ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN

L. O. POPA, I. MOANŢĂ, F. RAICU, D. CIMPONERIU, G. BORDEIANU, P. APOSTOL, L. DAN, O. POPA Institutul de Genetica al Universitatii din Bucuresti Aleea Portocalilor Nr.1-3 Sector 6 Bucuresti

Introducere
Termenul “genom” a fost introdus in anul 1920 de catre botanistul german Hans Winkler, pentru a desemna setul haploid de cromozomi al unui organism eucariot. Termenul a fost extins pentru a se putea folosi si la organismele non-eucariote, genomul desemnand in acest caz cantitatea de material genetic ce defineste zestrea ereditara a unui organism. Genomul nu este insa doar o suma a partilor sale componente, datorita faptului ca diferite tipuri de interactiuni, functionale, evolutive, apar intre diferitele parti ale genomului, mai ales intre secventele sale codificatoare si cele necodificatoare. Genomul uman poate fi impartit in doua componente: genomul nuclear si genomul mitocondrial. Cele doua componente au putine lucruri in comun, atat in ceea ce priveste organizarea cat si in ceea ce priveste expresia genelor. In fapt, cele doua componente pot fi privite ca fiind doua sisteme genetice separate si independente. In cele ce urmeaza ne vom referi doar la componenta nucleara a genomului uman.

Dimensiune Dimensiunea totala a genomului nuclear uman este estimata, in urma ultimelor descoperiri realizate in cadrul Proiectului Genomului Uman, la aproximativ 3000Mb, dimensiune conforma, de altfel, cu estimarile anterioare. Genomul nuclear este impartit intrun numar de molecule ADN individuale, fiecare dintre acestea fiind continuta si formand un cromozom diferit. Aceste molecule de ADN sunt liniare. In majoritatea celulelor din organismul uman exista doua copii ale fiecarui cromozom, deci doua copii ale fiecarei gene. Acest ansamblu formeaza ceea ce este denumit complementul diploid; termenul haploid se refera la situatia intalnita de obicei in celulele germinale, unde nucleul contine o singura copie a fiecarui cromozom. Cromozomi Genomul uman este impartit in 23 cromozomi, fiecare continand deci o singura molecula de ADN liniara, dublu-catenara, cu dimensiunea cuprinsa intre 51Mb si 279Mb (vezi Tabelul 1).
285

L. O. POPA, I. MOANŢĂ, F. RAICU, D. CIMPONERIU, G. BORDEIANU, P. APOSTOL, L. DAN, O. POPA

Tabelul 1. Dimensiunile cromozomilor umani Cromozomul 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Dimensiune (Mb) 279 251 221 197 198 176 163 148 140 143 148 142 118 107 100 104 88 86 72 66 45 48 163 51

Daca genomul uman ar fi fost reprezentat de o singura molecula de ADN, lungimea totala a acesteia ar fi fost de aproximativ 1m. Cum cantitatea de ADN din celula umana este impartita intre 23 de cromozomi, lungimea medie a acestora ar trebui sa fie de aproximativ 5cm. Totusi lungimea cromozomilor umani este de ordinul micrometrilor. Trebuie sa existe deci un sistem inalt organizat de impachetare a unei molecule de o asemenea lungime intr-o structura atat de mica. La inceputul secolului, citologii au propus termenul cromatina pentru a desemna componenta cromozomului care se coloreaza mai puternic cu coloranti specifici pentru cromozom. Astazi, prin cromatina se intelege complexul format prin asocierea intre molecula de ADN continuta in cromozom si proteinele legate de aceasta, proteine responsabile de impachetarea ADN intr-o structura regulata in interiorul cromozomului.
286

asociate mai intim cu componenta ADN a cromozomilor. o portiune este reprezentata de o mixtura heterogena de molecule. Aceste rezultate au fost completate anul urmator de prima observare in microscopie electronica a fibrei de cromatina. Singura portiune din molecula de ADN accesibila endonucleazelor este reprezentata de ADN linker (50-70bp) care uneste nucleosomii intre ei. este reprezentat de un grup de proteine numite histone. H2B. denumite respectiv. Figura 1. ci sunt multimeri de aproximativ 200bp lungime. fiind inalt conservate intre diferite specii. H3 si H4. Din componenta proteica. In anul 1973 s-a demonstrat ca in urma digestiei cromatinei purificate cu o endonucleaza (enzima care taie molecula de ADN la nivelul legaturilor fosfodiesterice interne) si extractiei ADN-ului. Taierea moleculei de ADN la nivelul acestui ADN linker va genera fragmente de 200bp. H3 si H4. Acestia sunt formati dintr-un miez histonic (octamer) format din cate 2 molecule din histonele H2A. Acest experiment arata ca proteinele din cromatina sunt asociate cu ADN-ul intr-un mod regulat si ca aceste complexe proteice protejeaza molecula ADN de atacul endonucleazelor. Exact 146 nucleotide formeaza portiunea de ADN implicata in edificarea nucleosomului. Restul de proteine. Histonele sunt proteine cu un pronuntat caracter bazic. Structura cromatinei 287 . fragmentele obtinute nu sunt de dimensiuni randomice. supusa unei noi metode preparative. incluzand ADN si ARN polimeraze si proteine reglatoare. H2B. asa cum ar fi fost previzibil. miez in jurul caruia se afla infasurata molecula de ADN. portiune protejata deci de atacul endonucleazelor. La microscopul electronic s-au observat aranjamente liniare de structuri sferice car au fost numite nucleosomi.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN Cromozomii sunt formati aproximativ 50% din ADN si 50% din proteine. H1. H2A.

deci fiecarui cromozom metafazic. pentru a da nastere fibrei de cromatina. fibra cu un diametru de aproximativ 30nm. Pozitia centromerului este caracteristica pentru un cromozom dat si este unul din criteriile utilizate pentru a distinge membrii cariotipului (intregul complement cromozomal din nucleu). BORDEIANU. Aceasta maniera de impachetare reduce dimensiunea cromozomilor de aproximativ 7 ori. Acest lucru se datoreaza faptului ca in urma unor coloratii specifice. Dimensiunea acestei structurii este de aproximativ 0. mai densa decat simpla insiruire a nucleosomilor. reduce lungimea moleculei de acid nucleic de aproximativ 6 ori. POPA. DAN. prezentei satelitilor si a constrictiilor secundare. CIMPONERIU. cei 46 de cromozomi au fost repartizati in urmatoarele grupe morfologice ale cariotipului uman: 1. in acord cu dimensiunea cromozomului metafazic. aspectul acestora fiind un alt caracter utilizat in identificarea unui cromozom dat. fibra de cromatina formeaza bucle superrasucite care emerg dintr-un miez proteic de natura nonhistonica. Aproximativ 85kb ADN sunt continute in fiecare bucla. ceea ce ar face ca dimensiunea cromozomilor sa fie de aproximativ 1. raportului bratelor.L. intervine un al treilea nivel de impachetare a fibrei de cromatina. APOSTOL. iar cei din perechea 2 submedian. Nucleosomii sunt aranjati intr-o structura numita solenoid. P.4mm. In realitate este vorba aici de doi cromozomi uniti la nivelul unei structuri numite centromer. Cromozomii umani au fost repartizati in 7 grupe morfologice la Conferinta de la Denver (Colorado) din anul 1960. 288 . In cromozomul metafazic.75 m. dintre care 1 si 3 au centromerul situat median. D. O. In celulele care se divid. Caracterizarea morfologica a cromozomilor mitotici a fost completata ulterior la Conferintele de la Londra (1963). cromatidele diferitilor cromozomi nu se coloreaza identic. Al doilea nivel de organizare a fibrei de cromatina a fost caracterizat intre anii 1977-1980 de catre Aaron Klug prin observatii de microscopie electronica. aparand un model de benzi pozitive si negative (pentru coloratia respectiva) caracteristic fiecarei cromatide. Cromozomii din perechea 1 prezinta o constrictie secundara in regiunea proximala a bratului q. indicelui centromeric. POPA Impachetarea ADN in nucleosomi. a sincroniei replicarii si modelului de bandare. L. MOANŢĂ. fiecare din cei doi cromozomi uniti la nivelul centromerului se numeste cromatida. I. Grupa A (1-3). G. Deci exista un alt nivel de organizare a cromatinei pentru a se putea ajunge la dimensiunea reala a cromozomilor. Nucleosomii se asociaza pentru a forma fibra de cromatina cu diametrul de 30nm. observatii care au revelat o fibra de cromatina. RAICU. Pe baza lungimii relative a cromozomilor. sugerand ca acesta este cel mai inalt nivel structural de organizare prezentat de cromozomul eucariot. O. Chicago (1971) si Paris (1972) consacrate cariotipului uman. Pentru formarea acestei structuri. Aspectul tipic al unui cromozom metafazic este prezentat in figura 1. F. deci si uman. prin formarea cromozomilor metafazici. Cuprinde cromozomi mari. Aceasta conformatie reprezinta o reminiscenta a nucleoidului bacterian.

7. iar 9. Figura 2. 4. 8 si 11 au centromerul situat median. 6. cu centromerul situat medain la cei din perechea 16 sau submedian la perechile 17 si 18. Acrocentrici si prezinta sateliti.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN 2. Cromozomii din perechea 16 prezinta o constrictie secundara in regiunea proximala a bratului q. lipsit de sateliti. 3. Toti cromozomii grupei sunt de marime mijlocie. Grupa G (21-22). diferentiindu-se astfel de eucromatina care devine 289 . submetacentrici. Grupa D (13-15). Cei din perechea 9 prezinta o constrictie secundara in regiunea proximala a bratului q. Grupa C (6-12). Cuprinde cei mai mici cromozomi ai cariotipului uman. Cromozomul X este apropiat ca lungime de cei din perechea 6 si prezinta centromerul situat median. 8. Grupa B (4-5). Sunt cromozomi de marime mijlocie. metacentrici. In 1928. Sunt cromozomi mici. Cromozomi mari. Grupa F (19-20). 10 si 12 submedian. iar cromozomul Y este de tip acrocentric. 7. Grupa E (16-18). Sunt cromozomi relativ mici. Cariotipul uman realizat prin bandare G Cromatina se prezinta sub doua stari fizice: condensata si decondensata. acrocentrici si care prezinta sateliti. 5. Heitz a denumit sub termenul de heterocromatina partea de cromatina care ramane condensata in cursul interfazei. avand o lungime apropiata de cei din grupa G. Cromozomii din perechile 6.

O. Se pare ca aceste secvente poseda activitate de transpozoni. MOANŢĂ. permitandule sa se replice si sa se deplaseze in noi locuri in genom. POPA. O. Figura 4. Orice ADN care nu se incadreaza in aceste categorii este extragenic. Secventele de tip LINE-1 (aproximativ 60000 copii) reprezinta un retroelement de tip non-viral. fie dispersat in genom. caracterizata printr-un continut inalt de ADN repetitiv. aproximativ 0. fragmente genice). P. DAN. POPA condensata. Tipuri de secvente Genomul uman poate fi impartit in ADN genic si ADN extragenic. Membrii acestei familii prezinta o dimensiune de aproximativ 250bp. I. nu este asociata cu o gena (secvente leader. fie aglomerat in clustere. Secvente LINE 290 . situsuri de reglare) si care nu este recunoscuta ca provenind dintr-o gena (pseudogene. BORDEIANU. G. aceste secvente fiind repetate de aproximativ 700000 in intregul genom. Restul. al femelelor la mamifere. F. trailer. ADN-ul extragenic reprezinta aproximativ 70-80% din intregul genom uman. un transpozon care se poate replica si deplasa in genom printr-un proces care implica revers-transcrierea. inactivat.5% din totalul genomului. Majoritatea ADN extragenic consta din secvente unice sau aflate in numar mic de repetitii. Termenul de heterocromatina facultativa trebuie utilizat numai pentru a desemna cromozomul X hetropicnotic. inclusiv in introni. este format din ADN moderat si inalt repetitiv. CIMPONERIU.L. ADN repetitiv dispersat Secvente SINE (Short Interspersed Nuclear Elements). promotor. D. Ulterior s-a propus ca termenul de heterocromatina sa fie utilizat doar pentru desemnarea heterocromatinei constitutive sau cariotipice. Figura 3. APOSTOL.7Mb. Secvente SINE Secvente LINE (Long Interspersed Nuclear Elements). In cazul genomului uman. Prin ADN extragenic intelegem orice secventa ADN care nu este continuta intr-o gena (sub forma de exoni sau introni). Si aceste secvente se pare ca s-au propagat prin transpozitii. RAICU. L. heterocromatina formeaza aproximativ 6. Cel mai cunoscut exemplu de SINE este reprezentat de familia Alu.

Genele cu secventa de nucleotide similara sunt numite gene omoloage. in care toate genele sunt identice. Telomerele (10-15kb) sunt clasificate ca ADN minisatelit. dar in cazul microsatelitilor unitatile repetitive sunt rareori mai mari de 4bp. intr-un singur loc in genom. Acest tip de ADN este numit ADN satelit si este impartit in trei categorii. gene care prezinta secventa identica sau similara de nucleotide si deci care contin informatie identica sau inrudita. ADN microsatelit Dimensiunea clusterilor este aceeasi ca in cazul minisatelitilor. ADN minisatelit ADN minisatelit formeaza clustere de 100bp-20kb lungime. De exemplu. acest numar mare este probabil datorat necesitatii de cantitati mari de produs genic in acelasi moment de timp. 3.caracterizare O familie multigenica este un cluster de gene inrudite.5% din total. reprezentand aproximativ 0. Clusterle de lanivelul centromerului formate din repetiiile Alphoid reprezinta exemplul clasic de ADN satelit. Exista doua tipuri de familii multigenice: 1. familia de gene pentru ARN ribozomal 5S. 291 . cantitate pe care o singura copie sau doar cateva copii ale genei respective nu ar fi putut sa o satisfaca. 2. Familii multigenice simple. Secvente dinucleotidice. Familii multigenice complexe. de tipul 5’-CACACACACACACACACACA-3’. formand un cluster genic. formate din gene similare. 2. Genomul uman ilustreaza toate cele trei modalitati posibile in care familiile multigenice pot fi organizate: 1. dar nu identice. inclusiv la om.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN ADN repetitiv grupat in clusteri Genomul uman contine regiuni intinse formate din secvente repetate aranjate in tandem. Monorepetitii de tipul 5’AAAAAAAAAAAAAAAA-3’ formeaza inca 0. care cuprinde 2000 de gene repetate in tandem pe bratul lung al cromozomului 1. Exemplul cel mai bun este reprezentat de genele pentru globine la toate vertebratele. in functie de dimensiunea clusterilor: 1. Exemple sunt familia de gene pentru hormonul de crestere. Familii de gene . In unele cazuri genele individuale sunt localizate impreuna. ale carui 5 gene sunt localizate pe cromozomul 17 si familia de gene pentru ARN ribozomal 5S. ADN satelit clasic Acesta a fost primul tip de ADN satelit identificat in genomul uman si consta in regiuni de 100-5000kb lungime. sunt foarte frecvente in genomul uman.3% din totalul genomului. reprezentata la om de aproximativ 2000 de copii.

BORDEIANU. exista ca o familie de molecule inrudite. respectiv . Fiecare tip de polipeptid care intra in componenta hemoglobinei. genele sunt raspandite in genom. In cazul altor familii genice. 14. Unele familii genice mari sunt atat raspandite in genom cat si organizate in clusteri genici. Astfel. 21 si 22. 2 si 2 sunt combinate cu un cofactor hem pentru a forma o singura molecula de hemoglobina. si . in acelasi timp. catenele si . F. APOSTOL. Tom Maniatis si colaboratorii sai au descoperit la sfarsitul anilor 1970. POPA. patru catene polipeptidice. de exemplu. Genele pentru globinele umane au fost printre primele studiate cu ajutorul tehnologiei ADN recombinant. G. DAN. 10. exista aproximativ 280 de copii pentru unitatea transcriptionala a ARN ribozomal. CIMPONERIU. G si . gasite doar in stadiile embrionare. P. I. De exemplu cei 5 membri ai familiei genei aldolazei sunt localizati pe cromozomii 3. RAICU. si cinci molecule de tip . D. Familia de gene pentru globine umane La om. MOANŢĂ. 3. O. Sa analizam acum cateva astfel de familii genice pentru o mai buna intelegere a organizarii lor. 9. POPA 2. grupate in 5 clusteri de cate 50-70 unitati fiecare. la om exista de fapt doua molecule de tip . O. A . ca genele pentru globinele umane sunt organizate intr-o familie multigenica pentru globina pe cromozomul 16 si o familie multigenica pentru globina pe cromozomul 11. proteina raspunzatoare de transportul oxigenului in torentul sanguin. . care difera una de cealalta prin cativa aminoacizi. 16 si 17. 15. L. cu tipurile si . Analize ulterioare au permis stabilirea cu precizie a pozitiei fiecarei gene in cadrul familiei. clusteri localizati pe bratele scurte ale cromozomilor 13. Tipul de globina din sange depinde de stadiul de dezvoltare a organismului.L. 292 . Astfel.

secventierea. una americana si una venezueleana. Aceste “gene” sunt foarte asemanatoare celorlalti membri ai familiei. 293 . 1. distonie. In continuare s-a incercat localizarea genei raspunzatoare pe cromozomi.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN Figura 5. Izolarea. Maladia Huntington Maladia Huntington este o boala neurodegenerativa progresiva. care a suferit o mutatie la bolnavi. de ambele sexe. 2 si 1. in afara genelor deja prezentate. Gena HD. Gusella si colaboratorii au adoptat o strategie sistematica de identificare a unui astfel de marker ADN asociat cu maladia Huntington. dar informatia codificata nu mai este activa. a fost localizata pe cromozomul 4p16. Acest lucru a condus la concluzia ca boala este de natura autosomala. caracterizata fenotipic prin miscari involuntare (chorea). Familiile de gene pentru globinele umane Familiile genelor pentru globine ilustreaza un alt aspect al organizarii genelor: pseudogenele. dominanta. genele 1. Analiza incidentei bolii a aratat ca aproximativ jumatate din descendenti. Astfel. contracteaza boala daca unul din parinti este afectat. tulburari emotionale si scaderea capacitatii intelectuale. Ca subiect pentru acest studiu au fost alese doua familii. caracterizarea unor gene umane: gena pentru maladia Huntington. clusterii pentru globinele de tip si includ.3 in anul 1983 si a fost clonata 10 ani mai tarziu. Deoarece polimorfismele la nivelul ADN sunt frecvente. autosomala. gena pentru mucoviscidoza. cu transmitere dominanta.

aceasta frecventa implica faptul ca 1:25 indivizi este heterozigot I populatie si ca frecventa genei mutate este de 2%. in timp ce la indivizii afectati. pentru a se constitui surse permanente de ADN pentru analiza. P. Acestea au fost detectate prin metoda Southern. 2. au fost desemnate ca fiind haplotipurile A. Nu exista un tratament specific si in majoritatea cazurilor maladia este extrem de invalidanta. (CAG)n. Mucoviscidoza Mucoviscidoza este maladia recesiva autosomala cea mai frecventa in populatiile de origine europeana. Pentru a stabili ca sonda G8 continea secvente din apropierea genei pentru maladia Huntington au fost necesare doua etape: 1. cu 17 codoni in aval de codonul de initiere ATG.L. Mutatia responsabila de generarea maladiei consta in extinderea repetitiei unei trinucleotide. CIMPONERIU. Mai intai s-a stabilit ca un numar de polimorfisme ale unor situsuri de restrictie poate fi detectat cu aceasta sonda. MOANŢĂ. Cele patru combinatii de alele. respectiv 2. Aplicand legea HardyWeinberg. In screeningul initial s-au folosit un numar de sonde pentru a analiza ADN-ul provenit de la familia americana. B. C si D. rezulta ca de asemenea ea este linkata cu cromozomul 4. D. avand o incidenta de 1:2500 nou-nascuti. numarul de repetitii al acestui codon este cuprins intre 6-35. RAICU. rezultate din aceste doua polimorfisme la nivelul situsurilor 1. datorita dezvoltarii tratamentelor paliative. APOSTOL. ci doua astfel de polimorfisme. care codifica pentru glutamina. s-a constatat ca celule hibride om-soarece continand cromozomul 4 uman hibridizau cu sonda G8. ambele detectabile cu ajutorul sondei G8. care survine la diferite varste. in interiorul exonului 1 al genei. evoluand inexorabil spre o insuficienta respiratorie mortala. care afecteaza mai ales epiteliul cailor respiratorii. I. Subiectii masculi 294 . numarul de repetitii este cuprins intre 40-121. Una din aceste sonde. in timp ce toti hibrizii lipsiti de cromozomul 4 nu hibridizau. sau haplotipuri. Pentru a se localiza pe cromozom gena bolii Huntington. Numarul de repetitii este invers proportional cu varsta la care apare boala. O. in cazul familiei din Venezuela. F. L. respectiv 2. G. si denumite situsul 1. in cazul familiei din America si cu haplotipul C. maladia antreneaza o patologie a secretiilor exocrine. de multe ori peste 20 de ani. POPA Pentru aceasta.6kb. a aratat o puternica asociere cu gena maladiei Huntington. DAN. denumita G8. utilizand HindIII ca enzima de restrictie. In forma sa cea mai obisnuita. Cum gena pentru maladia Huntington este linkata cu secventa G8. La indivizii normali. O. Clona G8 era un bacteriofag recombinant continand o secventa unica de ADN uman de 17. Gena pentru maladia Huntington segrega intotdeauna cu halpotipul A. POPA. In al doilea rand s-a stabilit ca un model caracteristic de situsuri de restrictie era transmis ereditar impreuna cu maladia Aceasta analiza a fost destul de complexa deoarece s-a aratat ca asociat cu boala nu era un singur polimorfism al unui sit de restrictie. limfocite colectate de la ambele familii au fost permanentizate in cultura. BORDEIANU.

Localizarea primara a genei CF pe cromozomul 7. Totusi. descoperire facuta de Tsui in 1985. Acest locus a fost identificat gratie legaturii dintre boala si un situs polimorf explorat cu sonda anonima DOCRI 917. pentru ca ulterior sa fie descoperite in populatiile de origine europeana din Statele Unite ale Americii si in Europa. Au durat aproximativ 4 ani pentru a exclude in jur de 50% din genom. pleda in favoarea unui locus unic implicat in maladie. desemnate respectiv A. Cu ajutorul acestor markeri s-au definit 4 haplotipuri. Acest fenomen implica pe de o parte ca gena este foarte aproape de domeniul de cateva zeci de kilobaze 295 .ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN ajunsi la maturitate sunt sterili datorita unei azoospermii generat de impermeabilitatea canalelor deferente. 1987). paroxonaza (locusul PON).11. CS7 si KM-19 la locusul anonim D7S23) care au permis detectarea unor RFLP in puternic dezechilibru de linkage cu gena CF mutanta (Estivil et al. B.3cM de locusul CF. sanatosi dar purtatori ai genei anormale. descoperirea unei prime legaturi semnificative intre un marker proteic polimorf. Haplotipuri asociate cu gena CF Haplotip A B C D Alela Xv-2c 1 1 2 2 KM-19 (sau CS7) 1 2 1 2 O asociere preferentiala intre haplotipul B si gena mutanta CF a fost descoperita pentru prima data in populatiile din Europa de Nord. proto-oncogena met si sonda anonima pJ3. 1987). In subclonele derivate din aceasta regiune s-au pus in evidenta sonde (sondele XV-2c. C. localizata pe bratul lung al cromozomului 7. de homozigotii normali. Aplicarea strategiei geneticii inverse la genele autosomale responsabile de o maladie recesiva se loveste de o dificultate intrinseca: imposibilitatea de a distinge heterozigotii. Cautarea genei CF Gena se afla deocamdata circumscrisa intr-un teritoriu care nu depasea 1 milion de perechi de baze (Williamson. Acest prim marker era situat la aproximativ 15cM de locusul CF. Cautarea genei CF (Cystic Fibrosis) a fost demarata inca de la inceputurile strategiei geneticii inverse (1980). cu localizare cromozomala necunoscuta insa. Rapid acesta din urma a fost incadrat de doi markeri mai apropiati. data fiind heterogenitatea clinica a acesteia. deoarece absenta unui indice in favoarea unui cromozom a impus o abordare pur aleatoare a cartografiei de excluziune. si D (vezi Tabelul 2) Tabelul 2. situati respectiv la 0.4 cM si 0. O problema foarte dezbatuta la inceput s-a referit la heterogenitatea genetica posibila a maladiei. Aceasta prima etapa a fost una laborioasa.

POPA. RAICU. F. MOANŢĂ. Acest succes a fost obtinut printr-o strategie de deplasare si salt pe un teritoriu de mai multe sute de kilobaze in aval de situsul KM-19. BORDEIANU. Datorita rolului presupus indirect al acestei proteine in transferul ionilor. Collins (Ann Arbor). L. in particular al ionilor de Cl-. Tsui (Toronto) si F. P. S. deoarece aceasta reprezinta cea mai mare gena din genomul uman. structura care este aceea a unei proteine transmembranare. mutatia F508. pe un haplotip comun. O. intr-o banca de cADN din celule de glande sudoripare. DAN. ceea ce explica dificultatile intalnite in identificarea ei.L. Gena este formata din 27 de exoni repartizati pe un teritoriu de 250Kb. restul de 30% fiind constituite de o constelatie de alele rare si variate. Una din aceste secvente. Acesta a fost argumentul decisiv pentru a se accepta ca gena pentru mucoviscidoza a fost desoperita. Un proiect cu scopul de determina secventa completa de nucleotide a genomului uman a fost pentru prima oara adus in discutie in 1985. a permis izolarea unei clone corespunzatoare inceputului genei. Validarea acestei gene s-a facut prin descoperirea unei deletii de 3 nucleotide care antrena pierderea unui codon Phe in pozitia 508 (mutatia numita F508). D. ca mutatia a avut loc o singura data. si anume pe haplotipul B care insoteste alela mutanta in peste 80% din cazuri Descoperirea genei Gena CF a fost in cele din urma identificata in anul 1989 de catre echipele lui L. POPA explorate de markerii respectivi. Patologia genei CFTR este dominata de un factor major in populatiile caucaziene: existenta unei alele comune. cauzele bolilor si relatia dintre mediu si organismul uman. mai mult de 230 de mutatii non. Proiectul Genom Uman (HGP. APOSTOL. C. In anul 1990. in cautarea unor secvente in acelasi timp conservate si exprimate. corespunzatoare unei insule HTF. reprezentand 70% dintre mutatii. regasita in 70% dintre cromozomii 7 purtatori ai anomaliei CF si in nici un caz la cromozomii nepurtatori. CIMPONERIU. Descifrarea genomului uman: Proiectul Genom Uman Decifrarea secventei ADN care codifica genomul uman a fost anticipata de sperantele pe care un astfel de proiect le genera in ceea ce priveste intelegerea evolutiei speciei umane. I. apartinand superfamiliei transportorilor activi ATP-dependenti. Un alt argument a fost furnizat de modelarea structurii proteinei putative codificate de aceasta gena. proiect 296 . National Institutes of Helth) si Departamentului Energiei al USA. sub conducerea Institutului National de Sanatate (NIH.F508 sunt actualmente repertoriate. Aceasta prima secventa ( de doar 113 bp) a permis reconstituirea intregului puzzle de cADN. Human Genome Project) a fost in mod oficial initiat in USA. ea a fost denumita CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator. iar pe de alta parte. Astfel. G. O.

Abordari similare pentru alte tesuturi. ceea ce va permite prezicerea regiunilor transcrise ale genomului. Cele mai importante tehnici de secventiere a ADN sunt metoda enzimatica de blocare a lantului 297 . fiind revers-transcris din ARNm. 1992).M. Secventele genice obtinute pot fi utilizate eficient pentru cartare fizica prin determinarea pozitiei lor pe cromozomi.A. secventele EST contribuie la intelegerea granitelor exoni-introni. precum si expresia genica specifica tesutului respectiv pot fi astfel studiate (Okubo et al. Secventele EST sunt extrem de utile pentru identificarea de noi gene. prin utilizarea de clone ADNc provenite de la consortiul I. Seventele EST pot fi de asemenea utilizate pentru a evidentia variatii la nivelul unei singure baze in cadrul genelor. iar secventierea EST-urilor provenite de la diferite organisme va permite efectuarea de studii evolutioniste si clonarea unor gene interesante trecand peste barierele taxonomice.. 1996). Secventele obtinute prin selectia randomica a clonelor ADNc furnizeaza o imagine statistica a nivelului si complexitatii expresiei genice in tesutul de provenienta. cu un buget de 3 miliarde USD. Pentru a capta atentia publicului si a oferi o alternativa in acest domeniu. Aceste fapte confirma necesitatea secventierii ADNc ca o completare a secventierii genomului. secventierea ADNc a devenit o tehnica larg acceptata care completeaza intr-o masura importanta eforturile de secventiere ale genomului. Tehnologii de secventiere a ADN In ciuda resurselor implicate in eforturile de secventiere a genomului. EST-urile reprezinta cea mai semnificativa forma de informatie per baza secventiata.. dar sunt de asemenea importante si din alte puncte de vedere. ADN-ul complementar (ADNc). Totusi. Detectarea acestor polimorfisme SNP (Single Nucleotide Polymorphism) poate fi un insrtument important de caracterizarea genelor pentru maladii umane. ca si pentru alte organisme au urmat rapid. Aceste secvente partiale reprezentau gene exprimate in tesutul nervos la un anumit moment de timp si ele au fost denumite EST-uri. reprezinta o sursa directa de secvente codificatoare ale genelor. Influenta factorilor de mediu. a initiat in anul 1994 sponzorizarea efortului public de secventiere a EST-urilor la Univeritatea Washington. clone din creier uman fiind alese randomic si secventiate. clonarea pozitionala a genelor pentru diferite maladii va fi mult facilitata de combinarea intre secventierea EST-urilor si cartarea fizica de mare densitate. EST (Expressed Sequence Tags) Genomul organismelor superioare este reprezentat doar intr-o mica masura de ADN codificator de proteine (1-3% in genomul uman).ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN care urma sa se intinda pe durata a 15 ani. Din acest motiv. Merck Inc. In anul 1991 a fost descrisa prima aplicatie a acestei metode de secventiere a ADNc. iar posibilitatea de a identifica rapid toate genele umane a condus la dezvoltarea unor baze de date comerciale care contineau secventele EST. pentru descifrarea completa a genomului uman. In sfarsit. (Lennon et al. tehnicile de baza de secventiere a ADN dezvolate in urma cu 20 de ani sunt inca in uz. Mai mult.E.G.

I. 1994). G. CIMPONERIU. 1993). Prin utilizarea factorului F de la E. Consta in ordonarea clonelor continand inserturi mari de-a lungul cromozomilor. fiecare dintre acestia putand contine inserturi de diferite dimensiuni. DAN.). Scopul ultim il constituie generarea unei harti fizice care sa acopere intregul genom. ceea ce face ca BAC-urile sa fie mentinute intr-un numar mic per celula. Dezavantajul YAC-urilor este rata mare de himerism si rearanjari pe care le sufera. RAICU. D.coli.coli. in anul 1992 (Shizuya et al. YAC-urile (Yeast Artificial Chromosome) tolereaza inserturi cu dimensiunea intre 250kb-1Mb. O. Astfel. Acest sistem are proprietati similare cu BAC. POPA sintetizat (Sanger et al. iar secventierea trebuie sa se realizeze pe ambele catene la nivelul intregului genom. manipularea facila si stabilitatea au facut din acesti vectori instrumente mult mai potrivite pentru cartarea fizica decat Cosmidele. Cosmidele sunt vectori plasmidiali care contin situsul cos de la fagul . a fost construit un cromozom artificial bacterian numit BAC (Bacterial Artificial Chromosome). in mod obisnuit una sau doua copii. P. YAC-urile pot contine regiuni dificil de clonat in constructe mici (de ex. ceea ce permite impachetarea in vitro de particule fagice. Secventierea genomului In ciuda diferentei semnificative de talie intre diferitele genomuri. In ultimii ani atat BAC cat si PAC au fost larg utilizati in secventierea genomurilor mari. pentru a fi supus secventierii orice genom trebuie sa fie subclonat in fragmente suficient de mici pentru a putea fi utilizate tehnicile de secventiere. ceea ce reduce riscul de recombinare. Cosmidele pot contine inserturi de aproximativ 40kb si au fost frecvent utilizate ca legatura intre YAC-uri si vectori de secventiere.. O data cu dezvoltarea HGP a devenit tot mai imperioasa nevoia existentei unor vectori care sa mentina in stare stabila fragmente de ADN cu dimensiuni cuprinse intre cele continute de YAC-uri si cele continute de cosmide. Astfel. 298 . BORDEIANU. pentru a sigura acuratete procesului de secventiere.L. O.coli. In comparatie cu metoda Maxam-Gilbert. si au fost utilizate pentru a produce contiguri (contig= set de clone care se suprapun) care acopereau majoritatea genomului uman (Cohen et al. uzual 100-200kb. Pe de alta parte. 1977). POPA. Clonele ordonate vor constitui baza pentru subclonarea ulterioara in vectori corespunzatori. cosmide). APOSTOL. metoda Sanger genereaza siruri de date mai usor de interpretat.. L. 1977) si metoda de degradare chimica (Maxam si Gilbert. ceea ce a facut ca aceasta tehnica sa devina cea mai larg utilizata.. MOANŢĂ. si a fost denumit PAC (P1derived Artificial Chromosome) (Ioannou et al. ADN-ul clonat poate fi cu usurinta introdus in celule de E. F. care sa contina inserturi de dimensiuni accesibile tehnicilor de secventiere. Un numar de vectori diferiti este disponibil pentru construirea hartilor fizice. acest vector poate contine inserturi de 15300kb. Un al doilea sistem a fost dezvoltat prin modificarea unui vector bazat pe bacteriofagul P1. Replicarea vectorilor ce contin factorul F se afla sub strict control in E. Eficienta mare in clonare prin electroporare. Cartarea fizica.

presiune scazuta. Un mare numar din aceste clone sunt apoi izolate randomic si secventiate utilizand primeri specifici pentru vectorul utilizat. O imbunatatire in acest sens s-a produs odata cu utilizarea PCR pentru a amplifica regiuni genomice unice. Secventierea randomica este realizata pana cand se acopera 75-95% din fragmentul initial. HPLC. generand astfel secvente raspandite randomic in fragmentul original (insert dintr-un cosmid sau BAC). Strategia conduce la o minima redundanta si un numar semnificativ mai mic de reactii de secventiere. sau “nebulizare”. Secventierea “shotgun” necesita utilizarea unor algoritmi computerizati de calitate pentru a asambla datele in contiguri. 1989). uzual denumita secventiere “shotgun”. comparativ cu metoda “shotgun”. Cele doua metode difera in ceea ce priveste procedura de clonare. Aceste secvente. de aproximativ 100-1000bp. apar o singura data in genom. Secventierea randomica Exista doua strategii majore de sceventiere a fragmentelor mari de ADN. Cea mai comuna metoda de secventiere directa este cea denumita “primer walking”. Dezavantajul metodei consta in continua nevoie de construire de primeri. Se refera la tehnici in care reactia de secventiere este realizata la pozitii cunoscute in molecula de analizat. Asamblarea datelor este mai simpla decat in cazul metodelor “shotgun”. denumite STS (Sequence Tagged Site) (Olson et al. pe de lata parte insa.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN Pentru a crea harti fizice de mare rezolutie trebuiesc aplicate diferite tehnici de ordonare a clonelor. In cazul metodei randomice. ceea ce permite standardizarea metodei. Umplerea golurilor ramase in urma acestei metode se realizeaza prin metode directe. dimensiunea inserturilor si strategia de secventiere. Numarul de reactii de secventiere este deci mai mare decat in cazul tehnicii directe. randomica si directa. dupa care se aplica strategii directe de secventiere pentru a umple golurile ramase. Astfel. Caracteristica tehnicii “shotgun” este numarul mare de clone care trebuiesc procesate pentru a se acoperi regiunea de interes. o plimbare de-a lungul secventei se poate realiza pe ambele catene. deoarece pozitia exacta a fiecarei reactii este cunoscuta. Metode directe de secventiere. 299 . si pot fi utilizate deci pentru a ordona YAC-urile sau BAC-urile prin metode de screening PCR. este generata o librarie de subclone plasmidiale sau M13. In acest caz.. Fractionarea inserturilor mari initiale in subclone se poate obtine prin cateva tehnici: digestia cu enzime de restrictie. tratamentul cu Dnaza I. secventa obtinuta in urma unei reactii este utilizata pentru a construi urmatorul primer. cu dimensiunea inserturilor de 1-2kb. toate aceste reactii de secventiere se pot realiza cu aceeasi primeri. ruperea ADN prin sonicare. Secventele sunt apoi combinate pentru a genera contiguri de pe ambele catene. sinteza care este scumpa si lenta.

gene sau dimensiune a genomului nu poate fi raspunzatoare de diferentele de complexitate constatate intre diferite organisme. BORDEIANU. furnizand candidati pentru markeri microsatelitici asociati cu diferite maladii. mult mai putine decat in estimarile anterioare (50000-140000). aceasta nu inseamna ca sarcina identificarii de alte polimorfisme SNP este incheiata. Variatia secventei ADN uman si distributia acesteia de-a lungul genomului. Totusi pot fi deja citate cateva aplicatii directe. P. Aplicatii ale rezultatelor HGP In cele mai recente lucrari. 300 . Numarul mic de gene umane inseamna ca mecanismele care genereaza complexitatea inerenta in dezvoltarea umana si semnalele complicate implicate in mentinerea homeostaziei trebuiesc cautate in alta parte. autorii pot doar specula asupra viitoarelor aplicatii ale acestui proiect. APOSTOL. POPA. Cel putin 30 de gene implicate in procese patologice au fost pozitionate in acest fel (Tabelul 3). tipuri genice. in principal din domeniul medical. nu in numarul mare de gene. tesuturi. Gene implicate in fenomene patologice O aplicatie importanta a cercetarilor in domeniul genomului uman este descoperirea de gene cu functie biochimica necunoscuta prin cartare pozitionala. POPA Rezultatele HGP Incheierea HGP a condus la o serie de concluzii care acopera diferite aspecte ale genomului uman. DAN. F. Desi s-au identificat peste 3 milioane de SNP-uri. CIMPONERIU. L. sunt multe cazuri in care secventa genica joaca un rol de suport. O. Complexitatea genomului Simpla examinare a numarului de neuroni. Acestea reprezinta doar o parte din numarul de SNP prezente in intregul populatiei umane. In aditie. D. O. RAICU. etc. MOANŢĂ. I. complexitatea este datorata mai degraba a interactiei dintre toti acesti factori. s-a evidentiat o puternica heterogenitate in distributia acestor polimorfisme in genom. Numarul mic de gene umane.L. G. In urma secventierii si asamblarii a aproximativ 95% din portiunea eucromatinica a genomului uman s-a estimat existenta a 26000-38000 gene. Totusi.

ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN Tabelul 3. Gene implicate in procese patologice Locus Maladie BRCA2 Breast cancer susceptibility AIRE Autoimmune polyglandular syndrome type 1 (APS1 or APECED) PEX1 Peroxisome biogenesis disorder PDS Pendred syndrome XLP X-linked lymphoproliferative disease DFNA5 Nonsyndromic deafness ATP2A2 Darier’s disease SEDL X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda WISP3 Progressive pseudorheumatoid dysplasia CCM1 Cerebral cavernous malformations COL11A2/DFNA13 Nonsyndromic deafness LGMD 2G Limb-girdle muscular dystrophy EVC Ellis-Van Creveld syndrome ACTN4 Familial focal segmental glomerulosclerosis SCN1A Generalized epilepsy with febrile seizures plus type 2 AASS Familial hyperlysinaemia NDRG1 Hereditary motor and sensory neuropathy –Lom CNGB3 Total colour-blindness MUL Mulibrey nanism USH1C Usher type 1C MYH9 May_Hegglin anomaly PRKAR1A Carney’s complex SCA10 Spinocerebellar ataxia type 10 OPA1 Optic atrophy XLCSNB X-linked congenital stationary night blindness FGF23 Hypophosphataemic rickets GAN Giant axonal neuropathy AAAS Triple-A syndrome HSPG2 Schwartz-Jampel syndrome 301 .

Identificarea de regiuni reglatoare Genomul uman. este crucial ca golurile ramase sa fie umplute iar ambiguitatile sa fie eliminate cat mai repede. O.L. de aceea. Analiza comparativa a genomului de la multiple vertebrate ofera cea mai buna speranta de identificare pe scara larga de astfel de motive. Finalizarea secventei genomului uman Secventa genomului uman va servi ca baza pentru cercetarea biomedicala in anii urmatori si. in toate tesuturile. precum si a proteinelor codificate de acestea permite extinderea efortului de identificare de noi tinte. POPA. I. un proiect pilot al epigenomului uman a fost lansat. F. va fi interesant de studiat modificarile epigenetice. raman inca pasi care trebuiesc parcursi pentru a produce o secventa completa. secventierea genomului uman a permis elucidarea unei probleme care ramanea nerezolvata de cateva decenii: baza moleculara a gustului amar. regasit in toate celulele. exista aplicatii similare in domeniul fiziologiei sau al biologiei celulare. Aceste studii au condus rapid la descoperirea unei noi familii de astfel de proteine. Biologie fundamentala Desi exemplele discutate pana acum se refera doar la domeniul medical. POPA Tinte pentru medicamente In ultimul secol industria farmaceutica a depins de numarul limitat de tinte cunoscute pentru medicamente. in incercarea de a dezvolta noi produse. Astfel. Cunoasterea completa a secventei genelor. contine suficienta informatie pentru diferentierea a sute de celule diferite si pentru a raspunde la o gama vasta de stimuli interni si externi. Oamenii si alte animale prezinta polimorfism in ceea ce priveste perceperea gustului amar. O lista recenta inventariaza 483 tinte pentru virtual toate medicamentele existente pe piata. 302 . O mare parte din aceasta plasticitate rezulta din controlul fin la nivel transcriptional. In acest scop. Se estimeaza ca pana in anul 2003 toti cromozomii vor fi complet secventiati. se estimeaza ca numarul acestora va depasi cateva mii si aceasta prezumtie a condus la o extindere masiva a cercetarii genomice in asociatie cu cercetari farmacologice. si determinarea consecintelor biologice ale metilarii. Perspective Desi s-a realizat un progres semnificativ in secventierea genomului uman. MOANŢĂ. Desi s-au invatat multe de spre motivele reglatoare cis ale diferitelor gene. iar apoi au cautat regiuni relevante in secventa genomica uman pentru receptori cuplati cu proteina G. O. De asemenea. la demonstrarea ca acestea sunt exprimate aproape exclusiv in papilele gustative si la confirmarea experimentala a faptului ca receptorii din celulele in cultura raspund la substante specifice amare. DAN. CIMPONERIU. cum ar fi metilarea resturilor citozina la scara intregului genom. D. Desi doar o minoritate dintre genele umane pot fi tinte pentru medicamente. L. Recent cercetatorii au cartat aceasta trasatura atat in genomul uman cat si in cel murin. P. semnalele genice ale majoritatii genelor raman in ca necunoscute. BORDEIANU. APOSTOL. RAICU. G.

Completarea catalogului variabilitatii umane Secventierea genomului uman realizata pana in prezent a permis identificarea a peste 1. localizarii proteinelor. care sunt raspunzatoare intr-o proportie semnificativa de variabilitatea umana. Concluzii Proiectul Genom Uman va avea consecinte profunde pe termen lung asupra societatii umane. Nu este vorba doar de aspectele medicale implicate. determinarea secventei genomului a cat mai multe organisme este un deziderat important. In completare. ci si de cele filosofice. Acest deziderat implica perfectionarea tehnicilor si bazelor de date pentru analiza globala a: expresiei ARN si a proteinelor.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN Secventierea altor genomuri mari Pentru realizarea cat mai completa si eficienta a analizei comparative in ceea ce priveste genomul. caci se poate spune ca pe masura ce invatam mai multe despre genomul uman. etice. Acest program trebuie extins pentru a se identifica virtual toate variantele genomice si pentru a se identifica haplotipurile ancestrale prezente in populatii. modalitatii chimice de inhibare a diferite cai metabolice. De la secventa la functie HGP s-a concentrat pe identificare secventei genomului uman ca sursa de informatie biologica. se ivesc mai multe aspecte de explorat.4 milioane SNP-uri. Rezultatele obtinute vor permite o intelegere mai adanca a ceea ce suntem. secventa genomului va furniza instrumente pentru o abordare functionala. a directiei in care mergem. Pentru aceasta insa mai sunt de strabatut pasi. intr-o maniera sistematica. 303 . interactiei proteina-proteina.

Genes V. Jordan E. DAN. Current Opinion in Neurobiology 1995. BORDEIANU. New Goals for the U. I. G. L. Bucuresti. Current Opinion in Biotechnology 1997. Gesteland R.. 29: 445-476 4. and the members of the DOE and NIH planning groups.000 Human Genes. Rogoz I. Gardiner K. Genetics. Gene 1999. Collins FS. Genetics. Bernardi G. Citogenetica moleculara si evolutionista. Editura Stiintifica si Enciclopedica. 1999. Delpech M. CIMPONERIU. Walters LR. Annu. Human genome organization. Kirschbaum BJ. 5: 315-322 8. Patrinos A. 1995. Zubay G. Current Opinion in Genetics & Development 1995. D. Science 2001. Human Genome Project: 1998–2003. Trends Neurosci. 291: 1304-1351 3. Williams M. 1989 9. 409: 860-921 11.1987 17. APOSTOL. Reddy PH. POPA Bibliografie 1. 282: 744-746 2. 282: 682-689 7. Gavrila L. 248-255 15. The essence of SNPs. 1994 14. 8: 684-687 304 . oxford University Press. The sequence of the Human Genome. Brown TA.Nature 2001. A Physical Map of 30. 76: 1-31 16. RAICU. Inc. Genetics a molecular aproach. Journal of Biotechnilogy 2000. Huntington’s disease: CAG genetics expands neurobiology. Lungeanu A. Rev. Kozian DH. ***. 234: 177-186 5. Trends in Biotechnology 1999. 17: 73-77 13. The Benjamin / Cummings Company. 1992 6. Zweiger G.S. MOANŢĂ. Sterky F. POPA. Chapman & Hall. O. 22. Lewin B. The Human Genome: Organization and Evolutionary History. Brookes AJ. Comparative gene-expression analysis. Lundeberg J. ***. P. From expressed sequence tags to ‘epigenomics’: an understanding of disease processes. Science 1998. Kaplan J-C. International Human Genome Sequencing Consortium. Chakravarti A. Recent advances in understanding the pathogenesis of Huntington’s disease. Tagle DA. Biologie moleculaire et medecine.L. Flammarion Medecine – Science. F. Scott RW. Initial sequencing and analysis of the human genome. MacDonald ME. O. 1994 12. Sequence analysis of genes and genomes. Science 1998. 5: 656-662 10. Gusella JF.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful