga lazim ditemukan . Flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan hijau sehingga pastilah ditemukan pada setiaap telaah ekstrak tumbuhan. Oleh karena itu, para ilmuwan perlu kiranya untuk mengetahui cara mengenal, mengisolasi, dan

mengidentifikasi bahan alam tersebut dalam berbagai bentuk. I.1 Kerangka dasar Flavonoid merupakan senyawa dengan kerangka dasar mempunyai 15 atom C, dua cincin benzen yang terikat pada suatu rantai propana sehingga susunannya adalah C6 – C3 – C6. Susunan ini akan menghasilkan tiga jenis struktur, yaitu : 1,3 – diaril propane atau flavonoid, 1,2 – diaril propane atau isoflavonoid dan 1,1 – diaril propane atau neoflavonoid
C3 C3 C3 C1 C2 C1 C2 C1 C2

FLAVONOID

ISOFLAVONOID

NEOFLAVONOID

Contoh : 1. Flavonoid
OH HO O O

O

OH

O

O

OH

O

O

OCH3

FLAVON

KUERSETIN

KRANJIN

2. Isoflavonoid
HO O

OH

O HO OCH3

FEREIRIN
H3CO O

O

O

O

O O OH O CH2 O OCH3 OCH3

PTEROKARPIN

ROTENON

3. Neoflavonoid
H3CO O O O O OH HO H3CO O O O

O

DALBERGIN

BRAZILIN

KALOFILOID

Kedua cincin aromatik (benzen) yang dihubungkan oleh satuan tiga karbon dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga. Untuk memudahkan maka cincin pertama benzen diberi indeks A, cincin benzen kedua indeks B dan cincin yang dapat terbentuk cincin C
3' 2' 8 7 9 1 O 2 3 4 1' 4' 2 3' HO 4' 5' 6' O 2' OH 1 3 OH

B
6'

5'

B
6

4 5

A
6 5 10

C
O

A

Senyawa flavonoid terdiri atas beberapa jenis, bergantung dari tingkat oksidasi dari rantai propane dari sitem 1,3 diaril propane. Dalam hal ini flavan mempunyai tingkat oksidasi yang terendah sehingga senyawa ini dianggap sebagai senyawa induk dalam tatanama senyawa-senyawa turunan flavon.

O

FLAVAN I.2 Asal usul Biogenetik Spekulasi awal mengenai biosintesis flavonoid dijelaskan oleh Robinson (1936) mengatakan bahwa kerangka C6 – C3 – C6. dari flavonoid berkaitan

dengan kerangka C6 – C3 dari fenilpropana yang mempunyai gugus fungsi oksigen pada para, para dan meta atau dua meta dan satu para pada cincin aromatik. Akan tetapi, senyawa-senyawa fenilpropana, seperti asam amino fenil-

alanin dan tirosin, bukannya dianggap sebagai senyawa yang menurunkan flavonoid melainkan hanya sebagai senyawa yang bertalian belaka. Pola biosintesis flavonoid pertama kali diusulkan oleh Birch, yang menjelaskan bahwa tahap pertama biosintesis flavonoid suatu unit C6 – C3 berkombinasi dengan 3 unit C2 menghasilkan unit C6 – C3 – (C2+C2+C2). Berdasarkan atas usul tersebut maka biosintesis dari flavonoid melalui 2 jalur bisosintesis yaitu poliketida (asam asetat atau mevalonat) dalam membentuk cincin A berkondensasi 3 molekul unit asetat, sedang cincin B dan tiga atom karbon dari rantai propana berasal dari jalur fenilpropana (shikimat). Selanjutnya, sebagai akibat dari berbagai perubahan yang disebabkan oleh enzim, ketiga atom karbon dari rantai propana dapat menghasilkan berbagai gugus fungsi, seperti ikatan rangkap, gugus hidroksil, gugus karbonil dan sebagainya. Pokok-pokok biosintesis flavonoid

HO

O

HO

OH

OH

O OH

O

FLAVANON Pembentukan flavonoid dimulai dengan

KHALKON memperpanjang unit

fenilpropanoid (C6 – C3) yang berasal dari turunan sinamat seperti asam pkumarat, kadang-kadang asam kafeat, asam ferulat atau asam sinapat. Percobaan menunjukkan bahwa khalkon dan isomer flavanon yang sebanding

juga berperan sebagai senyawa antara dalam biosintesis berbagai jenis flavanoid lainnya
OH HO O HO OH [O] OH HO H O O OH O OH

OH

O

OH

O

Flavanon

Khalkon

OH HO O b Ha a HO O

OH

+OH-

+

H OH O

OH [O]

OH
+

O a OH

-H

-H+

b OH

Flavanonol

H OH

HO

O

HO OH

O

HO OH

O

OH OH O

OH

O

OH

O

Flavon

Auron

Flavonol

HO

O

H HO O O

OH

O

H

OH

O OH

Isoflavon Katekin Antosianidin

Hubungan Biogenetik Berbagai jenis Flavonoid (Grisebach)

Biosintesis Antosianidin dan Katekin (Haslam)

I.3 Fungsi flavonoid pada tumbuhan 1. Fungsi penyerbukan. Flavonoid termasuk pigmen yang penting pada tumbuhan. Warna jingga, merah, biru dan ungu pada bunga dan buah pada umumnya disebabkan oleh flavonoid. Warna pada bunga adalah salah satu faktor yang menarik lebah, kupu-kupu, burung dan hewan lainnya untuk melakukan penyerbukan. Burung akan lebih menyukai warna merah, sedang lebah lebih menyukai warna biru dan juga dapat melihat di daerah ultraviolet. 2. Fungsi pengatur tumbuh. Flavonoid secara tidak langsung berperan sebagai zat pengatur tumbuh melalui sistem IAA (Indole Acetic Acid) – IAA Oxidase. Secara in vitro, senyawa flavonoid kuersetin dapat menghambat enzim IAA – Oxidae, yang berarti kuersetin secara tidak langsung dapat meningkatkan pertumbuhan. Senyawa flavonoid dapat pula berfungsi sebagai ”feeding deterrent” maupun ”feeding stimulant”. Kandungan tanin yang tinggi pada buah muda merupakan ”feeding deterrent” yang menyebabkan kera maupun manusia tidak bernafsu untuk memakan buah sebelum masak. Sedang senyawa morin dan isokuersetrin yang terdapat dalam daun murbei (Morus alba L), merupakan ”feeding stimulant” bagi ulat sutera (Bombyx mori).

3. Zat alelopati. Dalam berinteraksi dengan lingkungannya, tumbuhan menggunakan sinyal berupa senyawa kimia.Pada tahun 1986, secara hampir bersamaan, para ahli dari berbagai laboratorium di dunia melaporkan bahwa simbiosis antara tumbuhan polong-polongan dengan bakteri marga Rhizobium dipicu oleh sinyal kimia berupa senyawa flavonoid yang dikeluarkan oleh akar tumbuhan. Sejak tahun 1982, ahli ekologi sudah mengetahui tumbuhan “Spotted knapweeds” (Centaurea maculosa Lam.) mengeluarkan senyawa alelopati yang dapat menghambat pertumbuhan tumbuhan lain di sekitarnya, baru tahun 2001 diketahui bahwa senyawa tersebut adalah (-) – katekin, suatu senyawa flavonoid golongan flavan yang sekarang diteliti untuk dikembangkan menjadi herbisida alam. 4. Tabir surya. Rusaknya ozon di lapisan stratosfir, terutama di daerah dekat Kutub Selatan, menyebabkan tumbuhan mengalami cekaman sinar ultraviolet B (UVB). Penelitian pada sejenis semanggi di Selandia Baru memperlihatkan bahwa tumbuhan tersebut mempunyai toleransi yang tinggi terhadap sinar UVB, adaptasi ini disebabkan dengan peningkatan kadar flavonoid dari tumbuhan.

BAB II. Ekstraksi dan Isolasi II.1 Ekstraksi Aglikon flavonoid adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Harus diingat, bila dibiarkan dalam larutan basa dengan oksigen banyak yang akan terurai karena mengandung banyak oksigen yang tidak tersulih atau suatu gula. Senyawa flavonoid merupakan senyawa polar, kepolaran ini akan berbeda-beda terhadap berbagai pelarut sehingga harus diperhatikan dengan menggunakan pelarut yang sesuai kepolaran flavonoid yang akan diekstraksi. Umumnya flavonoid larut dalam pelarut-pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetil sulfoksida, dimetilformamida, air dan lain-lain. Dalam bentuk glikosida karena adanya gula yang terikat pada flavonoid menyebabkan mudah larut dalam air, dan dengan demikian campuran pelarut diatas dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosidanya. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon dan flavon serta flavonol yang termodifikasi, cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform.

Bahan segar merupakan bahan awal yang ideal untuk menganalisis flavonoid, walaupun bahan yang kering dan tersimpan lama mungkin masih

tetap memberikan hasil yang baik. Bila menggunakan bahan tumbuhan segar, setelah cuplikan dipilih untuk dianalisis maka sisanya dianjurkan agar segara secepatnya dikeringkan untuk mencegah kerja dari enzim. Setelah menimbang sebagian bahan tumbuhan yang telah digiling, ekstraksi paling baik dilakukan dalam dua tahap; pertama dengan pelarut metanol-air (9 : 1) dan kedua dengan metanol-air (1 : 1). Ekstrak kemudian dicampur dan diuapkan hingga volumenya menjadi sepertiga volume awal, atau hampir semua metanol menguap. Ekstrak yang diperoleh dapat dibabaskan dari senyawa yang kepolarannya rendah seperti lemak, terpena, klorofil, xantofil dengan ekstraksi (dalam corong pisah) menggunakan pelarut heksan atau kloroform. Ekstraksi harus dilakukan beberapa kali dan lapisan air mengandung sebagian besar flavonoid, selanjutnya dikeringkan pada tekanan rendah (rotapavor). Pemilihan pelarut tidak hanya tergantung pada kandungan zat aktif yang diselidiki, tetapi tergantung juga pada bagian mana substansi tersebut berada. Bila flavonoid terdapat dalam vakuola sel, umumnya bersifat hidrofilik, maka penyarian dilakukan dengan menggunakan air ataupun pelarut-pelarut alkoholik. Jika flavonoidnya terdapat dalam kloroplas maka diperlukan pelarut-pelarut nonpolar sebelum menyarian alkoholik. Ekstraksi flavonoid seperti yang dijelaskan di atas tidak cocok untuk antosianin atau flavonoid yang kepolarannya rendah. Untuk antosian, daun segar

atau bunga jangan dikeringkan tetapi segera digerus dengan NeOH yang mengandung 1% HCl pekat. Ekstraksi segera terjadi yang ditandai dengan adanya perubahan warna larutan, kromatografi atau analisis spektroskopi ekstrak dapat segera dilakukan untu mencegah hidrolsisi glikosida. Untuk simplisia yang mengandung flavonoid dengan kepolaran yang lebih rendah lagi dapat langsung diisolasi dengan merendam heksana atau eter selama beberapa menit, perlu diingat bahwa ekstrak yang diperoleh juga mengandung lemak dan lilin. II.2 Isolasi Metode terbaik untuk mengisolasi atau memisahkan campuran flavonoid antara lain dengan kromatografi kertas (KKt) dan kromatografi lapis tipis (KLT). Jika menggunakan metode KKt, kertas yang disarankan adalah kertas Whatman 3MM (46 x 57 cm) atau yang setara. Kertas dibuat seperti gambar di bawah. Ekstrak ditotolkan kira-kira 8 cm dari tepi lipatan pertama dan 3 cm dari lipatan kedua dengan garis tengah 3 cm yang berpusat pada satu titik. Pengeringan bercak dibantu dengan pengering rambut. Ekstrak yang ditotolkan dapat digunakan secara umum yaitu dari sejumlah ekstrak yang diperoleh dari 50 – 100 mg bahan tumbuhan kering. Elusi pertama dapat digunakan pengembang beralkohol, misalnya BAA (n-Butanol, Asam asetat, Air = BAW) 4:1:5 atau TBA (t-BuOH:HOAc:H2O) 3:1:1. Kertas diangkat dan dikeringkan di lemari asam, bagian kromatogram yang dilipat (a) digunting. Selanjutnya eluen kedua menggunakan pengembang, biasanya berupa larutan dalam air seperti asam

asetat 15%. Untuk antosianin disarankan pengembang setara , biasanya BAA atau Bu/HCl dan kedua HCl 1%. Flavonoid tidak nampak pada kertas kromatogram, kecuali antosian (bercak jingga sampai lembayung yang menjadi biru dengan uap ammonia), khalkon, auron dan 6-hidroksi flavanol kuning). Karena alasan tersebut, untuk mendeteksi bercak, kromatogram diperiksa dengan sinar UV (366 nm dan 254 nm) dan dapat diperjelas dengan uap ammonia.

8 cm

3 cm

arah aliran pengembang pertama

arah aliran pengembang pertama

(a)

(b)

biarkan 5 cm

(c)

(d)

Untuk isolasi flavonoid skala besar dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoid (berupa larutan) di atas kolom yang berisi serbuk penjerap (seperti selulosa,

silika, atau poliamida), dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang sesuai. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujungnya dengan ukuran garis tengah berbanding panjang kolom 1:10 atau 1:30. Mengemas kolom dilakukan dengan hati-hati agar dihasilkan kolom yang homogen. Jika kolom tidak memiliki kaca masir, maka dapat diganakan kaca wol atau kapas, sumbat ini direndam dengan pengelusi yang tingginya kira-kira 10 cm. Kemasan kolom dibuat bubur dengan pelarut yang sama, lalu dituang dengan hati-hati ke dalam kolom tanpa terputus-putus agar tidak terbentuk lapisan. Kemasan dibiarkan turun dan kelebihan pelarut dibiarkan turun. Jika fase diam poliamida yang digunakan maka dianjurkan untuk mengembangkan dulu satu jam. Selanjutnya larutan cuplikan ditempat di atas kemasan sedemikian rupa sehingga berupa satu pita, usahakan menggunakan pelarut sesedikit mungkin untuk memperoleh hasil yang baik. Biarkan larutan cuplikan meresap ke dalam kemasan dengan membuka sedikit keran dan setelah cuplikan terbuka, keran ditutup dan ditambahkan perlahan-lahan cairan pengelusi dan dibiarkan kembali meresap ke dalam kemasan. Memilih kemasan kolom dapat disesuaikan dengan flavonoid yang akan diisolasi sebagai berikut ; 1. Selulosa. Ideal untuk pemisahan antara glikosida atau glikosida dengan aglikon dan aglikon yang kurang polar, selulosa mikrokristal (Merck, Macherey & Nagel dan Whatman CF-11

2. Silika. Baik untuk aglikon yang kurang polar, misalnya isoflavon, flavanon, metil flavon dan falavonol. Sebaiknya dicuci lebih dahulu dengan asam klorida pekat untuk menghilangkan sesepora besi yang dapat membuat flavonoid terikat kuat pada kemasan. Kiselgel 60, 70 – 230 mesh (merck).

Radas kromatografi kolom 3. Poliamida. Cocok untuk memisahkan flavonoid dan glikosida. Harus dicuci terlebih dahulu dengan matanol dan air untuk menghilangkan poliamida

yang larut (dapat mengotori). Polyclar AT General Aniline and Film Corporation), Polyponco 66D Polymer Corporation) dan Polyamida (Woelm). 4. Gel sephadex (deret G). Digunakan untuk memisahkan campuran, terutama berdasarkan atas ukuran molekul (mengunakan pelarut air), molekul besar akan terelusi lebih dahulu. Sangat berguna untuk memisahkan poliglikosida yang berbeda bobot molekulnya. Bila pengelusinya adalah pelarut organik, gel sephadex deret G berprilaku seperti selulosa, tetapi kapasitasnya lebih besar. Gel harus dikembang terlebih dahulu selama 12 jam dengan eluen. Jenis niaga G-10 (untuk bobot molekul 0 – 700) dan G-25 (untuk bobot molekul 100 – 1500) 5. Gel sephadex (LH-20). Dirancang untuk menggunakan pelarut organik, dan dapat digunakan dua cara. Bahan ini menghasilkan eluen tanpa sisa, sangat cocok untuk pemurnian akhir aglikon flavonoid dan glikosida yang telah diisolasi dari kertas, selulosa, silika, atau poliamida. Umumnya pelarut yang cocok adalah MeOH, walaupun pada awalnya diperluka air untuk melarutkan flavonoid, disini gel perlu juga dicuci dengan MeOH. II.3 Karakterisasi dan Identifikasi Secara umum golongan senyawa biasanya dapat ditentukan dengan uji warna, penentuan kelarutan, bilangan Rf dan ciri spectrum ultraviolet. Jika tidak tercampur dengan pigmen lain, flavonoid dapat dideteksi dengan uap ammonia dan akan memberikan warna spesifik untuk masin-masing golongan. Falavon dan flavonol akan memberikan warna kuning sampai kuning kemerahan. Antosianin berwarna merah biru sedang flavononol menimbulkan

warna orange atau coklat. Warna merah dan lembayung yang terjadi mendadak dalam suasana asam disebabkan adanya khalkon atau auron. Flavonoid menjadi kuning terang atau jingga dalam larutan basa dan dapat dideteksi jika bagian tumbuhan tanwarna diuapi amonia.Timbulnya warna ini karena adanya pembentukan garam dan terbentuknya struktur kuinoid pada cincin B seperti berikut :
OH O O OO O

OH-

O

O

O-

Pembentukan struktur kuinoid dari flavonoid dengan basa Adanya gugus fenol pada flavonoid memberikan reaksi positif dengan pereaksi untuk fenol, misalnya dengan besi (III) klorida dan pereaksi asam sulfat akan memberi warna spesifik. Karena reaksi tidak spesifik, maka tidak dapat digunakan membedakan masing-masing golongan dan harus diikuti oleh uji warna lainnya. Flavonoid yang memliki gugus hidroksil berkedudukan orto akan memberikan warna kuning intensif jika bereaksi dengan asam borat dan larutan natrium asetat, seperti rekasi berikut.
HO OH OH HO O HO O O B O OH

NaOAc, H3BO3 OH-

O

O

Kompleks flavonoid dengan asam borat dan natrium asetat

Selain pada kedudukan orto, gugus hidroksi dengan kedudukan lain diduga juga dapat membentuk ikatan dengan campuran asam sitrat dan asam borat, pada pemanasan dan dikenal dengan pereaksi sitroborat, Sampai saat ini mekanisme reaksi yang terjadi antara flavonoid dengan pereaksi sitroborat belum dapat diketahui secara pasti. Warna fluoresensi yang terbentuk adalah fluoresensi kuning,kuning kehijauan dengan sinar UV 366 nm. Pereaksi aluminium klorida dapat membentuk kompleks dengan flavonoid menimbulkan warna kuning. Kompleks dari flavonoiv dengan gugus hidroksil berkedudukan orto tidak stabil dengan asam dan akan terurai kembali. Akan tetapi flavonoid dengan gugus hidroksil yang berkedudukan dekat gugus karbonil akan stabil dengan penambahan asam.
Cl OH OH HO O HO O O Al O

AlCl3 HCl

O

O

Cl O Al O OH HO O AlCl3 O OH O Cl Al O Cl O Cl Al O Cl HCl HO O HO O OH OH

OH

Pembentukan kompleks antara flavonoid dengan aluminium klorida lewat dua macam gugus yang berbeda yaitu gugus hidroksil yang berkedudukan orto dan gugus hidroksil yang berkedudukan dekat dengan gugus karbonil, dapat digunakan sebagai dasar penetapan adanya gugus hidroksil pada kedudukan tertentu dalam molekul flavonoid. Lazimnya identifikasi flavonoid diawali dengan reaksi warna

menggunakan pereaksi-pereaksi, seperti natrium hidroksida, asam sulfat, besi (III) klorida, logam magnesium dan asam klorida. Kelarutan dari flavonoid menjadi dasar dalam ekstraksi dan pemisahan secara kromatografi, sifat-sifatnya dengan pereaksi-pereaksi tertentu menjadi dasar analisis spektrofotometri UVtampak.

Reaksi Warna flavonoid
Golongan Flavonoid Khalkon Dihidrokhalkon Auron Flavanon Flavon Flavanol Flavanonol Larutan natrium Hidroksida Jingga sampai merah Tak berwarna Merah/violet Kuning / jingga, dipanas merah Kuning Kuning / jingga Kuning berubah Warna Asam sulfat pekat Jingga sampai merah Tak berwarna / kuning Merah/violet Jingga Kuning / jingga berpendar Kuning / jingga berpendar Kuning / merah Magnesium/ asam klorida Tak berwarna Tak berwarna Tak berwarna Merah / atau biru violet Natrium amalgam asam Kuning pucat Tak berwarna Kuning pucat Merah Merah Kuning / merah Kuning /coklat

Kuning / merah Merah / violet Merah / violet

coklat Leukoantosianin Antosianin Antosianidin Isoflavon Isoflavanon / Kuning Biru / violet Kuning Kuning Merah / violet Kuning / jingga Kuning Kuning Violet Merah memucat Kuning Tak berwarna lalu Violet Kuning / jingga Merah violet Merah muda /

II.4 Hidrolisis Senyawa flavonoid terdapat pada semua bagian tumbuhan tinggi, seperti bunga, daun, ranting, buah, kayu, kulit, kayu dan akar. Akan tetapi, senyawa flavanoid tertentu biasanya terkonsentrasi pada suatu jaringan tertentu, misalnya antosianidin adalah zat warna dari bunga, buah dan daun. Sebagian besar flavonoid alam ditemukan dalam bentuk glikosida, oleh karena itu ada baiknya diketahui bahwa secara umum, suatu glikosida adalah kombinasi antara suatu gula dan suatu alkohol yang saling berikatan melalui ikatan glikosida. Ikatan glikosida pada prinsipnya terbentuk apabila gugus hidoksil dari alkohol beradisi ke gugus karbonil dari gula, sama seperti adisi alkohol ke aldehida yang dikatalis oleh adanya asam menghasilkan asetal.

R

R

+C
R

+

OR' C OH

R'-OH H+

R C H

H

O

R' H

OR'

+
OR'

H2O

Aldehida

Alkohol

Hemiasetal

Asetal

CH2OH OH OH OH OH O C H OH

CH2OH O OH OH R'OH H+ OH

CH2OH O OH OH OH OR'

Glukosa (rantai terbuka)

Glukosa (siklik hemiasetal)

Glukosida

Pada hidrolisis, glikosida terurai kembali atas komponen-komponennya menghasilkan gula dan alkohol yang sebanding, alkohol yang dihasilkan disebut aglikon. Biasanya, sisa gula dari glikosida flavonoid alam adalah glukosa, rhamnosa, galaktosa dan gentiobiosa, sehingga glikosida tersebut masing-

masing disebut glukosida, rhamnosida, galaktosida dan gentiobiosida. Flavonoid dapat ditemukan sebagai mono, di atau tri-glikosida, dimana satu, dua atau tiga gugus hidroksil dalam molekul flavonoid terikat oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan hanya sedikit larut dalam pelarut-pelarut organik seperti eter, benzen, kloroform dan aseton. Untuk membedakan aglikon dan gula yang terikat sebagai glikosida, perlu dilakukan hidrolisis dapat dengan asam, enzim atau basa. 1. Hidrolisis dengan asam. Biasanya digunakan dengan asam klorida, gugus gula yang terikat pada aglikon biasanya berupa ikatan O-glikosida atau C-glikosida. Ikatan C-glikosida, sangat tahan terhadap pengaruh asam, sehingga dapat dibedakan antara C-glikosida dengan O-glikosida dengan melihat waktu atau lama hidrolsisinya.

Selain kecepatan hidrolisis dengan asam dari glikosida, juga dipengaruhi oleh posisi ikatan gula pada inti flavonoid. Gula yang berikatan pada posisi 3 dari flavonoid akan lebih mudah dihidrolisis dibanding pada posisi 7, sedang paling mudah dihidrolisis adalah pada posisi 5. Flavonol 3-rhamnosifuranosida kurang stabil sehingga hidrolsis lebih cepat dibanding flavonol 3-rhamnopiranosida yang relatif lebih stabil. Cara baku menghidrolisis O-glikosida: Larutan glikosida flavonoid (1mg) dihidrolisis dengan 5 ml HCl 2N : MeOH (1:1) dalam labu alas bulat 25 ml, kemudian drefluks selama 60 menit. Uapkan dengan rotavapour, sisanya kemudian dilarutkan dengan MeOH : H2O (1:1) sesedikit mungkin. Selanjutnya dikromatografi kertas atau KLT-selulosa, 15% asam asetat, hasil : - jika telah terjadi hidrolsisi, Rf akan menjadi lebih kecil, flavonoid tersebut adalah suatu O-glikosida, kemungkinan kecil juga sebagai bisulfat atau C-glikosida yang ter-O-glikosida. - Jika tidak terjadi hidrolisis, glikosida tersebut kemungkinan adalah Cglikosida atau suatu glukoronida - Jika terjadi hidrolisis sebagian, glikosida tersebut mungkin glukuronida 2. Hidrolsis dengan enzim. Hidrolisis dengan enzim, berguna untuk menentukan sifat ikatan antara gula dan flavonoid (yaitu α atau β). cara ini

hanya memutuskan monosakarida khas dari flavonoid O-glikosida. Selanjutnya dianalisis dengan KLT, atau KGC untuk mengetahui hasil hidrolosis, β-glukosidase (emulsin), menghidrolsisi β-D-gluksodia dan xilosida, tetapi tidak menghidrolsisi antosianidin glikosida.

-

β-galaktosidase, menghidrolsisi β-D-galaktosida β-glikuronidase, menghidrolsisi β-D-glukuronidase

- Pektinase, menghidrolsis α-D-poligalakturonida dan α-L-rhamnosida - Antosianase, menghidrolsisi sebagian besar antosianidin glikosida Rhamnodiastase, memutuskan sebagian besar oligosakarida secara utuh dari glikisda, terdapat dalam Rhamnus frangula - Takadiastase, menghidrolsisi naringenin 7-O-neohesperidosida. 3. Hidrolsis dengan basa. Jarang digunakan untuk menghidrolisis gliksodia flavonoid, tetapi digunakan untuk memutuskan gula secara selektif dari gugus hidroksil pada posisi 7 atau 4’ serta 3-hidroksil. Keselektifan ini kebalikan dari hidrolisis dengan asam. Hidrolsis dengan basa akan melepaskan disakarida dari 7 – hidroksil asal ikatan antara glukosida bukan (1----2). Rutinosida akan terhidrolisis, tetapi 7-O-apiol (1----2) gluksida dan 7-O-neohesperidosida tidak terhidrolsis. Dijaga agar tidak ada kontak dengan udara, sebab banyak flavonoid akan terurai dalam suasana basa jika terdapat oksigen. Kebanyakan 7 – dan 4’ – O – gliksida dapat dipecah dalam waktu 30 enit, beberapa glikosida lain memerlukan waktu dua jam. Pemutusan gula yang terikat pada posisi 4’ secara selektif tanpa mengganggu gula yang terikat pada posisi 7. Cara: Larutan glikosida (10 – 30 mg) dalam 10 ml KOH 0,5% direfluks di atas tangas air selama 30 menit dalam lingkungan N2. Netralkan dengan HCl 2N dan selanjutnya dikromatografi kertas dengan eluen HOAc 15% untuk mengisolasi flavonoidnya.

BAB III. Spektroskopi Ultraviolet Flavonoid III.1 Spektroskopi Ultraviolet flavonoid. Flavonoid mempunyai sistem aromatik terkonyugasi, oleh karena itu mempunyai pita serapan di daerah ultraviolet dan ultraviolet nampak (UV-UV Vis). Spektra dari flavon dan flavonol memperlihatkan dua puncak utama pada daerah 240 – 400 nm. Dua puncak utama ini biasanya memperlihatkan pita I (300 – 380 nm) dan pita II (240 – 280 nm). Pita I

menunjukkan absorbsi yang sesuai untuk cincin B sinamoil, sedang pita II berhubungan absobsi cincin benzoil.

O A

B

BENZOIL

O

SINAMOIL

Kerangka senyawa flavonoid dengan cincin benzoil dan sinamoil Isoflavon, falavanon dan dihidroflavonol memberikan spektra ultraviolet yang mirip satu sama lain, oleh karena masing-masing senyawa ini tidak mempunyai sistem konyugasi sinamoil dengan cincin B. Larutan isoflavon dalam metanol memberikan spektra ultraviolet dengan puncak II pada daerah 250 nm – 270 nm dan puncak I pada daerah 300 nm – 330 nm. Sedang flavanon dan dihidroflavanon keduanya memberikan puncak II pada daerah 270 nm – 290 nm dan puncak I pada daerah 320 nm – 330 nm. Peran gugus hidroksil pada cincin A pada flavon dan flavonol menghasilkan menghasilkan pergeseran batokromik yang nyata pada pita II dan sedikit pada pita I. Metilasi dan glikosilasi juga berefek pada absorpsi pada flavon dan flavonol. Jika gugus 3, 5, dan 4’ – OH pada flavon dan flavonol termetilasi dan terglikosilasi terjadi pergeseran hipsokromik terutama pita I. Pergeseran yang terjadi terbesar 12 – 17 nm, bisa mencapai 22 – 25 nm pada flavon yang tidak mempunyai gugus 5 – OH. Pita II merupakan serapan dari cincin A bagian benzoil, dan pita I merupakan serapan dari cincin B bagian sinamoil. Intesitas dari masing-masing

serapan tergantung pada panjangnya sistem konyugasi serta adanya subtitusi terutama pada kedudukan atom C3 dan C5. Sebagai contoh senyawa flavon yang mempunyai sistem sinamoil mengandung sistem konyugasi lebih panjang daripada sistem benzoil, intensitas puncak I lebih kecil dari intensitas puncak II. Flavon, flavonol yang tersubtitusi oksigen hanya pada cincin A, dalam metanol cenderung memberikan spektra yang nyata pada pita II dan lemah pada pita I, tetapi jika cincin B yang tersubtitusi oksigen, pita I akan kelihatan lebih nyata. Penambahan pereaksi geser atau pereaksi diagnostik, adanya

hidroksilasi, glikolasi, metilasi dan asetilasi dapat mengubah karakter resapan dari senyawa flavonoid. Dengan melihat perubahan-perubahan ini maka dapat digunakan untuk memperkirakan struktur flavonoid. 1. Efek hidroksilasi. Penambahan gugus hidroksil pada cincin A pada flavon atau flavonol menghasilkan pergeseran batokromik yang nyata pada pita resapan I atau pita resapan II pada spektra flavonoid. Apabila gugus hidroksil tidak ada pada flavon atau flavonol, panjang gelombang maksimal muncul pada panjang gelombang yang lebih pendek dibanding jika ada gugus 5 – OH ,

sedang subtitusi gugus hidroksil pada posisi 3, 5 dan 4 mempunyai sedikit efek atau tidak sama sekali pada spektra UV. Pita absorpsi I isoflavon mempunyai intensitas yang lemah, sedangkan pita II intensitas kuat. Pita absirbsi II dari isoflavon biasanya antara 245 – 270 nm dan relatif tidak mempunyai efek pada cincin B dengan adanya hidroksilasi. 2. Efek natrium metoksida. Natrium metoksida merupakan basa kuat yang dapat mengiionisasi semua gugus dalam flavonoid. Degradasi atau

pengurangan kekuatan spektra setelah waktu tertentu merupakan petunjuk yang baik akan adanya gugus yang peka terhadap basa. Spektra isoflavon yang mempunyai gugus hidroksi pada cincin A akan memperlihatkan pergeseran batokromik baik pada pita I maupun pita II. Puncak pada spektra UV senyawa 3’ – 4’ dihidroksi isoflavon akan mengalami penurunan intensitas beberapa menit setelah penambahan natrium metoksida. Adanya perbedaan kecepatan

dekomposisi 4’ monohidroksi isoflavon dapat digunakan untuk menentukan bahwa dekomposisi yang berjalan cepat menunjukkan adanya 3’ – 4’ dihidroksi isoflavon. Penambahan natrium metoksida pada flavon dan flavonol dalam metanol umumnya menghasilkan pergeseran batokromik untuk semua pita serapan. Walaupnun demikian pergeseran batokromik yang besar pada serapa pita I sekitar 40 – 65 nm tanpa penurunan intensitas, menunjukkan adanya gugus 4’ – OH bebas. Dan flavonol yang tidak mempunyai gugus 4’ – OH bebas juga memberikan pergeseran pada pita serapan I, dengan penurunan intensitas. Dalam hal ini pergeseran batokromik disebabkan adanya gugus 3 – OH bebas. Jika suatu flavonol mempunyai 3 dan 4’ – OH bebas, maka spektra dengan natrium metoksida akan mengalami dekomposisi. Pengganti natrium metoksida yang baik ialah laruan NaOH 2M dalam air. 3. Efek natrium asetat. Natrium asetat merupakan basa lemah dan hanya akan mengionisasi gugus yang sifat keasamannya tinggi, khususnya untuk mendeteksi adanya gugus 7 – OH bebas. Natrium asetat hanya dapat mengionisasi isoflavon khusus pada gugus 7 – OH. Gugus 3’ atau 4’ – OH pada flavonol. Oleh sebab itu interpretasi terhadap pergeseran spektra isoflavon untuk

penambahan natrium asetat menjadi sederhana. Adanya 7 – OH isoflavon menyebabkan pergeseran batokromik 6 – 20 nm pada pita II setelah penambahan natrium asetat. Adanya natrium asetat dan asam borat akan membentuk kompleks dengan gugus orto hidroksil paa cincin B menunjukkan pergeseran batokromik pada pita serapan I sebesar 12 – 30 nm. Gugus orto hidroksil pada cincin A juga dapat dideteksi dengan efek natrium asetat dan asam borat. Adanya pergesaran batokromik sebesar 5 – 10 nm pada pita II menunjukkan adanya gugus orto hidroksi pada posisi C6 dan C7 atau C7 dan C8. 4. Efek aluminium klorida. Pereaksi ini dapat membentuk kompleks tahan asam antara gugus hidroksi dan keton yang bertetangga dan membentuk kompleks tidak tahan asam dengan gugus orto – hidroksi, perekasi ini dapat digunakan untuk mendetekasi kedua gugus tersebut. Adanya gugus 3’, 4’ – dihidroksil pada isoflavon atau flavanon dan dihidroflavonol tidak dapat dideteksi dengan AlCl3 karena cincin B mempunyai sedikit atau tidak ada konyugasi dengan kromofor utama. Jika isoflavon, flavanon (dan mungkin dihidroflavonol) mengandung gugus-gugus orto – hidroksil pada posisi 6, 7 atau 7, 8 maka

spektra AlCl3 menunjuikkan pergeseran batokromik (biasanya pada pita I maupun pita II) dengan membandingkan terhadap spektra AlCl3 / HCl. Pita serapa II spektra UV dari semua 5 – OH isoflavon dapat dideteksi dengan penambahan AlCl3 atau HCl, kecuali 2 – karboksil 5, 7 – dihidroksil isoflavon. Adanya gugus tersebut ditandai dengan pergeseran batokromik pada pita II 10 – 14 nm (relatif terhadap spektra metanol). Spektra isoflavon yang tidak mempunyai gugus 5 – OH bebas tidak berefek setelah penamabahan AlCl 3 /

HCl. Pada flavon dan flavonol, adanya gugus orto – hidroksil pada cincin B dapat diketahui jika penambahan asam terhadap spektra AlCl3 menghasilkan

pergeseran hipsokromik sebesar 30 – 40 nm pada pita I (atau pita Ia jika terdiri dari dua puncak). Dengan adanya pergeseran batokromik pada pita Ia (dalam AlCl3 / HCl) dibandingkan dengan pita I (dalam metanol) sebesar 35 – 55 nm, menunjukkan adanya 5 – OH flavon atau flavonol 3 – OH tersubtitusi.

Pereaksi Geser NaOMe

Pereaksi Geser NaOAc

Pereaksi Geser AlCl3 / HCl

HO

O

O

7 – HIDROKSIFLAVON
Data kromatografi UV------------ Fluoresensi kuning pucat UV/NH3------ Fluoresensi kuning terang Rf 0,89 (TBA), 0,29 (HOAc) Data spectra UV (λmaks nm) MeOH -------------- 252,268,307 NaOMe ------------ 266,307,359

AlCl3 ---------------- 249,307 AlCl3 / HCl -------- 251,307,358 NaOAc ------------- 275,359 NaOAc / H3BO4 -- 255 sh,270 sh,309

OH OH HO O

O

3’, 4’ - DIHIDROKSIFLAVON
Data kromatografi UV------------ Fluoresensi biru terang UV/NH3------ Fluoresensi kuning-hijau Rf 0,77 (TBA), 0,18 (HOAc) Data spectra UV (λmaks nm) MeOH -------------- 242,308sh,340

NaOMe ------------ 249sh,278sh,302,404 AlCl3 ---------------- 248sh,273sh,304,378,468sh AlCl3 / HCl -------- 242,312sh,342 NaOAc ------------- 305,348,400 NaOAc / H3BO4 – 306,365

HO

O

OH

O

KRISIN
Data kromatografi UV------------ Ungu gelap UV/NH3------ Ungu gelap Rf 0,90 (TBA), 0,16 (HOAc) Data spectra UV (λmaks nm) MeOH -------------- 247sh,268,313 NaOMe ------------ 288,263sh,277,361 AlCl3 ---------------- 252,279,330,380 AlCl3 / HCl -------- 251,280,326,381 NaOAc ------------- 275,359 NaOAc / H3BO4 – 269,315

rhamnoglusil

O

O

OH

O

3’,4’,7-TRIHIDROKSIFLAVON 7-0-RHAMNOGLUKOSIDAKRISIN
Data kromatografi UV------------ Fluoresensi biru terang UV/NH3------ Fluoresensi kuning-hijau Rf 0,26 (TBA), 0,38 (HOAc) Data spectra UV (λmaks nm) MeOH -------------- 247sh,255sh,305,341 NaOMe ------------ 293, 405 AlCl3 ---------------- 244sh,258sh,306,380 AlCl3 / HCl -------- 247sh,257sh,306,341 NaOAc ------------- 275sh,299,350,401 NaOAc / H3BO4 – 257sh,365

HO

O

HO OH O

BAIKALEIN
Data kromatografi UV------------ Ungu gelap UV/NH3------ Ungu gelap Rf 0,78 (TBA), 0,19 (HOAc) Data spectra UV (λmaks nm) MeOH -------------- 247sh,274,323 NaOMe ------------ 257,366,410sh(dec) AlCl3 ---------------- 247,272,284sh,375 AlCl3 / HCl -------- 255sh,282,292sh,346 NaOAc ------------- 257,360,405sh(dec) NaOAc / H3BO4 – 262sh,277,333

OH OH HO O

HO OH O

LUTEOLIN
Data kromatografi UV------------ Ungu gelap UV/NH3------ Kuning Rf 0,77 (TBA), 0,08 (HOAc) Data spectra UV (λmaks nm) MeOH -------------- 242sh,253,267,291sh,349 NaOMe ------------ 266sh,329sh,401 AlCl3 ---------------- 274,300sh,328,426 AlCl3 / HCl -------- 266sh,275,294,sh,355,385 NaOAc ------------- 269,326sh,384 NaOAc / H3BO4 – 259,301sh,370,430sh

OCH3 OH HO O

HO OH O

KRISOERIOL
Data kromatografi UV------------ Ungu gelap UV/NH3------ Kuning-HIJAU Rf 0,80 (TBA), 0,05 (HOAc) Data spectra UV (λmaks nm) MeOH -------------- 241,249SH,269,347 NaOMe ------------ 254,275SH,329SH,405 AlCl3 ---------------- 262,274,296,366sh,390 AlCl3 / HCl -------- 259,276,294,353,386 NaOAc ------------- 271,321,396 NaOAc / H3BO4 – 268,349

Penafsiran spektrum UV dengan penambahan NaOMe (Karkham, 1988)
Jenis flavonoid Flavon Flavonol Pergeseran yang tampak Pita I Kekuatan penguraian) Mantap + 45 sampai 65 nm Kekuatan menurun Mantap + 45 sampai 65 nm Kekuatan menurun Pita baru (bandingkan dengan MeOH), 320 – 325 nm Isoflavon Flavanon Dihidroflavonol Tak ada pergeseran Kekuatan menurun dengan berjalannya waktu Bergeser dari k.280 nm ke k.325 nm, kekuatan naik Khakon Auron tetapi ke 330-340 nm +80 sampai 95 nm (kekuatan naik) + 60 sampai 70 nm 6–OH tanpa oksigenasi pada 4’ Tak ada OH pada cincin A O–diOH pada cincin (penurunan lambat: A Pita II menurun terus (artinya Petunjuk penafsiran 3,4’-OH,O –diOH pada cincin A; pada cincin B 3-OH yang berdampingan 4’-OH 3–OH. Tak ada 4’–OH bebas 7–OH

O –diOH

pada cincin B isoflavon) Falvanon dan dihidroflavonol dengan 5, 7–OH 7–OH, tanpa 5-OH bebas 4’–OH (auron)

(kekuatan naik) Pergeseran lebih kecil + 60 sampai 100 nm (kekuatan naik) (tanpa kenaikan kekuatan) + 40 sampai 50 nm Antosianidin Antosianin Semuanya terurai kecuali 3-

(auron) 6–OH dengan oksigenasi pada 4’ (auron) 4 – OH (khalkon) 2–OH atau 4’–OH dan tapa 4–OH 4’–OH (2’–OH atau 4–OR juga ada) Nihil

deoksiantosianidin

Penafsiran spektrum UV dengan penambahan NaOAc (Karkham, 1988)
Jenis flavonoid Flavon Flavonol Isoflavonol Pergeseran yang tampak Pita I Pita II + 5 sampai 20 nm (berkurang bila ada oksigenasi pada 6 atau 8) Kekuatan berkurang dengan bertambahnya waktu Mantap + 45 sampai 65 nm Kekuatan menurun Pita baru (bandingkan dengan MeOH), 320 – 325 nm Flavanon Dihidroflavonol +35 nm +60nm Kekuatan berkurang dengan bertanbahnya waktu Pergeseran batokromik atau bahu pada panjang gelombang yang lebih panjang 7-OH (dengan 5-OH) 7-OH (dengan tanpa 5-OH) Gugus yang peka terhadap basa, mis.67 atau 7,8-diOH 4’ dan / atau 4-OH (khalkon) 4’ dan / atau 6-OH (auron) Gugus yang peka terhadap basa, mis. 6,7 atau 7,8 atau 3,4’-diOH 3–OH. Tak ada 4’–OH bebas 7–OH 7-OH Petunjuk penafsiran

Khakon Auron

Penafsiran spektrum UV dengan NaOAc / H3 BO3 (Karkham, 1988)
Jenis flavonoid Pergeseran yang tampak Pita I Pita II Petunjuk penafsiran

Flavon Flavonol Auron Khalkon Isoflavon Flavanon Dihidroflavonol

+12 21mpai 36 nm (nisbi terhadap spektrum MeOH) Pergeseran lebih kecil

O-diOH pada cincin B

O-diOH pada cincin A (6,7 atau +10 sampai 15 nm (nisbi terhadap spektrum MeOH) 7,8) O-diOH pada cincin A (6,7 atau 7,8)

Penafsiran spektrum UV dengan penambahan AlCl3 dan AlCl3 /HCl (Markham, 1988)
Jenis flavonoid Flavon dan Flavonol (AlCl3 / HCl) Tak berubah (AlCl3) +50 sampai 60 nm Pergeseran AlCl3 / HCl Tambah 30 sampai 40 nm Pergeseran AlCl3 / HCl Tambah 20 sampai 25 nm Isoflavon, Flavanon, dan Dihidroflavonol (AlCl3 / HCl) (AlCl3) + 20 sampai 26 nm Pergeseran AlCl3 / HCl, tambah 11 sampai 30 nm Pergeseran AlCl3 / HCl, tambah 30 sampai 38 nm Auron Khalkon (AlCl3 / HCl) (AlCl3) (peka terhadap NaOAc) +48 sampai 64 nm + 40 nm +60 sampai 70 nm Pergeseran AlCl3 / HCl Tambah 40 sampai 70 nm Penambahan lebih kecil 5-OH (flavon, dihidroflavonol O-diOH pada cincin A (6,7 dan 7,8) Dihidroflavonol (tambahan tanpa 5-OH +10 sampai 14 nm Pergeseran yang tampak Pita I +35 sampai 55 nm +17 sampai 20 nm Pita II 5-OH 5-OH denganm gugus oksigenasi pada 6 Mungkin 5-OH dengan gugus prenil pada 6 Mungkin 3-OH (dengan atau Petunjuk penafsiran

tanpa 5-OH) O-diOH pada cincin B O-diOH pada cincin A (tambahan Pada pergeseran O-diOH pada cincin B) 5-OH (isoflavon)

pada

sembarang

pergeseran O-diOH) 2’-OH (khalkon) 2’-OH (khalkon) dengan oksigenasi pada 3’ 4-OH (auron) O-diOH pada cincin B Mungkin O-diOH pada cincin A

Antosianidin Antosianin (AlCl3)

+25 sampai 35 nm (pada pH 2-4) Pergeseran lebih besar

O-diOH Banyak O-diOH atau O-diOH (3deoksi antosianidin)

III.2 Penetapan kadar flavonoid Prinsip kerja: Flavonoid ditetapkan kadarnya sebagai aglikon dengan terlebih dahulu dilakukan hidrolsisi dan selanjutnya dilakukan pengukuran spektrometri dengan pereaksi geser AlCl3 dengan penambahan

heksametilentetramina pada panjang gelombang maksimum. Cara kerja : Sejumlah ekstrak yang setara dengan 200 mg simplisia dimasukkan ke dalam labu alas bulat. Tambahkan 1.0 ml larutan 0,5% b/v heksametilentetramina, 20.0 ml aseton dan 2.0 ml larutan 25% HCl dalam air. Refluks selama 30 menit. Campuran hasil hidrolisis disaring menggunakan kapas ke dalam labu tentukur 100 ml, ditambah 20 ml aseton, didihkan sebentar, lakukan dua kali dan filtrat dikumpulkan, cukupkan volumenya hingga 100.0 ml, kocok hingga rata. 20 ml filtrat dimasukkan dalam corong pisah dan ditambahkan 20 H2O, selanjutnya diekstraksi aglikon pertama dengan 15 ml etil asetat.

Kemudian dua kali dengan 10 ml etil asetat, lapisan etil asetat dikumpulkan ke dalam labu tentukur 50.0 ml, cukupkan volume hingga 50.0 ml. Lakukan pengukukuran spektrometri. Spektrometri : Sebanyak 10 ml larutan fraksi etil asetat ke dalam labu tentukur 25.0 ml, tambah 1 ml larutan 2 g AlCl3 dalam 100 ml larutan asam asetat glasial 5% dalam metanol. Tambahkan secukupnya larutan asam asetat glasial 5% v/v dalam metanol hingga 25.0 ml. Hasil reaksi siap diukur pada panjang gelombang maksimum. Perhitungan kadar menggunakan bahan standar

glikosida flavonoid (hipetoksida, rutin, hesperidin), gunakan kurva baku dan nilai kadar dihitung sebagai bahan standar tersebut.

SKEMA PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL
Sampel ekstrak
Setara dengan 200 mg simplisia

+ 1.0 ml lar 0,5% b/v heksametilentetramin + 20.0 ml aseton + 2.0 ml lar HCl 25% - Refluks selama 30’ - Saring menggunakan kapas

Ampas
+ 20 ml aseton - Didihkan sebentar - Perlakuan 2x

Labu ukur 100 ml

Ad kan dengan

Ampas

Filtrat 20 ml - Masuk ke dalam corong pisah + 20 ml H2O kocok dengan - 15 ml etil asetat - 2 x 10 ml etil asetat Lapisan air Filtrat campur
Dalam labu ukur 50 ml Adkan dengan etil asetat

50 ml larutan etil asetat

- Pipet 10 ml, masuk dalam labu ukur 25 ml - + 1 ml AlCl3 2% dalam asam asetat galsial 5% v/v - ad volume dengan asam asetat glacial 5% v/v dalam metanol - Diamkan 30’ - Ukur panjang gelombang maksimum - Buat kurva baku untuk memperoleh persamaan

garis linier dan bandingkan dengan sampel

Y = b + aX
Contoh : 1. Pembuatan larutan baku Rutin ditimbang secara saksama sebanyak 0,0113 g, dimasukkan ke dalam labutentukur 10 ml dan diencerkan dengan etanol 96% hingga tanda digunakan sebagai larutan stok. Selanjutnya dibuat berbagai konsentrasi dengan 0,2 ml AlCl3 dan asam asetat glasial masing-masing; a. 2 ml larutan stok rutin (0,113% b/v) diencerkan dalam labutentukur 10 ml dengan 0,2 ml AlCl3 dan asam asetat glasial hingga tanda (0,0226%) b. 1 ml larutan rutin 0,0226 % b/v) diencerkan dalam labutentukur 5ml dengan 0,2 ml AlCl3 dan asam asetat glasial hingga tanda (0,00452%) c. 3 ml larutan rutin 0,0226 % b/v) diencerkan dalam labutentukur 5ml dengan 0,2 ml AlCl3 dan asam asetat glasial hingga tanda (0,00678%) d. 2 ml larutan rutin 0,0226 % b/v) diencerkan dalam labutentukur 5ml dengan 0,2 ml AlCl3 dan asam asetat glasial hingga tanda (0,00904%) e. 3 ml larutan rutin 0,0226 % b/v) diencerkan dalam labutentukur 5ml dengan 0,2 ml AlCl3 dan asam asetat glasial hingga tanda (0,01356%) Ukur absorban spektrokooi UV. 2. Penetapan kadar flavonoid total Sebanyak 50 mg ekstrak daun paliasa, dimasukkan ke dalam labu alas bukat. Tambahkan heksamin 126,5 mg, 20 ml aseton dan 2.0 ml HCl,

kemudian direfluks selama 30 menit, dinginkan. Selanjutnya disaring dengan kapas ke dalam labutentukur 100 ml, ampas dicuci dua kali, setiap kali dengan 20 ml aseton dan didihkan sebentar. Filtratnya dimasukkan ke dalam labutentukur yang berisi filtrat pertama, cukupkan volumenya dengan aseton. Pipet 20 ml larutan dan masukka ke dalam corong pisah dan ditambah dengan 20 ml air serta 15 ml etilasetat, dikocok beberapa saat. Lapisan etil asetat (lapisan atas) ditampung ke dalam labutentukur 50 ml, lapisan bawah dikocok kembali sebanyak dua kali masing-masing dengan 10 ml etil asetat. Lapisan etil asetat dipisahkan dimasukkan ke dalam labutentukur yang telash berisi lapisan utama, cukupkan volumenya hingga tanda dengan etil asetat. Pipet dengan pipet volume sebanya 4 ml, masukkan dalam labutentukur 5 ml, tambahkan 0,2 ml AlCl3 dan asam asetat glasial hingga tanda, ukur absorban. Perhitungan Persamaan garis regresi linier dari kurva baku Y = 227,54 X + 0,0976 Y – 0,0976 X= 227,54 Jika absorban 0,330 nm, maka kadar flavonoid : 0,330 – 0,0976 X= 227,54 Kadar flavonoid total dalam 4 ml = 5 / 4 x 0,001021359 % = 0,001021359 %

= 0,001276699 % = 0,01276699 mg/ml Berat flavonoid total dalam 50 ml larutan etil asetat : = 50 ml x 0,01276699 mg/ml = 0,6383495 mg ~ 20 ml filtrat aseton Berat flavonoid total dari ekstrak yang dihidrolisis = 100 / 20 x 0,6383495 mg = 3,1917474 mg Jadi kadar flavonoid dalam ekstrak daun paliasa : = 3,1917474 mg / 101 mg x 100 % = 3,16 %

Spektrogram UV rutin dalam metanol

Spektrogram UV rutin + pereaksi Aluminium klorida dalam metanol

Spektrogram UV rutin + pereaksi aluminium klorida, Asam klorida dalam metanol

Kurva baku rutin dan absorbansi ekstrak daun paliasa

DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1986, Merck Index, Eighth Edition, Merck & CO,Inc,Rahway, M.J.,U.S.A Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. 1986, Sediaan Galenik. Departemen Kesehatan R.I. Jakarta Direktorat Pengawasan Obat Tradisonal, 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Departemen Kesehatan RI., Cetakan Pertama, Jakarta Gandjar,I.G., 1991, Kimia Analisis Instrumental , Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, 18 – 19 Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia, Penentuan Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Terbitan Kedua. Penerbit ITB, Bandung, 4-15, 47-89, 69-100 Harborne, J.B., Mabry, T.J., 1975, The Flavonoids, Chapman and Hall, London. Heyne, K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid I – IV. Terjemahan oleh Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan. Yayasan Sarana Warna Jaya, Jakarta. Ikan, R,. 1976. Natural Products. A Laboratory Guide. Second Printing. Academic Press, Jerusalem. Mabry, T.J., et.al., 1970, The Systematic Identification of Flavonoid, Springer Verlag, New York-Heidelberg Berlin, 3 -35, 165 – 171 Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung, 1 – 65 Pramono, S., 1989, Pemisahan Flavonoid, Fakultas Pasca Sarjana, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, 1 – 19 Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, diterjemahkan oleh Sarjono Kisman dab Slamet Ibrahim, Cetakan II, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta, 345 – 347 Samuelsson, G. 1999. Drug of Natural Origin. A Textbook of Pharmacognosy, 4th resived edition. Sweden, 46-47

Sastrohamidjojo, H., 1991, Spektroskopi, Edisi kedua, Penerbit Liberty, Yogyakarta, 1 – 11, 13 – 25 Untoro, P., 1990, Pemeriksaan Kandungan Flavonoid Eriobotrya japonic, Disertasi, ITB, Bandung, 15 World Heath Organization, 1998, Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials, Geneva

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful