...Análisis Microbiológico del agua ..12 Determinación de Clostridios Sulfito Reductores…………. 4 Determinación de Coliformes Totales y Fecales ………. 2 Determinación de microorganismos aerobios mesófilos. 5 Determinación de Estreptococos Fecales…………………..Análisis microbiológico del agua - Página Parámetros biológicos del agua………………………………...15 Conclusiones del análisis……………………………………..17 Página 1 ...........

según predominen unos organismos u otros. Así. químicos y microbiológicos. Los análisis que se pueden realizar al agua para controlar su calidad son: físicos. y si tienen capacidad para intoxicar a las personas y a los animales superiores. el curso de su ciclo vital y el índice de su supervivencia. Los parámetros biológicos en las aguas potables son de mucho interés. es costoso y complicado y como la relación patógenos/no patógenos es muy pequeña. hongos. los microorganismos que puede haber en el agua son virus. se realiza un control del agua a través de indicadores microbiológicos de contaminación. Dado que buscar todo tipo de microorganismos patógenos. por su diversidad. Todos los organismos que se encuentran en el agua son importantes en el momento de establecer el control de la calidad de la misma sin considerar si tienen su medio natural de vida en el agua o pertenecen a poblaciones transitorias introducidas por el ser humano. Aquellos que son inocuos para el hombre no tienen significación sanitaria. la magnitud y oscilación de su número. en esta ocasión se hará una determinación microbiológica. si su crecimiento lo propician los nutrientes presentes en el escurrimiento natural y en aguas residuales municipales o lo frenan los venenos procedentes de la actividad agrícola o industrial. podremos saber el estado de un agua. algas y protozoos. es por ello. Hay muchos seres vivos que se emplean como indicadores de la calidad de un agua. Para que un microorganismo sea considerado como indicador microbiológico ha de reunir unas condiciones que son: Página 2 . bacterias. Se debe conocer la forma de los patógenos hídricos y determinar su presencia y origen.Análisis Microbiológico del agua Parámetros biológicos del agua: El agua es un recurso natural necesario para el desarrollo de un gran número de actividades humanas. Su creciente degradación por disminución de su calidad implica la reducción del número de usos que se le da. lo que se hace necesario la realización de estudios que permitan determinar la calidad de ese agua. por lo que el control microbiológico del agua se va a centrar en las especies patógenas para el hombre.

identificar y contar. microoganismos parásitos y/o patógenos. Página 3 . vamos a realizar un análisis microbiológico normal y el objetivo va a ser determinar la contaminación microbiológica que puede existir. buscar las causas de esa contaminación y proponer soluciones al problema. o completo: los anteriores más aerobias a 22 ºC. Deben ser muy abundantes en heces y escasos en otros medios. ∗ ∗ ∗ Debe soportar mejor a los desinfectantes. La normativa recoge una serie de análisis microbiológicos según se efectúe sobre el agua un análisis mínimo: Coliformes Totales y Fecales.Análisis Microbiológico del agua ∗ ∗ Debe ser incapaz de desarrollarse en el agua. El agua problema procede de un manantial. el análisis realizado ha sido el normal. uno normal: los anteriores más: bacterias aerobias a 37 ºC. Deben ser fáciles de aislar. Estreptococos Fecales y Clostridios Sulfito-Reductores. Debe tener una supervivencia en el agua superior a los organismos patógenos.

expresándose el resultado en u.f.c. 24 -48 Resultados obtenidos: recuento de colonias: Al transcurrir el período de incubación establecido se saca la placa de Petri de la estufa y se recuentan las colonias crecidas. se incuba 37 ºC horas.f. por cada 100 mL de agua problema.A.C. se retira la membrana y se deposita con pinzas estériles sobre una placa Petri con medio P. en 100 mL. Página 4 . Tras la incubación se realiza un recuento de las colonias aparecidas.c. El número de colonias aparecidas es 270 u.Análisis Microbiológico del agua Determinación de microorganismos aerobios mesófilos: Se determinarán estos microorganismos que son los que se encuentran a temperatura ambiente en el agua. Una vez filtrada el agua. Procedimiento: El método consiste en filtrar a vacío una determinada cantidad de agua que va a ser de 100 mL sobre una membrana filtrante estéril depositada con la cuadrícula hacia arriba..

se distribuye el medio en nueve tubos (tres series de tres tubos) con diez mililitros cada uno de medio de cultivo y echando 10 ml de el agua a la primera serie de tubos. pH. que para los Coliformes Totales será de 37 ºC y para los fecales ha de ser de 44 ºC. Colocaremos en cada tubo Página 5 . Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están formados por Escherichia Coli y ciertas especies de Klebsiella. se considera que reflejan mejor la presencia de contaminación fecal. capaz de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales. Prueba presuntiva: Para determinar estos Coliformes se va a utilizar el medio de cultivo BGBB (dispuesto en tubo). Éstos últimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. que es un medio selectivo y de enriquecimiento ya que inhibe el crecimiento de microorganismos distintos de los del grupo de los Coliformes a la vez que permite que éstos crezcan sin restricción. Esta es la característica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. humedad… Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminación fecal. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente. Su presencia se interpreta como una indicación de que los organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua se halla exenta de organismos productores de enfermedades.Análisis Microbiológico del agua Determinación de Coliformes Totales y Fecales: Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales. y 0. lo único que variará será la temperatura de incubación de cada determinación.1 ml a la tercera. 1 ml de agua a la segunda serie. Procedimiento: Vamos a seguir el mismo método para la determinación de los dos tipos de Coliformes. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgánica.

que permiten determinar la presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso permiten determinar la existencia de una secuencia metabólica. Estos tubos se incuban a la temperatura correspondiente según se trate de Coliformes Totales ó Fecales durante 24 horas. Los Coliformes aparecerían como violetas oscuros y si hubiera microorganismos lactosa negativos aparecerían como colonias incoloras. son capaces de fermentar a la con producción de ácido y gas. o resultados positivos en la prueba presuntiva . Una reacción positiva por débil que sea.1 ml de agua problema.48 horas a la temperatura correspondiente según se trate de Coliformes Totales ó Fecales. Se incuban los tubos 24 . pueden identificarse a través de una serie de pruebas bioquímicas. indicará la presencia y coliformes y habrá que hacer las pruebas confirmativas de IMViC.se introduce un asa de siembra estéril y se toma una porción que va a sembrarse en estría en una placa Petri con medio EMB Levine. Los Coliformes son lactosa positiva. La reacción será positiva cuando se produce desprendimiento de gas en la campana Durham por lo menos en un 10% de su capacidad. uno de los más Página 6 . Se aplicará la técnica del número más probable (NMP). Prueba confirmativa: siembra en EMB Levine: En los tubos donde se introdujo 0. y el medio vira a color amarillo debido a formación de ácido. Pruebas IMViC: Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. estos signos serán los que buscaremos.Análisis Microbiológico del agua una campana Durham para recoger el gas producido y al medio de cultivo se le habrá añadido un indicador ácido-base. es decir. El EMB Levine contiene eosina y azul de metileno que inhiben parcialmente el crecimiento de los microorganismos Gram negativos. Con este fin se han desarrollado diversos esquemas de clasificación. además la combinación de azul de metileno y eosina permitirán diferenciar microorganismos lactosa positiva de los negativos.

El procedimiento es el mismo que el del indol. en vez de añadir indol de kovacs. Debido a la acidez producida. aminoácido suministrado por una peptona adecuada. colonias de la placas de EMB y se siembra en un tubo con agua de peptona. El indol producido es detectado por indol de kovacs que produce una coloración al reaccionar con él. añadimos Rojo de Metilo. Rojo de metilo: Esta es una prueba cualitativa de la acidez producida por el crecimiento de una bacteria en agua de peptona glucosa con tampón fosfato. pasado el tiempo de incubación se sacan los tubos de la estufa y se les añade 1 mL de reactivo indol de Kovacs y se deja reposar. Se incuba horas a la temperatura correspondiente según se trate de Coliformes Totales ó Fecales. 24-48 horas. el microorganismo produce indol. Si aparece una coloración roja indica que la prueba es positiva. se descompone en indol por acción de algunos microorganismos. con la diferncia que. Página 7 . no esporógenas que producen ácido y gas durante la fermentación de la lactosa). Se coge con un asa de siembra. La práctica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de producir indol cuando está en presencia de agua de peptona. Consiste en las siguientes pruebas: Indol: El triptófano. bacilares. Gram negativos.Análisis Microbiológico del agua conocidos y utilizados corresponde al IMViC que se desarrolló para clasificar especies de la familia antes mencionada y correspondientes al grupo de bacterias coliformes (bacterias aeróbicas o anaeróbicas facultativas. el medio virará de amarillo a rojo considerando la prueba positiva al añadir un reactivo.

luego se añade 1 mL de reactivo de Voges Proskauer.que contiene α-naftol y KOH. que es el violeta de genciana o el cristal violeta: • Las bacterias Gram positivas aparecen con el citoplasma teñido uniformemente de color azul o violeta. En un tubo con agua de peptona y glucosa se siembran colonias aparecidas en las placas EMB Levine. safranina. En un tubo con agar inclinado con Citrato de Simmons. Se incuba a 37 ó 44 ºC 24-48 horas. se deja reposar 10-15 minutos y si aparece una coloración roja la prueba es positiva. Página 8 . fuchina. Si aparece crecimiento en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a la producción de amoníaco que lo alcaliniza). se añade seis gotas de reactivo o´mehara y dos de reactivo de Barry. Citrato: Esta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema para utilizar el citrato como única fuente de carbono. para producir un color rojo. el microorganismo es citrato positivo. se oxida para dar diacetilo. que en presencia de KOH y aire. se siembra una colonia de las aparecidas en EMB en picadura y estría. se agita. Tinción de Gram: La coloración de Gram tiene fundamental importancia en la diferenciación morfológica y taxonómica de las bacterias.Análisis Microbiológico del agua Voges Proskauer: Algunas bacterias producen acatilmetilcarbimol (producto intermedio en la degradación de la glucosa de los hidratos de carbono). Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos según retengan o no el colorante de base usado en la tinción. • Las bacterias Gram negativas se tiñen de rojo por el colorante usado como contrastador. que reacciona con α-naftol y un producto de descomposición de la arginina de la peptona.

Tomamos una colonia de las aparecidas en EMB Levine y realizamos una tinción diferencial. Página 9 . daríamos por terminado el análisis. diez veces superior que el de las Gram positivas. Los resultados son positivos en 2 de los 3 primeros tubos. Se pasa a las pruebas de IMViC para determinar el microorganismo existente.Análisis Microbiológico del agua La diferencia entre unas y otras radica en la composición química de la pared celular y su permeabilidad. Resultado de la determinación: Se han obtenido idénticos resultados tanto en la determinación de coliformes totales como fecales y éstos han sido: Prueba presuntiva: En los tubos ha aparecido un viraje del color del medio de cultivo de violeta a amarillo debido a la producción de ácido y en la campana Durhan puede apreciarse con bastante gas en su interior. por cada mL de agua problema. a continuación observamos con el microscopio.2 de los 3 sundos y 1 de los 3 últimos (viraje del medio y gas). con estos datos vamos a las tablas del número más probable (NMP) y tenemos: Más de 20 u. Como ésta prueba ha sido positiva. La pared de las Gram negativas es más delgada y presenta un contenido en lípidos. Prueba confirmativa: siembra en EMB Levine: Tras la incubación han aparecido colonias de color violeta.f. realizaremos las pruebas confirmativas. tal y como se esperaba. lo cual dificulta la tinción y la retención del colorante en el citoplasma. de haber resultado negativas las primeras.c. grasas.

(tubo del medio). En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculación de bacterias. resultado negativo y resultado positivo a la derecha. el microorganismo produce acidez en su crecimiento. resultado negativo y resultado positivo a la derecha. En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculación de bacterias. . Página 10 . .Citrato: Tras la incubación se observa que el microorganismo no ha crecido en el slam del tubo (tubo del centro) y el medio no ha virado de color. por lo que no es capaz de obtener su fuente de carbono del citrato. se añade el reactivo y el tubo se colorea de rojo: Rojo de metilo positivo. resultado negativo y resultado positivo a la derecha. .Análisis Microbiológico del agua Pruebas IMViC: .Rojo de Metilo: Tras la incubación de cuatro días. en este caso el resultado es negativo.Voges-Proskauer: El microorganismo no produce acetilcarbimol al añadirle el reactivo que se detecta con la aparición del color rojo.Indol: Aparece un anillo rojo bordeando al tubo: Indol positivo:el microorganismo produce indol. En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculación de bacterias.

con esta combinación vamos a una tabla y como resultado tenemos que el microorganismo presente en nuestro agua es la Escherichia Coli. En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculación de bacterias. hemos observado bacterias bacilares Gram negativas con lo que podemos confirmar la presencia de Escherichia Coli que responde a estas características y es el mayor indicador de contaminación fecal en el agua. Escherichia Coli I + M + VI - C - Tinción de Gram: Con esta prueba.Análisis Microbiológico del agua El viraje del color del medio se debería a una producción de amoníaco que alcalinizaría el medio y se habría detectado este aumento de pH con el viraje del color del indicador que incorpora el medio de cultivo. resultado negativo y resultado positivo a la derecha. El resultado de las pruebas IMViC son: ++--. Página 11 .

Actualmente se considera que pertenecen al género Enterococcus . Procedimiento: Prueba presuntiva: Para determinar los Streptococcus Fecales se va a utilizar el medio de cultivo KAA caldo (Canamicina-Esculina-Azida). Página 12 . salinidad. la prueba presuntiva es positiva y se pasará a las confirmativas. que es un caldo de enriquecimiento para Streptococcus D de Lancefield. integrantes de la flora normal de los animales homeotérmicos.Análisis Microbiológico del agua Determinación de Streptococcus Fecales: Los Streptococcus Fecales son bacterias anaeróbias o aeróbias facultativas. por lo que son muy utilizadas en zonas donde sea abundante la cría de ganado. Vamos a sembrar en dos tubos con nueve mL de KAA 1 mL de muestra problema y lo incubamos 24 horas a 37 ºC. Los Streptococcus son abundantes en heces de animales. por lo que se suelen emplear para determinar la contaminación fecal en aguas de baño marítimas. pues son las que mejor soportan esas condiciones de salinidad. Todos los Enterococos presentan alta tolerancia a condiciones ambientales adversas altas o bajas temperaturas. conocidas como bacterias del ácido láctico. Si aparece ennegrecimiento. En ese medio de cultivo el sulfato de Canamicina y la Azida sódica inhiben el crecimiento de la flora acompañante. mientras que los Streptococcus crecen sin restricción. Nuestra muestra de agua problema está tomada en este ambiente por lo que es importante realizar esta prueba. A su vez los Streptococcus hidrolizan la Esculina produciendo glucosa y esculetina la cuál reacciona con el NH4+ que lleva el medio y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco. luz solar…). deshidratación.

Los Streptococcus Fecales son catalasa negativos luego no metabolizan el H2O2 y no se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxígeno lo que nos indicaría que se ha reacción se ha producido.Tinción de Gram: En el caso de la presencia de Streptococcus Fecales se observarán cocos Gram positivos.Prueba de la catalasa: Consiste en observar si un microorganismo es capaz de descomponer el agua oxigenada (H2O2) produciendo agua (H2O) y oxígeno (O2). si aparece un burbujeo.Análisis Microbiológico del agua Prueba confirmativa: Siembra en KAA Agar: De los tubos positivos de las pruebas presuntivas se hace una siembra en estría múltiple en placas KAA Agar.5%. en un portaobjetos y nunca con colonias de medios que contengan Azida sódica. Si pasado el periodo de incubación aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidrólisis de la esculina confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales.Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHI: Se trata del caldo Cerebro-corazón que tiene la característica que contiene una concentración en NaCl de 6. la prueba de la catalasa será positiva. Página 13 . como ya se ha comentado anteriormente. Otras pruebas confirmativas: . . es por lo que son índice de contaminación fecal en agua marina. Para realizar esta prueba se efectuará un frotís con las colonias aparecidas en el caldo BHI con Streptococcus. las que se incuban a 37 ºC 24-48 horas. Una vez fijada la extensión se añade H2O2. . Los Streptococcus crecen en medios con elevada concentración en sales minerales.

aparecen con el citoplasma Página 14 .Prueba de la catalasa: La prueba ha resultado negativa. los Streptococcus no tienen la enzima catalasa que consigue metabolizar el H2O2 a H2O y O2.Tinción de Gram: Se observan cocos Gram positivos que teñido uniformemente de color azul o violeta. Los Streptococcus han hidrolizado la esculina produciendo glucosa y esculetina. Prueba confirmativa: Siembra en KAA Agar: La prueba resulta positiva: Aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidrólisis de la esculina por ello confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales. la cuál reaccionan con el NH4+ que lleva y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco. aparece en el medio de cultivo. es decir. la prueba es positiva. . los Streptococcus han crecido en este medio rico en NaCl. Otras pruebas confirmativas: .Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHI: La prueba es positiva. .Análisis Microbiológico del agua Resultado de la determinación: Prueba presuntiva: Aparece un ennegrecimiento en el tubo.

dando lugar. Investigando la presencia de formas esporuladas. La detección se basa en el crecimiento de este tipo de bacterias en medios que contienen Na2SO3 y en su capacidad para reducicirlo a sulfuro. sobretodo para apreciar la calidad higiénico-sanitaria del agua y productos animales ó de origen animal. con lo que la aparición de este color nos indica que existen Clostridios Sulfito reductores. lo que les confiere una gran resistencia. Estos microorganismos son importantes por los daños que pueden provocar en las personas y por los beneficios económicos que reportan. La detección y recuento de Clostridios Sulfito reductores se puede hacer de dos formas: Investigando la presencia de formas de vida vegetativas y esporuladas conjuntamente. Se va a determinar la presencia de formas de vida vegetativas y esporuladas conjuntamente. Los géneros pertenecientes al género Clostridium tienen la característica común de poder reducir el sulfito a sulfuro. Este tipo de microorganismos pueden esporas.Análisis Microbiológico del agua Determinación de Clostridios Sulfito Reductores: Los Clostridios son un género de bacterias que se caracterizan por producir esporas terminales que deforman los bacilos. sulfuro de hierro que es de negro. Lo primero será preparar una serie de diluciones decimales. los Clostridios sulfito reductores se usan en ocasiones como índice de contaminación fecal. Página 15 . Procedimiento: Determinación de formas esporuladas y viables: Se va a utilizar como medio de culltivo el Agar Sulfito-PolimixinaSulfadiazina (SPS). en presencia de hierro. Son anaerobias y Gram positivos.

y pasado el periodo de incubación se cuentan las colonias negras aparecidas. La siembra se efectuará introduciendo la pipeta hasta el fondo del tubo y depositando el inóculo lentamente hasta antes de llegar a la superficie. donde se sembrará con pipeta estéril en un tubo. El número total de formas vegetativas y esporuladas será: 1 colonia * 10 (Inverso del factor de dilución) = 10 formas vegetativas y esporuladas por cada mL de agua problema. Una vez solidificado el medio de cultivo se añaden 2 mL de ese mismo medio para crear anaerobiosis. En el tubo sembrado a partir de la dilución 10-2 no se observa ninguna colonia. Página 16 . Resultado de la determinación: En el tubo sembrado a partir de la dilución 10-1 se observa 1 colonia negruzca. ese número multiplicado por el factor de dilución será el número total de formas vegetativas y esporuladas por gramos ó mL de muestra. por eso las colonias aparecidas son negras. que reacciona con el Fe+2 del medio formando FeS que es negro.Análisis Microbiológico del agua Se preparan dos tubos con medio. Se incuba a 37 ºC 48 horas. un mL de la dilución 10-2 y en otro tubo un mL de la dilución 10-3. El color negro de estas colonias es debido a que los Clostridios han reducido el sulfito a sulfuro.

por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad. ESTREPTOCOCOS FECALES : 0 u.f. : 200 u. / 100 mL. El reglamento que regula la calidad de las aguas (R.c. de donde se encuentra el manantial del agua analizado que originarían la contaminación.E.f. ya que es indispensable para la vida. BACTERIAS A.c.O. que es el mejor indicador de este tipo de contaminación.Análisis Microbiológico del agua Conclusiones del análisis: El agua constituye un elemento esencial. Como resultado hemos obtenido una gran contaminación microbiológica del agua. el límite se supera ampliamente.D.c. 140/2003 del 7 de Febrero (B. Es normal que aparezca una contaminación fecal en el agua y la presencia de Escherichia Coli. E. nº 45 de 21/2/2003)) establece unos límites de contaminación que no pueden ser superados y como puede observarse con los resultados obtenidos. así lo confirma.c. aunque actualmente se conocía la no potabilidad de la misma. La causa presumible es la ubicación de unas grandes instalaciones ganaderas. Durante años se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua analizado y comparando resultados vemos que los parámetros biológicos se alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momento. COLI: 0 u.f.f. CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES: 0 u. / mL COLIFORMES: 0 u.c. Con este análisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un manantial. / 100 mL. a pocos metros de distancia. M. donde no debería aparecer ningún tipo de contaminación puesto que se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo humano.f. Página 17 . / 100 mL. / 100 mL.

Página 18 .Análisis Microbiológico del agua El problema de la no potabilidad del agua sería solucionado con una buena gestión de los residuos de las instalaciones ganaderas y someter al manantial a un tratamiento de potabilización.

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