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Projeto: Diretrizes de Políticas Públicas para a

Agroindústria Canavieira de São Paulo.

Workshop Produção de etanol: Qualidade da matéria-


prima.

Efeito de fatores inibidores na


fermentação alcoólica.

Prof. Dr. Pedro de Oliva Neto


Faculdade de Ciências e Letras de Assis – UNESP
poliva@assis.unesp.br
INTRODUÇÃO

Para dimensionar os fatores bióticos e abióticos que inibem a


fermentação alcoólica industrial é necessário reconhecê-los e avaliá-los
de forma sinérgica.
Dentre os fatores destacam-se :

1. qualidade do substrato a ser fermentado


2. pH e temperatura de processo
3. teor alcoólico
4. aditivos químicos (ácidos, biocidas, antibióticos, íons Ca, P )
5. contaminações microbianas com produção de ácidos e outros
6. floculação celular
7. qualidade da centrifugação do fermento
8. tipo de processo fermentativo.
9. dimensionamento da planta
10. limpeza e assepcia
Nesta apresentação será dada atenção a alguns destes
fatores relacionados à qualidade da matéria-prima,
parâmetros de processo e efeito de contaminações
microbianas, sempre sobre o prisma do efeito sinérgico
com outros fatores.

Quando me refiro à matéria-prima para a fermentação


alcoólica, me refiro, em especial, ao melaço e caldo de
cana, pois atualmente, estes dois componentes compõe o
mosto, sendo o primeiro mais problemático do que o
segundo para a fermentação alcoólica.

Alguns parâmetros que podem ser inibidores da


fermentação alcoólica são apresentados a seguir,os
quais se pretende avaliá-los de forma detalhada:
Efeito de Ácidos orgânicos

O ácido lático (forma não dissociada) pode entrar na célula


diretamente por difusão simples, na presença de glicose no meio.
Os ácidos acético e fórmico são mais solúveis nos lipídeos da
membrana da levedura que o lático (que contém uma OH- extra,
inibindo o crescimento da levedura numa concentração inferior
ao ac. Lático.
- interfere na energia de manutenção celular
- reposição celular e crescimento,
- gasto ATP com as permeases de membrana para
manutenção do pH I,
- interferência na absorção de nutrientes ex.
Fósforo através da interferência no mecanismo de transporte
Symport (glicose, H+ e fósforo).
- consumo de glicose endógena (trealose ou glicogênio) ou
externa. Quando o pH externo está abaixo de 4 triplica a
atividade da ATPase, dobrando sua afinidade pelo ATP, sem
contudo alterar seu pH ótimo (ERASO & GANCEDO , 1987).
Efeito do pH do meio no metabolismo da levedura

Gradiente gera a força extrusão consumo


de pH ⃗ proton motiva ⃗ de prótons ⃗ glicose via ⃗
ATPases

excesso aumento H+ maior velocidade no limite


acidez ⃗ entrando célula ⃗ das permeases ⃗ ocorre acidificação
e consumo gli interna e ↓ pHi

inibição das enzimas inibição da viabilidade, morte ⃗


e da prod. ATP ⃗ e queda rendimento etanol
Efeito do sulfito
• Sulfito em solução aquosa existe em 3 formas dependendo do valor
do pH.
• SO2 ↔ HSO3- ↔ SO3 –2 pK entre SO2 ↔ HSO3- = 1,77 e entre
• HSO3- ↔ SO3 -2, pK = 6,9 .

• O dióxido de enxofre molecular é tóxico para bactérias


láticas e em menor grau para leveduras. O HSO3- (bissulfito) inibe
a zinco desidrogenase alcoólica, portanto a fermentação.
• O Sulfito é mais letal para bactérias no pH mais ácido (pH 4,0),
predomínio da forma HSO3- .
• Na fermentação industrial o efeito do sulfito é claro na acidez total
do vinho (o normal é 1,8-2,5 g/L e aumenta para níveis de até 3-5 g/L)
e como conseqüência temos:
• queda da viabilidade e número de células vivas.
• queda do brotamento celular e queda na eficiência alcoólica via
reprodução de mais fermento para reposição das perdas.
• aumento da atividade tamponante do meio, maior consumo de ácidos
e bases no processo.
• em casos mais graves, aumento exagerado na acidez do álcool
produzido.
Efeito da Temperatura
A temperatura é outro fator importante que pode levar a inibição
da levedura e do processo. S. cerevisiae tolera até 33ºC em
condições industriais para produção de etanol, apesar desta sp ter
uma faixa de crescimento mínima de 10ºC e máxima de 40ºC,
estando a temperatura ótima entre 28ºC e 35ºC (JONES et al,
1981).

O sinergismo entre ácidos orgânicos e temperatura ocorre levando a


um efeito inibidor potencializado. A faixa de crescimento de S.
cerevisiae é encurtada de 3-42OC para 19-26oC. na presença de
1% v/v de ácido acético (Tereza-Ramos e Madeira-Lopes , 1990).

A temperatura estimula o acúmulo de trealose. Segundo


HOTTIGER (1987), um choque térmico, com mudança de 27ºC
para 40ºC por uma hora resulta em um rápido e grande
acúmulo de trealose. Tal choque induz a um aumento de seis
vezes na atividade da trealose-P-sintetase.
100
90
80

% de células vivas
70
60
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40

te m po e m hor as

38º C 40º C 45º C 50º C 55º C 65º C

Viabilidade das células de levedura de panificação durante a autólise em


diferentes temperaturas
Efeito inibitório do Etanol

- alterações da composição da camada lipídica da


membrana,
- síntese de proteínas estressoras, na modulação dos
processos de troca iônica,
- redução de atividades metabólicas como causa da inibição
do transporte de glicose, diminuindo a viabilidade,
formação de produto e causando estresse hídrico
(Hallsworth, 1998, Martini et al., 2004).
- A toxidade do etanol em concentrações elevadas (acima de
10% p:v), limita o seu rendimento e produtividade durante
a fermentação industrial (Walker-Capriolo et al., 1985) e
diminui a tolerância à temperaturas mais altas .
Fatores de estresse fisiológico que levam ao aumento da energia de manutenção celular, queda viabilidade,
produção de etanol e reservas energéticas causando instabilidade do processo fermentativo .
Sinergismo entre ácidos fracos, pH, etanol, pressão
osmótica do meio, temperatura afetando de forma
potencializada a Força Próton Motiva.

Quando por ex. o pH externo cai de 6 para 3 aumenta a sensibilidade


da levedura ao etanol, dissipando a força protomotiva da membrana. Esse
feito é aumentado na presença de ácidos orgânicos fracos, principalmente
quando o pHi da célula está abaixo do pKa dos ácidos, aumentando a forma
indissociada do ácido e aumentando a toxidez pelo etanol, de modo
sinergístico, como ocorre com o ácido acético. O etanol em concentrações de
6 e 8% (v/v) ativa (acelera) a ATPase da membrana plasmática de
Saccharomyces cerevisiae, industrialmente trabalha-se com 9-9,5% de
etanol, portanto no limite do metabolismo da levedura. Efeito do pH baixo
ocasiona a perda de nutrientes como nitrogênio e potássio, bem como aumenta
a sensibilidade ao etanol, aos ácidos orgânicos e ao SO2.

Elevada Pressão osmótica do meio pode aumentar a toxicidade do ácido


lático que em baixa Pressão Osmótica (0,6) inibe o crescimento de S.cerevisiae
a partir de 5 g/L , em alta pressão osmótica (1,6) inibe a partir de 2,5 g/L.
(Ngang et al. 1989).
Sinergismo entre ácido lático, Sulfito, pH e etanol na
fermentação de Saccharomyces cerevisiae Pe-2 e M-26.

Tese de Doutorado da aluna: Claudia Dorta


Orientação: Prof. Dr. Pedro de Oliva Neto
UNESP –Campus de Rio Claro e Assis

Publicação: Dorta, C. Oliva-Neto, P. Synergism among lactic


acid, sulfite, pH and ethanol in alcoholic fermentation of
Saccharomyces cerevisiae (PE-2 and M-26). World Journal of
Microbiology and Biotechnoloy , vol. 22, p. 177-182, 2006.
Objetivo

Verificação dos efeitos sinérgicos de


estresse durante a fermentação
etanólica, podendo assim estabelecer
parâmetros reais para um
aprimoramento na produção de álcool
carburante.
Tabela 1: Formulação de meios fermentativos com os fatores de
estresse: etanol, ácido lático sulfito e pH.

______________________________________________________________________
TºC sulfito (mg/L) ácido lático etanol pH toxicidade
M (meio) (NaHSO3) (g/L) (% p:v)
______________________________________________________________________
1 32 200 6,0 9,5 3,6 máxima
2 32 50 6,0 9,5 3,6 - sulfito
3 32 200 2,0 9,5 3,6 - ác. lát.
4 32 200 6,0 7,5 3,6 - etanol
5 32 200 6,0 9,5 4,5 pH normal
6 32 0 0 7,5 4,5 controle
_____________________________________________________________________
80

70

Viabilidade celular (%)


60
50

40
30

20

10
0
M1 M2 M3 M4 M5 M6
Meios fermentativos

Figura 1: Efeito de diferentes estresses associados na


viabilidade celular das linhagens de levedura Saccharomyces
cerevisiae P-2 e M26 após a fermentação etanólica.
Figura 2: Efeito da fermentação em M5 sobre as células
da linhagem Pe-2.
Figura 3: Efeito da fermentação em M1 sobre as células
da linhagem PE-2.
20
18
16

Brotamento (%)
14
12
10
8
6
4
2
0
M1 M2 M3 M4 M5 M6
Meios fermentativos

Figura 4: Efeito de diferentes estresses associados na


taxa de brotamento das linhagens de levedura
Saccharomyces cerevisiae Pe2 e M26 após a fermentação
etanólica.
450

Liberaçãode H+(umoles de H+/ h/ g)


400
350

300

250

200
150

100

50

0
To 5 o Ciclo 7o Ciclo
Ciclo fermentativo

Figura 5: Efeito de diferentes mostos com estresses associados na


atividade da bomba de prótons, após o processo fermentativo por
S cerevisiae P-2. M1, M2, M3, M4, M5, M6.
Tabela 2. Ácidos orgânicos totais produzidos durante a
fermentação alcoólica por S. cerevisiae M-26 e PE-2.

______________________________________________________________________
Média ácidos orgânicos totais(g l-1)
______________________________________________________
M-26 PE-2
________________ _______________
M* DP * M* DP *
______________________________________________________________________
M1 14.97 1.76 10.86 3.68
M2 15.88 0.67 12.25 2.60
M3 12.02 1.37 8.50 1.96
M4 13.30 1.00 8.06 2.90
M5 14.65 1.00 11.00 2.28
M6 10.62 1.15 8.00 2.00
______________________________________________________________________
*M= média, *DP= desvio padrão. Obs. Somatória dos ácidos lático, acético, succínico,
aconítico, tartárico.
12

Trealose (g.100g-1 massa seca )


10

0
M1 M2 M3 M4 M5 M6
Meios de fermentação

Figura 6: Concentração de trealose em linhagens de Saccharomyces


cerevisiae PE-2 e M-26 durante diferentes condições de fermentação.
( ) PE-2, To-1o ciclo ; ( ) PE-2, 7o ciclo -12h; ( ) M-26, 1o ciclo-
To; ( ) M-26, 7 o ciclo-12h.
45

Concentração de proteína residual


40
35
30

(mg/ mL)
25
20
15
10
5
0
M1 M2 M3 M4 M5 M6
Meios fermentativos

Figura 7: Efeito de diferentes estresses associados na


formação de proteína residual no mosto fermentado pela
linhagem S. cerevisiae M-26 PE-2
3

2,5

ARRT (%)
1,5

0,5

0
M1 M2 M3 M4 M5 M6
Meios fermentativos

Figura 8: Efeito de diferentes estresses associados na


formação de ARRT após a fermentação de S. cerevisiae
P-2 e M26 .
90
85

Rendimento etanólico (%)


80
75
70
65
60
55
50
45
40
M1 M2 M3 M4 M5 M6
Meios fermentativos

Figura 9: Efeito de diferentes estresses associados no rendimento


etanólico obtido da fermentação de S. cerevisiae P-2 e M26 .
12

Produtividade etanólica(g/L.h)
10

0
M1 M2 M3 M4 M5 M6
Meios fermentativos

Figura 10: Efeito de diferentes estresses associados na


produtividade etanólica obtido da fermentação de S.
cerevisiae Pe-2 e M26 .
Conclusões do trabalho

O pH baixo do meio demonstra ser o fator de maior estresse


fisiológico para Saccharomyces cerevisiae obtida e utilizada em
destilarias de produção de etanol carburante, quando comparado
com outros fatores (sulfito, ácido lático e teor alcoólico elevado).
O pH 4,5 no mosto permite uma proteção contra os fatores de
estresse estudados, obtendo-se maior viabilidade celular,
brotamento, rendimento alcoólico, morfologia regular das
leveduras, diminuição no açúcar residual e menor liberação de
aminoácidos no meio, propiciando melhor eficiência alcoólica e
estabilidade do processo.
O desenvolvimento da tecnologia de produção do bioetanol deve
contemplar procedimentos que preservem a força próton-motiva
da levedura tais como: mostos com pH mais adequados, e
eliminação de métodos que envolvam aumento da concentração
hidrogeniônica do meio.
Perspectivas para a melhoria da matéria prima
usada na fabricação do bioetanol
Clarificação do melaço de cana
• 1. considerando-se que o melaço provoca aumento da acidez e
sulfito, no mosto, o que é prejudicial à levedura e ao processo.
• 2. Aumento de cálcio no mosto, estimulando a floculação celular
• 3. A quantia de ART via mel na composição do mosto ser superior à
do caldo de cana.
• 4. Aumento do poder tamponante do mosto o que impacta em maior
gasto com ácido sulfúrico no “pé-de-cuba”.
• 5. A eficiência na eliminação de sais, incluindo o sulfito via clarificação
do melaço, a qual pode chegar a 90%
Justifica-se a implementação deste procedimento em escala
indutrial, porém é necessário um decantador separado da linha de
fabricação de açúcar, maior entrave hoje .
Controle na deterioração da cana

• É mais fácil evitar a entrada de moléculas e microrganismos


indesejáveis no processo industrial, do que retirá-los do sistema. Cana
deteriorada no campo é rica em biopolímeros e microrganismos que
causam distúrbios no processo industrial, tanto para a linha de açúcar,
como para a de etanol. Por isso é necessário um eficiente
planejamento entre a área agrícola e a industrial, para evitar a
deterioração da cana no campo. Em meses quentes e chuvosos, a
deterioração pode chegar a infecções microbianas da ordem de 10
bilhões de células por ml de caldo de cana.
• Com a lei obrigando a mecanização do corte , onde a cana é cortada em
tamanhos menores, haverá mais área exposta a deterioração e maior
controle neste planejamento deverá ser feito.
• Investimentos em pesquisa e desenvolvimento de métodos de controle
biológico de insetos devem ser feitos para melhorar a tecnologia hoje
disponível no Brasil.
Assepsia da moenda

A qualidade do mosto a ser fermentado depende muito do


grau de assepcia da moenda. Para a assepcia da moenda
em condições de processo, apenas alguns biocidas são
utilizados, e com baixa eficiência nas dosagens
recomendadas. A limpeza física só é feita nas paradas.
Métodos de CIP (clean in place) deveriam ser estudados,
em especial nos locais considerados pontos críticos, onde
biofilmes são formados. Pesquisas de novos produtos
antimicrobianos são necessários, de preferência produtos
naturais com comprovada inocuidade ao ser humano e
meio ambiente.