57

Kết quả và biện luận

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP CÁC CHỦNG SINH LIPASE NGOẠI BÀO
Sau khi tiến hành phân lập và làm thuần, các chủng vi sinh vật có khả năng
sinh lipase ngoại bào được đặt tên như trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Các chủng vi sinh vật sinh lipase ngoại bào thu nhận được
Địa điểm
S_Q3 (mẫu đất tại
Trung tâm Kỹ thuật 3)

Vi khuẩn

Nấm men

Nấm mốc

S_Q3_B1

S_Q3_M1

S_Q3_B2

S_Q3_M2
S_Q3_M3
S_LT_M1

S_LT_B1

S_LT_M2

S_LT (mẫu đất tại
Linh Trung, Thủ Đức)

S_LT_M3
S_LT_M4

S_Q9 (mẫu đất tại
Khu công nghệ cao
Q.9)

S_Q9_B1

S_Q9_M1

S_Q9_B2

S_Q9_M2
S_Q9_M3
S_Q9_M4
S_Q9_M5

S_CT (mẫu đất tại
Cát Tiên)

S_CT_B1

S_CT_M1

S_CT_B2

S_CT_M2

S_CT_B3

S_CT_M3
S_CT_M4

W_TN (mẫu nước
thải của nhà máy sữa
Thống Nhất)
W_HD (mẫu nước
thải của công ty Hào
Dương)

W_TN_B1
W_TN_B2
W_TN_B3
W_TN_B4
W_HD_B1
W_HD_B2

W_TN_Y1

58

Địa điểm

Vi khuẩn

W_KD (mẫu nước
thải của công ty Kinh
Đô)

W_KD_B1

W_TT (mẫu nước
thải của nhà máy sữa
Trường Thọ)

Kết quả và biện luận

Nấm men

Nấm mốc

W_KD_B2
W_KD_B3
W_TT_B1

W_TT_Y1

W_TT_B2

W_TT_Y2

W_TT_B3

W_TT_Y3

W_TT_B4
W_TT_B5
W_TT_B6
W_TT_B7

W_TB (mẫu nước
thải của công ty dầu
thực vật Tân Bình)

W_Q9 (mẫu nước
thải sinh hoạt tại Suối
Cái, Q.9)

W_TB_B1
W_TB_B2
W_TB_B3
W_TB_B4
W_Q9_B1

W_Q9_Y1

W_Q9_B2
W_Q9_B3
W_Q9_B4

Nhận xét: đã phân lập được 53 chủng vi sinh vật có khả năng sinh lipase
ngoại bào, trong đó có 32 chủng vi khuẩn, 5 chủng nấm men và 16 chủng nấm mốc.
Vi khuẩn sinh lipase ngoại bào được phát hiện cả trong đất (8 chủng) và trong nước
thải (24 chủng), tuy nhiên nấm men chỉ phát hiện có trong nước thải và nấm mốc
chỉ phát hiện có trong đất.

59

Kết quả và biện luận

Vi khuẩn W_TT_B3 sau khi phân lập và

Vi sinh vật sinh lipase ngoại bào

làm thuần

Nấm men W_TN_Y1 sau khi phân lập

Nấm mốc S_Q9_M4 sau khi phân lập

và làm thuần

và làm thuần

Hình 3.1: Hình ảnh một số chủng vi sinh vật sinh lipase ngoại bào trên môi trường
phân lập
3.2. HOẠT TÍNH LIPASE NGOẠI BÀO CÁC CHỦNG THU ĐƯỢC
Để tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh lipase ngoại bào với hoạt tính cao
nhằm phục vụ cho các thí nghiệm kế tiếp, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính
lipase ngoại bào của các chủng vi sinh vật phân lập được, theo phương pháp định
phân tổng lượng acid béo được phóng thích ra môi trường với cơ chất là dầu olive
được nhũ hóa.

60

Kết quả và biện luận

Khi tiến hành xác định hoạt tính lipase ngoại bào của các chủng vi sinh vật
phân lập được, chế phẩm enzyme sau khi thu nhận được hòa tan với 5 mL nước cất
tiệt trùng. Như vậy hoạt tính chung của enzyme được tính theo đơn vị UI/mL và
được nhân với 5 mL để tính tổng hoạt tính (UI) của từng loại chế phẩm enzyme thu
được.
Kết quả xác định hoạt tính lipase ngoại bào của các chủng thu nhận được
trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Hoạt tính lipase ngoại bào các chủng vi sinh vật phân lập được
STT

Chủng vi sinh vật

Hoạt tính chung

Tổng hoạt tính

(UI/mL)

(UI)

Các chủng vi khuẩn
1

S_Q3_B1

2,45

12,25

2

S_Q3_B2

1,31

6,53

3

S_LT_B1

1,96

9,80

4

S_Q9_B1

3,43

17,15

5

S_Q9_B2

3,10

15,52

6

S_CT_B1

4,74

23,68

7

S_CT_B2

13,56

67,78

8

S_CT_B3

5,39

26,95

9

W_HD_B1

3,92

19,60

10

W_HD_B2

1,63

8,17

11

W_KD_B1

1,27

6,33

12

W_KD_B2

3,01

15,04

13

W_KD_B3

3,48

17,42

14

W_TN_B1

12,03

60,17

15

W_TN_B2

3,17

15,83

16

W_TN_B3

2,06

10,29

17

W_TN_B4

2,53

12,67

61

STT

Chủng vi sinh vật

Kết quả và biện luận

Hoạt tính chung

Tổng hoạt tính

(UI/mL)

(UI)

18

W_TT_B1

3,32

16,62

19

W_TT_B2

5,23

26,13

20

W_TT_B3

9,03

45,13

21

W_TT_B4

3,83

19,17

22

W_TT_B5

4,14

20,70

23

W_TT_B6

2,91

14,57

24

W_TT_B7

2,15

10,73

25

W_TB_B1

2,61

13,03

26

W_TB_B2

11,35

56,73

27

W_TB_B3

4,45

22,23

28

W_TB_B4

2,76

13,80

29

W_Q9_B1

3,68

18,40

30

W_Q9_B2

1,99

9,97

31

W_Q9_B3

1,86

9,30

32

W_Q9_B4

3,26

16,28

Các chủng nấm men
33

W_TN_Y1

6,05

30,23

34

W_TT_Y1

4,03

20,15

35

W_TT_Y2

4,81

24,03

36

W_TT_Y3

4,50

22,48

37

W_Q9_Y1

15,04

75,18

Các chủng nấm mốc
38

S_Q3_M1

5,27

26,35

39

S_Q3_M2

11,16

55,80

40

S_Q3_M3

3,88

19,38

41

S_LT_M1

6,24

31,20

62

STT

Chủng vi sinh vật

Kết quả và biện luận

Hoạt tính chung

Tổng hoạt tính

(UI/mL)

(UI)

42

S_LT_M2

4,64

23,20

43

S_LT_M3

4,96

24,80

44

S_LT_M4

5,44

27,20

45

S_Q9_M1

3,84

19,20

46

S_Q9_M2

3,20

16,00

47

S_Q9_M3

4,32

21,60

48

S_Q9_M4

6,72

33,60

49

S_Q9_M5

6,40

32,00

50

S_CT_M1

4,00

20,00

51

S_CT_M2

5,28

26,40

52

S_CT_M3

4,48

22,40

53

S_CT_M4

2,72

13,60

Kết quả trên là nền tảng cho chúng tôi chọn lựa các chủng vi sinh vật cho các
thí nghiệm kế tiếp, qua đó chúng tôi xác định:
¾ Chọn 3 chủng vi khuẩn (S_CT_B2, W_TN_B1 và W_TB_B2), 1 chủng
nấm men (W_Q9_Y1) và 1 chủng nấm mốc (S_Q3_M2) là những chủng
vi sinh vật được xác định sinh lipase ngoại bào với hoạt tính cao hơn so
với các chủng vi sinh vật khác phân lập được, để tiến hành định danh.
¾ Chọn 2 chủng đại diện cho 2 nhóm vi sinh vật: chủng S_CT_B2 đại diện
cho nhóm vi khuẩn và chủng W_Q9_Y1 đại diện cho nhóm nấm, để tiến
hành thí nghiệm khảo sát các yếu tố môi trường cảm ứng sinh tổng hợp
lipase ngoại bào và khảo sát một số điều kiện hoạt động của lipase thu
nhận được.

63

Chủng vi khuẩn S_CT_B2

Kết quả và biện luận

Chủng vi khuẩn W_TN_B1 Chủng vi khuẩn W_TB_B2

Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy ở 370C/ 3 ngày

Chủng nấm men W_Q9_Y1

Chủng nấm mốc S_Q3_M2

Chủng nấm men được nuôi cấy ở 370C/ 5 ngày và chủng nấm mốc được nuôi cấy ở
250C/ 5 ngày
Hình 3.2: Các chủng vi sinh vật sinh lipase trên môi trường phân lập

64

Kết quả và biện luận

3.3. ĐỊNH DANH VI KHUẨN
3.3.1. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn
Để định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống, chúng ta cần xác
định các đặc điểm về hình thái của vi khuẩn cũng như các đặc tính sinh lý, sinh hóa.
Dựa vào khóa phân loại định danh prokarytote là khóa phân loại Bergey’s (Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology), ta có thể định danh các chủng vi khuẩn thu
nhận.
Kết quả khảo sát các đặc điểm hình thái và sinh lý của 3 chủng S_CT_B2,
W_TN_B1 và W_TB_B2 được thể hiện trong Bảng 3.3 và Hình 3.3.
Bảng 3.3: Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng S_CT_B2, W_TN_B1 và
W_TB_B2
Chủng
S_CT_B2

Chủng
W_TN_B1

Chủng
W_TB_B2

(2 – 3) mm

(2 – 5) mm

(1,5 – 3) mm

Đặc điểm khuẩn
lạc

Tròn, lồi,
nhẵn, có màu
trắng đục

Hình dạng
bất định, lồi

Tròn, lồi, nhăn
nheo

Kích thước tế
bào

(0,5-1,5) x
(1,5-4,0) µm

(0,5–1,0) ×
(2,0–3,5) μm

(0,5-1,5) x
(1,5-3,0) µm

Hình que

Hình que

Hình que

Khả năng di
động

Gram
pH thích hợp


6,8 ± 0,3

+
6,8 ± 0,3


6,8 ± 0,3

35 0C
Hiếu khí hoàn
toàn

35 0C
Hiếu khí tuỳ
ý

35 0C

Đặc điểm
Đường kính
khuẩn lạc

Hình dạng tế bào

Nhiệt độ
Quan hệ với oxy

Hiếu khí tuỳ ý

65

Kết quả và biện luận

Chủng S_CT_B2

Chủng W_TN_B1

Chủng W_TB_B2
Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc của 3 chủng vi khuẩn trên môi trường TSA sau 1
ngày nuôi cấy và hình thái tế bào của 3 chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang
học, độ phóng đại 1500 lần

66

Kết quả và biện luận

™ Xác định đường cong tăng trưởng:
Sau 42 giờ nuôi cấy, cứ sau mỗi 2 giờ ghi nhận sự tăng sinh của chủng
vi khuẩn thông qua giá trị OD và dựa vào đường tuyến tính giữa giá trị OD và
mật độ tế bào chúng tôi thu được các số liệu về sự gia tăng mật độ tế bào trung
bình theo thời gian. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.4; 3.5; 3.6 và Đồ thị
3.1; 3.2; 3.3.
¾ Đường cong tăng trưởng của chủng S_CT_B2
Bảng 3.4: Sự gia tăng mật độ tế bào theo thời gian của chủng S_CT_B2, kết quả là
giá trị trung bình cộng của ba lần lặp lại.
Thời gian (h)
Log(N/ml)
Thời gian (h)
Log(N/ml)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

2,18

2,20

2,26

2,36

2,43

2,46

3,08

3,18

3,81

4,79

5,86

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

42

6,71

7,41

7,84

7,80

7,76

7,41

7,46

7,20

6,99

6,98

6,96

8.0

log (N/mL)

7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0

h
0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

40

Đồ thị 3.1: Đường cong tăng trưởng của chủng S_CT_B2

44

67

Kết quả và biện luận

¾ Đường cong tăng trưởng của chủng W_TN_B1
Bảng 3.5: Sự gia tăng mật độ tế bào theo thời gian của chủng W_TN_B1, kết quả là
giá trị trung bình cộng của ba lần lặp lại.
Thời gian (h)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Log(N/ml)

2,30

2,34

2,41

2,49

2,54

2,67

3,04

3,20

4,32

5,32

6,51

Thời gian (h)

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

42

Log(N/ml)

7,26

7,84

7,98

7,86

7,72

7,68

7,53

7,58

7,49

7,32

7,30

8.0

log (N/mL)

7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0

h
0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

Đồ thị 3.2: Đường cong tăng trưởng của chủng W_TN_B1

40

44

68

Kết quả và biện luận

¾ Đường cong tăng trưởng chủng W_TB_B2
Bảng 3.6: Sự gia tăng mật độ tế bào theo thời gian của chủng W_TB_B2, kết quả là
giá trị trung bình cộng của ba lần lặp lại
Thời gian (h)

0

Log(N/ml)

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

2,18 2,20 2,28 2,34 2,36 2,41 2,67 3,38 3,98 4,97 5,97

Thời gian (h)

22

Log(N/ml)

24

26

28

30

32

34

36

38

40

42

6,92 7,38 7,67 7,58 7,38 7,30 6,97 6,91 6,78 6,84 6,83

8.0

log (N/mL)

7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0

h
0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

40

44

Đồ thị 3.3: Đường cong tăng trưởng của chủng W_TB_B2
Như vậy, tốc độ phát triển của cả 3 chủng tương đối giống nhau, sau 12
giờ đến 16 giờ cả 3 chủng đã vào pha tăng trưởng và đạt tối ưu ở giờ nuôi thứ 28
đến 32. Như vậy, dựa vào đường cong tăng trưởng của 3 chủng vi khuẩn, chúng
tôi đã xác định được thời gian thích hợp để thu nhận sinh khối tế bào là từ 12
đến 32 giờ sau nuôi cấy.

69

Kết quả và biện luận

Các đặc điểm sinh hóa và khả năng sử dụng nguồn carbon ở 3 chủng
được trình bày trong Bảng 3.7:
Bảng 3.7: Đặc điểm sinh hóa của 3 chủng S_CT_B2, W_TN_B1 và W_TB_B2
Đặc tính
Catalase
Oxidase
Esculin
Citrate
Malonate
ADH
ODC
LDC
Urease
Gelatinase
H2S
Indol
TSI
+ Lactose/sucrose
+ Glucose
+ Gas
+ H2S
Nitrate
ONPG
MR
VP
Lên men các nguồn carbon
D-Glucose
D-Galactose
D-Maltose
D-Raffinose
D-Lactose
Sucrose
D-Trehalose
Đồng hóa các nguồn carbon
L-Arabinose
D-Cellobiose
Dulcitol
D-Galactose
Myo-Inositol
D-Maltose
D-Mannitol
D-Mannose
D-Raffinose
L-Rhamnose
Sucrose
D-Xylose

S_CT_B2
+
+

+
+
+



+


K/N




+


Chủng vi khuẩn
W_TN_B1
W_TB_B2
+
+
N/A
+
+
+
+
+
+

+
+






+
+




A/A
A/A
+
+
+
+




+
+
+

N/A

+



+



+

+

+


+
+
+





+

+
+

+
+

+
+

+

+
+
+
+

+
+

+
+

+

+
+
+
+

+
+

70

Đặc tính

S_CT_B2
D-Lactose

D-Glucose
+
D-Fructose
+
D-Sorbitol

D-Trehalose

Glycerol
+
+: có sử dụng;
–: không sử dụng
K/N: kiềm/ trung tính ở thạch nghiên.

Kết quả và biện luận

Chủng vi khuẩn
W_TN_B1
W_TB_B2
+

+
+
+

+





N/A: không áp dụng
K/A: kiềm/ acid ở thạch

nghiên

Từ các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập
được, dựa vào khóa phân loại Bergey’s chúng tôi có kết quả ghi nhận như sau:
¾ Chủng S_CT_B2 là vi khuẩn Gram âm, hình que, hiếu khí bắt buộc, có khả
năng di động, nhiệt độ thích hợp 35 0C, pH 6,8, tế bào có kích thước (0,51,0) x (1-5) µm và có các đặc điểm sinh hóa, biến dưỡng tương đồng với chi
Pseudomonas.
¾ Chủng W_TN_B1 là vi khuẩn Gram dương, hình que, hiếu khí tùy ý, có khả
năng di động, nhiệt độ thích hợp 35 0C và pH 6,8, tế bào có kích thước (0,5–
1,0) × (2,0–3,5) μm và có các đặc điểm sinh hóa, biến dưỡng tương đồng với
chi Bacillus.
¾ Chủng W_TB_B2 là vi khuẩn Gram âm, hình que, hiếu khí tùy ý, có khả
năng di động, nhiệt độ thích hợp 35 0C và pH 6,6, tế bào có kích thước (0,51,5) x (1,5-3,0) µm và có các đặc điểm sinh hóa, biến dưỡng tương đồng với
chi Burkholderia.
Tuy nhiên, khi dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa
chúng tôi vẫn chưa đủ cơ sở để khẳng định vi khuẩn này ở mức loài vì thông tin
về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các loài không đầy đủ. Do vậy,
chúng tôi tiến hành phân tích trình tự rDNA 16S của cả ba chủng để có thêm
thông tin cho quá trình phân loại và định danh.

71

Kết quả và biện luận

3.3.2. Phân tích trình tự rDNA 16S
Để định danh vi khuẩn đến loài có độ chính xác cao, ngoài định danh theo
phương pháp truyền thống, chúng tôi thực hiện định danh bằng phương pháp sinh
học phân tử dựa vào việc giải trình tự rDNA 16S.
Trước khi chạy PCR chúng tôi tiến hành tách DNA bộ gen để dùng làm
khuôn mẫu cho phản ứng PCR, kết quả tách chiết DNA cho thấy DNA bộ gen thu
nhận được tốt cho việc thực hiện phản ứng PCR, với nồng độ thu được và độ tinh
sạch (OD260/OD280) được thể hiện trong Bảng 3.8 và độ nguyên vẹn được thể hiện
trên Hình 3.4.
Bảng 3.8: Độ tinh sạch và nồng độ DNA bộ gen vi khuẩn thu được
Nồng độ DNA

OD260 nm

OD280 nm

OD320 nm

OD260nm/
OD280 nm

Chủng S_CT_B2

0,431

0,226

0,004

1,91

157,99

Chủng W_TN_B1

0,407

0,217

0,003

1,88

149,48

Chủng W_TB_B2

0,463

0,247

0,003

1,87

170,20

(ng/µL)

Trước khi giải trình tự rDNA 16S chúng tôi tiến hành khuếch đại chúng bằng
phản ứng PCR bằng cặp mồi 27F/1525R, đoạn trình tự này có kích thước khoảng
1500 bp, sau khi thực hiện phản ứng PCR sản phẩm được thể hiện trên Hình 3.4.

72

Kết quả và biện luận

Giếng 1: Sản phẩm sau khi tách DNA
chủng S_CT_B2
Giếng 2: Sản phẩm sau khi tách DNA
chủng W_TB_B2
Giếng 3: Sản phẩm sau khi tách DNA
chủng W_TN_B1
Giếng 4: Thang Lambda DNA/EcoR I
+ Hind III
Giếng 5: Sản phẩm khuếch đại rDNA
16S chủng S_CT_B2
Giếng 6: Sản phẩm khuếch đại rDNA
16S chủng W_TB_B2
Giếng 7: Sản phẩm khuếch đại rDNA
16S chủng W_TN_B1.
Hình 3.4: Kết quả thu nhận DNA bộ gen và sản phẩm khuếch đại trình tự rDNA
16S
Hình trên cho thấy sản phẩm khuếch đại có vạch nằm tương ứng với chiều
dài khoảng 1500 bp so với thang chuẩn, như vậy sản phẩm khuếch đại này tương
ứng với kích thước đoạn DNA sản phẩm dự kiến.
Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được gửi giải trình tự tại công ty
Macrogen Inc, Hàn Quốc. Kết quả được tiến hành xử lý bằng phần mềm FastPCR
để nối lại trình tự rDNA 16S gần như nguyên vẹn của các chủng lại, kết quả trình tự
rDNA 16S gần như nguyên vẹn của các chủng vi khuẩn được trình bày trong Phụ
lục V.
Sau khi đã có trình tự rDNA 16S của mỗi chủng, chúng tôi tiến hành tìm và
so sánh độ tương đồng di truyền của các chủng trên ngân hàng dữ liệu bằng công cụ
BLAST tại website: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. Kết quả so sánh độ tương

73

Kết quả và biện luận

đồng di truyền của các chủng trên ngân hàng dữ liệu được trình bày trong Phụ lục
VI.
Từ kết quả so sánh độ tương đồng di truyền của các chủng trên ngân hàng dữ
liệu cho thấy:
¾ Chủng S_CT_B2 (1392 bp) thuộc chi Pseudomonas và có quan hệ gần
nhất với loài Pseudomonas aeruginosa ở mức độ tương đồng di truyền
là 99%.
¾ Chủng W_TB_B2 (1416 bp) thuộc chi Burkholderia và có quan hệ gần
nhất với loài Burkholderia thailandensis ở mức độ tương đồng di truyền
là 99%.
¾ Chủng W_TN_B1 (1468 bp) thuộc chi Bacillus và có quan hệ gần nhất
với loài Bacillus licheniformis ở mức độ tương đồng di truyền là 97%.
Tuy nhiên, để kết luận các chủng là loài nào thì cần phải dựa trên cây phát
sinh loài. Bằng phần mềm BioEdit và MEGA cùng với dữ liệu trình tự rDNA 16S
của các loài cùng chi trong ngân hàng gen, chúng tôi đã xây dựng cây phát sinh loài
tổng quát được thể hiện trên Hình 3.5; 3.6 và 3.7.

74

Kết quả và biện luận

P.azotoformans IAM 1603T (D84009)

25

P.costantinii CFBP 5705T (AF374472)

12

P.extremorientalis KMM 3447T (AF405328)
17
65

P.simiae OLiT (AJ936933)

19

P.salomonii CFBP 2022T (AY091528)
P.palleroniana CFBP 4389T (AY091527)

44
78

P.tolaasii LMG 2342T (AF255336)
P.trivialis DSM 14937T (AJ492831)
P.lurida DSM 15835T (AJ581999)

59
33

P.poae DSM 14936T (AJ492829)
P.antarctica CMS 35T (AJ537601)

71

P.meridiana CMS 38T (AJ537602)

11

P.cedrina subsp. fulgida DSM 14938T (AJ4

53

P.fluorescens IAM 12022T (D84013)
P.grimontii CFML 97-514T (AF268029)
P.rhodesiae CIP 104664T (AF064459)
34

P.marginalis LMG 2210T (Z76663)
P.panacis CG20106T (AY787208)

26

P.mucidolens IAM 12406T (D84017)
51

P.synxantha IAM 12356T (D84025)

7

P.veronii CIP 104663T (AF064460)
P.brennerii CFML 97-391T (AF268968)

49
47

P.proteolytica CMS 64T (AJ537603)

0

P.kilonensis DSM 13647T (AJ292426)
P.mandelii CIP 105273T (AF058286)

23
39
33

P.migulae CIP 105470T (AF074383)
P.collierea PR212T (AM421016)
P.lini CFBP 5737T (AY035996)
P.frederiksbergensis DSM 13022T (AJ24938

1227

P.brassicacearum DBK11T (AF100321)

37
59

P.thivervalensis CFBP 11261T (AF100323)
P.chlororaphis subsp. aurantiaca NCIB 10

18
86

P.chlororaphis DSM 50083T (Z76673)

75

P.chlororaphis subsp. aureofaciens DSM 6
P.cichorii LMG 2162T (Z76658)
P.meliae MAFF 301463T (AB021382)

59
30

28

P.tremae CFBP 6111T (AJ492826)
P.syringae pv. savastanoi ATCC 13522T (A

68

P.amygdali LMG 2123T (Z76654)

24

P.congelans DSM 14939T (AJ492828)

38

P.cannabina CFBP 2341T (AJ492827)

61

P.ficuserectae JCM 2400T (AB021378)
P.lundensis ATCC 49968T (AB021395)
96

P.taetrolens IAM 1653T (D84027)

46

P.jessenii CIP 105274T (AF068259)
58

P.vancouverensis DhA-51T (AJ011507)

34

P.moorei RW 10T (AM293566)

28

P.reinekei Mt-1T (AM293565)

44

P.clemancea PR221T (AM419155)
P.mohnii Ipa-2T (AM293567)
P.abietaniphila ATCC 700689T (AJ011504)

66
26

P.rhizosphaerae IH5T (AY152673)

89

37

P.graminis DSM 11363T (Y11150)
89

P.lutea OK2T (AY364537)

15

P.koreensis KACC 10848T (AF468452)
P.moraviensis CCM 7280T (AY970952)

19

P.agarici LMG 2112T (Z76652)

27
37

P.teessidea PR65T (AM419154)
P.stutzeri ATCC 17588T (AF094748)

90

P.xanthomarina KMM 1447T (AB176954)
P.asplenii ATCC 23835T (AB021397)
29

P.japonica IAM 15071T (AB126621)

45

30

P.vranovensis CCM 7279T (AY970951)

44

P.monteilii CIP 104883T (AF064458)

82

P.plecoglossicida FPC951T (AB009457)

48
23

P.mosselii CIP 105259T (AF072688)
P.cremoricoloranta IAM 1541T (AB060137)

39

P.fulva NRIC 0180T (AB060136)

76
35

P.parafulva AJ 2129T (AB060132)

34

P.oryzihabitans IAM 1568T (D84004)

49

7

P.putida IAM 1236T (D84020)
P.pohangensis H3-R18T (DQ339144)
P.marincola KMM 3042T (AB301071)

100

P.segetis FR1439T (AY770691)

43

P.borbori R-20821T (AM114527)

33

P.cuatrocienegasensis 1NT (EU791281)
P.guineae LMG 24016T (AM491810)

75
99

P.peli R-20805T (AM114534)
P.argentinensis CH01T (AY691188)

99

P.straminea IAM 1598T (D84023)

2 7

P.mendocina NCIMB 10541T (D84016)
61

P.pseudoalcaligenes LMG 1225T (Z76666)
P.luteola IAM 13000T (D84002)

75

P.takelamaensis HR2T (EU046271)

10
22

7

P.oleovorans IAM 1508T (D84018)
42

P.tuomuerensis 78-123T (DQ868767)
P.aeruginosa DSM 50071T (X06684)

99

S CT B2

70
7

P.resinovorans LMG 2274T (Z76668)

89

P.guezennei RA26T (AJ876736)

47
99

P.otitidis MCC 10330T (AY953147)
P.alcaligenes IAM 12411T (D84006)

100

22

P.jinjuensis KACC 10760T (AF468448)
97
99

P.multiresinivorans ATCC 700690T (X96787
P.nitroreducens IAM 1439T (AM088473)
P.knackmussii B13T (AF039489)

87
58
99
73

P.citronellolis DSM 50332T (Z76659)
P.delhiensis RLD-1T (DQ339153)
P.azotifigens 6H33bT (AB189452)
P.pachastrellae KMM 330T (AB125366)
P.pertucinogena IFO 14163T (AB021380)

96

75

P.sabulinigri J64T (EU143352)

70
61

P.xinjiangensis S3-3T (EU286805)
P.elongata DSM 6810T (AF500006)

96

P.stanieri ATCC 27130T (AB021367)
P.beijerinckii ATCC 19372T (AB021386)

88

P.halophila DSM 3050T (AB021383)
48

95

P.doudoroffii MBIC 1298T (AB019390)
100

P.flectens ATCC 12775T (AB021400)
P.boreopolis ATCC 33662T (AB021391)

54

P.cissicola ATCC 33616T (AB021399)
P.beteli ATCC 19861T (AB021406)

100
100
59

P.geniculata ATCC 19374T (AB021404)
P.hibiscicola ATCC 19867T (AB021405)
P.lanceolata ATCC 14669T (AB021390)

89

P.saccharophila DSM 654T (AB021407)
P.syzygii ATCC 49543T (AB021403)

100

P.huttiensis ATCC 14670T (AB021366)

100
97

P.lemoignei LMG 2207T (X92555)
P.carboxydohydrogena DSM 1083T (AB021393

0.02

Hình 3.5: Cây phát sinh loài tổng quát của chủng S_CT_B2 với các chủng khác
trong chi Pseudomonas (số trình tự so sánh là 1188 nucleotide).

75

Kết quả và biện luận

71
54
95

B.plantarii LMG 9035T (U96933)
B.vandii LMG 16020T (U96932)
B.cocovenenans ATCC 33664T (AB021389)

39

B.glumae LMG2196T (U96931)
B.pyrrocinia LMG 14191T (U96930)

91

B.cepacia ATCC 25416T (U96927)
B.multivorans LMG 13010T (Y18703)

83

99

79

B.vietnamiensis LMG 10929T (AF097534)
B.pseudomallei ATCC 23343T (DQ108392)

25

B.thailandensis E264T (EF535235)

94
100

W TB B2
B.endofungorum HKI 456T (AM420302)

59
100
36

B.rhizoxinica HKI 454T (AJ938142)
B.caryophylli ATCC 25418T (AB021423)

60

B.soli GP25-8T (DQ465451)
B.glathei LMG 14190T (U96935)

37

B.hospita LMG 20598T (AY040365)
B.fungorum LMG 16225T (AF215705)

35

B.megapolitana LMG 23650T (AM489502)

33
56

B.phenazinium LMG2247T (U96936)
B.phytofirmans PsJNT (AY497470)

85

B.graminis C4D1MT (U96939)

66
100

16

B.terricola LMG 20594T (AY040362)

49

B.xenovorans LB400T (U86373)
B.sediminicola HU2-65WT (EU035613)

30

B.ginsengisoli KMY03T (AB201286)

17

B.bryophila LMG 23644T (AM489501)

75
57

B.caledonica LMG 19076T (AF215704)
B.kururiensis (AB024310)
B.unamae MTl-641T (AY221956)

62

B.nodosa Br3437T (AY773189)

98

B.mimosarum PAS44T (AY752958)

54

B.ferrariae FeGl01T (DQ514537)

82
61

B.silvatlantica SRMrh-20T (AY965240)

B.norimbergensis (Y09879)
B.pickettii ATCC 27511T (AY741342)

0.01

Hình 3.6: Cây phát sinh loài tổng quát của chủng W_TB_B2 với các chủng khác
trong chi Burkholderia (số trình tự so sánh là 1336 nucleotide).

76

Kết quả và biện luận

B.bataviensis LMG 21833T (AJ542508)

76

B.drentensis LMG 21831T (AJ542506)

38

B.soli LMG 21838T (AJ542513)

73

B.novalis LMG 21837T (AJ542512)

47
96

B.vireti LMG 21834T (AJ542509)

53

B.fumarioli LMG 17489T (AJ250056)
47

B.niacini IFO15566T (AB021194)
B.pocheonensis Gsoil 420T (AB245377)

27

B.methanolicus NCIMB 13113T (AB112727)
B.foraminis CV53T (AJ717382)

33

B.subterraneus COOI3BT (AY672638)

80

10

B.selenatarsenatis SF-1T (AB262082)

96

B.boroniphilus T-15ZT (AB198719)

68
10

84

B.jeotgali YKJ-10T (AF221061)
B.circulans IAM 12462T (D78312)

B.firmus IAM 12464T (D16268)

1
76

B.infantis SMC 4352-1T (AY904032)

0

B.korlensis ZLC-26T (EU603328)

18

B.pallidus CW 7T (EU364818)
B.kribbensis BT080T (DQ280367)
B.acidicola 105-2T (AF547209)

44
0

B.isabeliae CVS-8T (AM503357)

24

B.ginsengihumi Gsoil 114T (AB245378)
34

B.sporothermodurans M215T (U49080)
B.alveayuensis TM 1T (AY605232)

45

B.eolicus 4-1T (AJ504797)

68
0

B.smithii DSM 4216T (X60643)

6

B.lentus NCIMB 8773T (AB021189)
B.galactosidilyticus LMG 17892T (AJ53563

75
100

B.ruris R-6760T (AJ535639)

1

B.badius ATCC 14574T (X77790)
1

B.farraginis R-6540T (AY443036)

99
13

B.fortis R-6514T (AY443038)
B.coagulans NBRC 12583T (AB271752)

25

B.beijingensis ge10T (EF371374)

32
100

B.ginsengi ge14T (EF371375)

B.flexus IFO15715T (AB021185)

97

B.megaterium IAM 13418T (D16273)

25

B.koreensis BR030T (AY667496)
B.aquaemaris TF-12T (AF483625)

95

B.vietnamensis 15-1T (AB099708)

83
50
1

B.marisflavi TF-11T (AF483624)
B.seohaeanensis BH724T (AY667495)

29

B.coahuilensis m4-4T (EF014452)
B.coahuilensis m4-4 aT (EF014450)

100
86

0

B.coahuilensis m4-4 bT (EF014451)
B.butanolivorans K9T (EF206294)

100

B.simplex DSM 1321T (AJ439078)

81
13

B.asahii MA001T (AB109209)
B.funiculus NAF001T (AB049195)

96

2

B.panaciterrae Gsoil 1517T (AB245380)
B.pseudomycoides (AF013121)

26

B.thuringiensis IAM 12077T (D16281)

100

B.anthracis ATCC 14578T (AB190217)

84
66

B.cereus ATCC 14579T (AE016877)
B.acidiceler CBD 119T (DQ374637)

100

B.luciferensis LMG 18422T (AJ419629)

86

B.cohnii DSM 6307T (X76437)
27

81

B.halmapalus DSM 8723T (X76447)
B.alkalitelluris BA288T (AY829448)

9

B.litoralis SW-211T (AY608605)

44
59

B.niabensis 4T19T (AY998119)
B.azotoformans ATCC 29788T (X60609)
B.endophyticus 2DT (AF295302)

13
51
67

B.humi LMG 22167T (AJ627210)

9

B.cibi JG-30T (AY550276)

100

B.indicus Sd-3T (AJ583158)

92

B.idriensis SMC 4352-2T (AY904033)
B.aerophilus 28KT (AJ831844)
97
55

B.altitudinis 41KF2bT (AJ831842)

100

B.stratosphericus 41KF2aT (AJ831841)
B.pumilus ATCC 7061T (AY876289)

81

B.licheniformis ATCC 14580T (CP000002)

100

W TN B1
2

B.subtilis NCDO 1769T (X60646)

53

B.vallismortis DSM 11031T (AB021198)

99
53

B.velezensis CR-502T (AY603658)
100

B.arenosi LMG 22166T (AJ627212)
B.arvi LMG 22165T (AJ627211)

100

B.pycnus NBRC 101231T (AB271739)
98

B.insolitus DSM 5T (AM980508)
B.decisifrondis E5HC-32T (DQ465405)

97
99

B.massiliensis 4400831T (AY677116)

B.halodenitrificans DSM 10037T (AY543169
B.haloalkaliphilus DSM 5271T (AJ238041)
10

B.halophilus DSM 4771T (AJ243920)
4

23

B.aidingensis 17-5T (DQ504377)

100

B.qingdaonensis CM1T (DQ115802)

23

100

68

B.chaganniensis CG15T (AM492159)
B.chagannorensis CG-15T (AM492159)

B.aurantiacus K1-5T (AJ605773)

65

B.cellulosilyticus N-4T (AB043852)

74
94

B.polygoni YN-1T (AB292819)

B.hwajinpoensis SW-72T (AF541966)

48

B.taeanensis BH030017T (AY603978)
89

B.okhensis Kh10-101T (DQ026060)
B.wakoensis N-1T (AB043851)

93
71
24

B.krulwichiae AM31DT (AB086897)

29

B.akibai 1139T (AB043858)

45
41

B.alcalophilus DSM 485T (X76436)

25

B.hemicellulosilyticus C-11T (AB043846)
B.halodurans DSM 497T (AJ302709)
B.alkalidiazotrophicus MS 6T (EU143680)

100
29

B.macyae JMM-4T (AY032601)

22

B.alkalinitrilicus ANL-iso4T (EF422411)
B.plakortidis P203T (AJ880003)

4

B.patagoniensis PAT 05T (AY258614)

78
80

B.lehensis MLB2T (AY793550)

98
100

B.oshimensis K11T (AB188090)

B.decolorationis LMG 19507T (AJ315075)
B.arsenicus con a-3T (AJ606700)

51

B.gelatini LMG 21880T (AJ551329)

97
57

B.macauensis ZFHKF-1T (AY373018)

82
97

B.solisalsi YC1T (EU046268)
B.horti K13T (D87035)

100

B.mannanilyticus AM-001T (AB043864)
86

B.chitinolyticus HSCC 596T (AB045100)
B.ehimensis KCTC3748T (AY116665)

100
40

B.longisporus LMG13275T (AJ223991)
B.macerans IAM 12467T (AB073196)
B.formosus DSM 9885T (AB112712)
B.schlegelii ATCC 43741T (AB042060)

100

B.tusciae IFO 15312T (AB042062)

0.01

Hình 3.7: Cây phát sinh loài tổng quát của chủng W_TN_B1 với các chủng khác
trong chi Bacillus (số trình tự so sánh là 969 nucleotide).

77

Kết quả và biện luận

Tuy nhiên, số lượng loài sử dụng ở cây phát sinh loài tổng quát là rất nhiều
vì thế sau khi xử lý bằng phần mềm BioEdit thì số trình tự dùng để so sánh là
khoảng 1000 nucleotide. Do đó, kết quả ở cây phát sinh loài tổng quát chưa thể hiện
chính xác kết quả. Vì thế, chúng tôi tiếp tục dựng cây phát sinh loài chi tiết cho từng
chủng với các loài so sánh là các loài trong cùng nhánh, có mối quan hệ họ hàng
gần nhất với chủng khảo sát. Kết quả được thể hiện trên Hình 3.8; 3.9 và 3.10.
97
68
54

P.citronellolis DSM 50332T (Z76659)
P.delhiensis RLD-1T (DQ339153)
P.knackmussii B13T (AF039489)
P.jinjuensis KACC 10760T (AF468448)

100

P.multiresinivorans ATCC 700690T (X96787

50
92
36

P.nitroreducens IAM 1439T (AM088473)

P.alcaligenes IAM 12411T (D84006)
P.guezennei RA26T (AJ876736)

42
100

P.otitidis MCC 10330T (AY953147)
P.resinovorans LMG 2274T (Z76668)
P.aeruginosa DSM 50071T (X06684)

95

S CT B2
P.halophila DSM 3050T (AB021383)

0.02

Hình 3.8: Cây phát sinh loài chi tiết của chủng S_CT_B2 với các chủng khác trong
chi Pseudomonas (số trình tự so sánh là 1331 nucleotide).

78

Kết quả và biện luận

68

B.plantarii LMG 9035T (U96933)
B.vandii LMG 16020T (U96932)

69
97

B.cocovenenans ATCC 33664T (AB021389)

52

B.glumae LMG2196T (U96931)
B.pyrrocinia LMG 14191T (U96930)

85

B.cepacia ATCC 25416T (U96927)
B.multivorans LMG 13010T (Y18703)

73
80

B.vietnamiensis LMG 10929T (AF097534)
B.pseudomallei ATCC 23343T (DQ108392)

B.thailandensis E264T (EF535235)

85
100

W TB B2
B.hospita LMG 20598T (AY040365)

0.005

Hình 3.9: Cây phát sinh loài chi tiết của chủng W_TB_B2 với các chủng khác trong
chi Burkholderia (số trình tự so sánh là 1355 nucleotide).
86
99
59

B.vallismortis DSM 11031T (AB021198)
B.velezensis CR-502T (AY603658)
B.subtilis NCDO 1769T (X60646)
B.licheniformis ATCC 14580T (CP000002)
100

W TN B1
B.pumilus ATCC 7061T (AY876289)
100
97

B.altitudinis 41KF2bT (AJ831842)
B.aerophilus 28KT (AJ831844)
B.stratosphericus 41KF2aT (AJ831841)
B.halophilus DSM 4771T (AJ243920)

0.01

Hình 3.10: Cây phát sinh loài chi tiết của chủng W_TN_B1 với các chủng khác
trong chi Bacillus (số trình tự so sánh là 1369 nucleotide).
Đối với cây phát sinh loài chi tiết, trình tự sau khi xử lý được dùng để so
sánh lớn hơn 1300 nucleotide. Vì vậy, kết quả này đáng tin cậy.
Dựa vào kết quả so sánh trình tự rDNA 16S ta có thể kết tạm kết luận chủng
S_CT_B2 gần giống với loài Pseudomonas aeruginosa, chủng W_TB_B2 gần
giống với loài Burkholderia thailandensis và chủng W_TN_B1 gần giống với loài

79

Kết quả và biện luận

Bacillus licheniformis. Tuy nhiên, để có thể kết luận, chúng tôi tiến hành so sánh
các đặc điểm về sinh thái và các đặc tính sinh lý, sinh hóa để tính hệ số tương đồng
Jaccard của từng cặp vi khuẩn trên (được trình bày trong Bảng A, Phụ lục VII).
Kết quả tính hệ số tương đồng Jaccard như sau:
¾ Chủng S_CT_B2 với chủng Pseudomonas aeruginosa có hệ số tương
đồng là: 93,02% (40/43). Do đó, có thể kết luận chủng S_CT_B2 là loài
Pseudomonas aeruginosa.
¾ Chủng W_TB_B2 với chủng Burkholderia thailandensis có hệ số tương
đồng là: 95,35% (41/43). Do đó, có thể kết luận chủng W_TB_B2 là loài
Burkholderia thailandensis.
¾ Chủng W_TN_B1 với chủng Bacillus licheniformis có hệ số tương đồng
là: 90,24% (37/41). Do đó, có thể kết luận chủng W_TN_B1 là loài
Bacillus licheniformis.
3.4. ĐỊNH DANH NẤM MEN
3.4.1. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men
W_Q9_Y1
Để định danh nấm men theo phương pháp truyền thống, trước tiên ta cần xác
định các đặc điểm về hình thái nấm men như: màu sắc khuẩn lạc, hình dạng tế bào,
sự hình thành bào tử nang, khuẩn ty giả, khuẩn ty thật, kiểu sinh sản. Dựa vào khóa
phân loại định danh các giống nấm men của Kurtzman, C.P. and Fell, J.W. (1998),
ta có thể định danh sơ bộ nấm men đến giống. Kết quả khảo sát được thể hiện trong
Bảng 3.9 và Hình 3.11.

80

Kết quả và biện luận

Bảng 3.9: Đặc điểm hình thái của chủng nấm men
Các đặc điểm
Chủng

Bề mặt
Màu sắc
khuẩn lạc khuẩn lạc

W_Q9_Y1

Trơn

Trắng
đục

Hình
dạng tế
bào
Bầu dục

Kiểu sinh
sản
Nảy chồi
đa hướng

Bào tử
nang
Không

Khuẩn ty
Giả

Thật

Chủng W_Q9_Y1 trên môi trường YM

Hình thái tế bào chủng W_Q9_Y1 dưới

agar sau 2 ngày nuôi cấy ở 350C

kính hiển vi, độ phóng đại 600 lần

Khuẩn ty giả

Khuẩn ty thật

Hình 3.11: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng W_Q9_Y1

81

Kết quả và biện luận

Kết quả khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa được thể hiện trong Bảng
3.10.
Bảng 3.10: Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng W_Q9_Y1
Đặc tính

Chủng W_Q9_Y1

Phân giải ure

Thủy phân gelatin

Phát triển ở các nhiệt độ khác nhau
250C
+
300C
+
350C
+
400C

450C

Lên men các nguồn đường
D-Glucose

D-Galactose

D-Maltose

D-Raffinose
+
D-Lactose

Sucrose

D-Trehalose

Đồng hóa các nguồn nitrogen
KNO3

NaNO3

NaNO2

L-lysine
+
hydrochloride
Ethylamine
+
hydrochloride

Đặc tính

Chủng W_Q9_Y1

Đồng hóa các nguồn carbon
L-Arabinose
D-Cellobiose
Dulcitol
D-Galactose
Myo-Inositol
D-Maltose
D-Mannitol
D-Mannose
D-Raffinose
L-Rhamnose
Sucrose
D-Xylose
D-Lactose
D-Glucose
D-Fructose
D-Sorbitol
D-Trehalose
Glycerol




+

+
+
+


+

+
+



+

Từ các đặc điểm hình thái và các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng nấm
men W_Q9_Y1 và dựa vào khóa định danh nấm men của Kurtzman, C.P. and Fell,
J.W. (1998). Chúng tôi có kết quả ghi nhận là chủng W_Q9_Y1 có khuẩn lạc màu
trắng đục, không hình thành bào tử nang, tạo khuẩn ty giả, nảy chồi đa hướng, lên
men đường glucose, sucrose,…, không đồng hóa KNO3, NaNO3 và NaNO2 nhưng
đồng hóa L-lysine hydrochloride, ethylamine hydrochloride nên có nhiều điểm
tương đồng với chi Candida.
Tuy nhiên, khi dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa chúng tôi
vẫn chưa đủ cơ sở để định danh nấm men này ở mức loài vì thông tin về đặc điểm
hình thái, sinh lý, sinh hóa của các loài không đầy đủ. Do vậy, chúng tôi tiến hành

82

Kết quả và biện luận

phân tích trình tự đoạn D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA; 25/26/28S)
của chủng W_Q9_Y1 để có thêm thông tin cho quá trình phân loại và định danh.
3.4.2. Phân tích đoạn trình tự D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA;
25/26/28S)
Trước khi chạy PCR chúng tôi tiến hành tách DNA bộ gen để dùng làm
khuôn mẫu cho phản ứng PCR, kết quả tách chiết DNA cho thấy DNA bộ gen thu
nhận được tốt cho việc thực hiện phản ứng PCR, với các giá trị hấp thu ở các bước
sóng khác nhau lần lượt là: OD260nm=0,472; OD280nm=0,249 và OD320nm=0,004, do
đó, DNA thu được có nồng độ là 173,16 ng/μL và độ tinh sạch là OD260/OD280 =
1,90 và độ nguyên vẹn được thể hiện trên Hình 3.12.
Trước khi giải trình tự đoạn D1/D2 chúng tôi tiến hành khuếch đại chúng
bằng phản ứng PCR với cặp mồi LR3/F63, đoạn trình tự này có kích thước khoảng
600 bp, sau khi thực hiện phản ứng PCR sản phẩm được thể hiện trên Hình 3.12.
Giếng 1: Sản phẩm

Giếng 1: Thang EZ

sau khi tách DNA

Load

Giếng

Molecular ruler

2:

Thang

100

bp

Lambda DNA/EcoR

Giếng 2: Sản phẩm

I + Hind III

khuếch đại trình tự
600 bp

Kết quả thu nhận DNA bộ gen

đoạn D1/D2

Sản phẩm khuếch đại trình tự đoạn D1/D2

Hình 3.12: Kết quả thu nhận DNA bộ gen và sản phẩm khuếch đại trình tự đoạn
D1/D2 của chủng W_Q9_Y1
Hình trên cho thấy sản phẩm khuếch đại có vạch nằm tương ứng với chiều
dài khoảng 600 bp so với thang chuẩn, như vậy sản phẩm khuếch đại này tương ứng
với kích thước đoạn DNA sản phẩm dự kiến.

83

Kết quả và biện luận

Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được gửi đi giải trình tự tại công ty
Macrogen Inc, Hàn Quốc. Kết quả trình tự đoạn D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn
(LSU-rRNA; 25/26/28S) của chủng nấm men W_Q9_Y1 (568 bp) được trình bày
trong phần Phụ lục V.
Sau khi trình tự đoạn D1/D2 được biết, chúng tôi tiến hành tìm và so sánh độ
tương đồng di truyền của chủng nấm men W_Q9_Y1 trên ngân hàng dữ liệu bằng
công cụ BLAST tại website: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. Kết quả so sánh độ
tương đồng di truyền của của chủng nấm men W_Q9_Y1 trên ngân hàng dữ liệu
được trình bày trong Phụ lục VI
Từ kết quả so sánh độ tương đồng di truyền của các chủng trên ngân hàng dữ
liệu cho thấy chủng nấm men W_Q9_Y1 thuộc chi Candida và có mối quan hệ gần
nhất với loài Candida rugosa ở mức độ tương đồng di truyền là 97%.
Tuy nhiên, để kết luận chủng nấm men W_Q9_Y1 là loài nào thì cần phải
dựa trên cây phát sinh loài. Bằng phần mềm BioEdit và MEGA cùng với dữ liệu
trình tự đoạn trình tự D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA; 25/26/28S
rRNA) của các loài cùng chi trong ngân hàng gen, chúng tôi đã xây dựng cây phát
sinh loài tổng quát được thể hiện trên Hình 3.13.

84

Kết quả và biện luận

C.aaseri NRRL YB-3897T (U45802)

7 2

C.butyri NRRL Y-17648T (U45780)

4 4
5 6

C.insectorum NRRL Y-7787T (U45791)
C.conglobata NRRL Y-1504T (U45789)

8 3

C.tenuis NRRL Y-1498T (U45774)
7 1 7 6

C.trypodendroni NRRL Y-6488T (AF017240)
C.naeodendra NRRL Y-10942T (U45759)
C.dendronema NRRL Y-7781T (U45751)

98

4 9

43

C.diddensiae NRRL Y-7589T (U45750)

C.tammaniensis NRRL Y-8257T (AF017243)
C.buinensis NRRL Y-11706T (U45778)

61 5 6

C.friedric hii NRRL Y-17653T (U45781)

67
89

C.membranifac iens NRRL Y-2089T (U45792)
C.atlantica NRRL Y-17759T (U45799)

2 4
98

C.atmosphaerica NRRL Y-17642T (U45779)
C.ins ectamans NRRL Y-7786T (U45753)
C.albicans NRRL Y-12983T (U45776)

3 4

C.maltosa NRRL Y-17677T (U45745)

37
36

7

C.vis wanathii NRRL Y-17317T (U45755)
C.parapsilosis NRRL Y-12969T (U45754)

8 6

C.sojae NRRL Y-17909T (U71070)

27
60

C.tropicalis NRRL Y-12968T (U45749)

C.peltata NRRL Y-6888T (U71066)
C.populi NRRL Y-17681T (U70249)

7 2

0

C.ernobii NRRL Y-17782T (U70241)

87
96

C.karawaiewii NRRL Y-17784T (U94921)

C.c hilensis NRRL Y-7790T (U45821)

20

C.c ylindracea NRRL Y-17506T (U45823)
C.querc itrusa NRRL Y-5392T (U45831)
C.shehatae var. lignosa NRRL Y-12856T (U
9 3

1

C.shehatae var. shehatae NRRL Y-12858T (

50

C.shehatae var. insectosa NRRL Y-12854T

37

C.ergastensis NRRL Y-17652T (U45746)

13

C.sophiaereginae NRRL Y-17668T (U45817)
C.multigemmis NRRL Y-17659T (U45782)
C.beechii NRRL Y-17758T (U45798)
C.oleophila NRRL Y-2317T (U45793)

1 1

C.natalensis NRRL Y-17680T (U45818)

1
4

C.zey lanoides NRRL Y-1774T (U45832)
0

C.psy chrophila NRRL Y-17665T (U45813)
C.laureliae NRRL Y-17656T (U45787)
45
0

C.ralunensis NRRL Y-17666T (U45786)

54

C.boleticola NRRL Y-17080T (U45777)
C.schatavii NRRL Y-17078T (U45795)

0

C.fermentic arens NRRL Y-17321T (U45756)
C.fragi NRRL Y-17910T (U71071)

2

C.fukuyamaensis NRRL Y-17857T (U62311)

1 8

C.glaebosa NRRL Y-6949T (U45757)

29

C.palmioleophila NRRL Y-17323T (U45758)

81

C.saitoana NRRL Y-17316T (U45762)

41

C.fluviatilis NRRL Y-7711T (U45717)

42
44

C.pseudoglaebosa NRRL Y-17911T (U71072)
C.glucosophila NRRL Y-17781T (U45849)
C.castrensis NRRL Y-17329T (U45807)

10 0

C.paludigena NRRL Y-12697T (U45826)

4 7
3

30

C.valdiviana NRRL Y-7791T (U45835)

0

C.bertae NRRL Y-17643T (U70251)
19

C.cantarellii NRRL Y-17650T (U45814)
C.santjacobens is NRRL Y-17667T (U45811)

22

C.tepae NRRL Y-17670T (U45816)

69

C.ancudensis NRRL Y-17327T (U45810)

10 0
9 2

C.petrohuensis NRRL Y-17663T (U45819)
C.berthetii NRRL Y-17644T (U62298)

99

C.dendric a NRRL Y-7775T (U62301)

67
44

C.norvegica NRRL Y-17660T (U62299)

15

C.montana NRRL Y-17326T (U62305)
C.stellimalicola NRRL Y-17912T (U84234)

7

C.nitrativorans CBS 6152T (AJ508573)

1 2
9 6

C.s ilvicultrix NRRL Y-7789T (U69879)

7

C.quercuum NRRL Y-12942T (U70184)
C.maritima NRRL Y-17775T (U69877)

5
47

C.vartiovaarae NRRL Y-6701T (U69875)
C.solani NRRL Y-2224T (U70179)

1 1

0

C.vini NRRL Y-1615T (U70247)
C.pignaliae NRRL Y-17664T (U70183)

1 6

C.arabinofermentans NRRL YB-2248T (AF017

60

C.ovalis NRRL Y-17662T (U70248)

63
58

C.sithepensis S023T (AB120220)
C.boidinii NRRL Y-2332T (U70242)

9 9
1 4

C.ooitensis NRRL Y-17661T (U94926)
C.sonorensis NRRL Y-7800T (U70185)
2 0

C.methanosorbosa NRRL Y-17320T (U70186)

31

C.pini NRRL Y-2023T (U70252)

7

1 5

C.llanquihuensis NRRL Y-17657T (U70190)

5

C.suc ciphila NRRL Y-11998T (U70189)

27

C.nemodendra NRRL Y-7779T (U70246)

28

C.c arios ilignicola NRRL Y-11996T (U70188

30

C.k rabiensis N051T (AB120219)

2 5

C.maris NRRL Y-6696T (U70181)

2 8
4 4

C.nitratophila NRRL YB-3654T (U70180)

C.kruisii NRRL Y-17087T (U45718)

0

C.austromarina NRRL Y-17769T (U62310)

3 8
9 9

C.sake NRRL Y-1622T (U45728)
C.sequanensis NRRL Y-17682T (U45711)

29

C.tanzawaensis NRRL Y-17324T (U44811)
C.entomophila NRRL Y-7783T (U62302)

34

C.silvanorum NRRL Y-7782T (U71068)

2 2
1

C.ontarioens is NRRL YB-1246T (AF017244)
C.fennic a NRRL Y-7505T (U45715)

53

5

C.homilentoma NRRL Y-10941T (U45716)
61

C.gotoi CBS 8531T (AY489112)
9 9

C.rhagii NRRL Y-2594T (U45729)
C.hasegawae NBRC 102566T (AB306510)
C.kazuoi NBRC 102565T (AB306509)

20

3

4 5

C.s orbophila NRRL Y-7921T (U45852)
C.galac ta NRRL Y-17645T (U45820)

36

C.pararugosa NRRL Y-17089T (U62306)

8

C.s pandovensis NRRL Y-17761T (U62309)

3 4
6

C.az yma NRRL Y-17067T (U62312)

5 4
96

C.vanderwaltii NRRL Y-17671T (U62313)

C.auringiensis NRRL Y-17674T (U62300)
9 7

C.s almanticensis NRRL Y-17090T (U62308)
C.blankii NRRL Y-17068T (U45704)
C.pseudolambic a NRRL Y-17318T (U71063)

7 8

C.rugopellic ulos a NRRL Y-17079T (U71069)

4 2

1

1 00

C.incons picua NRRL Y-2029T (U71062)
C.ethanolica NRRL Y-12615T (U71073)

13

C.s ilvae NRRL Y-6725T (U71065)
3

C.haemulonii DMST 17134T (AB118792)

41
10 0

C.haemulonii NRRL Y-6693T (U44812)
C.s ilvatic a NRRL Y-7777T (U76201)
C.versatilis NRRL Y-6652T (U45834)

2

C.geochares NRRL Y-17073T (U48591)

4 9

C.magnoliae NRRL Y-2024T (U45722)

45
10 0

14

C.apis NRRL Y-2482T (U48237)

4 6
9 4

C.vaccinii NRRL Y-17684T (U45708)
C.gropengiesseri NRRL Y-1445T (U45721)
C.etchellsii NRRL Y-17084T (U45723)

3 5

1 00

C.stellata NRRL Y-1446T (U45730)
C.lactis condensi NRRL Y-1515T (U45724)

9 9

C.apicola NRRL Y-2481T (U45703)

25
5 4

C.bombi NRRL Y-17081T (U45706)

4 0
3 0

C.floric ola NRRL Y-17676T (U45710)

C.mogii NRRL Y-17032T (U44820)
C.k ofuensis CBS 8058T (AF158019)
1 3

C.oregonensis NRRL Y-5850T (U44815)

2 5
41

C.torresii NRRL Y-6699T (U45731)
C.fruc tus NRRL Y-17072T (U44810)

5 3

2 7

C.melibios ica NRRL Y-17076T (U44813)
C.tsuchiyae NRRL Y-17840T (U49064)

4 7

C.intermedia NRRL Y-981T (U44809)

5 3
10 0

C.pseudointermedia NRRL Y-10939T (U44816
C.incommunis NRRL Y-17085T (U62303)
C.savonica NRRL Y-17077T (U62307)

C.catenulata NRRL Y-1508T (U45714)

64

C.mesenterica NRRL Y-1494T (U45720)

47
9 2

C.suec ica NRRL Y-12943T (U45732)
C.ins ectalens NRRL Y-7778T (U62304)
C.rugos a NRRL Y-95T (U45727)

4 3
10 0

W Q9 Y1

0.02

Hình 3.13: Cây phát sinh loài tổng quát của chủng W_Q9_Y1 với các chủng khác
trong chi Candida (số trình tự so sánh là 323 nucleotide).

85

Kết quả và biện luận

Tuy nhiên, số lượng loài sử dụng ở cây phát sinh loài tổng quát là rất nhiều
vì thế sau khi xử lý bằng phần mềm BioEdit thì số trình tự dùng để so sánh là tương
đối thấp (khoảng 300 nucleotide). Do đó, kết quả ở cây phát sinh loài tổng quát
chưa thể hiện chính xác kết quả. Vì thế, chúng tôi tiếp tục dựng cây phát sinh loài
chi tiết cho chủng W_Q9_Y1 với các loài so sánh là các loài trong cùng nhánh, có
mối quan hệ họ hàng gần nhất với chủng khảo sát. Kết quả được thể hiện trên Hình
3.14.
C.mesenterica NRRL Y-1494T (U45720)

84
92

C.suecica NRRL Y-12943T (U45732)
C.savonica NRRL Y-17077T (U62307)

34

C.catenulata NRRL Y-1508T (U45714)

45
95

C.fragi NRRL Y-17910T (U71071)
C.incommunis NRRL Y-17085T (U62303)
C.rugosa NRRL Y-95T (U45727)
100

W Q9 Y1
C.insectalens NRRL Y-7778T (U62304)

0.05

Hình 3.14: Cây phát sinh loài chi tiết của chủng W_Q9_Y1 với các chủng khác
trong chi Candida (số trình tự so sánh là 409 nucleotide).
Đối với cây phát sinh loài chi tiết, trình tự sau khi xử lý được dùng để so
sánh lớn hơn 400 nucleotide. Vì vậy, kết quả này đáng tin cậy.
Dựa vào kết quả so sánh trình tự đoạn D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn
(LSU-rRNA; 25/26/28S) ta có thể kết tạm kết luận chủng W_Q9_Y1 gần giống với
loài Candida rugosa. Tuy nhiên, để có thể kết luận, chúng tôi tiến hành so sánh các
đặc điểm về sinh thái và các đặc tính sinh lý, sinh hóa để tính hệ số tương đồng
Jaccard của chủng W_Q9_Y1 với chủng Candida rugosa (được trình bày trong
Bảng B, Phụ lục VII), Kết quả tính hệ số tương đồng Jaccard như sau:
¾ Chủng W_Q9_Y1 với chủng Candida rugosa có hệ số tương đồng là:
91,89% (34/37). Do đó, có thể kết luận chủng W_Q9_Y1 là loài
Candida rugosa.

86

Kết quả và biện luận

Như vậy, từ các kết quả khảo sát về các đặc điểm về sinh thái, các đặc
tính sinh lý, sinh hóa của chủng W_Q9_Y1, kết quả so sánh trình tự đoạn D1/D2
và hệ số tương đồng Jaccard thì ta có thể kết luận chủng W_Q9_Y1 phân lập
được là loài Candida rugosa.
3.5. ĐỊNH DANH NẤM MỐC
3.5.1. Các đặc điểm hình thái của chủng nấm mốc S_Q3_M2
™ Các đặc điểm khuẩn lạc trên đĩa thạch
– Môi trường nuôi cấy: Czapek-DOX agar
– Nhiệt độ nuôi cấy: (25 ± 0,5) 0C
– Ánh sáng: thường
– Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày
– Tốc độ phát triển: trung bình
– Kích thước: (5 – 6) cm/ 7 ngày
– Dạng khuẩn lạc: tạo những vòng tròn đồng tâm, vùng ngoài khuẩn lạc hệ
sợi nền màu trắng.
– Màu sắc:
+ Mặt phải: những vòng tròn đồng tâm có màu đen, vàng olive đan xen
nhau từ tâm ra ngoài, vòng ngoài có màu trắng do hệ sợi non tạo thành.
+ Mặt trái: không màu
– Không tiết sắc tố ra môi trường
– Không tạo giọt tiết
™ Các đặc điểm vi học
– Số lượng, cách sắp xếp của đầu, hạch nấm, thể quả: mọc từ môi trường,
đầu hình cầu tỏa tia, cuống thẳng, đầu xé rách nhiều khi già.
– Đầu:
+ Cách sắp xếp: đầu hình tỏa tia
+ Hình dạng: hình tỏa tia (xé rách khi già)
+ Kích thước: (200 – 300) μm
– Cuống:

87

Kết quả và biện luận

+ Nguồn gốc, tính chất: mọc từ môi trường, vách cuống dày
+ Kích thước: (15 – 25) x (800 – 1850) μm
– Bọng:
+ Hình dạng: hình cầu
+ Kích thước: (20 – 50) μm
+ Vùng sinh sản: khắp mặt bọng
– Thể bình:
+ Cách sắp xếp: một tầng
+ Hình dạng: hình trụ dài
+ Kích thước: (3– 4) x (9– 12) μm
– Bào tử:
+ Hình dạng: hình cầu, nhám (có gai), vách dày, màu đen
+ Kích thước: (3 – 4,5) μm
Dựa vào khóa phân loại nấm mốc theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1976) và
khóa phân loại nấm mốc nhóm Aspergillus của tác giả Charles Thom và Kenneth B.
Raper cho thấy chủng nấm mốc S_Q3_M2 có các đặc điểm hình thái rất giống với
loài Aspergillus japonicus Saito, cụ thể phân loại được trình bày trong Phụ lục
VIII.
Tuy nhiên, để khẳng định tới mức loài, ngoài việc quan sát hình thái của
chủng nấm mốc S_Q3_M2 chúng tôi còn tiến hành phân tích trình tự đoạn D1/D2
của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA; 25/26/28S) để có thêm thông tin cho quá
trình phân loại và định danh.

88

Mặt phải

Kết quả và biện luận

Mặt trái

Khuẩn lạc chủng S_Q3_M2 trên môi trường Czapek (250C/ 7 ngày)

Cấu trúc bộ máy tạo bào tử khi non

Cấu trúc bộ máy tạo bào tử khi già

Cấu trúc của đầu

Bào tử đính

Hình 3.15: Hình thái của chủng S_Q3_M2

89

Kết quả và biện luận

3.5.2. Phân tích đoạn trình tự D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA;
25/26/28S)
DNA bộ gen của nấm mốc S_Q3_M2 được tách chiết với kết quả cho thấy
DNA bộ gen thu nhận được tốt cho việc thực hiện phản ứng PCR, với các giá trị
hấp thu ở các bước sóng khác nhau lần lượt là: OD260nm=0,503; OD280nm=0,266 và
OD320nm=0,004. Do đó, DNA thu được có nồng độ là 184,63 ng/μL và độ tinh sạch
là OD260/OD280 = 1,89 và độ nguyên vẹn được thể hiện trên Hình 3.16. Kết quả sau
khi thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại đoạn trình tự D1/D2 của rRNA tiểu đơn
vị lớn (LSU-rRNA; 25/26/28S) được thể hiện trong Hình 3.16.
Giếng 1: Sản phẩm sau

Giếng 1: Thang EZ

khi tách DNA

Load

Giếng

2:

Thang

100

bp

Molecular ruler

Lambda DNA/EcoR I +

Giếng 2: Sản phẩm

Hind III

khuếch đại trình tự
đoạn D1/D2
600 bp

Kết quả thu nhận DNA bộ gen

Sản phẩm khuếch đại trình tự đoạn
D1/D2

Hình 3.16: Kết quả thu nhận DNA bộ gen và sản phẩm khuếch đại trình tự đoạn
D1/D2 của chủng S_Q3_M2
Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được gửi đi giải trình tự tại công ty
Macrogen Inc, Hàn Quốc. Kết quả trình tự đoạn D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn
(LSU-rRNA; 25/26/28S) của chủng nấm mốc S_Q3_M2 (554 bp) được trình bày
trong phần Phụ lục V.

90

Kết quả và biện luận

Sau khi trình tự đoạn D1/D2 được biết, chúng tôi tiến hành tìm và so sánh độ
tương đồng di truyền của chủng nấm mốc S_Q3_M2 trên ngân hàng dữ liệu bằng
công cụ BLAST tại website: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. Kết quả so sánh độ
tương đồng di truyền của chủng nấm mốc S_Q3_M2 trên ngân hàng dữ liệu được
trình bày trong Phụ lục VI
Từ kết quả so sánh độ tương đồng di truyền của các chủng trên ngân hàng dữ
liệu cho thấy chủng nấm mốc S_Q3_M2 thuộc chi Aspergillus và có mối quan hệ
gần nhất với loài Aspergillus japonicus và Aspergillus aculeatus ở mức độ tương
đồng di truyền là 96%.
Tuy nhiên, để kết luận chủng nấm men S_Q3_M2 là loài nào thì cần phải
dựa trên cây phát sinh loài. Bằng phần mềm BioEdit và MEGA cùng với dữ liệu
trình tự đoạn trình tự D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn (LSU-rRNA; 25/26/28S
rRNA) của các loài cùng chi trong ngân hàng gen, chúng tôi đã xây dựng cây phát
sinh loài tổng quát được thể hiện trên Hình 3.17.

91

Kết quả và biện luận

A.clavatonanicus NRRL 4741 (U28397)

92

A.giganteus NRRL 6136 (U28399)

76

A.longivesica NRRL 5215 (U28400)

99

A.clavatus NRRL 2254 (U28392)
61

99

A.pallidus NRRL 5811 (U28393)
A.phialisepticus NRRL 6113 (U28466)

99

9

A.unilateralis NRRL 577 (U28475)
A.clavato-flavus NRRL 5113 (U28912)

29

A.zonatus NRRL 5079 (U28911)
A.cervinus NRRL 3157 (U29800)

59

31

6

A.parvulus NRRL 2667 (U29807)
100

A.kanagawaensis NRRL 4774 (U29811)

67

A.nutans NRRL 4897 (U29810)

1

A.brunneo-uniseriatus NRRL 4273 (U29823)
A.proliferans NRRL 1908 (U29564)

98

A.xerophilus NRRL 6132 (U29849)
A.penicillioides NRRL 5125 (U29646)

97
2

A.gracilis NRRL 4962 (U29644)

93

A.caesiellus NRRL 5061 (U29645)

97
98

100

A.conicus NRRL 150 (U29635)

A.carneus NRRL 527 (U28847)
A.terreus NRRL 4017 (U28845)
A.pulvinus (U20822)

23
11

A.gorakhpurensis (U15490)

86
56

A.itaconicus (U15485)
A.flaschentraegeri (U15504)

68

A.dimorphicus (U15491)

99

18

91

A.wentii NRRL 382 (U15495)

A.aureofulgens (U28858)
48

A.iizukae (U28854)

7

A.campestris NRRL 13001 (U28766)
100

A.candidus NRRL 4809 (U28765)

A.nomius NRRL 6552 (U28907)
A.leporis NRRL 6599 (U28909)
76

A.lanosus NRRL 3648 (U28914)
64

A.terricola NRRL 426 (U15499)
71

A.thomii (U15488)
A.parasiticus NRRL 502 (U28892)

89

A.kambarensis NRRL 3751 (U28896)
67

A.subolivaceus NRRL 4998 (U28901)
A.oryzae NRRL 447 (U28890)
A.sojae NRRL 1988 (U28894)
A.avenaceus NRRL 517 (U15508)

A.flocculosus NRRL 5224 (EU021616)

100

A.pseudoelegans NRRL 35671 (EU021607)
A.carbonarius (U15472)

90

A.niger NRRL 363 (U28817)

97
74

13

A.phoenicis NRRL 4851 (U28822)
A.ellipticus NRRL 5120 (U28819)
68
100

30

A.aculeatus NRRL 360 (U28829)
A.japonicus NRRL A-661 (U28828)
S Q3 M2

A.sparsus (U17910)
34
41

A.anthodesmis (U17916)
A.panamensis NRRL 1785 (U29798)

68
70

A.conjunctus NRRL 5080 (U29796)
A.bisporus NRRL 3693 (U29814)

52

A.deflectus NRRL 4993 (U29795)
54

A.elongatus NRRL 5176 (U29799)

31

A.subsessilis NRRL 3752 (U29832)

25
86

A.raperi NRRL 5039 (U29822)
37
85

48
37

A.aeneus NRRL 4769 (U29826)
A.eburneo-cremeus NRRL 4773 (U29834)
A.crustosus NRRL 4988 (U29833)
A.mellinus NRRL 6328 (U29840)

50

A.egyptiacus NRRL 5920 (U29863)
A.multicolor NRRL 4775 (U29835)

16

A.aureolatus NRRL 5126 (U29828)

39

A.puniceus NRRL 4991 (U29792)

56
75

A.ustus NRRL 275 (U29791)

0.005

Hình 3.17: Cây phát sinh loài tổng quát của chủng S_Q3_M2 với các chủng khác
trong chi Aspergillus (số trình tự so sánh là 487 nucleotide)

92

Kết quả và biện luận

Chúng tôi tiếp tục dựng cây phát sinh loài chi tiết cho chủng S_Q3_M2 với
các loài so sánh là các loài trong cùng nhánh, có mối quan hệ họ hàng gần nhất với
chủng khảo sát để kết quả thể hiện rõ ràng hơn. Kết quả được thể hiện trên Hình
3.18.
A.conjunctus NRRL 5080 (U29796)

76

A.panamensis NRRL 1785 (U29798)

100
96

A.anthodesmis (U17916)
A.sparsus (U17910)

86

S Q3 M2
100
66

A.aculeatus NRRL 360 (U28829)
A.japonicus NRRL A-661 (U28828)
A.oryzae NRRL 447 (U28890)

A.ellipticus NRRL 5120 (U28819)
A.carbonarius (U15472)

66
98
65

A.niger NRRL 363 (U28817)
A.phoenicis NRRL 4851 (U28822)

0.005

Hình 3.18: Cây phát sinh loài chi tiết của chủng S_Q3_M2 với các chủng khác
trong chi Aspergillus (số trình tự so sánh là 533 nucleotide)
Từ cây phát sinh loài cho thấy chủng S_Q3_M2 cùng nhóm với loài
Aspergillus aculeatus và loài Aspergillus japonicus phù hợp với phương pháp
định danh dựa vào hình thái truyền thống, đây là nhóm Aspergillus mà thể bình
chỉ có một tầng.
Như vậy, từ các kết quả khảo sát về các đặc điểm về sinh thái của chủng
S_Q3_M2 và qua kết quả so sánh trình tự đoạn D1/D2 của rRNA tiểu đơn vị lớn
(LSU-rRNA; 25/26/28S rRNA) ta có thể kết luận chủng S_Q3_M2 phân lập
được là loài Aspergillus japonicus.
Như đề cập ở trên, chúng tôi đã chọn 2 chủng để tiến hành các thí
nghiệm khác, 2 chủng được sử dụng là chủng vi khuẩn S_CT_B2 và chủng nấm
men W_Q9_Y1, đây là 2 chủng cho hoạt tính lipase cao trong các chủng thu

93

Kết quả và biện luận

nhận được và là 2 chủng đại diện cho 2 nhóm vi sinh vật: chủng S_CT_B2 đại
diện cho nhóm vi khuẩn và chủng W_Q9_Y1 đại diện cho nhóm nấm.
Nhằm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận được lipase
ngoại bào có hoạt tính cao của 2 chủng trên, chúng tôi tiến hành khảo sát một số
yếu tố của môi trường cảm ứng sinh tổng hợp lipase.
Nhằm xác định được điều kiện hoạt động thích hợp của lipase thu nhận
từ 2 chủng trên, chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố
sinh lý, sinh hóa lên hoạt tính lipase thu nhận từ 2 chủng đó.
3.6. KHẢO SÁT YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG CẢM ỨNG
Sau khi tiến hành xác định hoạt tính lipase ngoại bào các chủng vi sinh vật
thu nhận được và quá trình định danh 5 chủng vi sinh vật (3 chủng vi khuẩn, 1
chủng nấm men và 1 chủng nấm mốc), chúng tôi chọn ra 2 chủng (1 chủng vi khuẩn
và 1 chủng nấm men) được coi là có nhiều tiềm năng ứng dụng nhất để tiến hành
khảo sát các yếu tố môi trường cảm ứng sinh lipase ngoại bào tối ưu và khảo sát
điều kiện hoạt động tối ưu của lipase của 2 chủng này.
Với mục đích xác định các điều kiện thích hợp của môi trường cảm ứng sự
sinh tổng hợp lipase từ chủng vi sinh vật, chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều
kiện của môi trường cảm ứng.
3.6.1. Nguồn cơ chất cảm ứng
Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số loại dầu thực vật khác
nhau là dầu nành, dầu mè, dầu olive và dầu hỗn hợp (dầu nành, dầu olein, dầu đậu
phộng và dầu hạt cải) lên khả năng tổng hợp lipase của 2 chủng S_CT_B2 và
W_Q9_Y1. Các loại dầu trên được nhũ hóa với PVA 2% và được bổ sung vào môi
trường cảm ứng với tỷ lệ 1%.
Lấy hoạt tính lipase do dầu olive cảm ứng làm chuẩn (100%) từ đó so sánh
% hoạt tính lipase do các loại cơ chất khác cảm ứng. Kết quả được trình bày ở Bảng
3.11 và Đồ thị 3.4.

94

Kết quả và biện luận

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến sự sinh tổng hợp lipase của
2 chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1
Chủng S_CT_B2

Chủng W_Q9_Y1

Hoạt tính

% hoạt tính

Hoạt tính

% hoạt tính

chung (UI/mL)

(%)

chung (UI/mL)

(%)

Dầu olive

9,40

100

10,18

100

Dầu nành

5,48

58

6,27

62

Dầu mè

7,05

75

7,83

77

Dầu hỗn hợp

3,92

42

4,70

46

120

% hoạt tính (%)

100
80

S_CT_B2

60

W_Q9_Y1

40
20
0
Dầu olive

Dầu nành

Dầu mè

Dầu hỗn hợp

Nguồn cơ chất

Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến sự sinh tổng hợp lipase của 2 chủng
S_CT_B2 và W_Q9_Y1
Kết quả ở Đồ thị 3.4 cho thấy: trong số các loại dầu thực vật sử dụng thì dầu
olive đã nhũ hóa là nguồn cơ chất cảm ứng tốt nhất cho sự tổng hợp lipase của cả 2
chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1. Trong khi đó, hoạt tính lipase tạo ra từ nguồn cảm
ứng là dầu hỗn hợp là thấp nhất (khoảng 42% ở chủng S_CT_B2 và 46% ở chủng
W_Q9_Y1 so với dầu olive).

95

Kết quả và biện luận

Như vậy, kết quả trên cũng phù hợp với các nghiên cứu ở các loài vi sinh vật
khác cho rằng dầu olive là chất cảm ứng tốt đối với khả năng sinh tổng hợp lipase
của đa số vi sinh vật.
3.6.2. Nồng độ cơ chất
Do triglyceride vừa là chất cảm ứng vừa là chất ức chế quá trình sinh tổng
hợp lipase nên chúng tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dầu olive lên hiệu
quả sản xuất lipase của 2 chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1. Kết quả được trình bày
trong Bảng 3.12 và Đồ thị 3.5.
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến sự sinh tổng hợp lipase của 2
chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1
Chủng S_CT_B2

Chủng W_Q9_Y1

Nồng độ dầu

Hoạt tính chung

Tổng hoạt tính

Hoạt tính

Tổng hoạt tính

olive (%)

(UI/mL)

(UI)

chung (UI/mL)

(UI)

0,6

3,13

31,33

5,37

53,67

0,8

4,70

47,00

7,67

76,67

1,0

7,83

78,33

8,43

84,33

1,2

9,40

94,00

13,03

130,33

1,4

12,53

125,33

17,63

176,33

1,6

15,67

156,67

13,80

138,00

1,8

10,97

109,67

11,50

115,00

2,0

6,27

62,67

9,20

92,00

2,2

5,48

54,83

6,90

69,00

2,4

3,92

39,17

6,13

61,33

96

Kết quả và biện luận

200.00

Tổng hoạt tính (UI)

180.00
160.00
140.00
120.00

S_CT_B2

100.00

W_Q9_Y1

80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

2.6

Nồng độ cơ chất (%)

Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến sự sinh tổng hợp lipase của 2
chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1
Từ Đồ thị 3.5 chúng tôi nhận thấy sự sinh tổng hợp lipase đạt hiệu quả tốt ở
nồng độ dầu olive từ 1,2% đến 1,8%, trong đó nồng độ tối ưu để chủng W_Q9_Y1
sinh tổng hợp lipase là 1,4% và chủng S_CT_B2 là 1,6%.
Ở nồng độ dầu olive trong khoảng (0,6 – 0,8)%, hoạt tính lipase tạo ra rất
thấp do cơ chất cảm ứng không đủ cho vi sinh vật sử dụng trong hoạt động sinh
tổng hợp.
Ngược lại, nồng độ dầu olive quá cao (2,0 – 2,4)% cũng ức chế tốc độ tăng
trưởng và phát triển của vi sinh vật, từ đó ức chế khả năng tổng hợp lipase.
Như vậy, nồng độ dầu olive 1% là giới hạn dưới của cơ chất còn nồng độ
1,8% là giới hạn trên (ức chế cơ chất).
3.6.3. pH của môi trường cảm ứng
pH của môi trường là một thông số quan trọng vì nó ảnh hưởng đến các hoạt
động biến dưỡng của vi sinh vật. Khảo sát pH của môi trường cảm ứng giúp xác
định giá trị pH thích hợp cho vi sinh vật tồn tại cũng như sản xuất lipase.
Môi trường cảm ứng sinh lipase được chỉnh về pH khảo sát từ 3,0 đến 12,0,
mỗi pH khảo sát cách nhau 1 đơn vị. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.13 và Đồ
thị 3.6.

97

Kết quả và biện luận

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh tổng hợp lipase của 2 chủng
S_CT_B2 và W_Q9_Y1
Chủng S_CT_B2

Chủng W_Q9_Y1

pH môi

Hoạt tính chung

Tổng hoạt tính

Hoạt tính

Tổng hoạt tính

trường

(UI/mL)

(UI)

chung (UI/mL)

(UI)

3,0

3,03

30,33

3,49

34,88

4,0

3,79

37,92

6,52

65,22

5,0

6,07

60,67

8,34

83,42

6,0

9,86

98,58

14,41

144,08

7,0

16,68

166,83

17,44

174,42

8,0

8,34

83,42

10,62

106,17

9,0

4,55

45,50

5,31

53,08

10,0

2,88

28,82

4,55

45,50

11,0

2,28

22,75

3,18

31,85

12,0

1,82

18,20

2,73

27,30

200.00

Tổng hoạt tính (UI)

180.00
160.00
140.00
120.00

S_CT_B2

100.00

W_Q9_Y1

80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

13.0

pH môi trường

Đồ thị 3.6: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh tổng hợp lipase của 2 chủng
S_CT_B2 và W_Q9_Y1
Từ kết quả ở Đồ thị 3.6 và Bảng 3.13 cho thấy:

98

Kết quả và biện luận

pH môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp lipase của 2 chủng S_CT_B2 và
chủng W_Q9_Y1 là pH (6,0 – 8,0), trong đó pH 7,0 lượng enzyme lipase tạo ra là
cao nhất (với tổng hoạt tính là 166,83 UI của chủng S_CT_B2 và 174,42 UI của
chủng W_Q9_Y1).
Tại pH môi trường acid (3,0 – 5,0) hay pH kiềm (9,0 – 12,0) làm ảnh hưởng
mạnh đến khả năng tăng trưởng và phát triển của cả 2 chủng, do đó cũng ảnh hưởng
đến khả năng sinh tổng hợp lipase.
Như vậy, pH 7,0 là pH môi trường thích hợp cho chủng S_CT_B2 và chủng
W_Q9_Y1 sinh tổng hợp lipase.
3.6.4. Thời gian nuôi cấy
Lipase là sản phẩm của quá trình lên men ngoại bào nên khi kết thúc quá
trình lên men cần phải nhanh chóng thu nhận protein để giảm tổn hao và bảo toàn
hoạt tính lipase khỏi các tác động của môi trường.
Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian cảm ứng để đảm bảo thu nhận
enzyme lipase có chất lượng tốt, thời gian khảo sát từ 1 ngày tới 6 ngày đối với
chủng S_CT_B2 và từ 4 ngày tới 8,5 ngày đối với chủng W_Q9_Y1. Kết quả được
thể hiện trong Bảng 3.14 và Đồ thị 3.7.
Bảng 3.14: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp lipase của 2
chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1
Chủng S_CT_B2

Chủng W_Q9_Y1

Thời gian nuôi

Hoạt tính

Tổng hoạt tính

Hoạt tính

Tổng hoạt tính

cấy (ngày)

chung (UI/mL)

(UI)

chung (UI/mL)

(UI)

1,0

0,76

7,58

2,0

3,03

30,33

2,5

7,58

75,83

3,0

12,89

128,92

3,5

15,93

159,25

4,0

8,34

83,42

5,92

59,15

99

Kết quả và biện luận

Chủng S_CT_B2

Chủng W_Q9_Y1

Thời gian nuôi

Hoạt tính

Tổng hoạt tính

Hoạt tính

Tổng hoạt tính

cấy (ngày)

chung (UI/mL)

(UI)

chung (UI/mL)

(UI)

4,5

6,52

65,22

8,34

83,42

5,0

5,61

56,12

9,86

98,58

5,5

4,40

43,98

15,93

159,25

6,0

3,19

31,85

18,20

182,00

6,5

14,41

144,08

7,0

12,13

121,33

7,5

9,10

91,00

8,0

7,58

75,83

8,5

4,25

42,47

200.00
180.00
Tổng hoạt tính (UI)

160.00
140.00
120.00

S_CT_B2

100.00

W_Q9_Y1

80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

Thời gian (ngày)

Đồ thị 3.7: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp lipase của 2
chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1
Kết quả thể hiện trong Đồ thị 3.7 cho thấy:
Ở chủng S_CT_B2: Hoạt tính lipase thu được cao nhất ở ngày thứ 3,5 với
tổng hoạt tính thu được là 159,25 UI. Như vậy, thời gian tốt cho quá trình thu nhận
lipase là 3,5 ngày.

100

Kết quả và biện luận

Ở chủng W_Q9_Y1: Hoạt tính lipase thu được cao nhất ở ngày thứ 6 với
tổng hoạt tính thu được là 182,0 UI. Như vậy, thời gian tốt cho quá trình thu nhận
lipase là 6 ngày.
3.6.5. Nhiệt độ nuôi cấy
Mỗi loài vi sinh vật khác nhau có nhiệt độ thích hợp khác nhau để tăng
trưởng, sinh tổng hợp, chuyển hóa cơ chất, ... khác nhau, do đó, chúng tôi tiến hành
khảo sát nhiệt độ thích hợp cho quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp lipase của 2 chủng,
nhiệt độ được khảo sát từ 20 0C đến 45 0C, mỗi thí nghiệm cách nhau 5 0C. Kết quả
được thể hiện trong Bảng 3.15 và Đồ thị 3.8.
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp lipase của 2
chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1
Chủng S_CT_B2

Chủng W_Q9_Y1

Nhiệt độ nuôi

Hoạt tính

Tổng hoạt tính

Hoạt tính

Tổng hoạt tính

cấy (0C)

chung (UI/mL)

(UI)

chung (UI/mL)

(UI)

20

4,55

45,50

5,16

51,57

25

6,82

68,25

7,58

75,83

30

9,10

91,00

10,92

109,20

35

13,65

136,50

15,93

159,25

40

8,34

83,42

5,31

53,08

45

4,85

48,53

2,73

27,30

101

Kết quả và biện luận

180.00

Tổng hoạt tính (UI)

160.00
140.00
120.00
100.00

S_CT_B2
W_Q9_Y1

80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

0

Nhiệt độ nuôi cấy ( C)

Đồ thị 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp lipase của 2
chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1
Tóm lại: điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận lipase từ chủng vi khuẩn
S_CT_B2 là nuôi cấy trong môi trường cảm ứng có pH 7,0 với cơ chất là dầu olive
nồng độ 1,6% được nhũ hóa và sau 3,5 ngày nuôi cấy lắc ở 35 0C. Trong khi đó,
điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận lipase của chủng nấm men W_Q9_Y1 là
môi trường cảm ứng có pH 7,0, cơ chất là dầu olive nồng độ 1,4% được nhũ hóa và
sau 6 ngày nuôi cấy lắc ở 35 0C.
Sau khi xác định được một số điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận
lipase ngoại bào của 2 chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1, chúng tôi tiến hành nuôi cấy
2 chủng trong điều kiện thích hợp trên để thu nhận lipase ngoại bào và tiến hành
khảo sát hoạt tính của lipase thu nhận được trong các thí nghiệm tiếp theo nhằm đưa
ra tiềm năng ứng dụng của lipase thu được.
3.7. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPASE
3.7.1. Đường chuẩn albumin dùng trong phương pháp Bradford
Để xác định hàm lượng protein trong dịch enzyme mẫu, đầu tiên chúng tôi
tiến hành xây dựng đường chuẩn albumin. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.16.
Từ sự tương quan giữa nồng độ albumin và giá trị ΔOD595 chúng tôi xây dựng
đường chuẩn albumin (Đồ thị 3.9).

102

Kết quả và biện luận

Bảng 3.16: Tương quan giữa giá trị ΔOD595 và nồng độ albumin
Nồng độ Albumin

0

10

20

30

40

50

OD595

0,228

0,271

0,322

0,368

0,418

0,461

ΔOD595

0,000

0,043

0,094

0,140

0,190

0,233

(mg/mL)

ΔOD595
0.250
0.200

y = 0.005x
2

R = 0.999

0.150
0.100
0.050

μg/mL

0.000
0

10

20

30

40

50

60

Đồ thị 3.9: Đường chuẩn albumin
Đường chuẩn có hệ số gốc là 0,005 và độ tin cậy R2 là 0,999. Căn cứ vào
đường chuẩn vừa dựng được, hàm lượng protein được suy ra từ công thức
y = 0,005x
Với

y: giá trị ΔOD595
x: hàm lượng protein (µg/mL)

Để đảm bảo tính chính xác, dung dịch enzyme mẫu được pha loãng sao cho
giá trị ΔOD595 nằm trong đường chuẩn.
Sau khi thu nhận được enzyme lipase, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng
xúc tác phản ứng thủy giải lipid của lipase dưới tác động của các yếu tố hóa lý khác
nhau.

103

Kết quả và biện luận

3.7.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipase
Lipase nói riêng và enzyme nói chung rất nhạy cảm đối với pH vì pH thay
đổi sẽ ảnh hưởng đến trạng thái ion của enzyme, do đó enzyme có thể bị mất hoạt
tính khi pH quá kiềm hay quá acid (biến tính bởi pH). Khảo sát ảnh hưởng của pH
đến hoạt tính lipase giúp xác định được pH tối ưu cho hoạt động của lipase.
Từ lượng enzyme thô thu nhận được chúng tôi hòa tan với nước cất tiệt trùng
và xác định hàm lượng protein của dung dịch này theo phương pháp Bradford, kết
quả hàm lượng protein thu nhận từ chủng S_CT_B2 là 0,163 mg/mL và từ chủng
W_Q9_Y1 là 0,144 mg/mL.
Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipase thu nhận từ 2 chủng được ghi
nhận trong Bảng 3.17 và Đồ thị 3.10.
Bảng 3.17: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipase của 2 chủng S_CT_B2 và
W_Q9_Y1
pH

Chủng S_CT_B2

Chủng W_Q9_Y1

Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(UI/mL)

(UI/mg protein)

4,0

4,65

28,56

3,22

22,33

5,0

5,43

33,32

5,83

40,41

6,0

7,75

47,60

8,89

61,67

6,5

9,15

56,17

13,65

94,64

7,0

12,25

75,21

19,01

131,85

7,5

14,73

90,45

11,19

77,62

8,0

19,07

117,11

5,98

41,47

8,5

13,95

85,69

4,14

28,71

9,0

5,89

36,18

2,91

20,20

10,0

2,02

12,38

2,15

14,89

104

Kết quả và biện luận

Hoạt tính riêng (UI/mg protein)

140.00
120.00
100.00
80.00

S_CT_B2

60.00

W_Q9_Y1

40.00
20.00
0.00
3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

pH

Đồ thị 3.10: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lipase của 2 chủng S_CT_B2 và
W_Q9_Y1
Đồ thị 3.10 cho thấy:
Enzyme lipase thu nhận từ chủng S_CT_B2 hoạt động thích hợp trong
khoảng pH từ 7,0 đến 8,5. Trong đó hoạt tính lipase đạt tối ưu tại pHopt 8,0. Như
vậy, lipase thu nhận từ chủng S_CT_B2 là lipase kiềm.
Enzyme lipase thu nhận từ chủng W_Q9_Y1 hoạt động thích hợp trong
khoảng pH từ 6,5 đến 7,5. Trong đó hoạt tính lipase đạt tối ưu tại pHopt 7,0. Như
vậy, lipase thu nhận từ chủng W_Q9_Y1 là lipase trung tính.
3.7.3. Khảo sát tính bền của lipase theo pH
Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme sau 24 giờ bảo quản
trong dung dịch đệm và so sánh với hoạt tính lipase ban đầu, từ đó suy ra % hoạt
tính bị mất trong quá trình bảo quản.
Dung dịch enzyme sử dụng trong thí nghiệm này có hàm lượng là 0,163
mg/mL thu nhận từ chủng S_CT_B2 và từ chủng W_Q9_Y1 là 0,144 mg/mL.
Kết quả tính bền của lipase theo pH được thể hiện trong Bảng 3.18, Bảng
3.19 và Đồ thị 3.11.

105

Kết quả và biện luận

Bảng 3.18: Ảnh hưởng của pH đến độ bền lipase của chủng S_CT_B2
Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

% hoạt tính

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(%)

Đối chứng

19,07

117,11

100,0

4,0

4,96

30,47

26,0

5,0

5,43

33,32

28,5

6,0

6,51

39,99

34,1

6,5

8,22

50,46

43,1

7,0

9,15

56,17

48,0

7,5

10,23

62,84

53,7

8,0

13,18

80,93

69,1

8,5

9,77

59,98

51,2

9,0

7,44

45,70

39,0

10,0

2,94

18,09

15,4

pH

Bảng 3.19: Ảnh hưởng của pH đến độ bền lipase của chủng W_Q9_Y1
Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

% hoạt tính

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(%)

Đối chứng

19,01

131,85

100,0

4,0

3,22

22,33

16,9

5,0

3,99

27,65

21,0

6,0

4,91

34,03

25,8

6,5

5,83

40,41

30,6

7,0

11,65

80,81

61,3

7,5

10,12

70,18

53,2

8,0

5,37

37,22

28,2

8,5

2,76

19,14

14,5

9,0

1,84

12,76

9,7

10,0

0,77

5,32

4,0

pH

106

Kết quả và biện luận

80.0

% Hoạt tính (%)

70.0
60.0
50.0

S_CT_B2
W_Q9_Y1

40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
4.0

5.0

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

10.0

pH

Đồ thị 3.11: Ảnh hưởng của pH đến độ bền lipase của chủng S_CT_B2 và
W_Q9_Y1
Ở chủng S_CT_B2 cho thấy enzyme lipase giữ được hoạt tính cao nhất sau
24 giờ bảo quản trong dung dịch đệm pH 8,0 ở 4 0C (giữ được 69,1% hoạt tính so
với trước khi xử lý), kế đến là pH 7,5 (53,7%). Hoạt tính lipase giảm mạnh tại pH
acid (4,0 – 6,5) và pH quá kiềm (9,0 và 10,0).
Ở chủng W_Q9_Y1 cho thấy enzyme lipase giữ được hoạt tính cao nhất sau
24 giờ bảo quản trong dung dịch đệm pH 7,0 ở 4 0C (giữ được 61,3% hoạt tính so
với trước khi xử lý). Kế đến là pH 7,5 (53,2%). Hoạt tính lipase giảm mạnh tại pH
acid (4,0 – 6,5) và pH quá kiềm (8,5 – 10,0). Như vậy, ở chủng W_Q9_Y1 giá trị
pH 7,0 vừa là pH tối ưu của môi trường cảm ứng sinh lipase vừa là pH tốt nhất cho
sự ổn định của lipase.
3.7.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính lipase
Nhiệt độ là một thông số quan trọng ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng và hoạt
tính lipase. Chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính của lipase dưới các điều kiện
nhiệt độ khác nhau để tìm khoảng nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme.
Hàm lượng protein đo được trong dịch enzyme theo phương pháp Bradford
là 0,139 mg/mL thu nhận từ chủng S_CT_B2 và từ chủng W_Q9_Y1 là 0,132
mg/mL.

107

Kết quả và biện luận

Khảo sát hoạt tính của lipase trong khoảng nhiệt độ (20 – 70) 0C. Kết quả
được trình bày trong Bảng 3.20 và Đồ thị 3.12.
Bảng 3.20: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính lipase của 2 chủng S_CT_B2 và
W_Q9_Y1
Nhiệt

Chủng S_CT_B2

độ (0C) Hoạt tính chung
20
25
30
35
40
45
50
55
60
70

Chủng W_Q9_Y1

Hoạt tính riêng

Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(UI/mL)

(UI/mg protein)

3,68
4,32
6,24
7,36
8,80
12,96
16,32
10,88
4,48
3,20

26,51
31,12
44,96
53,03
63,40
93,37
117,58
78,39
32,28
23,05

7,21
8,30
14,73
18,33
12,38
6,74
3,92
2,98
2,51
1,10

54,51
62,81
111,40
138,65
93,62
50,96
29,63
22,52
18,96
8,30

Hoạt tính riêng (UI/mg protein)

160.00
140.00
120.00
100.00

S_CT_B2

80.00

W_Q9_Y1

60.00
40.00
20.00
0.00
15

25

35

45

55

65

75

0

Nhiệt độ ( C)

Đồ thị 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính lipase của 2 chủng S_CT_B2 và
W_Q9_Y1

108

Kết quả và biện luận

Kết quả thể hiện trong Đồ thị 3.12 cho thấy, hoạt tính của lipase từ chủng
S_CT_B2 có nhiệt độ tối ưu ở 50 0C. Trong khoảng nhiệt độ dưới 50 0C, hoạt tính
lipase tỷ lệ thuận với độ tăng của nhiệt độ, do nhiệt độ tăng làm tăng động năng của
các phân tử tham gia phản ứng từ đó gia tăng vận tốc phản ứng và hoạt tính của
lipase. Tương tự đối với chủng W_Q9_Y1, nhiệt độ hoạt động tối ưu của lipase là
35 0C.
Khi nhiệt độ tăng cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính lipase bắt đầu giảm dần
và hầu như bị bất hoạt ở 700C. Nguyên nhân là do động năng của các phân tử tham
gia phản ứng tăng quá mức làm đứt gãy các nối thứ cấp, phá vỡ cấu hình không
gian chuẩn, từ đó làm mất hoạt tính lipase.
3.7.5. Khảo sát tính bền của lipase theo nhiệt độ
Giống như pH, nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến tính bền của lipase. Khảo sát
ảnh hưởng của nhiệt độ lên tính bền của lipase giúp chúng tôi xác định được nhiệt
độ bảo quản thích hợp cho lipase.
Lấy hoạt tính lipase trước khi khảo sát làm chuẩn (100%), các hoạt tính sau
khi khảo sát được quy đổi về % hoạt tính dựa theo hoạt tính chuẩn.
Hàm lượng protein đo được trong dịch enzyme theo phương pháp Bradford
là 0,139 mg/mL thu nhận từ chủng S_CT_B2 và từ chủng W_Q9_Y1 là 0,132
mg/mL.
Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.21, Bảng 3.22 và Đồ thị 3.13.
Bảng 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tính bền lipase của chủng S_CT_B2
Nhiệt độ

Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

% hoạt tính

(0C)

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(%)

Đối chứng
4
25
30
35
40
50
60
70

16,32
16,32
15,36
13,76
11,68
9,76
8,64
4,96
1,12

117,58
117,58
110,66
99,14
84,15
70,32
62,25
35,73
8,07

100,0
100,0
94,1
84,3
71,6
59,8
52,9
30,4
6,9

109

Kết quả và biện luận

Bảng 3.22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tính bền lipase của chủng W_Q9_Y1
Nhiệt độ

Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

% hoạt tính

(0C)

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(%)

Đối chứng
4
25
30
35
40
50
60
70

18,33
18,33
16,76
14,88
13,94
11,59
6,11
2,19
0,63

138,65
138,65
126,80
112,58
105,47
87,70
46,22
16,59
4,74

100,0
100,0
91,5
81,2
76,1
63,2
33,3
12,0
3,4

120.0

% Hoạt tính (%)

100.0
80.0

S_CT_B2
W_Q9_Y1

60.0
40.0
20.0
0.0
4

25

30

35

40

50

60

70

0

Nhiệt độ ( C)

Đồ thị 3.13: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tính bền lipase của 2 chủng S_CT_B2 và
W_Q9_Y1
Kết quả thể hiện trong Đồ thị 3.13 cho thấy enzyme lipase của 2 chủng
S_CT_B2 và W_Q9_Y1 khá ổn định với hoạt tính giảm không đáng kể khi giữ ở 25
0

C trong 1 giờ (giữ được 94,1% hoạt tính đối với chủng S_CT_B2 và 91,5% hoạt

tính đối với chủng W_Q9_Y1). Hoạt tính được bảo toàn khi bảo quản ở 4 0C trong 1
giờ.
Hoạt tính của lipase giảm dần khi nhiệt độ ủ tăng và chỉ còn 6,9% hoạt tính
đối với chủng S_CT_B2 và 3,4% hoạt tính đối với chủng W_Q9_Y1 khi ủ ở 70 0C.

110

Kết quả và biện luận

Như vậy, nhiệt độ bảo quản dung dịch tối ưu của lipase từ hai chủng là 40C.
Tuy nhiên, kết quả cho thấy lipase từ 2 chủng khảo sát dễ bị mất hoạt tính
khi bảo quản ở dạng dung dịch. Do đó, chúng tôi đề nghị nên tiến hành bảo quản
lipase ở dạng bột trong điều kiện nhiệt độ lạnh (dưới 00C) và chỉ nên hòa vào dung
dịch đệm khi sử dụng.
3.7.6. Ảnh hưởng của cơ chất đến hoạt tính lipase
Mỗi loại lipase có tính chuyên biệt về cơ chất khác nhau. Trong luận văn
này, chúng tôi khảo sát hoạt tính của lipase từ 2 chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1 trên
các loại dầu khác nhau gồm: dầu olive, dầu nành, dầu mè, dầu hỗn hợp (dầu nành,
dầu olein, dầu phộng và dầu canola).
Lấy dầu olive làm chuẩn (100%), hoạt tính lipase khảo sát từ các dầu khác
được quy đổi ra % hoạt tính dựa trên hoạt tính của dầu olive.
Hàm lượng protein đo được trong dịch enzyme theo phương pháp Bradford
là 0,128 mg/mL thu nhận từ chủng S_CT_B2 và từ chủng W_Q9_Y1 là 0,117
mg/mL.
Kết quả được trình bày trong Bảng 3.23, Bảng 3.24 và Đồ thị 3.14.
Bảng 3.23: Ảnh hưởng các loại dầu lên hoạt tính lipase của chủng S_CT_B2
Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

% hoạt tính

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(%)

Dầu olive

15,79

123,77

100

Dầu nành

7,36

57,68

46,6

Dầu mè

10,43

81,71

66,0

Dầu hỗn hợp

5,21

40,86

33,0

Cơ chất

Bảng 3.24: Ảnh hưởng các loại dầu lên hoạt tính lipase của chủng W_Q9_Y1
Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

% hoạt tính

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(%)

Dầu olive

18,14

155,53

100

Dầu nành

9,92

85,08

54,7

Cơ chất

111

Kết quả và biện luận

Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

% hoạt tính

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(%)

Dầu mè

13,49

115,65

74,4

Dầu hỗn hợp

5,74

49,19

31,6

Cơ chất

120.0

% hoạt tính (%)

100.0
80.0

S_CT_B2

60.0

W_Q9_Y1

40.0
20.0
0.0
Dầu olive

Dầu nành

Dầu mè

Dầu hỗn hợp

Nguồn cơ chất

Đồ thị 3.14: Ảnh hưởng các loại dầu lên hoạt tính lipase của 2 chủng S_CT_B2 và
W_Q9_Y1
Kết quả thể hiện trong Đồ thị 3.14 cho thấy enzyme lipase của 2 chủng có
hoạt tính trên cả 4 loại cơ chất. Tuy nhiên, vận tốc thủy phân của nó với các loại dầu
khác nhau thì khác nhau. Trong cùng một khoảng thời gian phản ứng là 30 phút thì
lipase thủy phân dầu olive tốt hơn so với các loại dầu còn lại. Điều này một phần là
do chất lượng khác nhau của các loại dầu, một phần do thành phần chất béo của các
loại dầu trên. Cả 4 loại dầu trên đều chứa 3 loại chất béo: không bão hòa đa, không
bão hòa đơn và bão hòa, tuy nhiên tỷ lệ các chất trên lại khác nhau (Phụ lục IV).
Theo phần Phụ lục IV, trong các loại dầu thực vật sử dụng thì dầu olive có
hàm lượng chất béo không bão hòa đơn là cao nhất (80%), tiếp đến là dầu mè (42%)
và dầu nành (24%). Chúng tôi nhận thấy điều này tương ứng với hoạt tính lipase ở
từng loại dầu, do đó, chúng tôi đưa ra giả thiết là hoạt tính của enzyme lipase từ 2
chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1 tỷ lệ thuận với hàm lượng chất béo không bão hòa
đơn trong cơ chất.

112

Kết quả và biện luận

3.7.7. Ảnh hưởng của EDTA và cation đến hoạt tính lipase
Như đã biết enzyme lipase hoạt động không cần hỗ trợ từ cofactor hay
coenzyme, tuy nhiên sự hiện hiện của một số cation cũng sẽ làm tăng hoạt tính của
nó. Ngoài ra trong các nghiên cứu trên lipase của những vi sinh vật khác, EDTA
được biết đến là chất có khả năng kìm hãm mạnh đối với hoạt tính của lipase.
Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số ion
kim loại và EDTA đến hoạt tính của lipase từ hai chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1
qua đó giúp lipase hoạt động tốt hơn.
Hàm lượng protein đo được trong dịch enzyme theo phương pháp Bradford
là 0,102 mg/mL thu nhận từ chủng S_CT_B2 và từ chủng W_Q9_Y1 là 0,092
mg/mL.
Kết quả được trình bày trong Bảng 3.25, Bảng 3.26 và Đồ thị 3.15.
Bảng 3.25: Ảnh hưởng của EDTA và cation đến hoạt tính lipase của chủng
S_CT_B2
Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

% hoạt tính

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(%)

Mẫu chứng

14,57

138,20

100,0

Ca2+

17,10

162,24

117,4

Cu2+

12,19

115,67

83,7

Fe2+

4,43

42,06

30,4

K+

11,40

108,16

78,3

Mg2+

15,83

150,22

108,7

Mn2+

10,93

103,65

75,0

Na+

10,45

99,15

71,7

EDTA

3,80

36,05

26,1

113

Kết quả và biện luận

Bảng 3.26: Ảnh hưởng của EDTA và cation đến hoạt tính lipase của chủng
W_Q9_Y1
Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

% hoạt tính

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(%)

Mẫu chứng

17,79

192,50

100,0

Ca2+

21,77

235,64

122,4

Cu2+

15,49

167,60

87,1

Fe2+

13,65

147,69

76,7

K+

11,81

127,78

66,4

Mg2+

19,78

214,07

111,2

Mn2+

17,02

184,20

95,7

Na+

11,65

126,12

65,5

EDTA

7,82

84,63

44,0

140.0

% Hoạt tính (%)

120.0
100.0

S_CT_B2
W_Q9_Y1

80.0
60.0
40.0
20.0
0.0
Mẫu
chứng

Ca2+

Cu2+

Fe2+

K+

Mg2+

Mn2+

Na+

EDTA

Đồ thị 3.15: Ảnh hưởng của EDTA và cation đến hoạt tính lipase của 2 chủng
S_CT_B2 và W_Q9_Y1
Kết quả thể hiện trong Đồ thị 3.15 cho thấy:
Ở chủng S_CT_B2 hoạt tính của lipase chỉ còn lại 26,1% khi có sự hiện diện
của EDTA. Các cation Cu2+, Fe2+, K+, Mn2+ và Na+ cũng là các chất kìm hãm đối
với lipase của chủng S_CT_B2, trong đó Fe2+ là các chất kìm hãm mạnh hoạt tính

114

Kết quả và biện luận

lipase chỉ còn 30,4%. Ngược lại, ion Ca2+ và Mg2+ có tác dụng tăng hoạt tính lipase,
đặc biệt Ca2+ giúp lipase tăng đến 17,4% hoạt tính.
Tương tự ở chủng W_Q9_Y1, sự hiện diện của EDTA cũng làm giảm hoạt
tính lipase chỉ còn 44,0% so với không xử lý, các ion Cu2+, Fe2+, K+, Mn2+ và Na+
cũng là các chất kìm hãm nhẹ đối với lipase của chủng W_Q9_Y1. Tương tự như
chủng S_CT_B2 ion Ca2+ và Mg2+ cũng có tác dụng làm tăng hoạt tính lipase, trong
đó Ca2+ giúp lipase tăng đến 22,4% hoạt tính.
Như vậy trong phạm vi phòng thí nghiệm khi thực hiện những phản ứng cần
xúc tác của lipase, chúng tôi đề nghị tiến hành ủ lipase với dung dịch CaCl2 11mM
trong 1 giờ ở 40C với tỷ lệ 1:1 trước khi tiến hành phản ứng.
3.7.8. Ảnh hưởng của chất tẩy đến hoạt tính lipase
Chúng tôi tiến hành khảo sát độ ổn định của lipase từ 2 chủng S_CT_B2 và
W_Q9_Y1 dưới ảnh hưởng của một số chất tẩy ở nồng độ 10% (w/v). Các chất tẩy
sử dụng là CTAB, SDS, Tween 20, Tween 80 và Triton X-100.
Hàm lượng protein đo được trong dịch enzyme theo phương pháp Bradford
là 0,133 mg/mL thu nhận từ chủng S_CT_B2 và từ chủng W_Q9_Y1 là 0,129
mg/mL.
Kết quả được trình bày trong Bảng 3.27, Bảng 3.28 và Hình 3.16.
Bảng 3.27: Ảnh hưởng của chất tẩy đến hoạt tính lipase của chủng S_CT_B2
Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

% hoạt tính

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(%)

Mẫu chứng

15,84

119,48

100,0

CTAB

3,59

27,10

22,7

SDS

2,78

20,94

17,5

Tween 80

4,90

36,95

30,9

Tween 20

5,88

44,34

37,1

Triton X-100

3,92

29,56

24,7

115

Kết quả và biện luận

Bảng 3.28: Ảnh hưởng của chất tẩy đến hoạt tính lipase của chủng W_Q9_Y1
Hoạt tính chung

Hoạt tính riêng

% hoạt tính

(UI/mL)

(UI/mg protein)

(%)

Mẫu chứng

18,92

146,17

100,0

CTAB

3,72

28,74

19,7

SDS

5,17

39,98

27,4

Tween 80

6,31

48,72

33,3

Tween 20

7,11

54,97

37,6

Triton X-100

5,66

43,73

29,9

120.0

% Hoạt tính (%)

100.0
80.0

S_CT_B2
W_Q9_Y1

60.0
40.0
20.0
0.0
Mẫu chứng

CTAB

SDS

Tween 80

Tween 20

Triton X-100

0

Nhiệt độ ( C)

Đồ thị 3.16: Ảnh hưởng của chất tẩy đến hoạt tính lipase của 2 chủng S_CT_B2 và
W_Q9_Y1
Kết quả thể hiện trong Đồ thị 3.16 cho thấy cả hai enzyme lipase thu nhận từ
hai chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1 đều bị kìm hãm (chỉ giữ được khoảng (15 –
40)% hoạt tính ban đầu) sau khi ủ 1 giờ ở 40C với các loại chất tẩy. Hoạt tính giảm
theo độ mạnh của các loại chất tẩy: Tween 20 < Tween 80 < Triton X-100 < CTAB
< SDS. Ở đây ta nhận thấy CTAB và Triton X-100 gây kìm hãm mạnh đến hoạt tính
lipase thu từ 2 chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1 và SDS làm hoạt tính lipase giảm đến
khoảng 80% sau khi ủ 1 giờ ở 350C.

116

Kết quả và biện luận

3.7.9. Khảo sát hoạt tính lipase của 2 chủng ở các điều kiện hoạt động tối ưu
Từ kết quả khảo sát hoạt tính lipase dưới ảnh hưởng của các yếu tố hóa lý,
chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính lipase từ 2 chủng S_CT_B2 và W_Q9_Y1 ở
các điều kiện hoạt động tối ưu.
™ Hoạt tính lipase thu nhận từ chủng S_CT_B2:
Enzyme sau khi thu nhận được hòa với 10 mL dung dịch đệm Sorensen pH
8,0.
Hàm lượng protein được xác định dựa trên phương pháp Bradford là 2,16
mg/mL, vậy tổng hàm lượng protein thu nhận từ dịch nuôi là 21,60 mg.
Enzyme lipase được định hoạt tính ở các điều kiện phản ứng tối ưu vừa khảo
sát có kết quả là 143,49 UI/mg protein. Tổng hoạt tính lipase thu nhận từ 500 mL
môi trường cảm ứng là 3099,38 UI.
Vậy, hoạt tính lipase thu nhận từ 1 mL môi trường cảm ứng là 6,20 UI/mL
™ Hoạt tính lipase thu nhận từ chủng W_Q9_Y1:
Enzyme sau khi thu nhận được hòa với 10 mL dung dịch đệm Sorensen pH
7,0.
Hàm lượng protein được xác định dựa trên phương pháp Bradford là 2,84
mg/mL, vậy tổng hàm lượng protein thu nhận từ dịch nuôi là 28,40 mg.
Enzyme lipase được định hoạt tính ở các điều kiện phản ứng tối ưu vừa khảo
sát có kết quả là 319,18 UI/mg protein. Tổng hoạt tính lipase thu nhận từ 500 mL
môi trường cản ứng là 9064,71 UI.
Vậy, hoạt tính lipase thu nhận từ 1 mL môi trường cảm ứng là 18,13 UI/mL.
Kết luận:
Enzyme lipase ngoại bào thu nhận từ chủng S_CT_B2 là một lipase kiềm
(hoạt động thích hợp ở pH 8,0), tương đối ổn định ở pH kiềm (giữ được 69,1% hoạt
tính ban đầu sau khi bảo quản trong dung dịch đệm pH 8,0 ở 4 0C trong 24 giờ),
hoạt động tốt ở 50 0C, bị ức chế bởi đa số các cation ngoại trừ Ca2+ và Mg2+ làm
tăng hoạt tính lipase và bị kìm hãm bởi đa số các chất tẩy mạnh. Do đó, chúng tôi

117

Kết quả và biện luận

nhận thấy lipase ngoại bào thu nhận từ chủng S_CT_B2 có tiềm năng ứng dụng làm
nguyên liệu bổ sung vào bột giặt hay các ứng dụng khác.
Enzyme lipase ngoại bào thu nhận từ chủng W_Q9_Y1 là một lipase trung
tính (hoạt động thích hợp ở pH 7,0), ổn định ở pH trung tính (giữ được 61,3% hoạt
tính ban đầu sau khi bảo quản trong dung dịch đệm pH 7,0 ở 4 0C trong 24 giờ),
hoạt động tốt nhất ở 35 0C, bị ức chế bởi đa số các cation ngoại trừ Ca2+ và Mg2+
làm tăng hoạt tính lipase và bị kìm hãm bởi đa số các chất tẩy mạnh. Do đó, lipase
thu nhận từ chủng W_Q9_Y1 không thích hợp để ứng dụng trong ngành công
nghiệp tẩy rửa, tuy nhiên, chúng sẽ có tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh vực khác,
do lipase này có hoạt tính cao trong điều kiện hoạt động thích hợp (pH 7,0 ở 35 0C),
dễ thu nhận, hoạt tính thu nhận từ 1 mL môi trường cảm ứng cao (18,13 UI/mL).
Khi tiến hành so sánh về tiềm năng ứng dụng của 2 chủng S_CT_B2 và
W_Q9_Y1 chúng tôi nhận thấy:
– Thời gian nuôi cấy để thu nhận enzyme lipase ngoại bào từ chủng
S_CT_B2 (3,5 ngày) nhanh hơn rất nhiều so với chủng W_Q9_Y1 (6 ngày).
– Ngày nay, trên thế giới enzyme lipase được quan tâm nhiều nhất là enzyme
lipase kiềm, do ứng dụng lớn nhất của enzyme lipase là trong ngành công
nghiệp tẩy rửa, vì thế, tiềm năng ứng dụng của enzyme lipase thu nhận từ
chủng S_CT_B2 cao hơn so với lipase thu nhận từ chủng W_Q9_Y1, do
lipase thu nhận từ chủng S_CT_B2 là lipase kiềm và hoạt động tốt ở nhiệt
độ tương đối cao (50 0C).
– Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy, mặc dù để thu nhận lipase từ chủng
W_Q9_Y1 tương đối lâu (6 ngày), nhưng bù lại enzyme thu được có hoạt
tính cao hơn rất nhiều so với chủng S_CT_B2 (18,13 UI/mL môi trường
cảm ứng từ chủng W_Q9_Y1 so với 6,20 UI/mL môi trường cảm ứng của
chủng S_CT_B2). Do đó, chủng W_Q9_Y1 cũng có tiềm năng ứng dụng
cao trong sản xuất lipase, enzyme lipase thu nhận có thể được ứng dụng
trong các lĩnh vực khác như: chuyển hóa sinh học, biosensor, công nghiệp
thực phẩm, công nghiệp giấy và bột giấy,…

4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ