CAPITULO 1 MARCADORES GENÉTICOS Ripoli, María Verónica1, 2 y Villegas Castagnasso, Egle Etel1, 2

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Centro de Investigaciones en Genética Básica y Aplicada (CIGEBA), Facultad de Ciencias Veterinarias,

Universidad Nacional de La Plata. Calle 60 y 118 s/n CC 296, B900AVW La Plata, Argentina. mvripoli@fcv.unlp.edu.ar
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Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET).

1.1. Introducción. 1.2. Polimorfismos bioquímicos. 1.3. Polimorfismos a nivel del ADN. 1.3.1 Enzimas de restricción. 1.3.2 Southern blot. 1.3.3 Secuenciación del ADN. 1.3.4 Huellas digitales del ADN o fingerprint. 1.3.5 Metodologías de detección de polimorfismos basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 1.3.6 Polimorfismos de nucleótido simple (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs). 1.3.6.1. Reacciones de hibridación alelo específica (ASO). 1.3.6.2. Polimerización a partir de un cebador (Primer extensión). 1.3.6.3. Ligado de oligonucleótidos (Oligonucleotide ligation assay, OLA). 1.3.6.4. Corte invasivo (Invasive cleveage). 1.3.7 Cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC). 1.3.8 ADN mitocondrial y polimorfismos del cromosoma Y. 1.4. Conclusiones.
1.5. Referencias Bibliograficas.

1.1. Introducción. A principios del siglo pasado las diferencias entre los individuos se expresaban señalando detalles de su aspecto externo. Para este fin se empleaban descripciones fenotípicas de la cabeza y de ambos flancos del animal, en las que se destacaban características distintivas como ser el color de capa, la presencia de remolinos, manchas, marcas, tatuajes o alguna otra particularidad. La mayor parte de estos métodos de identificación individual constituían una fuente de errores involuntarios, ya que estas descripciones subjetivas eran tomadas con criterios ambiguos, por lo cual resultaban ser escasamente informativas. El primer estudio sobre polimorfismos genéticos fue llevado a cabo en el año 1901 por Landsteinner, quien describió la variabilidad presente en los grupos sanguíneos humanos mediante el empleo de técnicas serológicas. Así, por primera vez, los individuos se podían agrupar en base a un criterio objetivo, y se acuñó el término “marcador genético”, definido sencillamente como caracteres heredables con múltiples estados (alelos) en cada carácter (locus). Las definiciones propuestas acerca del concepto de polimorfismo han sido muy variadas y entre ellas se destaca la de Ford (1965): "polimorfismo es la presencia simultánea de dos o más formas discontínuas en una especie, de manera tal que la menos frecuente de ellas no puede ser mantenida únicamente por mutación". Para Cavalli-Sforza y Bodmer (1981), "el polimorfismo bioquímico - genético es la existencia en una misma población de dos o más alelos en un locus, cada uno con una frecuencia apreciable". Según Lucotte (1977), se puede considerar un determinado locus como polimórfico cuando la frecuencia del alelo más común es igual o inferior a 0,99. Sin embargo, esta definición es arbitraria ya que este valor puede variar dependiendo de los valores muestrales (1%, 5%, etc.). En términos prácticos se deben descartar aquellos alelos que aparezcan una única vez y que por lo tanto puedan considerarse mutaciones espontáneas. De este modo el criterio a tener en cuenta para considerar polimórfico a un locus sería que en la muestra haya al menos dos individuos heterocigotas portadores. A pesar que los trabajos sobre polimorfismos genéticos comenzaron a principios del siglo XX, fue recién en la década de 1960 que los estudios basados en marcadores genéticos se hicieron sistemáticos. Smithies (1955), Lewontin y Hubby (1966), y Harris (1966) desarrollaron el método de electroforesis en almidón, lo que permitió estudiar las distintas formas (electromorfos) que presenta una proteína dada. Esta simple técnica revolucionó el estudio de la sistemática, la sociobiología, la evolución y la genética de poblaciones entre otras. El creciente desarrollo de las diferentes técnicas para la identificación del polimorfismo en distintos sistemas, hizo que se ampliara el concepto de marcador genético, ya no sólo aplicado para los caracteres

Andersson . Dentro de los polimorfismos bioquímicos analizados se encuentran la albúmina. analizando poblaciones de diferentes regiones del mundo (Braend. hemoglobina y transferrina (Braend . 1974. 1980). Baker y Manwell. 1989). Medjugorac et al. ya en el año 1964 Braend y Stormont describieron el polimorfismo del sistema A1b glicoproteína (A1B ó Xk).. Polimorfismos bioquímicos En el año 1977. Si bien la Sociedad Internacional de Genética Animal. Kidd y Cavalli-Sforza. producto de estos estudios. 1972. no todos son utilizados ya que presentan diferentes requerimientos técnicos. puestos de manifiesto por reacciones inmunológicas.2. Astolfi et al. consistió en la demostración de que las razas Bos taurus y Bos indicus divergían a nivel proteico (Braend. plasma seminal y principalmente sangre.. por ejemplo. prealbúmina.. Arranz Santos. 1971. estos datos permitieron construir árboles filogenéticos y superponerlos con mapas geográficos para de esta manera desarrollar teorías biogeográficas sobre el origen de las razas bovinas. al. debido principalmente a su accesibilidad y al elevado nivel de polimorfismos detectados en las enzimas y otras proteínas sanguíneas. identificados mediante electroforesis en geles de almidón o acrilamida. se comenzaron a analizar los grupos sanguíneos y los polimorfismos bioquímicos a nivel de diversos órganos. 1980. este tipo de estudios permitieron detectar las diferencias y similitudes entre las razas y analizar la variación genética dentro y entre poblaciones. 1994. 1980. se realizaron estudios a nivel regional utilizando poblaciones estrechamente relacionadas (Kidd y Pirchner.. Manwell y Baker. Manwell y Baker. ISAG) reconoce 16 sistemas proteicos en equinos. Lucotte distinguió tres tipos de polimorfismos bioquímicos: (i) los grupos sanguíneos. 1994).. Por otra parte. 1980.. Asimismo. Kidd et al. En cuanto al estudio de los polimorfismos proteicos en equinos. (ii) los sistemas de histocompatibilidad. (International Society of Animal Genetics.fenotípicos y los grupos sanguíneos. sino que también se incorporaban los polimorfismos a nivel proteico o bioquímico. En bovinos.. A1b glicoproteína. tejidos y líquidos orgánicos como leche. 1996).Eklund et al. 1991. (iii) los polimorfismos bioquímicos propiamente dichos. 1983. 1. Durante la década de 1970 comenzó la caracterización del genoma bovino por métodos bioquímicos (Tabel et al. 1990. Una de las principales conclusiones. Irvin et al.. Dichos análisis se llevaron a cabo en gran escala. Esta última constituye el fluido orgánico analizado con mayor frecuencia. De esta manera. carboxilesterasa. 1992) o inmunogenéticos (Bensaid et al. revelados mediante técnicas serológicas. 1972. Arranz Santos et.

Kienast.al (1986). En 1953. Con respecto al análisis de los polimorfismos bioquímicos en caninos estos se iniciaron. 1994. Kobayashi et al. (1991a y b). Estas secuencias específicas se caracterizan por ser palindrómicas (inversamente repetidas) y tener una longitud de 4 a 10 pares de bases. Hashimoto et al. estos fueron de gran utilidad para analizar niveles de variabilidad genética y constitución alélica de distintas poblaciones. los trabajos realizados en perros resultan escasos. ya que las mismas hidrolizan al ADN foráneo. Kingsbury y Masters. 1977. 1989). (1987) y Jordana et al. al igual que en bovinos y equinos. Si bien. 2004). (1984). Juneja et al.y Stormont. 1972. y poner en evidencia un alto grado de variabilidad presente en la raza. 1978). proteínas bacterianas que digieren al ADN de doble cadena al reconocer un determinado motivo o diana de restricción (Meselson y Yuan.3. 1977). Esta metodología conocida como hibridación ADN-ADN se basa en las propiedades termodinámicas de reasociación de las cadenas simples de ADN. En equinos de la raza Criolla Argentina. 1990). Este descubrimiento fue seguido por otros no menos importantes como ser el modelo de replicación semiconservativa de Messelson y Sthal en 1958. Sugiura et al. Simonsen (1976. A continuación describiremos en forma breve las principales metodologías utilizadas en el estudio de los polimorfismos a nivel de ADN: 1. Para preservarse de la hidrólisis de . a diferencia de las otras especies domésticas.3. Las bacterias utilizan estas enzimas para protegerse de la infección causada por bacteriófagos.1 Enzimas de restricción. 1968) y se aplicó en estudios sistemáticos y de evolución molecular (Sibley y Ahlquist. el empleo de estos marcadores permitió realizar la primer caracterización racial. 1968). (1974. En la década de 1960 se descubrieron las enzimas de restricción. Esta línea de descubrimientos marcó la tendencia hacia estudios cada vez más pormenorizados del material genético y por ende de los polimorfismos. o el aislamiento de la ADN polimerasa por Kornberg en 1960 (Kornberg. Gahne et al. Polimorfismos a nivel del ADN. 1979). 1964. así como también posibilitó establecer relaciones filogenéticas con razas ancestrales (Peral García. La primera técnica para estimar diferencias a nivel de ADN se desarrolló en la década de 1960 (Britten y Kohne. (1977). en la década de 1970 pudiéndose citar entre otros los trabajos realizados por Tanabe et al. James Watson y Francis Crick propusieron el modelo de doble hélice del ácido desoxirribonucleico (ADN). Ejima et. 1. (1981a y b).

Este tipo de endonucleasas pueden efectuar dos tipos de cortes en la cadena de ADN. 1993. los .su propio material genético. Cualquiera de estos eventos puede crear. Por otra parte. Luego. La metodología de Southern blot consiste en digerir el ADN con enzimas de restricción y someter a los productos de la digestión a una electroforesis en un gel de agarosa. Inicialmente.. las bacterias poseen enzimas de modificación que metilan su propio ADN en las regiones específicas reconocidas por las endonucleasas.1). cuando el corte se realiza por la mitad de la secuencia de reconocimiento genera extremos “romos”. o reordenamientos. ya que representaban una nueva herramienta para el estudio de los polimorfismos a nivel del ADN. 1993). El descubrimiento de las enzimas de restricción revolucionó a la biología molecular.2). eliminar o translocar los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción.. EcoRI se obtuvo a partir de la cepa RY13 de Escherichia coli. así por ejemplo HaeIII fue aislada de Haemophilus aegyptius. Los estudios de los polimorfismos a nivel del ADN se popularizaron en la década de 1980. De esta manera se pueden separar los distintos fragmentos obtenidos a partir de la digestión. estas enzimas permitieron realizar los mapas de restricción que indican la ubicación de los fragmentos de ADN a lo largo de un determinado cromosoma. Las enzimas de restricción se nombran de acuerdo a la bacteria de la cual se han aislado. 1980. Trommelen et al.. Estas diferencias pueden apreciarse mediante la realización de una corrida electroforética en un gel de agarosa o de poliacrilamida y su posterior tinción (Figura 1. 1.: Botstein et al. Definimos como sonda a una secuencia corta de nucleótidos (ADN o ARN) marcada y complementaria a la región del ADN en estudio en la cual se busca un determinado sitio de restricción (ej. cuyo fundamento es la detección de sitios de restricción (presencia o ausencia) mediante la utilización de una sonda. y cuando es desigual con respecto al eje de simetría de la secuencia se obtienen extremos “pegajosos” (Figura 1. El análisis del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción obtenidos a través del uso de endonucleasas se denomina RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism) y consiste en comparar los patrones de bandas generados a partir de moléculas de ADN de diferentes individuos que han sido sometidas a digestión con las mismas enzimas de restricción.3. estos trabajos se basaron en la combinación de la técnica de RFLP y la de Southern blot.2 Southern blot. Haberfeld et al. La presencia o ausencia de los sitios de restricción se debe a cambios moleculares como deleciones. Las diversas mutaciones que presentan las diferentes moléculas de ADN son las responsables de la aparición de los fragmentos de longitud variable. cambios de bases. inversiones.

Miller y Koopman.. Southern (1975) (Figura 1. la tercera ddCTPs y la cuarta ddGTPs. pero al carecer del hidroxilo en la posición 3´ no pueden formar enlaces fosfodiéster con nucleótidos sucesivos y la cadena queda interrumpida (Sanger et al. durante la década de 1970. y en la incorporación de dideoxinucleótidos (ddNTPs) trifosfato en la cadena en formación. 1990. C. Los dos métodos difieren muy poco entre sí. 1990. Este procedimiento de transferencia es lo que se denomina transferencia de Southern. se separan mediante electroforesis. G o T (Sambrook et al. Otro hito importante en la historia de la biología molecular fue el desarrollo.. De este modo los dNTPs y los ddNTPs compiten entre ellos generando poblaciones de oligonucleótidos terminados en A.. que difieren en la última base. La diferencia entre las cuatro reacciones es que una lleva ddATPs. 1977). Posteriormente se identifica la última base de cada oligonucleótido leyendo el gel de abajo hacia arriba. uno fue desarrollado por Maxam y Gilbert.. con la sonda adecuada pueden detectarse las diferentes variantes en base a la longitud y al número de fragmentos de restricción (Theilmann et al. 1990.fragmentos de ADN se transfieren a membranas de nylon o de nitrocelulosa para poder realizar la hibridación con la sonda adecuada que permitirá identificar a los fragmentos específicos ya que será posteriormente revelada mediante autorradiografía o a través de algún método de detección alternativo (por ejemplo quimioluminiscencia). 1990. (1977). en las cuales debe incluirse el fragmento de ADN que se desea secuenciar. Los fragmentos obtenidos. Damiani et al.3). otra ddTTPs. pero dado que el más comúnmente utilizado es el método enzimático de Sanger es el que vamos a describir a continuación.. Siguroardottir et al.3 Secuenciación del ADN. Los ddNTPs carecen de un residuo -OH en la posición 3´ de la desoxirribosa. Ferreti et al. 1. Este procedimiento se basa en la extensión específica de la cadena de ADN a partir de un cebador.. (1977) y el otro por Sanger et. la secuenciación se realiza en equipos automatizados que utilizan los mismos principios básicos establecidos por Sanger et al. dNTPs convencionales que si llevan el residuo -OH en posición 3´ y los ddNTPs. Siguroardottir. Actualmente. por la acción de la ADN polimerasa. Estos nucleótidos se incorporan a la cadena en crecimiento por medio del trifosfato presente en posición 5´. 1989). Estos cambios pueden suceder tanto en zonas que se transcriben como en zonas que no se transcriben. M. 1989.. La técnica original consiste en realizar cuatro reacciones de polimerización diferentes. De esta manera se logra conocer la secuencia del fragmento original (Figura 1. Barendse et al.4)... de dos métodos para poder determinar la secuencia de un fragmento de ADN. (1977). 1991. por lo que aportan un mayor grado de información y amplían los límites de los estudios. Por lo tanto. al. 1991). ya que fue descripto por primera vez por E. pero empleando los cuatro .3.

se separan los fragmentos mediante una corrida electroforética y se realiza la transferencia de Southern. En la década de 1980 surgen también las técnicas de análisis de secuencias codificantes como no codificantes. 1993.. Cowan et al. ADN telomérico.. los cuales se diferencian con cuatro fluorocromos distintos que son “leídos” por un láser. 1. 1990). Para el desarrollo de está técnica se realiza primero la digestión del ADN con una enzima de restricción. 1986. Lenstra et al. el término polimorfismo sólo se aplicaba a las regiones codificantes y a sus manifestaciones fenotípicas (Lewin. Las secuencias repetidas en tandem a su vez se clasifican en: ADN satélite. se realiza la hibridación con una sonda específica para un núcleo o core determinado. 1997)..4 Huellas digitales del ADN o fingerprint. El número y grado de representatividad con respecto al genoma total depende de la sonda elegida y de la distribución de esta secuencia en el mismo. Beckmann et al..: Botstein et al. Dichas secuencias están compuestas por ADN de copia única. 1990. Trommelen et al. presentando una longitud de 0..1 a 2 Kb. ADN repetido heterodisperso y ADN repetido en secuencias iguales una seguida de la otra (tandem). 1993) permitió el desarrollo de sondas capaces de hibridar con secuencias altamente repetidas del ADN denominadas minisatélites. 1985a.ddNTPs en una misma reacción. que permite estudiar simultáneamente distintos sectores del genoma (Jeffreys et al. Dichas secuencias se caracterizan por estar constituidas por un núcleo o core (secuencia determinada de bases) que posee un tamaño de entre 9 y 24 pares de bases (pb) y que se repite un número variable de veces... Richardson et al. microsatélites y minisatélites. 1989. 1986.3. 1993). Las secuencias no codificantes comprenden entre el 90 al 95% del ADN total. 1991. 1985b. El uso de sondas correspondientes a secuencias repetidas de este tipo posibilitó el desarrollo de la técnica de huellas digitales del ADN o fingerprint. siendo las regiones más variables del genoma. Gerard et al. Haberfeld et al. El descubrimiento de la existencia de secuencias repetidas heterodispersas en el genoma (Gerbi. 1980. Dado que se trata de una técnica muy laboriosa y que en muchos casos presenta baja repetibilidad.. para luego realizar el revelado de la misma. De esta manera los secuenciadores automáticos analizan los electroferogramas resultantes y generan un cromatograma de cuatro colores en el cual cada pico representa a cada una de las cuatro bases del ADN. Posteriormente. son escasos los trabajos poblacionales y de asociación con caracteres de producción realizados en animales domésticos (ej. 1975. Hasta el descubrimiento de los marcadores genéticos ubicados en regiones no codificantes del genoma. .. Kirby.

MacHugh et al. amplificada mediante PCR..1.. La gran versatilidad de la técnica de PCR permitió el desarrollo de diferentes variantes de esta metodología. cada uno específico para un alelo determinado y un cebador común (David y Deuhtch. Innis et al. 1991) (Figura 1. que se ubica junto a la base polimórfica.. las que permiten resolver distintas situaciones. 1990.3. 1990. 1998). La técnica de PCR es una herramienta útil para el estudio de la variación genética en poblaciones naturales o domésticas. el desarrollo del método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha simplificado y revolucionado los estudios genéticos poblacionales debido a que puede analizarse un gran número de individuos en forma fácil y económica (Mullis. 1994). Entre estas metodologías podemos mencionar: PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism): este método se basa en la detección de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción en una secuencia de ADN determinada. Se realizan dos reacciones simultáneas en las que se incluyen el mismo ADN . (1995). 1999. por lo que éstos pueden ser creados a través del método PCR-ACRS descripto por Park et al. Westemeier et al. Esto último permite realizar estudios cronológicos de las variantes alélicas y de esta manera evaluar los cambios de la diversidad genética de las poblaciones a lo largo del tiempo (Kirby.. 1990). puede aplicarse tanto a muestras frescas como a colecciones de museo (Herrmann y Hummel.2). 1990. Como resultado de 25 ciclos de amplificación se obtienen aproximadamente 106 copias del fragmento deseado. no todos los fragmentos de ADN incluyen sitios de restricción polimórficos. AS-PCR (Allele Specific-PCR): Esta metodología se basa en la utilización de dos cebadores. limitada por un par de cebadores u oligonucleótidos específicos mediante la utilización de una polimerasa termoestable (Taq polimerasa)... Desde 1985. 1987. Denicourt et al. PCR-ACRS (Amplification Created Restriction Site): esta técnica permite identificar las variantes alélicas de un locus ya que crea un sitio de restricción artificial utilizando un cebador que posee en el extremo 3´ una base no complementaria al ADN molde. 1989. Pinder et al. Dado que dicha metodología puede realizarse a partir de poca cantidad de ADN y que es poco exigente en cuanto a la calidad de la muestra. y sometida luego a la acción de una o varias enzimas de restricción (Damiani et al. Erlich.5 Metodologías de detección de polimorfismos basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Sin embargo. 1992). Esta técnica se basa en la amplificación o replicación in vitro de una secuencia determinada del ADN.

Weber y May. PCR-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism): permite detectar variaciones puntuales en un fragmento amplificado de ADN. STRs (Short Tandem Repeat): El uso de la técnica de la PCR no sólo se limitó al análisis de genes estructurales. de modo tal que las moléculas de cadena simple no se reasocian entre si pero si forman estructuras secundarias. Sin embargo. Kemp et al. en el otro tubo se añade el cebador complementario al otro alelo y además el oligonucléotido común. tres o cuatro nucleótidos. 1992). Los productos de PCR se someten a electroforesis y se determina el genotipo del individuo en estudio de acuerdo a la presencia o ausencia de las bandas correspondientes a cada reacción. Si bien se trata de una técnica sencilla y que permite amplificar varios loci simultáneamente. 1989. Tautz. que se encuentran ampliamente distribuidos por todo el genoma. . la diferencia entre los alelos está dada por variaciones en el número de repeticiones (Georges et al. RAPDs (Random Amplification Polymorphisms DNA): esta técnica consiste en la amplificación al azar de secuencias de ADN y fue descripta por Williams et al. sino que también permitió la amplificación de secuencias repetidas del tipo microsatélites (Litt y Lutty. Se basa en la amplificación al azar de secuencias desconocidas del genoma utilizando pequeños cebadores de aproximadamente 10 pares de bases. 1989). Para el desarrollo de esta técnica se desnaturaliza el producto de la PCR y se somete a una electroforesis en condiciones no desnaturalizantes. es una técnica de mucha utilidad en la evaluación de poblaciones naturales de animales y vegetales. suele ser criticada por la falta de repetibilidad entre los distintos laboratorios (Hedrick. 1989. pero mientras en un tubo se agrega uno de los cebadores específicos mas el cebador común. La aparición de estas estructuras se debe a los apareamientos intracatenarios que se producen entre las bases de una misma cadena y dependen de la secuencia de la misma.molde... Estas secuencias consisten en repeticiones en serie de dos. Este método genera polimorfismos de tipo dominancia-recesividad. donde no se cuenta con los datos de secuencias de ADN necesarios para el diseño de cebadores específicos para una determinada secuencia. (1990). es decir que solo se evalúa la presencia o ausencia de una banda. En el caso de estos loci. ASO-PCR (Allele Specific Oligonucleotide): esta técnica permite la discriminación de las variantes mediante la hibridación del fragmento amplificado con sondas específicas para la detección de los distintos alelos de un marcador (Jadot et al. 1991. 1992). De este modo no se busca ningún fragmento de ADN específico ya que los cebadores se unen a secuencias complementarias desconocidas del ADN molde. Los fragmentos así generados se separan mediante electroforesis. Las diferencias de estructura secundaria hacen que las cadenas de ADN migren de modo diferente en el gel y es esta característica la que permite realizar la discriminación de los alelos..

. lo que aumenta o disminuye el número de repeticiones. Steffen et al. 1993a. 1992. cualquiera sea su origen y su complejidad (Zabeau y Vos.. Avraham et al. en los últimos veinte años se han publicado numerosos trabajos sobre caracterización genética y sobre análisis de estructura poblacional utilizando microsatélites (MacHugh et al.. 1993). Brezinsky et al. Es un método muy sensible para caracterizar ADN. El elevado polimorfismo presente en los microsatélites sería consecuencia de la alta tasa de recombinaciones o crossing-over desiguales ocurridos durante la meiosis. La mayoría de los marcadores de AFLP son de tipo mono-alélico. La técnica de PCR-STR se basa en la amplificación de las mencionadas secuencias repetidas mediante la utilización de cebadores adyacentes a dicha secuencia. 1998. En este caso deben utilizarse cebadores marcados con fluorescencia.. Vaiman et al. 1993. o bien pueden detectarse las distintas variantes mediante la utilización de secuenciadores automáticos.. específicos de cada sitio de restricción y se realiza una primera PCR (preselectiva). principalmente del tipo microsatélites. 1997. 1993a. 1993.. Los productos de la PCR se someten a electroforesis en geles de poliacrilamida y las diferentes bandas se visualizan mediante tinción con nitrato de plata. 1997. usando cebadores complementarios al adaptador y a los sitios de restricción. los marcadores tradicionales (polimorfismos bioquímicos y grupos sanguíneos) han sido reemplazados por marcadores de ADN.. una de las cuales hace cortes frecuentes y la otra hace cortes poco frecuentes. Ellegren. 1993b. Ciampolini et al. 1993. Sunden et al. Se basa en la amplificación selectiva de los fragmentos de restricción mediante la PCR... Peelman et al. Los AFLP .. La técnica AFLP detecta polimorfismos generados por cambios en los sitios de restricción o en los adyacentes a éstos. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): También denominada polimorfismos en la longitud de los fragmentos amplificados. 1994.1991. 1993b. 1994. 1993). Moazami-Goudarzi et al. 1995. La separación de los fragmentos de la reacción se realiza mediante electroforesis en geles de poliacrilamida de tipo desnaturalizante revelados mediante tinción con plata o bien puede realizarse con un secuenciador automático. lo que significa que sólo se detecta un alelo de los dos posibles. Luego se ligan en los extremos de los fragmentos obtenidos unos adaptadores sintéticos. Gradualmente.. 1994a. En el caso de las razas bovinas. Los productos de la amplificación preselectiva se someten a otra PCR.. esta metodología es una combinación de las tecnologías de RFLP y de PCR. El ADN analizado es digerido con dos enzimas de restricción diferentes. 1993. Sun et al. 1993. Goudarzi et al. 1990. Swarbrick et al. 1998). 1994. 1994b. A cada cebador se le añade un nucleótido para seleccionar un solo subconjunto de fragmentos. y nuevamente se selecciona un subconjunto de fragmentos ya que se agregan dos nucleótidos más a los cebadores.

por consiguiente una adecuada tecnología de computación. Este tipo de polimorfismo consiste en el cambio de un nucleótido por otro (transición o transversión) dentro de una secuencia determinada de ADN. Otra característica de interés de los SNPs es su baja tasa mutacional. 1. han sido reportados. 2005). son secuencias cortas de ADN (200 a 500 nucleótidos de largo) generadas a partir de la secuenciación de uno o ambos extremos del ADN copia de un gen determinado. la mayoría de los SNPs se hallan fuera de las zonas codificantes. los SNPs tienen también . está basado principalmente en su abundancia. mas de cinco millones de SNPs y cerca de cuatro millones han sido validados. ESTs (Expressed Sequence Tags): los ESTs.permiten una exploración rápida de los polimorfismos del genoma entero y generan cantidades enormes de información. para obtener información acerca de su expresión y regulación. Un caso particular de polimorfismo son las deleciones o inserciones de pocos pares de bases denominadas INDELs. A pesar de su simplicidad y del polimorfismo limitado. también llamados marcadores de secuencia expresada. SNPs).3. y para mapear su posición en el genoma. los SNPs que se encuentran dentro de las regiones codificantes son de mucha importancia ya que probablemente puedan alterar la función biológica de una proteína. dado que pueden ser usados como marcadores para la identificación de genes responsables de enfermedades complejas y para estudiar el potencial de la fármacogenómica en el análisis de la respuesta variable a las drogas. es decir que han mostrado ser polimórficos en uno o varios de los principales grupos raciales (Sobrino. Los ESTs representan herramientas muy poderosas y rápidas para el descubrimiento de nuevos genes. deben mencionarse las técnicas de análisis de polimorfismos de nucleótido simple (SNPs). el creciente interés por el análisis de los SNPs en el campo de la medicina. Sin embargo. tanto por entidades públicas como privadas. y para construir mapas genómicos. Dentro de las metodologías que se están utilizando actualmente. tejidos y órganos de diferentes organismos y que utilizadas como sondas permiten detectar genes en los cromosomas o en secuencias genómicas por apareamiento de bases complementarias. Sin embargo. al. que pueden ser utilizadas para identificar genes desconocidos.6 Polimorfismos de nucleótido simple (Single Nucleotide Polymorphisms. Si bien aún es difícil estimar el número de SNPs presentes en el genoma humano. Dado que solo el cinco por ciento del genoma codifica para la producción de proteínas. por lo que se requiere un análisis automatizado de los datos y. es decir que cada SNP posee usualmente dos nucleótidos alternativos en una posición determinada. lo que los hace marcadores ideales para estudios de paternidad. Estas secuencias son porciones de genes que se expresan en ciertas células. et.

) y en fármacogenética. diversos métodos de detección de los alelos discriminados y diferentes formatos de ensayo. Para comprender las técnicas de tipificación de SNPs se debe tener en cuenta que existen distintas reacciones para discriminar alelos. et. estos pueden realizarse en reacciones homogéneas que son las que ocurren en medio líquido. y reacciones en soporte sólido como ser láminas delgadas de vidrio. etc.sonda complementaria serán estables. chips. abigeato. De esta manera se pueden diferenciar dos ADN blanco que difieran en la base polimórfica. los hace marcadores biológicos de excelentes características. mientras que los híbridos que difieren en una base serán inestables (Figura 1. etc. sin embargo. etc. medición de la masa. No existe un método ideal para la tipificación de los SNPs por lo tanto la selección de una técnica apropiada depende de los requerimientos del investigador. cada una específica para un alelo determinado. El principio empleado en este tipo de reacciones es el de transferencia de energía (FRET.1. En animales domésticos aún no se han llevado a cabo estudios tan extensivos como en humanos. El hecho que los SNPs se encuentren distribuidos a lo largo de todo el genoma.6. Los genotipos pueden inferirse a partir de las señales de hibridación. fluorescence . OLA) y corte invasivo (invasive cleveage). extensión de cebadores (primer extension). los datos disponibles indican que existiría una alta densidad de SNPs en las regiones que han sido estudiadas. sean marcadores bialélicos de herencia codominante y tiendan a ser relativamente estables. 1.3. Para poder realizar este tipo de reacciones es necesario diseñar dos sondas. La mayoría de las reacciones de discriminación de alelos pueden asignarse a uno de cuatro grupos principales de técnicas basadas en mecanismos moleculares: hibridación alelo específica (ASO). así como también en identificación genética (trazabilidad.limitaciones. por ejemplo el número de SNPs que se necesitan para realizar un estudio es alrededor de cuatro veces el número de STRs que serían necesarios (Sobrino. De esta forma la información que se obtenga a partir de estos polimorfismos podrá ser aplicada en un futuro cercano en programas de selección. En condiciones óptimas de hibridación los híbridos ADN . Los estudios realizados en animales domésticos para la detección de SNPs se enfocan principalmente hacia el análisis de marcadores genéticos potencialmente asociados a caracteres de producción (genes candidatos). Dentro de los formatos de ensayo. luminiscencia. al.5). Generalmente la base polimórfica se ubica en el centro de cada sonda. ligado de oligonucleótidos (oligonucleotide ligation assay. Reacciones de hibridación alelo específica (ASO). Los métodos de detección de los alelos discriminados pueden incluir fluorescencia. 2005).

La emisión de fluorescencia solo ocurre si la sonda es específica para uno de los alelos. Para la tipificación de los SNPs deben utilizarse dos sondas. . marcadas con dos colorantes fluorescentes diferentes. Si bien el concepto de hibridación es muy simple. 1. de no ser así no se detecta ningún tipo de emisión. Esta reacción puede realizarse en forma alelo específica utilizando dos sondas internas con diferentes colorantes. este tipo de técnicas presentan una alta tasa de error y además las sondas y los protocolos deben ser diseñados de forma muy específica. una específica para cada alelo. la Taq polimerasa también realiza una actividad exonucleásica 5´→ 3´ que degrada a la sonda. la sonda adquiere una configuración de bucle cuando no hibrida con el ADN blanco. Debido a la presencia de esas secuencias en los extremos. entonces la molécula fluorescente está inhibida por el atenuador y no se produce emisión de fluorescencia. con un espacio entre ambos de manera que pueda actuar la polimerasa.6. (ii) Guías moleculares (Molecular beacons): En este caso se utilizan sondas que poseen. Esta técnica se basa en la capacidad que posee la ADN polimerasa para incorporar a partir del extremo 3´ de un cebador los desoxirribonucleótidos complementarios a la secuencia de un ADN molde. Polimerización a partir de un cebador (Primer extension). de forma tal que el colorante fluorescente se separa de la molécula atenuadora y comienza a emitir fluorescencia.2. Cuando la distancia entre las dos moléculas se hace mayor. Se realiza entonces una PCR y a medida que avanza la polimerización a partir del cebador hacia la sonda. a ambos lados de la región complementaria al ADN en estudio.3. el marcador y el atenuador se separan produciéndose la emisión de fluorescencia. Para poder tipificar SNPs utilizando este tipo de reacciones existen dos tipos de técnicas: (i) Detección de actividad exonucleásica (Taqman): Esta técnica se basa en el principio FRET y en la actividad exonucleásica 5´ de la Taq polimerasa. En este caso el colorante fluorescente y el atenuador se encuentran en los extremos de una sonda complementaria al fragmento de ADN amplificado. Cuando la sonda se aparea correctamente con el ADN analizado. Por lo tanto para el desarrollo de esta metodología se utilizan oligonucleótidos que se unen al ADN y se extienden debido a la acción de una polimerasa. el atenuador deja de actuar y permite que el colorante emita fluorescencia. La metodología consiste en permitir que se unan al fragmento amplificado un cebador y la sonda complementaria con el colorante fluorescente. secuencias complementarias que llevan un marcador fluorescente en el extremo 5´ (reporter) y un atenuador (quencher) en el 3´.resonance energy transfer) según el cual la fluorescencia se emite como resultado de un cambio en la distancia física entre un colorante fluorescente (reporter) y una molécula atenuadora (quencher) de la fluorescencia.

Los nucleótidos no incorporados son degradados por una enzima apirasa. espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) y microarrays (Figura 1. Luego el microarray es escaneado para poder medir la fluorescencia.Existen tres variaciones de esta técnica. Cuando se utilizan microarrays los cebadores se fijan a un chip y son extendidos por una ADN polimerasa con ddNTPs marcados. La sucesión de incorporaciones correctas se registran en un pirograma en el cual se puede leer la secuencia del ADN molde. dado que compara las masas de los fragmentos de ADN después de una reacción de extensión. de modo tal que solo puede producirse la extensión de los fragmentos de ADN solo si los cebadores son perfectamente complementarios al fragmento de ADN. El producto de este tipo de reacción puede ser detectado sobre un microarray utilizando nucleótidos marcados con colorantes fluorescentes (Figura 1. La metodología denominada MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) está basada en la espectrometría de masas. En este caso no es necesario marcar los nucleótidos. Cada vez que se incorpora un nucleótido complementario a la cadena molde por acción de la polimerasa se libera un pirofosfato (PPi) que se transforma en ATP por acción de una ATP sulfurilasa. La gran ventaja de este método es que se puede detectar . SBE primer) y cuyo extremo 3´ se ubica junto a la base que precede al SNP. Luego.7).6). y en todas se parte de un amplificado originado a partir de la PCR: (i) Extensión alelo-específica: esta técnica utiliza dos cebadores diferentes. para poder analizar los resultados puede utilizarse cualquier método que permita separar los oligonucleótidos marcados de los ddNTPs marcados no incorporados. La masa precisa del producto de la reacción varía de acuerdo al tipo de ddNTP incorporado. Se parte de una estructura de ADN molde – cebador y se van incorporando nucleótidos mediante la actividad de una polimerasa. (iii) Pirosecuenciación: Esta nueva tecnología se basa en la ocurrencia de una cascada de reacciones enzimáticas que producen la emisión de luz cada vez que se incorpora un nucleótido correcto al ADN molde. Las metodologías mas ampliamente utilizadas son la electroforesis y detección de fluorescencia. cada uno de los cuales es complementario a uno de los alelos del SNP analizado. Permite diferenciar los diferentes genotipos. pero si es preciso disponer de equipos automatizados y además debe asegurarse la pureza de la muestra sometida al ensayo. Para lograr la extensión se agrega una ADN polimerasa y ddNTPs marcados con cuatro colorantes fluorescentes. El ATP es entonces utilizado por la enzima luciferasa para producir un pico de luz que es captado por una lente. (ii) Minisecuenciación: esta metodología implica la utilización de un cebador que solo se extiende una base (single base extensión.

4. pero si se requiere una gran cantidad de ADN.3. . La detección de los alelos se realiza mediante métodos colorímétricos (Figura 1. entre ellos el que se basa en el principio FRET. Cuando la complementariedad es perfecta y actúa la endonucleasa.9). En el caso que la sonda no fuera complementaria al alelo del SNP la endonucleasa no reconoce a la estructura formada y no actúa (Figura 1. 1. Los oligonucleótidos se denominan oligonucléotido invasor y sonda. puede realizarse una PCR para aumentar la sensibilidad del ensayo. El invasor es complementario a la secuencia que flanquea el extremo 3´ del SNP. una complementaria al polimorfismo del SNP y al extremo 5´ del mismo y un brazo 5´ no complementario. La unión entre los fragmentos es mediada por una ligasa y solo ocurre si la complementariedad con la base polimórfica es perfecta. Sin embargo. Ligado de oligonucleótidos (Oligonucleotide ligation assay. La longitud del solapamiento de ambos oligonucleótidos es de solo una base. Cuando la correspondencia entre la sonda y el alelo del SNP es perfecta. Este último se une al templado de ADN inmediatamente río abajo del SNP. y ambos son complementarios a una misma región del ADN. y se unen en forma adyacente al cebador común. el colorante se separa del atenuador y se produce la emisión de fluorescencia.6. Esta metodología se basa en la capacidad de la ligasa de unir covalentemente dos oligonucleótidos adyacentes cuando hibridan. En este caso la marca fluorescente se ubica en el brazo 5´de la sonda y el atenuador en la región complementaria de la misma. uno junto al otro. OLA).cualquier nuevo polimorfismo y analizar un gran número de individuos simultáneamente. esta se superpone con el extremo 3´ del invasor formándose una estructura que es reconocida por la endonucleasa Flap que actúa cortando y liberando el brazo 5´ no complementario de la sonda.3. En este caso se diseñan dos oligonucleótidos específicos para cada alelo y un cebador común. Estas estructuras se originan cuando dos oligonucleótidos hibridan perfectamente con un ADN molde y se superponen. 1. mientras que los cebadores específicos son complementarios a la base polimórfica. y la desventaja es que se requiere de un equipamiento automatizado específico. mientras que la sonda presenta dos regiones. en este caso la técnica se denomina PCR-ensayo invasor. Este método no necesita un paso de amplificación previo. Para conocer el resultado de este ensayo se pueden utilizar distintos métodos de detección.8). Esta técnica se basa en la capacidad de reconocimiento y corte sobre estructuras tridimensionales que tiene la endonucleasa Flap.6.3. con un ADN molde. Corte invasivo (Invasive cleveage).

Si bien este tipo de tecnología sirve para identificar la presencia de diferencias en las secuencias y no la variante genética en si. Otra técnica muy utilizada en la actualidad para la detección de polimorfismos es la DHPLC. En el ADN amplificado de cadena doble. ayuda a reducir el intervalo de posibles estrategias que se emplearían para detectarla. 1995. o de acuerdo a la elución diferencial de homoduplex (cadenas de ADN idénticas reasociadas) y heteroduplex (cadenas de ADN no idénticas reasociadas) durante su tránsito por el gradiente de una columna cromatográfica (Oefner y Underhill. 1993.. mediante HPLC en condiciones parcialmente desnaturalizantes. no presenta intrones y la mayoría de los genes se encuentran solapados. Yu et al. 1994a. Meirelles et al. 1994b.. 1997. Este análisis puede hacerse para detectar variaciones de secuencia entre individuos o para determinar la heterocigosidad... sino que también son de gran utilidad para el estudio de ADN no nuclear como el ADN mitocondrial (ADNmt) (Ron et al. 1999. 1998).. 1993.. Kemp et al. 1999. Las técnicas del ADN. 1994.. 1994. 1999). en el cual se separan los fragmentos de ADN según su tamaño.. Nijman et al.. así como también para detectar la presencia de mutaciones conocidas. Otra característica del ADNmt es la heteroplasmia.. una de las subunidades de la ATPasa y siete subunidades de la NADH deshidrogenasa. tres subunidades de la citocromo oxidasa.8 ADN mitocondrial y polimorfismos del cromosoma Y. Loftus et al. Entre estas podemos mencionar el citocromo b. Suzuki et al. Si esta mezcla de fragmentos se hace migrar.7 Cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC).3.1. 1. los heteroduplex fluyen de la columna antes que los homoduplex debido a su temperatura de fusión más baja. Hanotte et al. los nucleótidos que se incorporan erróneamente a causa de mutaciones y polimorfismos se hacen evidentes después de la formación de heteroduplex. Esta metodología permite el descubrimiento de nuevas mutaciones y polimorfismos en cualquier fragmento de ADN o en cualquier secuencia específica de un gen. . es decir heterogeneidad de mitocondrias en un mismo organismo. 1998. La presencia de estos polimorfismos crea una mezcla de heteroduplex y homoduplex durante la reasociación del ADN salvaje y del mutante.. 1999) y para el análisis de los polimorfismos del cromosoma Y (Bradley et al. Gwakisa et al. que es un método de cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento. En los mamíferos el ADNmt es una molécula circular que presenta una organización extremadamente compacta. Teale et al.. no sólo se aplican al estudio de loci autosómicos. Cymbron et al. 1992. En el caso del ser humano el ADNmt presenta una región control (D-loop) y 13 regiones codificantes que corresponden a las proteínas del aparato respiratorio de la célula. 1994.3.

las investigaciones realizadas en otros mamíferos son escasas. sin embargo gracias al desarrollo de nuevas tecnologías de citogenética y al desarrollo del proyecto genoma humano se han podido detectar también marcadores del cromosoma Y.. y una región haploide que en muchos aspectos se comporta como el ADN mitocondrial. En contraste con los numerosos estudios realizados en poblaciones humanas acerca de los polimorfismos en el cromosoma Y. el ADN mitocondrial representa la molécula mas intensamente estudiada. microsatélites y minisatélites. de los polimorfismos presentes tanto en el ADNmt como del cromosoma Y. como ser SNPs. El cromosoma Y presenta una región pseudoautosómica que es la que recombina durante la meiosis con el cromosoma X. En humanos.La región mas estudiada del ADNmt es el segmento de la región del D-loop. 1997). . En poblaciones humanas es suficiente la utilización de siete microsatélites para alcanzar una diversidad haplotípica de mas del 99%. lo cual permite la utilización de estos polimorfismos para la identificación de individuos (de Knijff et al. como ser la ausencia de heteroplasmia y la presencia de una gran variedad de polimorfismos que no presenta el ADNmt. acompañados del análisis de loci autosómicos permiten inferir parámetros poblacionales específicos de cada sexo como así también conocer los efectos de los mecanismos de selección sexual y de los sistemas de apareamiento. los cuales son específicos del sexo masculino. Mas allá de estas características comunes. La utilización. no sufre recombinación y se hereda únicamente por línea materna. tanto el ADNmt como la región haploide del cromosoma Y no sufren recombinación. por lo tanto los polimorfismos presentes en una molécula de ADNmt o en la región no homóloga al X del cromosoma Y comparten la historia de único linaje femenino o un único linaje masculino respectivamente (Petit et al. siendo los microsatélites aún mas abundantes. 2002). el cromosoma Y presenta una serie de propiedades muy interesantes cuando se lo compara con el ADNmt. A diferencia de los autosomas y de la región específica del cromosoma X. en estudios de genética de poblaciones. Diversos estudios realizados en cuatro regiones codificantes del cromosoma Y han revelado la existencia de un SNP cada 640-850 pb. Además. ya que tiene una alta tasa de evolución por lo que presenta un alto poder de resolución para estudios microevolutivos. La mayoría han sido realizadas en poblaciones de ratones y han incluido varios tipos de marcadores como ser micro y minisatélites (Boissinot y Boursot.. 1997).

La protección del nombre de la raza como marca del artículo puede. El advenimiento de las técnicas moleculares permitió trabajar directamente sobre la fuente primaria de variación o sea el propio material genético. como el avance metodológico ha ido acompañando el desarrollo y descubrimiento de nuevos marcadores genéticos. han permitido su aplicación como herramientas de utilidad en la identificación individual. brindando la posibilidad de utilizar distintas estrategias para el estudio de los polimorfismos y como éstos mismos se han convertido en una herramienta válida en los diversos campos de la investigación. Esto se torna cada vez más importante debido a utilización del nombre de la raza como “marca” de diversos productos cárnicos y lecheros (carne “Aberdeen Angus”. los grupos sanguíneos y especialmente los marcadores de ADN. la amplia variedad de técnicas existentes para estudiar los polimorfismos bioquímicos. permitiendo el análisis de cualquier cambio tanto en regiones codificantes como no codificantes. requerir del control de origen mediante test de ADN. en ciertas ocasiones. quesos de leche “Jersey” o “Ayrshire”). Actualmente. hemos visto en forma resumida. Conclusiones. en el control de filiación y en la determinación de la raza de origen de los individuos. .1.4. De este modo. Este último punto resulta de mucha importancia para la validación de diferentes productos alimenticios derivados de la explotación animal.

22: 444. White RL. Beckmann JS. Botstein D. 1964. Animal Genetics 1996. Pagnacco G. Avraham A. Tesis doctoral de la Universidad de León 1994. Solinas Toldo S. Z. Zücht. American Journal of Human Genetics 1980. 24: 361-376. More SS. Tierz. Yoffre MB. Nord. Cuninngham P: Zebu-taurine variation in Ychromosomal DNA: a sensitive assay for genetics introgession in West African trypanotolerant cattle populations.237. Teale A J. Ron M : Bovine dinucleotide repeat polymorphism at the aro26 locus. Machugh ND. Biol. 27: 415 . Guglielmino-Matessi CR: Phylogenetic analysis of native Italian cattle breeds. Soller M. Shalom A. Danell B.419. Clayton D. Keele JW. San Primitivo F: Comparison of protein markers and microsatellites in differentiation of cattle populations. Asia and Europe: evidence obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms. Manwell C: Chemical classification of cattle.17(1):25-38.. 100: 87-100. Loftus RT. Animal Genetics 1991. Hallerman EM. 11: 127-150. Nature Genetics 1994. Machugh E. Vet-Med. Mcgraw RA. Arranz Santos JJ: Estudio genético en poblaciones bovinas mediante polimorfismos bioquímicos y de DNA (Variaciones puntuales y microsatélites). Shani M. Departamento de Producción Animal. Weiss BK. Bishop MD. Facultad de Veterinaria. Genetics 1994. Li L. Grosz MD. Fries R. 24 (2):147. Astolfi P. Davis RW: Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Kirkpatrick J. 20: 241255. Breed groups. 16: 31-37. 146: 10191034. Animal Blood Groups Biochemical . 8: 9-14. 32: 314-331. 1983. Georges M. Anim Genet. Animal Genetics 1989. Braend M. Genetics 1997. Bayon Y. 6: 227 . Teale AJ: Biochemic characterization of activation associated bovine Class I major histocompatibility complex antigens. Sow RS. Kossarek LM. Animal Genetics 1993. Zhang N. Bensaid A. Braend M: Studies on the relationship between cattle breeds in Africa. Womack JE. Arranz Santos JJ. Kashi Y. Neibergs HL. Fries R. Beattie JW: A genetic linkage map for cattle. Sunden SL. Mccarthy F. 1986. Armitage SM. I. Animal Genetics 1994. Ron M. Ryan AM. Boissinot S y Boursot P: Discordant phylogeographic patterns between the Y chromosome and mitochondrial DNA in the house mouse: selection on the Y chromosome?. Barendse W. Baker AC. 25:1-12. Hawkins GA. Bradley DG. Shapiro SZ. Andersson . . Skolnick M. Kaushal A. Hoste CH. 136: 619-639. Armitage S. Nave A. Referencias Bibliograficas. World Review of Animal Production 1972. Yoo J. Hetzel DJ: Human apolipoprotein B (ADOB) detects a polymorphism RSAI in cattle. Barendse W. Stone RT. Grosse W: A genetic linkage map of the bovine genome. Kappes SM. Stormont C: Studies on hemoglobin and transferrin types of horses.1. Genetics 1980. Soller M: Restriction fragment length polymorphism among Israeli Holstein-Friesian dairy bulls.Eklund L. Rendel I: Association between blood group blood protein polymorphisms and breeding values for production traits in Swedish Red and White Dary Bulls.5. Hetzel DJ. Creighton P. Animal Genetics 1991.

Kohne DE: Repeated sequences in DNA. Ax RL.Ed. B. Schuler LA: Restriction fragment length polymorphisms associated with growth hormone and prolactin genes in Holstein bulls: evidence for a novel growth hormone allele. Loftus RT. Sci. Omega 1981. Ferretti L. Brezinsky L. Ciampolini R. Ejima H. Kurokawa K. Moazami-Goudarzi K. Kemp SJ. 24: 111 . Foulley JL. Teale A: ILSTS005: A polymorphic bovine microsatellite. R. Animal Genetics 1992. Lond. Damiani G. Biology Reviews 1965. Vaiman D. Rognoni G. Ford EB: Polymorphism. Fries R: Mapping the bovine genome: methodological aspects and strategy. Teale A: Five polymorfhic bovine microsatellites (ILSTS010-014). 6: 580-589. 23 (1): 81. Brezinsky L.Brezinsky L. Sgaramelli V: Restriction fragment length polymorphism analysis of the kappa-casein locus in cattle. Soc. Cymbron T. Kemp SJ.88. Dillmann C. Vet. Anim Genet. Vromans H. David V. Sci. Journal of Animal Science 1995. Berzi P.110. Deuhtch A: Detection of αS1-casein genomic variants using the allele-specific polymerase chain reaction. Erlich HA: PCR technology: principles and applications for DNA amplification. 246 pp. 23:425-429. 48(2): 363-368. Ikemoto S: Phenotype and gene frequencies of red blood cell groups in dogs of various breeds reared in Japan. Proc. Cianci D: Individual multilocus genotypes using microsatellite polymorphisms to permit the analysis of the genetic variability within and between Italian beef cattle breeds. Goudarzi K. Uppsala. Teale A: ILSTS001: A polymorphic bovine microsatellite. Mazzanti E. Sabour MP. Leveizel H: A new bovine dinucleotide repeat microsatellite: microsatellite INRA 30. Stockton Press 1989. 1989. Animal Genetics 1993a. . Bodmer WF: Genética de las poblaciones humanas. Vaiman D. J. Britten RJ. 1986. Vanmannshoven P. NY. Animal Genetics 1990. Animal Genetics 1990. Department of animal breeding and genetics 1993. Leveziel H. Animal Genetics 1993. Brouwers B. Kemp SJ. Biol. Swedish University of Agricultural Sciences. 73: 3259–3268. Animal Genetics 1993b. 1999. 24(3): 221. Denicourt D. 24 (1): 73. Ciampolini R. Mcallister AJ: Detection of bovine κ-casein genomic variants by the polymerase chain reaction method. Genome Research 1996. Jpn. 161: 529-540. Ellegren H: Genome analysis with microsatellite markers. Science 1968. 21: 215-216. Cavalli-Sforza LL. Dentine MR. Barcelona. Malheiro MI. Georges M: Identity-bydescent mapping of recessive traits in livestock: Application to map the bovine syndactyly locus to chromosome 15. Nueva York. Cowan CM. Bradley DG: Mitochondrial sequence variation suggests an African influence in Portuguese cattle. 24 (1): 74. 20:73 . Farnir F. 266: 597-603. Animal Genetics 1993. Charlier C. 20(2):157-65. 21:107-114. Animal Genetics 1992.

Bradley DG. Georges M. 253: 367-370. Georges M. 18: 4297. Compere T. White TJ: PCR Protocols: A guide to methods and applications. 96: 1777-1782. Proceedings of the Royal Sociecty London. Gerbi SA: Interdigitated repeated sequences in bovine satellite DNA. Dietz AB. Animal Genetics 1997. Animal Genetics 1993. Rege E. Hanotte O. Holm T. 28: 318-319. Harris H: Enzyme polymorphism in man. San Diego. 9: 37-40. Threadgill DS. Teale AJ: Characterization of Zebu cattle breeds in Tanzania using random amplified polymorphic DNA markers. Hedrick PW: Shooting the RAPDs. Teale A: A polymorphic Y chromosome microsatellite locus in cattle. Juneja RK. 482 pp. Vassart G: The poly (purine) poly (pyrimidine) sequence in the 5’ end of the thyroglobulin gene used as a probe identifies a DNA fingerprint in man. Sargeant LS. CA. Academic Press 1990. Kalay D. Larthrop M. Nature 1992. albumins and post-albumin in the blood plasma of cattle. Animal Genetics 1992. Yamakawa T. Animal Genetics 1994. Gerard C. Zhao X. Proceedings of the National Academy of Science USA 1993. Ser. A possible assumption about the origin of Japanese dogs. Sninsky JJ. and Biochem. Wilson AC: Evolutionary genetics of rumiants lysozymes. Rege EO: Geographic distribution and frequency of taurine Bos taurus and zebu B. Journal of Dairy Science 1993. Nature 1975. Ochieng JW. Tanabe Y: Further studies on the red cell glycolipids of various breeds of dogs.1984. Kemp SJ. Threagill DW. Hashimoto Y. Gunawardana A. Hanotte O. Nueva York. Libert F. Verjee Y. 23(1): 77-80. Mishra A. Kettmann R: Detection of bovine β -lactoglobulin genomic variants by the polymerase chain reaction method and molecular hybridization. Animal Genetics 1998. Verjee Y. Minisatellites y Microsatellites. Springer-Verlag 1994. 90: 1058-1062. Laloux J. Leveziel H: A new bovine dinucleotide repeat microsattellite: microsatellite INRA 18. Haberfeld A. Jadot M. Nucleic Acids Research 1990. Genet 1977. B 1966. Gelfand DH. 355:679-680. 1. 23: 193-202. 76: 645-652. Vainman D. Sargeant LL. Zhao X. Fries R. Herrmann B. . Animal Genetics 1992. Prager EM.. Olsaker I. J. Genomics 1991. Okono M. 25: 89-94. Leipold H. Nielsen D. Mishra A. Biochem. Lefort A. Weisberger P. Burny A. medical and forensic specimens. Terry C. Steele MR. archeological. Lathrop M. indicus Y chromosome haplotypes amongst subSaharan African catlle breeds. Goudarzy K. Steele MR. 29 (Suppl. Hummel S: Ancient DNA. Christophe D. Irvin DM. Ciampolini R. Gal O. museum. Schoeberlein A. Hilliel J: Application of multilocus molecular markers in cattle breeding. Innis MA. Recovery and analysis of genetic material from paleontological. 11:24-32. Womack E: Microsatellite mapping of the gene causing weaver disease in cattle will allow the study of an associated QTL. 164: 298-310. Teale A. 24(3): 221. Womack JE: Characterization of a set variable number of tandem repeat markers conserved in bovidae. Blood Grps. 1): 9.Gahne B. Grolmus J: Horizontal polyacrylamide gel electrophoreisis for the simultaneous phenotyping of transferrins. Gwakisa PS. Anim. Okomo M.

11: 21-38. Hashimoto Y. Wilson V. Andresen E: Two dimensional gel electrophoresis of dog plasma proteins: Genetic polymorphism of an a1-proteasa inhibitor and another postalbumin. Wilson V. La Plata. Animal Blood Groups Biochemics and Genetics 1971. Smith TPL. Kappes SM. 7: 235 . Christensen K. Genet. Masters CJ: Heterogeneity. Nature 1985b. Feb 28 1972. Animal Genetics 1994. Rognoni M: Immunogenetics and population genetic analysis of Iberian cattle. Faruque MO: Blood protein polymorphism in the Bangladesh native dogs. Archivos de Zootecnia 1991b. de Knijff P: Chromosome Y microsatellites: population genetic and evolutionary aspects. Neil DL. 258(2):455-65. Kingsbury N. 314: 67-73. Teale AJ: Dinucleotid repeat polymorphism at the bovine locus FSHB. Keele JW. Thein SL: Hypervariable “minisatellite” regions in human DNA. Jeffreys AJ. Miyakawa H. Blood Grps.N. Kidd KK. Jeffreys A. 83:367-374. Sanchez A. Int. U. Tanabe Y. Gahne B: Frequencies of transferrin types in various breeds of domestic dogs.1987. 28: 397-400. Puig P: Comparative F statistics of the genetic structure of ten spanish dog breeds. Juneja RK. 2: 93-103. Animal Genetics 1991. Jeffreys A. Kidd KK.Jamieson A. 2: 145-158. Jordana J. Nature 1985a. Taylor CS: Comparisons of three probability formulae for parentage exclusion. Christensen K. Tamaki K. Anim. Sanchez A: Variabilidad genética en diez razas caninas españolas.J. Juneja RK. Biochem. Teale AJ: Randomly primed PCR amplification of pooled DNA reveals polymorphism in a rumiant repetitive DNA sequence which diferentiates Bos indicus and Bos taurus. Macleod A. 28: 381-395. 40(147):115-129. Piedrafita J. Andresen E. Monckton DG: Minisatellite repeat coding as a digital approach to DNA typing. J. Kidd KK. Animal Blood Groups Biochemics and Genetics 1980. Gahne B. Carenzi C. Lopez-Corrales NL. 18(4): 225-233. Thein SL: Individual specific fingerprints of human DNA. 1981b.Tesis Doctoral de la Facultad de Ciencias Veterinarias. Biochim Biophys Acta. Journal of Heredity 1991a. Beattie CW: A second generation linkage map of the bovine genome.L. Genetic studies on breed differentiation of the native domestic animals in Bangladesh. Genome Research 1997. Piedrafita J. . Evolution 1974. molecular weight interrelationships and developmental genetics of the esterase isoenzymes of the rainbow trout. 110: 134-140.J. Legal Med. 25: 83-88. Ota K. Nature 1991. Jordana J.P. Kienast M: Estudio de polimorfismos genéticos en poblaciones equinas de Argentina. Animal Genetics 1997. Stone RT. 2004. 354: 204-209. Casati C. 12: 79-88. Kemp SJ. Kobayashi R. Stone WH. 1981a. Reetz I. 1997. Crimella C. 316:7679. Sonstegard TS. Argentina. Mcgraw RA.249. Cavalli-Sforza L: The role of genetic drift in the differentiation of Icelandic and Norwegian cattle. 22(5): 435. Pirchner F: Genetic relationships of Austrian cattle breeds. Kemp SJ.

74: 560564. Domestication and Phylogeography of Taurine and Zebu Cattle (Bos taurus and Bos indicus). Animal Genetics 1994. 54: 595-609. 25:19-27. Ficher SR. Lucotte G : Le polymorphisme biochemique et les facteurs de son maintien. Hines HC. Da Y. Sharp PM. 25: 265-271. Animal Genetics 1993. 29: 1-8. Mac Hugh DE. Cambridge. Animal Blood Groups Biochemics and Genetics 1980. Animal Genetics 1998. Landsteiner. Pirchner F: Marker-derived phylogeny of European cattle supports demic expansion of agriculture. Loftus RT. Loftus RT. Amount of variation and degree of heterozygosity in natural populations of Drosophila pseudobsucura. Sci. París. B Genes VI. Lazar P. Biochem. Machugh DE. Natl. Maxam AM. Kustermann W. Prak C. K: Ueber heterogentisches antigen und hapten. Van Boxtel JAF. Bradley DG. Proceedings of the National Academy of Science USA 1994a. Cunningham EP: Mitochondrial genetic variation in European. Bradley DG. Lewin HA: A male linkage map of the cattle (Bos taurus) genome. Olsaker I. Trans. Baker MA: Chemical classification of cattle. Manwell C. II. Hered 1996. 91: 2757-2761. Luty JA: A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. 44: 397-401. Kemp SJ. Bradley DG: Early medieval cattle remains from a Scandinavian settlement in Dublin: genetic analysis and comparison with extant breeds. Animal Genetics 1994b. 256: 2531. Ngere LO. Lond. Mac Hugh DE. American Journal of Human Genetics 1989. Lewontin RC. Russ I. Heyen DW. Shriver MD. Soc. Overton KM. 87: 261-271. Proc. Russ I. Bradley DG: Microsatellite DNA variation and the Evolution.Kornberg A: For the love of Enzymes: The odyssey of a Biochemist. R. Lenstra JA. 11:151-162. Medjugorac I. USA. Gilbert W: A new method for sequencing DNA. Loftus RT. 24: 33-40. Francia. 2. Litt M. Guérin G. Machugh DE. Beever JE. Cunningham P. Genetics 1966. Lewin. Acad. 1999. 146: 1071-1086. Mar Z. Troy CS. Bradley DG: Genetic structure of seven European cattle breeds assessed using 20 micrisatellite markers. Hubby J: A molecular approach to the study of genic heterozygosity in natural populations. B. 354: 99-109. Loftus RT. J. Oxford University Press 1997. Bradley DG. Cunningham EP: Evidence for two independent domestications of cattle. . Zwaagstra KA. Cunningham P: Microsatellite DNA variation within and among European cattle breeds. Balain DS. Proceedings of the Royal Society of London 1994. Mac Hugh DE. Mac Hugh DE. Sharp PM. Genetics 1997. Teale AJ. Mccormick F. Masson 1977. USA 1977. 119: 294-306. Schwerin M: Short interspersed nuclear element (SINE) sequence of the bovine. New York.: Harvard University Press. African and Indian cattle populations. Mass. Z. Eythórsdottir E. Phil. Loftus RT. Phylogenetic tree and specific status of the Zebu. Cunningham P. Green CA. Everts RE. 1901. Badi AM.

E. Hanotte O. Miller JM. 17(1): 28-33. Burny A. Bradley DG. T. Current Protocols in Human Genetics 1998. Sci. European Journal of Biochemistry 1986. Furet JP. Lobo RB. Perry BN. Trends in Ecology and Evolution 2002. Lewin HA: Genetic mapping of F13A to BTA23 by sperm typing: Difference in recombination rate between bulls in the DYA-PRL interval. Ezra E. Evol. Pinder SJ. Da Y. Rosa AJM. 155: 335-350. Faloona F: Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Grousclaude F: Analysis of genetic relationships between 10 cattle breeds with 17 microsatellites. Mortiaux F. Laloe D. Dansercoer A. Koopman M: Isolation and characterization of two male-specific DNA fragments from bovine gene. Petit E. Skidmore CJ.L. 29: 161-167. Levéziel H. 22-4: 543-546. Meselson M. coli. Methods Enzimology 1987. Sel. Ron M. 19: [7. La Plata. Messelson M y Sthal F: The replication of DNA in Escherichia coli. Renaville R. Weller JI: Sequence variation in D-loop mtDNA of cow lineages selected for high and low maternal effects on milk production.10. Yuan R: DNA restriction enzyme from E. 27:113-118. Animal Genetics 1990.. Genis I. Tesis Doctoral de la Facultad de Ciencias Naturales y Museo. Peelman LJ. Su Comparación con los Equinos de Pura Raza Española Mediante el Análisis de sus Polimorfismos Genéticos. Balloux F. 154: 349-354. 1989. Genet. 21: 77-82. Van Zeveren A.12]. Acad. 1994. Grohs C. Excoffier L: Mammalian population genetics: why not Y?. Yoffe O.. Crosby RM. Russ I. Good PJ. Underhill PA: DNA mutation detection using denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC). . Peral Garcia P: Caracterización Racial de Equinos de Pura Raza Criolla. Maniatis. Animal Genetics 1999. Nature 1968. Animal Genetics 1998. Genomics 1995.186. Furet JP. Genetics and Molecular Biology 1999. 44: 671-682. 22:11-20.10. E. F. Bouquet Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA 1958. Park CH. Argentina. Weller JI. Ron M. Molecular Cloning: A laboratory manual. 30: 265-273. Fritsch. Mayfield JE: Bovine DNA contains a single major family of interspersed repetitive sequences. Nijman IJ.P. García JM. Animal Genetics 1991. Coopman F.219. NY. U. Vaiman D. Shani M: Mitochondrial DNA polymorphism and determination of effects on economic traits in dairy cattle. Moazami-Goudarzi K. Portetelle D: Evaluation of the genetic variability of 23 bovine microsatellite markers in four Belgian cattle breeds. Lenstra JA: Satellite DNA polymorphisms and AFLP correlate with Bos indicus-taurus hybridization. 24: 183 . Savva D: Analysis of polymorphism in the bovine casein genes by use of the polymerase chain reaction. 28: 338-345. Martin P : Emploi de microsatellites pour l´analyse de la diversité génétique des races bovines francaises: premiers resultates.U. 3: 201 .1]-[7. Animal Biotechnology 1992. Nat. Smith LC. NY. Mullis K. 26 (Suppl 1): 155-165. Animal Genetics 1997. 1626 pp. Oefner PJ. Sambrook J. Proc. Wiley & Sons. Cold Spring Harbor. Duarte FAM: Is the american zebu really Bos indicus?. Animal Genetics 1993. Otsen M. Mercier D. Richardson KK.N. Rosen NL. 217: 1110-1114. Yoffe O. 1994. Mommens G. Moazami-Goudarzi K.Meirelles FV.

New Haven 1990. 1977. Anim. Animal Genetics 1993. Keele JW. USA. Simonsen V: Low level of heterozygosity among carnivores. 8: 121-126. Blood Grps. 24(2):142. Forensic Sci. Acad. J. Sunden SLF. Swedish University of Agriculty Science. Lunden A. Kirkpatrick BW: A polymorphic microsatellite (UWCA4) detected on bovine chromosome 23. 2005. Nicklen S. Uppsala. Department of Animal Breeding 1991. CT: Yale University Press. Barense W. Biochem. 98:503 – 517. Coulson AR: DNA sequencing with chain – terminating inhibitors. Tanabe Y. Ota K: Genetic polymorphism of eserine resistant esterases in canine plasma. Anderson L: Restriction fragment lenght polymorphism of bovine lysozyme genes. Kirkpatrick BW: A polymorphic microsatellite (UWCA1) detected on bovine chromosome 23. Sun H. Steffen P. 1975. Proceedings of the National Academy of Science USA 1992. Animal Genetics 1990. 24: 1221-1224. Ahlquist JE: Phylogeny and Classification of Birds. 24(2): 149. Proc. Bishop MD. Kehrli ME. 154: 181 – 194. Biol. Kappes SM. Ackermann MR. Siguroardottir S: Studies of Class II genes of the Major Histocompatibility Complex in cattle. Dietz Ab. Genet. 1955. Southern EM: Detection of specific sequences among DNA fragments separated by electrophoresis. Stranzinger G. Mol. Sobrino B. Animal Genetics 1994. 24(2): 149. 91: 315. Biochem. 21: 259-266. Carracedo A: SNPs in forensic genetics: a review on SNP typing methodologies. Simonsen V: Electrophoretic studies on the blood proteins of domestic dogs and other Canidae. 1977. 89: 9225-9229. Eggen A. Hereditas 1976. Kirkpatrick BW: A polymorphic bovine microsatellite. Brion M. . 74: 5463 – 5468 Shuster DE.Sanger F. Natl. Fries R: Isolation and mapping of polymorphic microsattellites in cattle. 82: 7-18. Sugiura S. Animal Genetics 1994. 24(2): 142. Smithies O: Zone electrophoresis in starch gels: group variations in ths serum proteins of normal human adults. Dentine MR. Beattie CW: A highgly polymorphic bovine microsatellite locus: BM2113. Sci. Dentine MR. Dentine MR. Hart GL. Sun H. Sibley CG. Int. Animal Genetics 1993. Sun H. Sun H. Womack Je. 61: 629-641. Siguroardottir S. 24(1):69. Hereditas 1979. Animal Genetics 1993. Kirkpatrick BW: UWCA19 and UWCA20: Polymorphic bovine microsatellite. Stone RT. Gilbert RO: Identification and prevalence of a genetic defect that causes leukocyte adhesion deficiency in Holstein cattle. Animal Genetics 1993.

Kemp SJ: A polymorphism in randomly amplified DNA that differentiates the Y chromosomes of Bos indicus and Bos taurus. Omi T. Animal Genetics 1989. Kemp SJ. Tabel H. Teale AJ. Gwakisa PS. 5: 288-297. Teale AJ: Polymerase chain reaction analysis of mitochondrial DNA polymorphism in N'Dama and Zebu cattle. Asanoma M. Vijg J. 5: 225-230. Bradley D. 8: 191-195. Crick F: Molecular estructure of nucleic acids: A structure for deoxyribose nucleic acid. and polymorphism. 26: 243-248. 20: 257 . Animal Genetics 1993. cristallin. Tautz D: Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Genet. Kraay GJ. 1974. Womack JE.9) in canine erythrocytes. 21: 123-128. 9: 79-83. Animal Genetics 1995. Jansen RW. Blood Grps.3. synteny mapping. 1993. Jian CS. Dietz AB. He ZQ. Moazami-Goudarzy K: A set of 99 cattle microsatellites: characterization. Womack JE: Restriction fragment length polymorphisms for growth hormone. Sugiura S. Brawn JD. Nie L. 17 (16): 6463-6471. 171:737-738. osteonectin. Baker JF. Groat HJ. Zabeau M. Biochem. Ota K: Genetic variants of hemoglobin in canine erythrocytes. Simpson SP. Anim. Uitterlinden AG: DNA profiling of cattle using micro. Ota K: Genetic variants of glucose phosphate isomerase (E. American Journal of Human Genetics 1989. . Vos P: Selective restriction amplification: a general method for DNA fingerprinting. Paige KN: Tracking the long-term decline and recovery of an isolated population. Biochem. Rafalski JA. 1977. Bouzat JL. 23: 182. 44: 388-396. Livak J. 1978. Yu Y. Aston WP: Genetic polymorphism of complement factor H in cattle. Animal Genetics 1995. Esker TL. Mercier D. Watson J. Swarbrick PA. Anim. Zhang YP: Mitochondrial DNA variation in cattle of south China: origin and introgression. fibronectin and 21-steroid hydroxilase in cattle. Den Daas JHG. prolactine. Aston WP: Ovine and bovine dinucleotide repeat polymorphism at the MAF46 locus. Kershner EL. Genet.and minisatellites core probes. Simpson SA. Walk JW. Tanabe Y. 24: 339-343. 26: 155-161. Genet. EP0534858A1) 1993. Nature 1953. Wambugu J. Biochem. Animal Genetics 1990. Nucleic Acids Research 1989.1.C. Blood Grps. Weber JL. Tanabe Y. Animal Genetics 1990. Tingey SV: DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.Suzuki R. Blood Grps. Wen JK. 30: 245-250. Anim. Kubelik AR. Publicación Europea de Patente 92402629 (Publicación No. 5. Williams JGK. Usha AP. Nucleic Acids Research 1990. Theilmann JL. Tanabe Y. Westemeier RLl. 282:1695-1698. May PE: Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Williams JL: Probability of random sireexclusion using microsatellite markers for parentage verification. Mammalian Genome 1994. 24: 235-241. Omi T. Vaiman D. Skow LC. Stranzinger G. Trommelen GJ.266. 18: 6531-6535. Ota K: Genetic polymorphism of leucine aminopeptidase in canine plasma. Animal Genetics 1999. Science 1998.

dos que producen extremos romos (HaeIII y AluI) y dos con extremos pegajosos (TaqI y HinfI). Representación esquemática de sitios de digestión correspondientes a cuatro enzimas.Figura 1. .1.

2. (a) Representación esquemática de los patrones de restricción correspondientes al cuarto exón del gen κ-caseína (CASκ) digerido con la enzima HindIII y (b) su posterior visualización en un gel de poliacrilamida.Figura 1. (a) 583 pb Exón 4 CASκ CASκ A 583 pb CASκ B 380 pb Hind III 203 pb (b) AA AB BB 583pb 380pb 203pb .

Procedimientos empleados en la técnica de Southern Blot Figura 1. .Figura 1. (1977).4.3. Procedimiento para secuenciación de DNA ideado por Sanger et al.

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