PRAKATA Mikrobiologi merupakan suatu sains praktik.

Oleh itu, selain mempelajari dan mengumpul fakta serta konsep adalah penting bagi pelajar dan pengamal mikrobiologi mahir dan cekap dalam mengendalikan kaedah-kaedah makmal mikrobiologi.Sungguhpun kaedah yang digunakan dalam mikrobiologi banyak dan berbagai-bagai, terdapat beberapa kaedah seperti pewarnaan bakteria yang boleh dianggap sebagai teknik asas dalam amalan sains ini. Teknik asas ini biasanya diajarkan kepada pelajar mikrobiologi dalam sesi amali yang terancang. Daripada pengalaman kami dalam mengendalikan sesi amali mikrobiologi terdapat beberapa kesilapan serta amalan yang tidak sewajarnya diulangi oleh setiap kumpulan pelajar baru. Sering juga terdapat soalan serta kemusykilan yang sama yang diajukan oleh mereka. Oleh yang demikian, sebuah buku yang menyentuh tentang teknik-teknik dasar makmal dan tradisional mikrobiologi amat diperlukan. Menyedari hakikat di atas, kami menulis buku ini yang bukan sahaja memaparkan kaedah serta pelaksanaan yang sempurna, tetapi juga merangkumi pengenalan ringkas dan tepat mengenai teknik-teknik tersebut. Ini dilakukan supaya pelajar dapat memahami teori serta penggunaan teknik-teknik di atas dengan lebih mendalam kerana buku ini menyertakan beberapa petunjuk dan petua bagi mencapai hasil yang baik dan diharapkan. Buku ini mengandungi 81 teknik dan maklumat teknikal. Penggunaan setiap teknik ini sengaja diolah berdasarkan konsep yang dimaksudkan di atas. Kami menaruh harapan agar buku ini berguna dalam mempertingkatkan lagi kemahiran pelajar mahupun pengamal mikrobiologi, di samping menambahkan sebuah lagi judul teks ke dalam senarai buku-buku teknikal dalam Bahasa Melayu yang tercinta. Yap Kok Leong Abdul Hamid Abdul Aziz Mohd Salleh Mohd Yasin

Jabatan Sains Bioperubatan Fakulti Sains Kesihatan Bersekutu UKM

9 1. AMALAN DAN PERATURAN DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI 1.1. PROSEDUR UMUM DI DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI Mikroorganisma boleh menyebabkan penyakit pada manusia. Oleh itu adalah penting bagi kita menyedari dan mengawasi prosedur dan perilaku dengan betul serta penuh tanggungjawab semasa bekerja dengannya. Mikrobiologi adalah mengenai mikroorganisma atau jasad renik yang mempunyai saiz kecil seperti fungus (kulat), bakteria dan virus. Tumpuan khusus perlu diberikan kepada aspek-aspek keselamatan dan ketelitian di dalam makmal mikrobiologi demi kepentingan diri sendiri mahupun pekerja-pekerja lain. Untuk mencapai matlamat ini sentiasalah mengingati dan mematuhi peraturan-peraturan umum makmal berikut: 1. Pakai kot makmal dan kasut pada setiap waktu anda bekerja di dalam makmal. Kot makmal janganlah dipakai di luar makmal. 2. Basuh tangan dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum anda memulakan sebarang pekerjaan di makmal. 3. Jangan membawa bahan-bahan makmal yang rosak, pecah atau tercemar kepada instruktor. Panggillah instruktor dengan segera jika berlaku sebarang KEMALANGAN terutama yang

berkaitan dengan kultur mikroorganisma. 4. Jangan menyentuh kawasan muka atau mulut anda semasa bekerja. 5. Jangan makan, minum atau merokok di dalam makmal pada setiap waktu. 6. Jangan memasukkan pensil, jari atau sebarang objek ke dalam mulut atau membasahkan pelekat dengan menggunakan lidah. 7. Jangan menyedut sebarang cairan ke dalam pipet dengan mulut. Gunakan penyedut getah atau alat penyedut khas untuk tujuan ini. 8. Jangan membawa keluar dari makmal sebarang kultur atau bahan-bahan dalam kelas amali. 9. Simpan buku dan catatan berjauhan daripada tempat bekerja anda di dalam makmal untuk menghindari daripada tercemar. 10. Buangkan semua bahan dan kultur yang tercemar ke dalam bekas khusus yang disediakan, misalnya bikar yang berisi disinfektan atau bekas yang disediakan khas. 11. Jangan nyalakan mancis semasa bekerja dengan/atau berdekatan dengan reagen meruap seperti alkohol dan eter. 12. Tutup gas dan paip air dengan rapat dan bersihkan meja setelah anda selesai bekerja dan bersiap sedia untuk meninggalkan makmal. 13. Periksa penunu Bunsen dari semasa ke semasa untuk memastikan tidak berlaku kebocoran gas. Gantikan tiubnya jika perlu. 14. Basuh tangan anda semula dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum meninggalkan makmal. 1.2. BANTUAN PEMULA KECEMASAN DI DALAM MAKMAL

Oleh kerana kemalangan boleh berlaku di dalam makmal, pekerja makmal haruslah mempunyai sedikit sebanyak pengetahuan mengenai bantuan pemula dan tindakan yang perlu diambil serta sedar akan keperluan ini, khususnya dalam kes-kes kecederaan ringan. Bekalan Bantuan Pemula Kecemasan 1. Antiseptik ringan untuk luka dan luka terbakar 2. Kain kasa (gauz) atau pembalut steril 3. Larutan asid asetik 2% 4. Natrium bikarbonat 5. Jeli petroleum/vaselin 10 Tatacara Rawatan Bantuan Pemula 1. Luka bakar asid. Segera simbah dengan sabun dan air dan sapukan dengan natrium bikarbonat. 2. Luka bakar alkali. Elak daripada menggunakan air kerana boleh menyebarkan alkali berkenaan. Bilas bersungguh-sungguh dengan asid asetik 2%. 3. Luka bakar api. Untuk luka bakar kulit yang ringan (kulit kemerahan tetapi tidak sampai mengelupas), sapukan lapisan tipis jeli petroleum di kawasan berkenaan. Bagi luka bakar yang lebih serius, jangan berikan sebarang rawatan tetapi bawalah mangsa ke hospital. 4. Luka. Untuk luka ringan dan cakaran, cuci luka dan teliti sama ada terdapat bendasing (kaca) di dalam luka. Bilas dengan alkohol 70% atau dengan antiseptik. Balut dengan kain pembalut berperekat atau dengan balutan longgar. Jika luka kelihatan parah, jangan

Digunakan untuk kebanyakan bahan organik. Disinfektan adalah bahan kimia yang dimaksudkan di atas yang digunakan untuk memusnahkan mikrob patogenik pada sesuatu objek tak bernyawa (inanimate). Segera berjumpa doktor. Jika formalin atau mana-mana cairan tersimbah ke dalam mata. 2. DISINFEKTAN UNTUK KEGUNAAN MAKMAL Pekerja di makmal mikrobiologi sentiasa berhadapan dengan bahan-bahan berbahaya terutamanya yang mengandungi mikrob patogenik. Umumnya. objek seperti spesimen klinikal dan pipet dikumpulkan di dalam bekas yang sesuai sebelum disterilkan dan dibuang. Namun demikian. Aktiviti antimikrobnya tidak banyak dikurangkan oleh bahan organik dan tidak bertindak . spesimen dan bahan terpakai terlebih dahulu disimpan buat sementara di dalam bahan kimia tertentu sehingga pekerjaan di makmal tersebut selesai. bahan tuberkulosis dan bahan bakteriologi umum. Jika keradangan pada mata tersebut masih berterusan. pipet dan slaid mikroskop juga sering tercemar. objek di dalam makmal seperti tempat kerja. Disinfektan Jenis Fenolik Jernih 1. tahap pemusnahan di peringkat ini tidaklah perlu mencapai tahap pensterilan. jumpalah doktor. Di samping ini.menggunakan antiseptik. Sebatian kimia halogen dan fenol adalah di antara agen yang penting sebagai disinfektan. tidak digunakan untuk darah dan virus.3. pastikan mata dicuci dengan air yang banyak dengan air paip. iaitu pemusnahan semua bentuk hidupan. Untuk mengelakkan penyebaran patogen. 1.

4. balang pipet terpakai dan untuk mendisinfeksi permukaan. 7. Penggunaan umum: 1000 ppm klorin bebas. 3. 1. 4. Digunakan pada pencairan seperti yang ditetapkan oleh pengeluar disinfektan. Disinfektan Jenis Hipoklorit 1. Hipoklorit sesuai digunakan dengan detergen anionik dan bukan ionik tetapi tidak sesuai 11 dengan detergen kationik. Gunakan hipoklorit untuk bahan yang mengandungi hanya sedikit bahan organik atau sedikit darah. 6. Presept. Bahan antimikrob ini menyerang logam. TATACARA ASEPTIK Teknik aseptik bukan sahaja bertujuan untuk menjamin kesterilan bahan yang anda sedang kendalikan (iaitu tanpa berlakunya sebarang pencemaran ke atas bahan berkenaan) tetapi juga . Balang pipet: 2500 ppm klorin bebas. 2. Sudol. tetapi tidak digunakan untuk bahan tuberkulosis atau yang diperbuat daripada logam. hematologi dan patologi kimia di dalam balang buangan sisa makmal. Boleh digunakan dalam bidang virologi.terhadap logam. Sesuai untuk kerja mikrobiologi umum. 4. 3. Contoh: Clearsol. 5. Contoh: Chloros. Aktiviti antimikrobnya dikurangkan oleh bahan organik. sesuai untuk menginaktivasi virus. 5. balang buangan sisa makmal.

Gelung dawai 2. Gelung dawai ini merupakan alat utama di makmal bakteriologi yang digunakan untuk memindahkan bakteria daripada suatu kultur ke tempat-tempat lain. Tatacara Pensterilan Gelung Dawai dengan Api BAHAN 1. pakaian mahupun tempat anda bekerja di makmal) dan juga ke atas pekerja-pekerja lain. gelung dawai ini disterilkan setiap kali selepas digunakan. Pensterilan Gelung Dawai dengan Api Gelung dawai adalah sejenis dawai yang umumnya terdiri daripada nichrome atau platinum dengan garis pusat berukuran 0.5 mm yang dibentuk melingkar seperti gelung pada salah satu penghujungnya. Rak gelung dawai 3. Dengan perkataan lain. gelung dawai ini terlebih dahulu dibakar supaya semua mikrooganisma yang terdapat pada permukaannya musnah dan terhapus serta tidak akan tercampur atau mencemari kultur bakteria murni yang akan diambil dengannya nanti. Sebelum digunakan. gelung dawai ini disterilkan.merangkumi tindakan menghindari daripada berlakunya pencemaran mikroorganisma yang sedang dikaji ke atas diri anda sendiri (tangan. Penunu Bunsen . Adalah penting juga dalam mengamalkan teknik aseptik. Penghujung lainnya dicantumkan kepada sebatang pemegang dawai.

Masukkan gelung dawai ke dalam api penunu Bunsen seperti yang ditunjukkan pada Rajah 1. Nyalakan penunu Bunsen dan buka sepenuhnya liang kemasukan udaranya.1. seperti bahagian memotong gunting ialah dengan mencelupkan objek atau bahagian daripada objek berkenaan ke dalam alkohol dan kemudian membakar objek beralkohol tersebut. 3. Pastikan gelung dawai yang steril ini tidak tersentuh sebarang objek sebelum digunakan. Letakkan ia di atas rak khas atau pegang sahaja sementara menunggu dingin. Lakukan pembakaran sehingga peringkat keseluruhan dawai menjadi merah membara. Gelung dawai haruslah sentiasa disterilkan melalui pembakaran merah membara seperti di atas sebelum dan sesudah digunakan. Elakkan daripada meletakkannya langsung di atas meja. Biarkan ia supaya dingin semula (sama ada dengan memegang atau meletakkannya di atas rak khas) sebelum digunakan. 12 Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar Suatu tatacara cepat untuk mensterilkan objek kecil atau sebahagian daripada sesuatu objek. 4. Keluarkan dawai. 2.TATACARA 1. 2. PERHATIAN 1. mikroorganisma yang terdapat pada permukaan . Dalam tempoh alkohol pada permukaan objek tersebut terbakar.

Pegang objek kecil seperti slaid mikroskop atau penutup slaid dengan forseps dan objek yang lebih besar pada pemegangnya. 2. 3.objek tersebut juga turut terbakar dan akhirnya dihapuskan. Celup objek atau bahagian yang akan disterilkan ke dalam balang alkohol. Singkirkan alkohol yang berlebihan. Balang alkohol (mengandungi etanol 70%) 2. Penunu Bunsen TATACARA 1. Naikkan gelung perlahan-lahan sehingga bahagian gelung keluar dari kemuncak api biru dan biarkan terbakar sehingga merah . 4. misalnya.1 Cara membakar gelung dawai Mulakan dengan memasukkan gelung dawai langsung ke dalam api (biru) di bahagian gas tak terbakar. RAJAH 1. Tatacara Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar BAHAN 1. Sungguhpun ini merupakan suatu kaedah pensterilan yang boleh digunakan dalam keadaan-keadaan tertentu. ia kurang meyakinkan dibandingkan dengan pensterilan yang diperolehi dengan menggunakan autoklaf. Sentuhkan objek beralkohol kepada api penunu Bunsen supaya alkohol terbakar.

Letakkan balang berisi alkohol berjauhan daripada api penunu Bunsen untuk mengelak daripada disambar api tersebut. Tatacara Mengeluarkan dan Memasukkan Bahan daripada Botol yang Tertutup 1. Peganglah botol/tabung di bahagian dasarnya (iaitu agak berjauhan daripada mulut botol/ . 3. Jauhkan objek daripada api penunu Bunsen dan biarkan sehingga api pembakaran alkohol tersebut padam dengan sendirinya. NOTA 1. Mata gunting mestilah dalam keadaan terbuka semasa proses pensterilan supaya bahagian tajamnya terdedah kepada alkohol dan pembakaran.membara. PERHATIAN 1. 2. 2. 13 5. Bahan kaca seperti slaid atau penutupnya akan pecah sekiranya dibiarkan dalam api pembakar terlalu lama. Sentiasalah memegang objek supaya parasnya lebih rendah daripada paras tangan untuk mengelak daripada alkohol yang sedang terbakar mengalir ke tangan dan mengakibatkan kebakaran pada diri sendiri. Kaedah ini hanya boleh digunakan untuk objek kaca dan logam sahaja. Seterusnya bakar keseluruhan dawai sehingga menjadi merah sebelum dikeluar dan didinginkan di udara.

tabung) dengan tangan kiri. Tanggalkan penutup botol/tabung tersebut dengan jari kelengkeng kanan dan pegang terus penutup ini dengan jari berkenaan. Longgarkan dahulu penutup botol/tabung yang ketat dengan tangan kanan. Teknik ini membolehkan anda melakukan dua perkara secara serentak dengan kedua-dua tangan. tanpa meletakkannya (lakukan prosedur ini berdekatan dengan api penunu Bunsen). iaitu mensterilkan mulut botol/tabung sambil menghindari daripada berlakunya pencemaran udara dan mengambil inokulum daripada sejenis media kultur ataupun memasukkan inokulum ke dalam media. 5. 3. PERINGATAN Amalkan prosedur ini setiap kali anda melakukan penginokulasian supaya pencemaran khususnya dari udara di sekitar kita dapat dihindari. segera lalukan mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali dan kemudian masukkan sesuatu yang diambil dengan gelung dawai atau pipet steril dengan tangan kanan. . 4. 2. NOTA 1. Dengan tangan kiri. Lalukan semula mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali sebelum botol/tabung tersebut ditutup. ATA U dengan peralatan yang sama keluarkan sesuatu bahan (misalnya kultur) daripada botol/tabung berkenaan.

bekerja berdekatan dengan api ini amat digalakkan dan seharusnyalah menjadi amalan di bidang mikrobiologi. Dengan demikian. MIKROSKOP CAHAYA DALAM MIKROBIOLOGI Antara teknik asas makmal yang seharusnya diketahui oleh seseorang penuntut mikrobiologi ialah pengamatan ke atas mikrooganisma serta sel-sel yang terinfeksi mikroorganisma dengan menggunakan mikroskop.2. iaitu arus udara yang bergerak ke atas disebabkan haba dari api tersebut. Jadi udara di persekitaran api akan terbawa arus ini ke atas dan akan mencegah partikel kecil seperti debu dan sebagainya daripada mendap di kawasan persekitaran ini. ia dapat mengelak daripada berlakunya pencemaran dari udara disebabkan partikel-partikel yang kecil apatah lagi spora fungus dan bakteria yang biasanya terapung atau berterbangan akan bergerak ke atas menurut arus dan tidak akan terjatuh ke dalam mana-mana media yang terdedah di bawahnya berdekatan dengan api. Mikroskop makmal . untuk melaksanakan pengambilan inokulum dari spesimen tertentu atau penginokulasian sesuatu media. api penunu Bunsen menghasilkan arus perolakan. Berdasarkan konsep ini. yang lazim dan paling sering digunakan ialah mikroskop cahaya jenis kompaun iaitu mempunyai dua set kanta (Rajah 2. Oleh itu. Sungguhpun kini terdapat pelbagai jenis mikroskop. dipercayai bahawa bekerja berdekatan dengan sesuatu sumber api umumnya boleh mengurangkan kadar pencemaran dari udara. 14 2. Pada prinsipnya.1).

Keadaan ini memberikan imej yang lebih terang kerana cahaya yang melalui slaid mikroskop dan terkena pada spesimen yang sedang diamati tidak dibiaskan dan oleh yang demikian disalurkan ke dalam kanta rendaman minyak sebab indeks refraktif kaca dan minyak rendaman adalah hampir sama. Jumlah kuasa pembesaran adalah kuasa pembesaran objektif darab kuasa pembesaran kanta okula. Oleh yang demikian. Dengan menggunakan cahaya biasa untuk memancarkan imej objek. Sebaliknya.yang biasa mempunyai sekurang-kurangnya tiga kanta objektif: objektif kuasa rendah (pembesaran 10X). jika ruang antara spesimen dan kanta adalah udara. Kanta okular (mata) biasanya mempunyai kuasa pembesaran 10X. sebahagian besar daripada cahaya akan dibiaskan disebabkan perbezaan indeks refraktif yang besar antara kaca dan udara. kuasa sederhana (40-45X) dan kuasa tinggi (100X) atau rendaman minyak (kuasa yang paling tinggi). peringkat yang paling halus sekali . cahaya yang dibiaskan pasti tidak akan masuk ke dalam kanta. Spesimen dihubungkan secara fizikal dengan kanta rendaman minyak melalui minyak rendaman. Cahaya menjadi tertumpu dengan intensiti yang meningkat dan akan memberikan resolusi yang tinggi.

struktur dan saiznya amat sukar dipastikan. Minyak rendaman 4. 5. 4. Pusingkan tombol pengatur fokus kasar perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga . Slaid apusan bakteria yang telah diwarnai 3. 2.2 mikron (µm) atau 200 nm kerana ini adalah had yang ditentukan oleh gelombang cahaya yang dapat dilihat. Letakkan slaid di atas pentas/dataran mikroskop dengan apusan di sebelah atas. TATACARA MIKROSKOP CAHAYA Tatacara Menggunakan Mikroskop Cahaya Biasa BAHAN 1. Kertas/tisu kanta TATACARA 1. Walau bagaimanapun. Sebenarnya. Mikroskop cahaya 2. 2.1. resolusi mikroskop cahaya biasa ialah 300 nm. Turunkan objektif dengan memutarkan tombol pengatur fokus kasar sehingga jarak objektif berada kira-kira 1 mm di atas slaid. Putarkan objektif (40X) supaya berada tepat di atas apusan.yang boleh kita lihat (kuasa resolusi) adalah 0. kuasa resolusi 200 nm ini adalah dalam keadaan optimum dan sungguhpun objek boleh „diamati‟. 3. Amatilah apusan melalui kanta okular (mata).

Kemudian. 10. 12. Sebelum memulakannya terlebih dahulu naikkan kanta objektif (100X) sehingga ke had maksimum. gerakkan objektif ke atas menjauhi slaid. letakkan satu titis minyak rendaman di dalam lingkaran apusan pada slaid. Pusingkan tombol pengatur fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga dapat memfokus sesuatu objek pada slaid. 7. Amatilah apusan melalui kanta okular. 14. 13. Lapkan minyak rendaman daripada objektif dengan kertas kanta kering atau dibasahi dengan sedikit . 8. putarkan tombol fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga anda dapat memfokus dan meneliti morfologi sel bakteria dengan jelas. 15 11. Putarkan pula tombol pengatur fokus halus untuk mendapatkan imej objek yang tajam dan terang. Setelah selesai pengamatan. Ulangi prosedur di atas dengan kanta objektif rendaman minyak (100X). Sambil mengamati melalui kanta okular. Tukarkan kepada kanta objektif (100X) dan turunkannya sehingga hampir-hampir menyentuh permukaan slaid. 6. 9.anda dapat melihat dan memfokus sesuatu pada slaid. Turunkan objektif semula sehingga terendam di dalam minyak rendaman dan hampir-hampir menyentuh slaid.

Sebelum melakukan pengamatan. 2. Adalah suatu amalan yang baik jika dalam melaksanakan pemfokusan ke atas sesuatu objek. atau minyak rendaman yang diletakkan di atas apusan tidak mencukupi.xilena diikuti dengan kertas kanta kering yang bersih lainnya sejurus selepas setiap kali anda selesai melakukan pengamatan minyak rendaman. Jika spesimen masih tidak kelihatan dengan kanta rendaman minyak ada kemungkinan spesimen tidak dapat difokus kerana tombol pengatur objektif mikroskop diputarkan terlalu cepat. yang digerakkan adalah objektif mikroskop daripada permukaan slaid ke arah atas dan bukan sebaliknya. pastikan terlebih dahulu apusan pada permukaan slaid berada di sebelah atas atau slaid tidak diletakkan dalam keadaan terbalik. objektif dapat diturunkan sehingga boleh melampaui paras pentas mikroskop dan apabila ini berlaku semasa pemfokusan besar kemungkinan penghujung objektif akan menekan ke atas slaid dan boleh menyebabkan slaid pecah. NOTA 1. atau slaid melekat kepada kanta objektif dan turut bergerak ke atas semasa kanta digerakkan (masalah ini boleh diatasi dengan menekan slaid dengan satu jari semasa objektif digerakkan). atau mungkin juga slaid dalam keadaan terbalik . 3. Ini kerana dalam sesetengah jenis/jenama mikroskop.

atau tisu tandas atau sapu tangan untuk membersihkan permukaan kanta hanya akan mengakibatkan calar ke atas kanta dan ini akan mempersulitkan pengamatan seterusnya. lambat-laun debu akan melekat dan menutupi kanta tersebut dan akan menyebabkan pengamatan kabur serta . RAJAH 2.dan apusan berada di sebelah bawah. Jika minyak rendaman pada kanta rendaman minyak tidak dilap dengan baik. 5. Penggunaan kertas tisu lain seperti kertas tisu muka.1 Komponen-komponen mikroskop cahaya Tiub binokular Bahagian mata ( eye piece ) Bahagian mercu yang berputar Objektif Pentas Kondenser Pentas mikroskop Lampu Tombol pengatur fokus 16 4.

menimbulkan kesulitan. Tatacara Penjagaan Mikroskop Cahaya Iklim di Malaysia adalah lembap dan keadaan ini menggalakkan pertumbuhan fungus pada permukaan kanta mikroskop. Terdapat jenama mikroskop yang kantanya dilapisi dengan bahan kimia untuk mencegah masalah ini, tetapi perlindungan ini, dipercayai tidak berkekalan. Ia perlu dirawat secara berterusan khususnya dengan menyalutkan semula bahan kimia berkenaan pada waktu tertentu. Cara yang mudah dan baik untuk mengatasi hal ini adalah dengan menyimpan mikroskop di dalam bilik atau ruangan tertutup yang dilengkapi dengan alat penyahlembap (dehumidifier) yang akan mempastikan suasana udara di dalam bilik atau ruangan tersebut sentiasa kering. 17 3. PENGAMATAN MIKROB 3.1. PENGAMATAN BAKTERIA 3.1.1. PENGAMATAN PERGERAKAN BAKTERIA DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Bakteria dalam keadaan semulajadi susah untuk diamati dengan mikroskop cahaya kerana bersifat transparen atau tidak mempunyai warna. Walau bagaimanapun, pengamatan dalam keadaan seperti ini terpaksa dilakukan juga, misalnya untuk menentukan pergerakannya (motiliti). Dalam hal ini terdapat dua tatacara yang boleh digunakan, iaitu pelekapan basah

dan titisan tergantung. Pengamatan motiliti bakteria di dalam suspensi cairan digunakan khusus untuk bakteria yang dikulturkan dalam media broth kerana tidak dapat tumbuh dengan baik pada media padat (agar). Tatacara Pelekapan Basah Bakteria BAHAN 1. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) 2. Slaid mikroskop 3. Penutup slaid 4. Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. 2. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sekeping slaid mikroskop bersih. 3. Sentuhkan gelung dawai steril kepada 1 koloni bakteria pada plat kultar. 4. Buatkan suspensi bakteria dari gelung dawai di dalam titisan salin di atas. 5. Letakkan sekeping penutup slaid di atas suspensi bakteria seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3.1. 6. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X. Sekiranya menggunakan kultur broth tukarkan langkah 4 kepada berikut: 4a. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. 4b. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair bakteria (yang agak keruh atau tebal) ke atas slaid mikroskop.

Tatacara Pelekapan Titisan Tergantung BAHAN 1. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) 2. Slaid mikroskop 3. Penutup slaid 4. Plastisin 5. Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. Sediakan 1 titis suspensi bakteria di tengah-tengah sebuah penutup slaid mengikut tatacara pelekapan basah. 2. Buatkan 1 lingkaran/cincin plastisin berukuran tidak melebihi luas penutup slaid. 3. Letakkan lingkaran tersebut di atas penutup slaid supaya titisan suspensi berada tepat di tengah-tengah lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya lingkaran ini melekat kepada penutup slaid. 18 4. Letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya ia melekat kepada plastisin. 5. Angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat supaya penutup slaid berada di atas dan suspensi bakteria menjadi tergantung. 6. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X. NOTA

1. Intensiti cahaya perlu dikurangkan dengan menurunkan kondenser dan mengecilkan diafragma untuk memberikan kontras yang secukupnya. Ini membolehkan sel bakteria kelihatan lebih jelas dan pergerakannya dapat diamati dengan mudah. 2. Semasa melakukan pengamatan jangan letakkan tangan di atas meja ataupun menekan meja di mana mikroskop berada. Ini adalah untuk mengelak daripada suspensi bakteria mengalami gegaran goncangan yang akan menyulitkan pengamatan. 3. Dalam pergerakan Brown, partikel (termasuk bakteria) bergerak perlahan-lahan secara bolak-balik (to and fro) tanpa arah tertentu. Kadangkala kesemua partikel bergerak ke satu arah menurut aliran cecair, atau disebabkan mikroskop tergoncang, atau berlakunya RAJAH 3.1 Tatacara melakukan pelekapan basah Letakkan setitis larutan salin di atas slaid mikroskop bersih dan sentuh 1 koloni bakteria dengan gelung dawai dan buatkan suspensi. Letakkan sebuah penutup slaid mikroskop dan dengan berhati-hati lekapkan di atas suspensi bakteria (usahakan supaya tidak terbentuk gelembung udara). Amatilah pelekapan basah ini di bawah kanta objektif pembesaran 40X. Rajah muka surat 18 19 penyejatan dari sisi kaca penutup. Motiliti sebenarnya ditunjukkan dengan gerakan yang

Pengeraman optimum yang biasanya digunakan. untuk melakukan ujian motiliti. disarankan agar kultur cecair digunakan. Dengan berhati-hati sekali angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat. atau partikel individu bergerak dengan pantas menuju ke sesuatu arah tertentu. RAJAH 3. dalam hal ini. Dengan hati-hati letakkan cincin plastisin melingkari suspensi tanpa menyentuhnya.2 Tatacara melakukan pelekapan titisan tergantung Letakkan kaca penutup slaid di atas permukaan yang bersih dan titiskan.aktif bercorak putaran. Kelebihan tatacara ini daripada tatacara pelekapan basah adalah perubahan rupa bentuk (distortion) bakteria dikurangkan kerana tidak ditindih oleh penutup kaca. 5. Oleh yang demikian. Kebanyakan spesies yang diambil daripada kultur padat sering memberikan hasil yang negatif untuk motiliti (memperlihatkan tidak motil). . 4. atau buatkan suspensi bakteria di atasnya. suhu pengeramannya adalah di bawah 37°C. Dengan demikian suatu suspensi bakteria yang tergantung akan dihasilkan. yakni 22°C atau 25°C. adalah kira-kira 2 jam dan bagi kebanyakan bakteria. Kemudian letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas plastisin dan tekan sedikit supaya melekat kepada plastisin.

PENYEDIAAN UNTUK PEWARNAAN BAKTERIA Tatacara Membersihkan dan Menyimpan Slaid Mikroskop BAHAN 1.2. Cuci dengan air suling. Rendam slaid kaca di dalam alkohol asid semalaman. Asid hidroklorik pekat PERSEDIAAN REAGEN Alkohol asid 0. Campurkan 5 ml asid hidroklorik pekat kepada 1 liter etanol 70%. PERHATIAN Pastikan balang slaid tidak diletak berhampiran penunu Bunsen atau sebarang sumber api kerana alkohol mudah terbakar.1. Metanol 95% 4.5%. Etanol 70% 3. 3. 2. Lakukan di dalam kabinet asap. Slaid mikroskop 2. Tatacara Membuat Apusan Bakteria BAHAN . TATACARA 1.20 3. Simpan di dalam balang tertutup yang mengandungi metanol 95%.

Jauhkan bekas slaid yang mengandungi alkohol daripada api. 4. Kertas turas 4. Gelung dawai 6. 2.1. . Kultur bakteria 8. Pegang slaid supaya aras tangan berada lebih tinggi daripada slaid. Penunu Bunsen 5. Forseps 3.85% (steril) TATACARA 1. Keluarkan slaid mikroskop yang disimpan di dalam bekas yang mengandungi alkohol dengan menggunakan sebuah forseps bersih. Jangan pegang slaid yang dibakar dengan forseps secara tegak untuk mengelak kemungkinan alkohol mengalir ke atas tangan dan menyebabkan kebakaran. Letakkan slaid di atas kertas penyerap dan biarkan sehingga sejuk. Hapuskan alkohol dengan membakarnya dengan api penunu Bunsen. 21 Kultur bakteria dari broth 1. 3. 2. Larutan salin 0. PERHATIAN 1. Sterilkan gelung dawai. Slaid mikroskop yang disimpan di dalam metanol 95% di dalam bekas yang tertutup 2. Pensil gris/pena tanda (marker) kalis air 7.

5. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair di atas sebuah slaid bersih. 6. 4. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid bersih. 5. Sebarkan suspensi bakteria sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 – 2 cm garis pusat. 3.2. Biarkan sehingga kering di udara. Sterilkan gelung dawai. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. 6. 7. 4. Sebarkan sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 cm garis pusat. 3. Biarkan supaya kering di udara. 2. Swab yang mengandungi spesimen klinikal Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid dan emulsifikasikan spesimen dari swab di dalam titisan salin ini. 8. Nanah dan eksudat . Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Kultur bakteria dari media padat (agar) 1. Buatkan suspensi bakteria daripada gelung dawai di dalam titisan salin. Sentuh 1 koloni bakteria yang terasing dengan gelung dawai. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air.

Pada apusan yang terlalu tebal. sel-sel bakteria akan kelihatan tersusun terlalu rapat dan padat sehingga sukar untuk menentukan morfologinya. 3. Emparkan urin dan cecair serebrospina pada tekanan emparan 10. Kacau. sel bakteria berada dalam keadaan berkelompok dan kemungkinan pewarnaan yang didapati juga tidak sama rata dan morfologi sel individu sukar untuk ditentukan. Buat apusan dengan suspensi bakteria yang diperolehi. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid. Gunakan setitis suspensi sahaja supaya apusan cepat kering. NOTA 1. Kahak (sputum) Pindahkan sedikit kahak dari bekas spesimen dengan swab steril ke atas sebuah slaid bersih dan sebarkan seluas 1. .5 x 2. 3.Ambil 1 gelung penuh spesimen dan sebarkannya di atas slaid supaya mencapai seluas 1. Tuangkan supernatan dan masukkan beberapa titis salin steril ke dalam tiub emparan ini.5 x 2. Jika tidak.5 cm. 2. Urin dan cecair serebrospina 1. 4. Gunakan sedikit kultur bakteria supaya apusan yang disediakan membentuk filem yang agak tipis. Suspensi bakteria harus disebarkan dengan baik supaya menghasilkan apusan yang sama rata.000 g selama 10 minit pada suhu bilik.5 cm. 2.

Di samping kebaikan dari segi kesihatan. Proses ini tidaklah semata-mata bertujuan untuk melekatkan sel bakteria kepada slaid. Lazimnya. Sebelum bakteria diwarnai. ia terlebih dahulu difiksasi. Justeru. pastikan bahawa permukaan slaid mikroskop yang mengandungi apusan berada di sebelah atas menghadap kanta objektif. Fiksasi boleh dilakukan dengan cara fizikal (haba. 5. di sekeliling kawasan apusan (di sebelah bawah slaid) dilingkari dengan pensil gris atau pena tanda kalis air supaya tapak di mana terdapatnya apusan mudah dikesan untuk diletak tepat di bawah kanta objektif serta untuk meletakkan titisan minyak rendaman. tetapi juga untuk mengekalkan (mengawet) struktur sel bakteria tersebut serta meningkatkan daya penglihatan ke atasnya. dehidrasi) dan cara kimia. pembunuhan bakteria adalah penting dalam pewarnaan kerana pada umumnya bakteria yang masih hidup sering bersifat kurang telap terhadap kebanyakan pewarna yang digunakan. Dalam pengamatan ke atas sesuatu apusan dengan mikroskop. Fiksasi Bakteria dengan Haba Sebarang proses yang membeku serta memejalkan sel bakteria dan strukturnya dikenali sebagai fiksasi . Cara yang popular memfiksasi bakteria adalah dengan suatu menggunakan haba dari . Permukaan slaid di mana terdapatnya apusan ini dapat dipastikan dengan tanda pensil gris yang dapat dikikis atau pena tanda kalis air pada permukaan bawah slaid.22 4. fiksasi juga boleh membunuh bakteria.

Sebaik-baiknya. Ulangi prosedur ini sebanyak 3 kali (kesemuanya). Apusan bakteria ke atas slaid mikroskop 2. Pegang salah satu penghujung slaid dengan ibu jari dan jari telunjuk dengan apusan di sebelah atas. Biarkan slaid dingin di udara. sebab tidak akan memberikan hasil seperti yang diharapkan dan sebaliknya apa yang diperoleh ialah suatu keadaan yang dikenal sebagai artifak. Dengan cepat sentuhkan slaid ke atas tapak tangan. Pemanasan ke atas apusan yang basah dipercayai boleh mengakibatkan perubahan rupa (distortion) morfologi bakteria yang ketara. NOTA 1. 5. Akibatnya pewarnaan yang diusahakan akan sia-sia sahaja. Adalah lumrah jika di dalam kelas amali terdapat pelajar yang memegang slaid dengan . Tatacara Memfiksasi Bakteria dengan Haba BAHAN 1. 4. Lalukan slaid sekali dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen. 2.sumber api. Penunu Bunsen TATACARA 1. biarkan apusan sehingga benar-benar kering sebelum melakukan fiksasi. 3. Pemanasan yang berlebihan akan menyebabkan perubahan besar dalam bentuk sel bakteria atau sel bakteria menjadi pecah dan mengalami kerosakan. 2. 3.

perbezaan indeks biasan yang kecil antara komponen-komponen sel bakteria juga menyulitkan substruktur bakteria untuk dilihat. 23 3.3. Sekiranya slaid dirasakan terlalu panas pada tapak tangan maka besar kemungkinan sel bakteria pada apusan telah mengalami kehancuran atau telah berlaku artifak. Sebagai langkah untuk mengatasi masalah ini perbezaan warna digunakan untuk memudahkan melihat keseluruhan sel bakteria dan juga untuk mempamerkan substruktur bakteria dan segala-galanya mengenai bakteria dengan lebih terperinci. Keadaan ini mengakibatkan sel bakteria sukar untuk diamati. Slaid disentuhkan ke atas tapak tangan selepas setiap kali pemanasan.forseps dan memasukkannya ke dalam api penunu Bunsen dengan tujuan untuk mengeringkan dan sekaligus memfiksasi apusan. Melalukan slaid dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen sebanyak 3 kali adalah mencukupi bagi tujuan pemfiksasian. Tambahan pula. Pewarna dan Jenis Pewarnaan .1. juga akan menghilangkan haba dari slaid. maka jurang perbezaan optikalnya juga adalah sedemikian. Ini selain mempastikan slaid tidak terlalu panas. Pewarnaan juga digunakan untuk menunjukkan taburan dan jenis kimia berbagai-bagai komponen sel serta membezakan antara golongan-golongan bakteria. Amalan ini tidak digalakkan kerana dengan cara demikian adalah sukar untuk menentukan sama ada fiksasi tercapai atau apusan telah terdedah kepada haba terlalu lama. PEWARNAAN BAKTERIA Oleh kerana perbezaan indeks biasan antara bakteria dan kawasan sekelilingnya tidak besar.

tatacara pewarnaan perbezaan yang menggunakan dua atau lebih pewarna digunakan. keseluruhan sel bakteria diwarnakan secara sama rata dan substruktur atau komponen-komponen selnya tidak dibezakan. pewarnaan ini disebut pewarnaan sederhana (simple staining). Sebaliknya cas negatif ini akan menolak pewarna asid. berasal daripada terbitan garam asid bebas kerana bentuk ini lebih larut. mampu menyusup masuk ke dalam sel dengan lebih baik dan pewarnaannya lebih kekal. Pewarna yang digunakan. Pada pewarna asid. dengan demikian hanya latar belakang (kawasan di luar bakteria) sahaja yang diwarnai.Bahan pewarna boleh dibahagikan kepada dua golongan: pewarna asid dan pewarna bes. ciri pewarnaan adalah bergantung kepada anion (ion negatif) dan pada pewarna bes . kristal ungu) kerana protoplasma bakteria mempunyai kandungan asid nukleik bercas negatif yang tinggi. metilena biru. Pada umumnya dalam pewarnaan ini. fenol atau anilin. Apabila diwarnakan dengan pewarna bes. Apabila sel bakteria diwarnakan dengan satu jenis pewarna sahaja. ciri pewarnaan bergantung kepada kationnya (ion positif). Bakteria menunjukkan kecenderungan atau afiniti yang kuat terhadap pewarna bes (contoh: safranin. Tindakan aksentuator ini tidak melibatkan . cas yang negatif ini akan bertindak dengan ion positif pewarna bes. Untuk menunjukkan perbezaan yang wujud di kalangan sel bakteria tertentu. Intensiti pewarnaan boleh dipertingkatkan (ataupun supaya sasaran dapat diwarnakan) dengan menggunakan haba dalam keadaan tertentu atau menggunakan bahan kimia ( aksentuator) seperti asid asetik. umumnya.

pergabungannya dengan pewarna seperti yang berlaku pada mordan. Mordan adalah bahan kimia yang membolehkan sesuatu pewarna mewarnakan sesuatu bahan, atau mordan mempertingkatkan afiniti ataupun kecenderungan pewarna terhadap struktur tertentu. Pewarnaan yang diterangkan setakat ini dikenal sebagai pewarnaan positif kerana yang diwarnakan ialah bakteria. Dalam pewarnaan negatif, satu filem pewarna gelap meliputi ruang dan celah di antara bakteria-bakteria (latar belakang) dan bakteria tidak diwarnakan. Perlu disedari bahawa ciri-ciri pewarnaan bakteria (serta morfologi) dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti umur kultur dan sumber bakteria, iaitu sama ada berasal daripada spesimen klinikal atau dari kultur pertumbuhan. Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram adalah tatacara pewarnaan utama di bidang bakteriologi. Di samping membolehkan bakteria dilihat dengan lebih mudah, pewarnaan ini juga digunakan untuk menggolongkan bakteria. Dalam tatacara pewarnaan Gram, pewarna digunakan secara berlebihan dan kemudian agen penghapus warna atau pembeza digunakan untuk 24 menghilangkan pewarna berkenaan. Bakteria yang mengekalkan pewarna pertama (kristal ungu) disebut sebagai Gram-positif, manakala yang kehilangan pewarna ini dan diwarnai dengan pewarna kedua dinyatakan sebagai Gram-negatif. Larutan iodin Lugol yang berfungsi sebagai mordan dan pelarut organik seperti alkohol dan aseton digunakan digunakan sebagai

pembeza atau pengnyahwarna. Pewarna yang digunakan untuk menggantikan pewarna pertama yang dihilangkan oleh pembeza disebut pewarna balas (counter stain). Hasil tindak balas pewarnaan Gram adalah bergantung kepada komposisi dinding sel bakteria yang berkemampuan untuk mengikat pewarna pertama atau tidak. Protoplasma bakteria, dalam hal ini, sentiasa memberikan tindak balas Gram-negatif. Tatacara Pewarnaan Gram BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Kristal ungu 3. Iodin Lugol 4. Aseton-alkohol 5. Safranin/karbol fuksin 6. Kertas turas Tatacara 1. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop, keringkan di udara dan fiksasi apusan tersebut. 2. Liputi apusan dengan kristal ungu selama 1 minit. 3. Cuci dengan air, kemudian singkirkan keseluruhan air tersebut. 4. Liputi pula apusan dengan iodin Lugol selama 1 minit, kemudian buangkan. 5. Pegang slaid di dalam sinki secara condong dan titiskan dengan cepat aseton-alkohol ke atas apusan sehingga tiada warna biru (kristal ungu) terlihat keluar dari apusan (lebih kurang 3-10 saat bergantung kepada ketebalan apusan).

6. Segera cuci dengan air. 7. Kemudian liputi apusan dengan safranin atau karbol fuksin cair selama 30 saat. 8. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas penyerap (lipat kertas turas/penyerap, masukkan slaid ke dalam lipatan dan tekan kertas dari luar sehingga semua air terserap daripada slaid tanpa menggosok permukaan slaid atau apusan). Nota: peringkat No. 8 = cuci & keringkan Pengamatan dan Pentafsiran Sel bakteria berwarna biru: Gram-positif. Sel bakteria berwarna merah/merah jambu: Gram-negatif. NOTA 1. Dalam kebanyakan spesies bakteria, reaksi Gram berubah dengan umur kultur. Kultur tua bakteria Gram-positif memberikan reaksi Gram tak tetap (Gram variable) – ada sel yang terwarna biru dan ada yang terwarna merah bercampur di antara satu dengan lainnya. Ada juga bakteria Gram-positif seperti Corynebacterium yang mudah kehilangan warna pertamanya dan seringkali kelihatan sebagai Gram-negatif. 2. Pada beberapa spesies basilus aerobik yang menghasilkan spora (contoh, Bacillus subtilis), sel vegetatifnya akan terwarna Gram-negatif atau granul-granul di dalam sel diwarnakan Grampositif selama beberapa generasi selepas spora bergerminasi. 25 Pewarnaan Ziehl-Neelsen (Pewarnaan Tahan Asid) Mikobakteria yang diwarnakan dengan pewarna fenilmetana (contoh: fuksin bes) dalam larutan anilin

atau fenol akan mengekalkan warna tersebut meskipun telah didedahkan kepada asid yang kuat berbanding dengan bakteria jenis lain. Oleh yang demikian, bakteria golongan pertama ini disebut sebagai bakteria tahan asid . Sifat tahan asid ini merupakan ciri yang berfaedah dan penting dalam membezakan mikobakteria dengan bakteria lain. (Beberapa spesies aktinomiset juga tahan asid). Pada bakteria tahan asid, pewarna fenol mempunyai kelarutan yang tinggi di dalam sel dibandingkan dengan pembeza (penghilang warna). Oleh yang demikian, apabila bakteria yang didedahkan kepada penghilang warna, pewarna berkenaan kekal di dalam sel, manakala pada bakteria tak tahan asid pewarna tersebut akan hanya masuk ke dalam sel dan oleh penghilang warna. Di samping ciri-ciri ini, kadar resap pewarna pada sel yang tahan asid adalah rendah berbanding dengan sel tak tahan asid. Ciri-ciri ini disebabkan oleh perbezaan komposisi kimia (secara dan kualitatif) bakteria tahan asid dan bakteria tak tahan asid. Mikobakteria yang tahan asid mempunyai karbohidrat, alkohol dan asid lemak (seperti asid mikolik) yang tersendiri. Oleh yang demikian, dalam tatacara ini slaid perlu dipanaskan sehingga wap keluar kerana, dalam hal ini, kuantitatif kemudian disingkirkan daripada sel telah diwarnakan

untuk membolehkan pewarnaan terlaksana dalam jangka masa yang Tatacara Pewarnaan Ziehl-Neelsen BAHAN 1. Alkohol asid 4. Tambahkan alkohol-asid (penghilang warna) selama 25-30 saat. Biarkan sejuk dan cuci dengan air. (Pastikan pewarna tidak mendidih atau menjadi kering). Panaskan slaid dengan api pembakaran kain gauz yang dibasahi dengan alkohol. Banjirkan apusan dengan pewarna karbol fuksin Ziehl-Neelsen.haba digunakan munasabah. Metilena biru 5. 4. Kertas turas 8. Lakukan ini sehingga keluar wap dari apusan selama 5-10 minit. 3. keringkan di udara dan fiksasikan apusan tersebut. 2. Alkohol 6. Penunu Bunsen TATACARA 1. 5. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop. Karbol fuksin Ziehl-Neelsen 3. Kultur bakteria 2. Sebatang kaca yang satu penghujungnya dibalut kain kasa (gauz) 7. .

3. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Sel bakteria berwarna merah: bakteria tahan asid. Sel bakteria berwarna biru kehijauan: bakteria tak tahan asid. Pemanasan dilakukan dari bahagian bawah slaid (apusan di permukaan atas) yang diletakkan di atas rak pewarnaan iaitu dengan menggunakan api kecil penunu Bunsen. Pewarnaan Albert (Pewarna Granul Metakromatik) Volutin bakteria (granul metakromatik) adalah bahan basofilik yang refraktif. Kadangkala sel mikobakteria tidak terwarna sama rata dan kelihatan berjalur merah berselang-seli dengan bahagian tanpa warna atau kelihatan berbutir. Volutin ini terdiri . Cuci dengan air. NOTA 1. Liputi pula apusan dengan metilena biru selama 30 saat. Sebaliknya boleh juga dengan menggunakan sebatang kaca yang salah satu penghujungnya 26 dibalut dengan kain yang dicelup di dalam alkohol dan kemudian dinyalakan. daya kelarutan fenol di dalam air dan kehadiran elektrolit di dalam larutan pewarna. Ini adalah suatu artifak yang disebabkan oleh beberapa faktor seperti kemurnian pewarna karbol fuksin. sel pesakit akan berwarna biru-kehijauan. 7. 8. Jika spesimen klinikal digunakan.6. 2. Cuci dan keringkan dengan kertas penyerap. Elakkan daripada memanaskan slaid dan pewarna dengan memegang slaid dengan forseps dan memasukkannya langsung ke dalam api penunu Bunsen.

Walau bagaimanapun. Tetapi jika metilena biru digunakan. volutin ini mengubahkan spektrum serapan (absorption) toluidina biru supaya pada mata kasar pewarna ini kelihatan telah berubah warnanya dari biru kepada biru kehitaman. Tatacara Pewarnaan Albert BAHAN 1. Toluidina biru adalah pewarna metakromatik: apabila pewarna ini masuk ke dalam kompleks granul volutin yang besar. Pewarna Albert 3. pendedahan metilena biru kepada udara menyebabkan sebahagian kecil daripada pewarna ini dioksidasi menjadi metilena ungu pada pH tinggi dan metilena ungu secara selektif mewarnakan volutin tersebut. komponen ini akan . Kertas turas toluidina biru. keadaan ini sebenarnya bukanlah merupakan fenomena metakromasi sungguhpun di dalam bidang bakteriologi ia dinyatakan demikian. Keadaan ini disebabkan oleh fenomena metakromasi yang melibatkan perubahan di dalam warna sesuatu bahan. Apusan kultur bakteria 2. Iodin Gram 4. Jika diwarnai dengan kelihatan berwarna biru kehitaman dan bukan biru.daripada polimetafosfat yang mempunyai berat molekul tinggi dan dihubungkaitkan dengan bakteria genus Corynebacterium. granul volutin akan kelihatan merah dan bukan biru. Dalam keadaan ini.

keringkan dan fiksasikannya. Semasa pendinginan/pencucian pewarna terperangkap di dalamnya. 2. Liputi pula apusan dengan iodin Gram selama 1 minit. Spora bakteria hanya dapat diwarnakan jika mordan atau haba digunakan. Cuci dengan air. sedangkan pada sel tanpa butir-butir berwarna biru kehitaman di . Cuci dengan air dan keringkan. Buat apusan pada slaid mikroskop. Pemanasan meningkatkan ketelapan dinding spora sehingga pewarna malakit hijau dapat dengan mudah masuk dan mewarnai struktur ini. 5.TATACARA 1. Tapak atau kedudukan spora di dalam sel serta saiz spora berbanding dengan sel yang mengandunginya mempunyai kepentingan taksonomi. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna biru kehitaman di dalam sitoplasma bakteria yang berwarna hijau: Kehadiran granul metakromatik. Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) Bakteria Genus Bacillus dan Clostridium dicirikan dengan kehadiran struktur bulat atau bujur yang dinamakan spora (atau endospora ). Liputi apusan dengan pewarna Albert selama 5 minit. Sitoplasma bakteria yang berwarna hijau dalamnya: Tiada granul metakromatik. 3. 4.

4. Buat apusan pada slaid mikroskop. Pewarna malakit hijau nampaknya merupakan pewarna terbaik untuk pewarnaan spora bakteria. Liputi pula apusan dengan safranin selama 30 saat. Alkohol TATACARA 1. Safranin 4. Malakit hijau 5% 3. 3. Cuci dengan air. Liputi apusan dengan malakit hijau 5%. Panaskan sehingga wap keluar beberapa kali tetapi jangan sampai mendidih (tambah pewarna jika akan mengalami kekeringan). Tatacara Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) BAHAN 1. Pewarna balas memberikan warna yang kontras supaya spora dapat dikesan dengan mudah. Apusan kultur bakteria 2. Kertas turas 6. 2. Biarkan selama 1 hingga 3 minit.27 vegetatif. 5. ia tercuci bersih. Batang kaca yang dibalut kain kasa pada salah satu penghujungnya 5. 6. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas turas. 7. . keringkan dan fiksasikannya.

iaitu suatu struktur yang menyelubungi keseluruhan sel bakteria dan sukar untuk diwarnai. tetapi granulgranul halus dakwat India hanya menghasilkan latar belakang yang gelap dalam bidang penglihatan. Disebabkan ketumpatan kapsul lebih rendah daripada sel. Teknik ini sebenarnya tidak mewarnai sebarang struktur pada mikroorganisma. Walau bagaimanapun. Butir berwarna hijau adalah spora bakteria. Oleh kerana sebahagian daripada sel telah mengalami lisis. 2. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) Pewarnaan negatif dengan dakwat India membolehkan bakteria diamati dalam keadaan masih utuh dan tanpa perubahan rupa bentuk yang disebabkan oleh agen kimia (contoh: pewarna) dan agen fisikal (contoh: haba) serta membolehkan morfologinya ditentukan dengan cepat.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna hijau di dalam sel bakteria yang berwarna merah ATAU butir-butir berwarna hijau bertaburan di luar sel bakteria. manakala bahagian sel vegetatif bakteria berwarna merah. 28 . maka ia kelihatan lebih terang (di sekeliling sel). di dalam apusan akan kelihatan spora yang bebas. tatacara ini jarang digunakan kecuali untuk mengamati kapsul. spora akan kelihatan tanpa warna atau berwarna pudar. NOTA 1. Jika apusan bakteria tidak dipanaskan secukupnya.

Kurangkan cahaya mikroskop dengan menurunkan kondensernya dan amati kultur dengan objektif 40X (untuk fungus) atau objektif minyak rendaman (untuk bakteria). Slaid mikroskop 5. 3. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN . Larutan salin 0. 2. 4.Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) BAHAN 1.85% (steril) 3. Campurkan dengan baik satu gelung kecil dakwat India ke dalam suspensi mikroorganisma yang telah disediakan. Dakwat India (Pelican TM atau Pilot TM ) TATACARA 1. Penutup slaid 4. Kultur bakteria 2. Tutup campuran dengan penutup slaid. Letakkan setitis kecil kultur cecair ke atas slaid mikroskop atau buatkan suspensi organisma dari sedikit pertumbuhan kultur muda mikroorganisma pada media padat di dalam setitis salin dengan menggunakan dawai inokulasi.

7 . ia mempunyai nilai diagnostik. 3. Tatacara Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1. 2. NOTA 1.Kapsul kelihatan sebagai suatu lapisan cincin lutcahaya atau bersinar melingkari keseluruhan sel di atas latar belakang yang gelap. Sebagai pilihan lain. Namun demikian. Dalam hal ini. struktur flagela serta tapaknya lebih mudah dipastikan dengan mikroskop elektron melalui pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik. Tambahan pula. Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik Pengamatan flagela bakteria dapat dilihat dengan mikroskop cahaya selepas berlakunya pewarnaan seperti pewarnaan tatacara Gray. Forseps jenis tukang jam tangan. Ia merupakan tatacara yang paling mudah untuk mengesan kehadiran kapsul dan sering digunakan ke atas spesies bakteria seperti Streptococcus pneumoniae. Kultur bakteria 2. bengkok No. Intensiti cahaya perlu dikurangkan untuk memberikan kontras yang lebih baik. tatacara pewarnaan flagela yang hasilnya kemudian diamati dengan mikroskop cahaya adalah sukar dilakukan. Jika terlalu banyak dakwat digunakan bakteria mungkin tidak dapat dilihat kerana transmisi cahaya terhalang. ia melibatkan penggunaan logam berat yang akan menyumbang kepada pencemaran alam sekitar. Klebsiella pneumoniae dan fungus Cryptococcus neoformans.

5%. Biarkan 1 minit sebelum cairan diserap oleh kepingan kertas turas. Walau .5 5. 6. Sterilkan gelung dawai dan pindahkan 1 koloni bakteria ke dalam tabung. Pindahkan 1 titis suspensi bakteria ke atas grid pada permukaan yang disaluti Formvar. Simpan grid di atas alat penyimpan grid atau di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas. 3. Penunu Bunsen 10. 7. Gelung dawai 9.3. Serapkan larutan asid fosfotungstik dengan menyentuhkan pinggir grid dengan kepingan kertas turas.85% (steril) 7. 5. Pindahkan 1 ml salin ke dalam tabung. Tatacara Pengamatan Grid yang Disaluti Spesimen Bakteria Selepas Pewarnaan Negatif Tatacaranya adalah seperti pengamatan partikel virus (lihat muka surat 41-42). Tabung yang steril 8. 4. Pindahkan 1 titis larutan asid fosfotungstik ke atas grid berkenaan dan biarkan 1 minit. Alat penyimpan grid atau piring Petri yang dialas dengan kertas turas 29 TATACARA 1. Larutan salin 0. Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar 4. Asid fosfotungstik 1. pH 6. 1 6. 2. Kepingan kertas turas gred Whatman No.

4. PENGAMATAN FUNGUS Seperti juga bakteria. ataupun ke atas kultur dari sesuatu spesimen klinikal.1.bagaimanapun. Susunan sel-sel basilus: Tak teratur Spiroket Berfilamen Sel tunggal Berpasangan Berantai 30 Susunan sel-sel kokus: Kokus tunggal Diplokokus Tetrad (berempat) Palisad Basilus Vibrio Spirilla 3. Ini merupakan suatu kriteria yang berfaedah dalam pengenalpastian bakteria.2. kuasa pembesaran yang digunakan adalah di antara 5000 – 10 000 kali ganda sahaja. 3. Berbagai-bagai susunan sel bakteria dikenali dan telah ditentukan berdasarkan perbezaan dari segi pertumbuhan serta strukturnya. . PENGKELASAN BENTUK DAN SUSUNAN SEL VEGETATIF BAKTERIA Bentuk Kokus Susunan Bakteria yang membiak secara aktif mempunyai kecenderungan untuk mengekalkan susunan selnya yang menjadi ciri bakteria tersebut. oleh kerana saiz bakteria lebih besar daripada virus. pengamatan fungus boleh dilakukan sama ada melalui pemeriksaan secara langsung ke atas spesimen yang diambil.

Di dalam salin.Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dalam bentuk pelekapan basah atau terhadap apusan fungus yang telah diwarnai.2. 3. pelekapan basah fungus berperanan penting dalam pengenalpastian fungus serta diagnosis penyakit yang disebabkan olehnya. di mana pelekapan basahnya hanya terhad kepada ujian motiliti. Larutan salin 0. Kaca penutup slaid TATACARA 1. dan jika perlu. PENGAMATAN FUNGUS DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Pelekapan basah fungus di dalam salin dilakukan dalam pengamatan secara langsung fungus. Berbeza dengan bakteria.85% 3. Tatacara Pelekapan Basah Salin BAHAN 1. Tambahkan 1 titis spesimen. 4. Letakkan 1 titis salin ke atas slaid mikroskop. Amati dengan objektif 10X (jumlah kuasa 100X) dan kemudian 40X (jumlah kuasa 400X). perhitungan jumlah sel epitelium dan sel darah putih dapat dilakukan. Spesimen yang disyaki mengandungi fungus 2.1. 3. keutuhan sel dan organisma tersebut dapat dikekalkan. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN . 2. Tutup dengan kaca penutup slaid. Beberapa pewarnaan yang digunakan dalam bidang bakteriologi juga digunakan dalam bidang mikologi sungguhpun prosedurnya disesuaikan untuk fungus.

biasanya terletak di penghujung atau perbatasan sel. Perbezaan di antara yis dengan gelembung udara dan sel darah merah: Sel yis mengandungi badan inklusi. Mosaik fungus (artifak): Jaringan jisim yang mempunyai bentuk yang berbeza-beza dan tidak teratur. NOTA Intensiti cahaya dikurangkan. 3. Pelekapan Basah Kalium Hidroksida ( KOH) Spesimen kikisan kulit dan rambut diamati secara langsung untuk pengesanan fungus dalam pelekapan Berkelompok . bentuk kristal berbeza-beza dan larut air. Perbezaan hifa dengan kristal panjang: Penghujung kristal tidak bersambung atau terputus-putus. Perbezaan di antara hifa dengan benang kapas: Pinggiran atau lebar (kaliber) benang kapas tidak teratur dan serat benang sering berpilin atau kelihatan melingkari sesuatu paksi dan penghujungnya berumbai. dengan kondenser mikroskop diturunkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. Berantai 31 2. PERHATIAN 1. 4.Fungus akan kelihatan refraktil. berkilat atau hijau pudar.

Gliserin yang ditambah mengakibatkan pelekapan menjadi lambat kering dan menghalang presipitasi KOH. rambut dan kuku. Kulit. Kaca penutup slaid . Tatacara Pelekapan Basah Kalium Hidroksida ( KOH) BAHAN 1. PERHATIAN Pelekapan KOH juga boleh digunakan untuk spesimen kahak ( sputum) atau spesimen daripada vagina yang banyak mengandungi bahan mukoid. KOH (20%) melarutkan keratin dan memudahkan pengamatan ke atas hifa fungus. Proses penjernihan dapat dipercepatkan melalui pemanasan. adalah legap dan latar belakang ini boleh menyelubungi fungus. Spesimen 2. Masalah ini boleh diatasi dengan menggunakan beberapa persediaan yang boleh menghancurkan serta melarutkan keratin supaya latar belakang menjadi jernih. KOH 10-20% 3.basah yang terdiri daripada larutan penjernih . Penjernihan biasanya dilakukan dengan KOH mungkin kerana bahan kimia ini mudah didapati di dalam makmal. natrium sulfida 10% di dalam alkohol 20% dan larutan kalium hidroksida ( KOH) atau natrium hidroksida (NaOH). yang mengandungi keratin. Jenis larutan kalium hidroksida penjernih termasuklah natrium lauryl 5% di dalam air suling.

4. Penunu Bunsen TATACARA 1.4. Tutup spesimen dengan kaca penutup perlahan-lahan. tatacara ini dapat diubahsuai dengan penambahan dimetil sulfoksida ( DMSO ) 40%. Tekan kaca penutup slaid. Intensiti cahaya dikurangkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. Pelekapan ini tidak dipanaskan dan diamati dalam masa 20 minit. 2. 5. 32 PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Hifa adalah dalam bentuk filamen kurus dengan bahagian tepinya sejajar dan disusun secara rawak berbanding dengan sel. NOTA 1. Amati dengan objektif 10X dan kemudian 40X (jumlah kuasa. Masukkan spesimen ke dalam titisan KOH. . Panaskan dengan api pilot penunu Bunsen sehingga pelekapan basah ini menjadi jernih tanpa pendidihan (5-20 minit). Untuk kuku dan kikisan kulit yang keras. Letakkan 1 titis larutan KOH di tengah slaid mikroskop. 2. Penutup slaid ditekan untuk memperoleh sediaan yang tipis dan untuk mengeluarkan KOH yang berlebihan. masing-masing 100X dan 400X). 6. 3.

Jangan panaskan pelekapan KOH terlalu lama atau dengan suhu yang terlalu tinggi kerana akan terbentuk hablur KOH. Dalam pengamatan ke atas fungus. Dalam hal ini. gliserol mengelak pelekapan basah menjadi kering dan pewarna cotton blue diserap oleh struktur kitin fungus dan mewarnainya. 5. fenol membunuh fungus. 6. maka memudahkan fungus diamati. Spesimen fungus 2. Kaca penutup slaid . Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) Pelekapan basah yang juga mengandungi sejenis pewarna akan memudahkan pengamatan fungus. 4. fungus lebih mudah dapat diamati jika dibiarkan 1 hingga 2 jam. jangan tersalah anggapan bahawa bahagian tepi sel (dinding sel) adalah hifa. Pelekapan yang tidak jernih mungkin mengandungi artifak yang mirip dengan struktur fungus. Persediaan menjadi lebih jernih dan oleh yang demikian. persediaan lactophenol cotton blue digunakan untuk membuat pelekapan basah fungus sama ada dari spesimen ataupun dari kultur untuk pengamatan mikroskop.3. Slaid mikroskop 3. Tatacara Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) BAHAN 1. Asid laktik mengekalkan struktur fungus serta menjernihkan latar belakang.

Ambil sebahagian kecil bahan fungus dari kultur dengan menggunakan jarum atau dawai bengkok di atas. 33 NOTA 1. 2. 7. 3. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Miselium (dinding dan septum sel) serta struktur spora (fruiting structures) kelihatan biru tua di atas latar belakang yang berwarna pudar (muda). 2. Amati dengan objektif pembesaran 10X dan 40X. 5. Bakar jarum atau dawai apabila sudah selesai. Titiskan 1 titis kecil LCB di tengah-tengah slaid mikroskop.4. Jarum atau dawai dengan penghujungnya dibengkokkan 5. Masukkan spesimen ke dalam titisan LCB . 6. ambillah spesimen daripada bahagian koloni yang terletak di antara tepi dan tengahnya: bahagian tepi dan tengah koloni biasanya terdiri daripada struktur yang sama ada terlalu muda atau terlalu tua dari segi pembentukan spora dan berkemungkinan . 4. Leraikan bahan fungus ini dengan menggunakan 2 dawai. Lactophenol cotton blue ( LCB ) TATACARA 1. Struktur fungus lebih mudah dilihat jika pelekapan ini dibiarkan selama kira-kira 10 minit. Pada kultur fungus. Tutup spesimen dengan kaca penutup dengan perlahan tanpa menekan spesimen.

2. Tatacara Pewarnaan Gram Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan untuk bakteria (lihat pewarnaan Gram. Aktinomiset adalah golongan bakteria yang hampir menyerupai fungus dan secara tradisional dirangkumkan ke dalam bidang mikologi. 3. Nocardia adalah aktinomiset yang bersifat separuh tahan asid. Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun Tatacara ini tidak menggunakan haba untuk memudahkan pewarna memasuki sel. .akan memberikan hasil pengamatan yang kurang memuaskan. Kapsul Cryptococcus neoformans lazimnya menghalang sel yis ini daripada diwarnai dengan sempurna dan seringkali mengakibatkan ia kelihatan seperti bahan lemak Gram-negatif berwarna merah jambu pucat (lavender) dengan badan inklusi yang bergranul berwarna ungu (Gram-positif). Oleh yang demikian. PEWARNAAN FUNGUS Pewarnaan Gram Semua fungus adalah Gram-positif. Sebaliknya fungsi haba diambil alih oleh sejenis detergen (Tergitol) yang bertindak di atas permukaan sel. Pewarna tahan asid yang digunakan untuk mikobakteria mungkin menyahwarnakan pewarna secara berlebihan ke atas spesies ini dan memberikan hasil yang negatif palsu.2. muka surat 23-24).

Cuci dengan air. 7. Asid sulfurik 1% 5. Kertas turas 7. 6. 3. Fiksasi apusan dengan haba. 4. Cuci dengan air yang mengalir. Kultur fungus (kontrol kultur positif. Banjiri dengan etanol 50% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar (biasanya sejurus selepas alkohol ditambah). Masing-masing daripada kultur yang diuji. Karbol fuksin Kinyoun 3. 2. kontrol kultur positif dan negatif dan biarkan kering di udara. Tatacara Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun BAHAN 1. kultur yang diuji) 2. Buatkan 3 apusan tipis.5% di dalam etanol 95% 6.suatu pengubahsuaian pewarnaan tahan asid perlu dilakukan khususnya untuk Nocardia . Cuci dengan air. Metilena biru 2. Banjiri slaid dengan karbol fuksin Kinyoun dan biarkan selama 5 minit. 5. 8. negatif. Hilangkan pewarna dengan asid sulfurik 1% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar. . Etanol 50% 4. Penunu Bunsen TATACARA 1.

10. Asid periodik 1% 4. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Nocardia kelihatan merah manakala bakteria lain dan fungus kelihatan biru. Tatacara Pewarnaan Asid Periodik-Schiff BAHAN 1. Pewarnaan ini amat berguna untuk mengesan fungus pada keratan tisu serta apusan seperti kikisan kulit.2-glikol daripada polisakarid fungus ke gugusan aldehid. asid periodik . Air suling PA S ). Askus yis kelihatan merah manakala blastokonidia berwarna biru. Pewarnaan Asid Periodik-Schiff Dalam pewarnaan asid periodik-Schiff (periodic acid-Schiff – mengoksidasi gugusan 1.34 9. Metil hijau 2% 6. Reagen Schiff 5. Apusan spesimen pada slaid mikroskop 2. Metanol mutlak 3. Grup aldehid yang reaktif ini bergabung dengan reagen Schiff-leuko-fuksin untuk menghasilkan warna fuksin merah ungu. Liputi dengan larutan metilena biru selama 1 minit. Cuci dengan air dan keringkan.

Titiskan reagen Schiff selama 20 minit. Keberkesanan tindakan pewarna Schiff boleh diuji dengan menitiskannya ke dalam formalin 40%. 5. Sebaliknya. Balas warna dengan metil hijau selama 5 – 10 minit. Cuci dengan air paip selama 10 minit sehingga warna merah jambu muncul. 2. Titiskan larutan asid periodik selama 10 minit.TATACARA 1. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Fungus (dan juga komponen tisu) yang mempunyai polisakarida di dalam strukturnya kelihatan merah ungu. Pewarnaan Metenamin-Argentum Gomori Pewarnaan metenamin-argentum Gomori dianggap sebagai pewarnaan yang amat berguna dalam penyaringan spesimen klinikal bagi fungus. NOTA 1. Pewarnaan ini memberi kontras yang lebih ketara dan . Bilas seketika dengan air suling. 2. 6. ia tidak boleh digunakan lagi jika tiada warna yang muncul atau warnanya ungubiru. 4. Fiksasikan apusan dengan metanol mutlak selama 5 – 15 minit. Aktinomiset tidak diwarnakan dengan baik atau langsung tidak diwarnakan dengan tatacara ini. nukleus kelihatan biru dan latar belakang adalah hijau. 7. 3. Reagen ini masih boleh digunakan jika ia cepat berubah menjadi ungu-merah. Cuci dengan air suling selama 15 minit dan keringkan.

biasanya mewarnakan elemen fungus yang tidak ditunjukkan oleh pewarnaan lain. Larutan light green 0. alkohol 95%. Apusan spesimen pada slaid mikroskop 2. Larutan metenamin-argentum nitrat (pewarna Gomori) 6. Asid kromik 5% 4. Natrium bisulfit 1% 5. Xilena 11.04% 9. Alkohol mutlak. Letakkan slaid yang mengandungi apusan di dalam larutan asid kromik selama 1 jam. Ketuhar 3. 3. Bilas dengan natrium bisulfit selama 1 minit. Aurum (emas) klorid 0. 35 Tatacara Metenamin-Argentum Gomori BAHAN 1. Natrium thiosulfat 2% 8. Cuci dengan air paip selama 15 saat. .1% 7. Forseps yang disaluti parafin 12. Permount TM TATACARA 1. 2. alkohol 70% 10.

Periksa apusan dengan mikroskop untuk menentukan sama ada fungus telah terwarna perang tua atau memerlukan pengeraman yang lebih lama. Gunakan forseps yang diselaputi dengan parafin untuk mengeluarkan slaid dari larutan metenamin-argentum nitrat dan celupkannya ke dalam air suling. 8. Cuci dengan air. 10. 17. 16. 9. Balas warna dengan pewarna light green selama 30-45 saat. Bilas 6 kali dengan air suling apabila kontrol menunjukkan pewarnaan yang optimum telah dicapai. Bilas dengan air suling. Lekapkan dengan media pelekap Permount TM . PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN . 95% dan mutlak. 7. 15. Cuci 3 kali dengan air suling. 11. 5.4. Jernihkan spesimen dengan 2 hingga 3 kali pertukaran xilena.1% selama 2 hingga 5 minit. Cuci dengan air paip selama 5 – 10 minit. 14. 6. 13. Hilangkan argentum yang tidak tereduksi dengan natrium thiosulfat selama 2 hingga 5 minit. 12. Liputi apusan dengan larutan emas klorid 0. Letakkan slaid di dalam bekas yang mengandungi larutan metenamin-argentum nitrat dan eramkan bekas berkenaan di dalam ketuhar pada suhu 58-60°C. Keringkan dengan 2 pertukaran masing-masing alkohol 70%.

Komponen tisu sebagai latar belakang diwarnai kuning dengan nukleus berwarna hitam. manakala bahagian di dalam miselium dan hifa diwarnakan kelabu tua dan latar belakang adalah hijau muda. Tatacara ini boleh juga digunakan untuk keratan tisu dari ketulan parafin. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India . Presipitasi putih yang muncul berikutan penyimpanan boleh dihilangkan dengan menggoncangnya. NOTA 1. Oleh yang demikian semua yang diwarnakan kelabu tua tidak semestinya fungus. Dengan spesimen jenis ini. Larutan stok metenamin-argentum nitrat adalah stabil jika disimpan di dalam peti beku. alkohol 95% dan air suling. Cryptococcus neoformans diwarnai merah muda gelap atau merah. 5. Pastikan pewarnaan tidak menjadi telalu gelap hingga struktur morfologi halus tidak dapat diamati. Sesetengah bakteria (termasuk Nocardia spp) serta sesetengah komponen tisu juga diwarnakan. Nocardia serta fungus tua dan yang telah mati mungkin memerlukan masa pengeraman yang lebih lama (sehingga 90 minit) dengan larutan metenamin-argentum nitrat untuk diwarnai. 4.Dinding sel fungus (serta fiber retikulum dan fiber elastik tisu) terwarna hitam. keratan tisu terlebih dahulu dihilangkan parafinnya dengan 2 pertukaran rendaman di dalam xilena dan kemudian dihidrasikan melalui suatu urutan rendaman di dalam alkohol mutlak. 36 3. 2.

Bercabang Tak bercabang Membengkak Artrokonidia (artrospora) Blastokonidia (blastospora) Klamidokonidia (klamidospora) 37 Bentuk konidiofor: .Pewarnaan ini digunakan untuk menunjukkan kehadiran kapsul yis. BENTUK DAN STRUKTUR FUNGUS DALAM KULTUR 1.3. khususnya bagi Cryptococcus neoformans di dalam mendapan cairan serebrospina dalam diagnosis kes meningitis. Morfologi mikroskopik Morfologi fungus bermiselium Hifa: Saiz: garis pusat yang berbeza Pigmentasi: tanpa warna atau berwarna Berseptum atau tak berseptum Bercabang atau tak bercabang Spora aseksual: Bentuk spora yang dihasilkan secara langsung dari miselium vegetatif. Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan ke atas bakteria (Rujuk tatacara yang sama bagi bakteria) 3.2. Spora asekual (konidia) yang dihasilkan daripada hifa khas yang disebut konidiofor.

Filem yang nipis serta lembut ini diletak ke atas suatu jaringan halus berbentuk Bertunas Multipel Gada Sigar Bengkok dan berkeadaan tidak sempurna (distorted) . spesimen diletakkan di atas satu lapisan tipis plastik atau karbon yang disebut filem sokongan . Dalam mikroskopi elektron.3.Konidia Makrokonidia (konidia bersaiz besar pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil) Septum: Berseptum atau tanpa septum Bujur Bentuk: Berasingan Berkelompok Berantai Raket Berbentuk gada (clavate) Bernodul Susunan dari konidiofor: Mikrokonidia (konidia bersaiz kecil pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil). Bulut/sfera Bujur (ovoid) Ala buah pear (piriform) Bentuk: Tunggal Sabit 38 3. PENGAMATAN VIRUS DENGAN MIKROSKOP ELEKTRON Dalam pengamatan bakteria dan fungus dengan mikroskop cahaya. spesimen yang akan diamati diletakkan pada sebuah slaid kaca yang kemudian diletak di atas pentas mikroskop.

Seperti juga bakteria dan fungus.5 nm berbanding dengan kuasa pembesar mikroskop cahaya yang hanya berkisar di antara 30 sehingga 1500 kali dan had resolusi 200 nm. dan satu siri kanta magnetik yang digunakan untuk membelok dan memfokuskan aliran elektron. sama ada ke atas spesimen yang diambil ataupun ke atas kultur daripada sesuatu spesimen klinikal. Dalam elektron mikroskop jenis transmisi. Penaburan elektron oleh spesimen menghasilkan imej yang diperbesar di atas layar pendaflour. pengamatan terhadap virus boleh dilakukan secara langsung. Fokus yang halus boleh didapati dengan binokular berkuasa rendah. aliran elektron yang digunakan sebagai sumber radiasi diarahkan ke atas spesimen.bulat yang dinamakan grid. Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dengan teknik mikroskopi elektron langsung ataupun dalam bentuk teknik pengubahsuaian mikroskopi elektron imun kesensitifan – yang dapat meningkatkan . Mikroskop elektron transmisi mempunyai julat kuasa pembesaran di antara 1500 hingga 500000 kali dan had kuasa resolusi 0. diwarnakan secara negatif dan kemudian diamati dengan mikroskop elektron. Spesimen virus diletakkan di atas lapisan filem ini. Komponen asas mikroskop elektron adalah sumber elektron. Dua elektromagnet mempunyai fungsi seperti kondenser mikroskop cahaya untuk memfokuskan aliran elektron ini ke atas spesimen tersebut.

Mangkuk kaca ~ 10 cm isipadu 6. dan kedua-dua jenis plastik tersebut yang distabilkan oleh karbon. Grid kuprum 400 mesh. plastik formal polivinil (Formvar TM ). Tatacara Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar BAHAN 1. Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar Virus perlu diletak di atas filem sokongan sebelum partikel virus dapat “diwarnakan” dan diamati. Filem sokongan ini diletakkan di atas grid kuprum berbentuk jaringan halus.5% di dalam kloroform 2.dalam pengesanan virus melalui mikroskopi elektron tersebut. Forseps 7. Bahan-bahan yang berfungsi sebagai filem sokongan adalah plastik nitroselulos (contoh Parlodion TM ). garis pusatnya bergantung kepada jenis mikroskop elektron 3. Air suling . Pisau cukur 5. karbon murni. Formvar E larutan 0. Slaid mikroskop 4.

Potong filem di bahagian yang berhampiran dengan tepi slaid supaya terdapat filem berbentuk segi empat. 9. Slaid yang dicuci dengan teliti (dengan asid alkohol) akan melekatkan filem dengan kuat sehingga . 7. 3. Letakkan grid dalam 2 barisan di atas filem yang terapung-apung di atas air tersebut.TATACARA 1. 4. Slaid berkenaan kemudian dikeluarkan dan permukaan slaid dipegang secara tegak dengan paksi panjangnya agak disendengkan dan biarkan sehingga kering. 6. 39 5. Letakkan sekeping kertas turas di atas filem dan apabila kertas ini tenggelam ia dikeluarkan dan filem dibiarkan sehingga menjadi kering. Slaid dicelupkan ke dalam larutan formvar selama 15 – 20 saat. Isikan bekas air dengan air suling sehingga penuh. Gunakan slaid mikroskop baru yang sengaja dilap dengan kertas pengering tangan. Masukkan slaid ke dalam air pada sudut 30 darjah supaya filem terapung bebas pada permukaan air. 2. 8. NOTA 1. Tekan grid perlahan-lahan dengan forseps untuk mencapai sentuhan yang baik di antara filem dan grid. Pegang slaid berdekatan dengan mulut dan keluarkan nafas dengan kuat supaya permukaan filem diliputi dengan wap yang terkondensasi dari mulut. Tunggu sehingga semua gelembung udara bergerak ke permukaan air.

Penyalutan Virus Ke atas Grid dan Pewarnaan Negatif: Teknik Mikroskop Elektron Secara Langsung Spesimen diletakkan di atas filem sokongan melalui kaedah pemindahan titisan tunggal sebelum pewarnaan dilakukan. 2. Keadaan ini wujud kerana kawasan yang mempunyai lebih “pewarna” seperti kawasan di sekeliling virus dan celah-celah permukaan virus akan menaburkan lebih elektron berbanding dengan kawasan yang kurang “pewarna”. Pastikan air yang digunakan bersih. ia tidak akan tanggal lagi kecuali jika dilarutkan atau dihadamkan. Pewarnaan negatif melibatkan penanaman (embedding) bahan kecil yang berpartikel. Proses perlekatan bahan protein ke atas filem memerlukan beberapa saat sahaja dan selepas itu. jumlah elektron yang sampai ke layar dari kawasan yang mempunyai lebih “pewarna” adalah lebih rendah dan menyebabkan kawasan ini kelihatan lebih gelap daripada kawasan lainnya. seperti pewarnaan virus. seperti virus.membuatkannya sukar untuk ditanggalkan daripada slaid. Oleh yang demikian. proses yang berikutnya. dapat dilakukan tanpa kehilangan virus. Terdapat beberapa pewarna negatif seperti natrium fosfotungstat. Oleh yang demikian. natrium tungstat dan garam . ke dalam suatu lapisan bahan berketumpatan tinggi supaya spesimen dapat diamati sebagai objek yang cerah di atas latar belakang gelap.

1 5. Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus di atas titisan air suling selama 30 saat. Apungkan 1 grid dengan permukaan filem sokongannya bersentuhan dengan titis suspensi virus selama 3 minit. Letakkan setitis (~ 20 µl) suspensi virus. Letakkan grid tersebut di atas kertas gris dan biarkan sehingga kering. air suling dan pewarna dalam 1 barisan di atas sekeping kertas gris. Sampel virus 2.7 3. Kepingan kertas turas gred Whatman No. Tetapi natrium fosfotungstat merupakan pewarna negatif yang utama. pH 6. Kertas lilin 6. Forseps halus jenis tukang jam yang bengkok No. Dengan forseps halus keluar dan sentuhkan tepi grid dengan sekeping kertas turas supaya dapat menghilangkan cairan yang berlebihan.5 TATACARA 1. 3. .uranium seperti uranil asetat. 40 4.5%. Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar 4. Tatacara Pewarnaan Negatif dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1. 2. 5. Asid fosfotungstik 1.

7. Bagi spesimen multipel. 8. Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus ke atas titis pewarna selama 30 saat. 5. NOTA 1. 4. 2. Keluar dan hilangkan cairan yang berlebihan.6. Ia diagihagihkan dalam jumlah kecil ke dalam botol dan disimpan beku kecuali satu botol untuk kegunaan semasa yang seharusnya disimpan di dalam peti beku. Cecair yang berlebihan disingkirkan dengan menyentuhkan bahagian tepi grid sambil dipegang dengan penghujung forseps. Pegang grid dengan kemas dengan menggunakan forseps kerana grid-grid ini amat ringan dan mudah terlepas daripada forseps akibat tarikan tegangan permukaan titisan cecair. Permukaan grid yang disaluti dengan filem yang digunakan untuk melekatkan virus adalah permukaan di sebelah atas kertas turas. 3. Buang sediaan ini apabila didapati berubah kepada warna kebiruan. Asid fosfotungstik seharusnya disediakan dengan menggunakan air suling steril. Pindahkan grid ke sekeping kertas turas yang terletak di dalam sebuah piring Petri. elakkan daripada berlakunya pencemaran silang dengan menggunakan forseps yang berbeza atau mencelupkan forseps yang telah digunakan di dalam air mendidih setiap kali sebelum digunakan semula. Keluar serta hilangkan cairan yang berlebihan. 9. Teknik Mikroskopi Elektron Imun . Kertas turas yang dikoyak adalah lebih berkesan daripada yang digunting.

Larutkan antiserum dalam larutan salin ditampan fosfat (nisbah antiserum: larutan salin yang digunakan bergantung kepada sediaan antiserum). Cara ini juga digunakan untuk menentukan identiti virus yang tidak mempunyai morfologi permukaan yang khusus. Larutan salin ditampan fosfat TATACARA 1. Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar 4.Kesensitifan mikroskopi elektron (ME) boleh dipertingkatkan iaitu dengan menggunakan antibodi yang spesifik untuk mengelompokkan partikel-partikel virus. Antiserum yang spesifik terhadap virus berkenaan 8. Kepingan kertas turas gred Whatman No. 2. Tatacara Mikroskopi Elektron Imun BAHAN 1. 1 6. 4. pH 6. Letakkan kertas lilin dengan campuran virus/antiserum di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas lembap. Eramkan campuran virus/antiserum di dalam bekas ini selama satu jam pada 37°C. Campurkan 15 µl virus dengan 15 µl tiap larutan antiserum ke atas sekeping kertas lilin.5%.5 5. Forseps halus jenis tukang jam tangan 3. . Kertas lilin 7. Asid fosfotungstik 1. 3. Sampel virus 2.

adalah amat penting sekali. Letakkan campuran ke atas grid dan warnakan mengikut bahagian “tatacara menyaluti grid dengan virus & tatacara pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik” di muka surat 39-40. 41 NOTA 1. Serum biasa pun sudah mencukupi. Apa yang akan dibentangkan dalam bahagian ini adalah cara untuk memasukkan spesimen ke dalam mikroskop dan beberapa petua untuk mengamati virus.5. Suspensi virus murni boleh menyebabkan partikel virus dikelompokkan secara spontan. tidak semestinya IgG atau IgM yang murni digunakan. 3. 2. partikel virus akan disaluti dengan suatu lapisan protein yang tebal dan ini akan menyukarkan pengamatan ke atas struktur virus serta menyebabkan perubahan bentuk vitus berkenaan. Tatacara Pengamatan Spesimen Virus dengan Mikroskop Elektron . jika teknik ini dilakukan dengan menggunakan spesimen tanpa campuran antibodi sebagai kontrol. Campuran virus dan antiserum daripada satu siri pencairan dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi antibodi yang optimum untuk menghasilkan pengelompokan virus. Serum haruslah didedahkan kepada suhu tinggi (56°C) sebelum digunakan untuk menghapuskan komplemen yang boleh melisiskan sampul (envelop) virus. Oleh yang demikian. 4. Pengamatan Spesimen Virus Terletak di atas Grid Mikroskop Elektron Persediaan penggunaan mikroskop memerlukan seseorang yang terlatih di dalam bidang ini. Dalam tatacara ini. Dalam keadaan antibodi yang berlebihan.

3. 6. iaitu sebagai isyarat bahawa ruang hampas udara telah pun dicapai di dalam ruang spesimen. Amati layar melalui tingkap pengamatan. Grid yang diliputi dengan spesimen yang diwarnakan 2. 2. 5. Untuk mengamati sesuatu objek dengan lebih teliti dan mendalam. supaya spesimen mencapai tempat yang ditetapkan. Mikroskop elektron jenis transmisi TATACARA 1. Letakkan spesimen dengan menggunakan forseps di dalam ruang khas pemegang spesimen (berhati-hati supaya tidak tersentuh bahagian pemegang spesimen yang akan diletakkan di dalam ruang hampas udara). gunakan binokular. 8. Putarkan tombol fokus sehingga memperolehi imej yang paling jelas. Kurangkan kuasa pembesaran kepada 80 kali dan pilih satu kawasan (segi empat sama) untuk diamati. NOTA . 7.000 kali ganda dan dalam masa yang sama pusatkan semula pancaran elektron serta tingkatkan intensitinya.BAHAN 1. Letakkan batang pemegang spesimen ke dalam tapak yang ditetapkan dan tunggu sehingga lampu merah padam. Naikkan kuasa pembesaran kepada 60. Skan secara teratur kawasan di dalam segi empat tepat yang dipilih supaya seluruh kawasan diamati. Putarkan batang pemegang ke arah lawan pusingan jam. 4.

1. bawah. Campurkan 1 ml asid asetik dan tambahkan 100 ml air suling. janganlah mendapatkan kawasan yang gelap kerana virus akan terlindung/tersembunyi dan susah untuk diamati. 2. iaitu yang berada di tengah. 4. atas serta kiri dan kanan grid sebelum spesimen tersebut dapat dianggap sebagai tidak mengandungi virus (iaitu pada tahap kesensitifan mikroskop elektron dalam mengesan virus). Alkohol asid Campurkan 5 ml asid hidroklorik dengan 95 ml etanol 95%.15 g toluidina biru dan 0. larutan pewarna Albert Larutkan 0. Saiz serta bentuk virus. akan banyak membantu dalam proses pencarian virus berkenaan. Dalam memilih segi empat tepat untuk diamati. amatilah 5 segi empat tepat. REAGEN PEWARNAAN: RUMUSAN DAN PERSEDIAAN 1. dalam hal ini. Juga. Aseton-alkohol Campurkan aseton dan etil alkohol 95% dalam nisbah isipadu yang sama. 2. 42 3.4. Asid sulfurik . jika diketahui. janganlah memilih segi empat yang kelihatan terlalu “bersih” kerana ia tidak dapat memberikan kontras yang baik di antara virus dengan latar belakangnya. Oleh kerana terdapat kemungkinan bahawa taburan virus di atas filem grid tidak rata.2 g malakit hijau di dalam 2 ml etanol 95%. Albert. 3. 3.

Campurkan 1 ml asid sulfurik pekat ke dalam 100 ml air suling. Lakukan di dalam almari asap. 5. Karbol fuksin Ziehl-Neelsen Larutkan 4 g fuksin bes di dalam 20 ml etanol 95%. Larutkan 5 g fenol di dalam 100 ml air suling. Campurkan kedua-dua sediaan ini. 6. Karbol fuksin Kinyoun Larutkan 2 g fuksin bes di dalam 10 ml etanol 95%. Larutkan 8 g fenol di dalam 100 ml air suling. Campurkan kedua-dua sediaan ini. 7. Karbol fuksin (0.05%) Larutan 0.05g fuksin bes di dalam 100 ml air suling. 8. Iodin Gram Larutkan 1 g kalium iodid di dalam 70 ml air suling. Tambahkan 0.5 g iodin dan tambah air sehingga mencapai 100 ml. Goncang sehingga keseluruhan iodin tersebut larut. 9. Kristal ungu Larutkan 1 g kristal ungu di dalam 100 ml air suling. 10. Lactophenol cotton blue Campurkan 20 ml asid laktik dengan 40 ml gliserol dan 40 ml air suling. Tambahkan 20 g kristal fenol dan larutkan dengan air panas di dalam penganggas air pada suhu 70°C. Kemudian tambahkan 0.075 g cotton blue. Larutkan pewarna cotton blue dengan meletakkan bekas di dalam penganggas air. Saring larutan ini dengan kertas turas. 11. Light green, Larutan pewarna

Larutkan 0.2 g Light Green, SF yellowish di dalam 100 ml air suling dan tambah 0.2 ml asid asetik glacial . Campurkan 1 bahagian larutan stok ini dengan 5 bahagian air suling untuk digunakan dalam pewarnaan. 12. Malakit hijau (5.0%) Larutkan 5 g pewarna di dalam 100 ml air suling. 13. Metilena biru (0.3%) Larutkan 0.3 g metilena biru di dalam 30 ml etanol dan tambahkan 100 ml air suling. 43 14. Metenamin-argentum nitrat, larutan stok Campurkan 50 ml larutan argentum nitrat 5% yang disediakan di dalam air suling dengan 100 ml metenamin (heksa-metilena-tetra-amin) 3% yang disediakan di dalam air suling. 15. Metenamin-argentum nitrat, larutan pewarnaan Larutkan 2 ml boraks (borax) 5% di dalam 25 ml air dan kemudian campurkan larutan ini dengan 25 ml larutan stok metenamin-argentum nitrat. 16. Reagan Schiff-leuko-fuksin Larutkan 1g fuksin bes di dalam 200 ml air suling yang mendidih. Kemudian kurangkan suhu kepada 50°C dan saringkan dengan kertas turas. Tambahkan 20 ml 1N HCl dan 1g kalium metabisulfit bentuk kontang. Biarkan di tempat gelap selama 2 hari. Tambahkan 0.5 g arang kayu yang teraktivasi dan goncang sekali-sekala dalam tempoh 1 jam. Saring dengan kertas turas dan simpan larutan reagen Schiff ini di dalam botol gelap di dalam peti beku. 17. Safranin (0.5%)

Larutkan 0.5 g safranin di dalam 100 ml air suling. 44 4. PENGKULTURAN MIKROB Mikroorganisma dan virus dikulturkan untuk beberapa tujuan. Dalam mikrobiologi diagnostik, ujian yang dijalankan ke atas kultur sesuatu mikrob tertentu dapat membantu mengenal pasti atau menentukan identiti mikrob berkenaan. Jika mikrob ini merupakan suatu agen “baru” yang mungkin belum dikenali, melalui pengkulturan dapatlah diwujudkan satu sumber atau bekalan kultur agen berkenaan supaya kajian boleh dijalankan untuk menentukan ciri-cirinya. Dalam bidang perindustrian dan bioteknologi, mikrob merupakan salah satu komponen yang harus diperolehi bagi penghasilan sesuatu produk, misalnya vaksin. Keadaan pengkulturan mikrob adalah berbeza-beza bergantung kepada jenis mikrob, misalnya bakteria ataupun virus. Kadangkala keadaan yang berbeza ini wujud walaupun di kalangan mikrob daripada golongan yang sama. 4.1. PENGKULTURAN BAKTERIA 4.1.1. JENIS MEDIA KULTUR Media kultur digunakan terutama untuk pertumbuhan bakteria (dan mikroorganisma lain) dan terdapat dalam bentuk pepejal, separuh pepejal dan cecair. Di samping pertumbuhan, media

juga digunakan untuk pemencilan, ujian motiliti dan menentukan ciri-ciri metabolik dan fisiologi bakteria. Media boleh dibahagikan kepada media sintetik (media yang diketahui kandungannya) dan media tiruan atau kompleks. Media sintetik adalah media yang semua komponennya merupakan bahan kimia yang nyata dan spesifik daripada segi kandungannya; manakala media tiruan adalah media yang mengandungi bahan-bahan kompleks seperti ekstrak daging lembu, yis atau darah di mana kandungannya kurang jelas atau tidak dapat dipastikan. Dari segi penggunaan, media kultur dibahagikan kepada beberapa golongan: Media dasar (juga dipanggil media nutrien atau media basal) yang mengandungi infusi , pepton , garam dan air. Infusi – Ekstraks daging. Pepton – Hasil daripada penghadaman enzim ke atas bahan organik. Contoh; Pepton soya disediakan daripada tindakan enzim terhadap kacang soya, pepton P adalah penghadaman daging oleh pepsin. Contoh: Agar nutrien, broth nutrien, broth infusi (otak-jantung, jantung, otak atau hati). Media diperkaya (enriched media) adalah media dasar yang dicampurkan dengan bahan yang boleh menggalakkan pertumbuhan seperti cecair tubuh (contohnya darah, serum), vitamin tertentu, asid amino, protein atau sebarang nutrien yang memiliki ciri yang khas dan tepat. Media pengaya (enrichment media) digunakan untuk pertumbuhan bakteria yang tidak tumbuh

baik pada media dasar atau kerana pertumbuhannya pada media ini lebih baik dan cepat berbanding dengan bakteria yang lazimnya tumbuh dengan pesat dan seringkali mengatasi kecepatan pertumbuhannya dalam media dasar. Media pembeza (differential) adalah media dasar atau media diperkaya yang mengandungi bahan kimia . 45 1. Media pemilih (selective) adalah media dasar atau media diperkaya yang dicampurkan dengan bahan yang menghalang pertumbuhan majoriti jenis bakteria dan memberikan kelebihan kepada segolongan kecil bakteria lain yang diinginkan untuk tumbuh. Contoh media diperkaya Nama media Bahan campuran khas Agar darah Darah utuh Agar coklat Darah yang dipanaskan Broth (atau agar) serum Serum Agar darah triptos Darah. Media ini juga meningkatkan peluang untuk memencilkan bakteria tertentu di dalam sesuatu kultur campuran. arnab atau kuda. triptos Agar Mueller-Hinton Kanji Sumber darah: kambing biri-biri.

ia juga dianggap sebagai media pemilih. kebanyakan media pembeza juga mempunyai reagen yang dapat menghalang pertumbuhan bakteria tertentu dan dalam hal ini. Contoh media yang mempunyai ciri pemilih dan pembeza Nama media Bahan pemilih Ciri pembezaan Ciri Indikator MacConkey Hempedu Fermentasi laktosa Neutral red Potassium telurit Kalium telurit Reduksi telurit Kalium telurit Shigella untuk membiak dengan lebih baik kerana kekurangan atau ketiadaan . Pada hakikatnya. ia memberi peluang kepada Salmonella dan/atau persaingan pertumbuhan spesies koliform lainnya. misalnya dalam bentuk perubahan warna koloni (fermentasi) ataupun perubahan kepada media itu sendiri (hemolisis).0 adalah toksik terhadap bakteria koliform dan dengan demikian. media pengaya boleh juga disifatkan sebagai media pemilih. Dari segi fungsi. Media pengaya (enrichment) digunakan untuk pemencilan (misalnya patogen usus) dengan merencat atau menekan pertumbuhan saprofit dan/atau flora normal tubuh. 2. dalam broth selenit F natrium selenit pada pH 7.khusus yang akan bertindak ke atas sesetengah jenis bakteria melalui cara yang membolehkan bakteria berkenaan dikenali. Sebagai contoh.

1. 46 4. Penghasilan H 2 S akan menukar ferik ammonium sitrat kepada ferik sulfida dan pembentukan warna hitam pada koloni bakteria.2.Deoksikolat sitrat Natrium deoksikolat Fermentasi laktosa Neutral red Kesan penghasilan H 2 S Ferik ammonium Sitrat Garam manitol Natrium klorida Fermentasi manitol Fenol merah Lowenstein-Jensen Malakit hijau – Fermentasi laktosa akan menyebabkan koloni menjadi merah atau merah jambu. Pada umumnya. Fermentasi manitol menghasilkan koloni bakteria berwarna kuning. Tiap-tiap bentuk agar mempunyai fungsi tersendiri. bakteria dikulturkan ke atas plat media agar melalui teknik plat garisan untuk mendapatkan koloni bakteria yang terpencil. BENTUK MEDIA AGAR Media kultur dipadatkan dengan agar dan disediakan dalam 2 bentuk. manakala pengkulturan pada cerun agar digunakan . Reduksi telurit akan menghasilkan koloni berwarna hitam. sebagai satu lapisan rata di dalam plat Petri (juga dipanggil „plat agar‟/„piring agar‟) dan dalam bentuk cerun (agar cerun/ condong) di dalam tabung atau botol.

6. 3. Putarkan plat supaya agar tersebar sama rata. Pada keesokan harinya pastikan tiada pertumbuhan (bakteria/fungus) atau kontaminasi berlaku ke atas media. 4. Tatacara Menyediakan Plat Media Agar BAHAN 1. Eramkan secara terbalik dengan penutup dalam keadaan terbuka pada suhu 37°C selama semalaman. Piring Petri TATACARA 1. Biarkan sehingga beku. 5. 7.untuk ujian biokimia atau sebagai kultur simpanan. Bikar air yang mendidih 3. 8. Letakkan larutan media agar ke dalam penganggas air bersuhu 50°C. 2. Tutup plat dan simpan pada suhu 4 – 8°C jika tidak digunakan. Tuangkan 15 – 20 ml agar ke dalam setiap piring Petri bergaris pusat 90 cm. Media agar 2. Larutkan media agar berisipadu kecil di dalam bikar air mendidih dan media agar berisipadu besar di dalam penganggas air atau autoklaf. Penganggas air 4. NOTA .

segera hilangkan dengan mengarahkan/ melalukan api penunu Bunsen ke atas gelembung-gelembung tersebut sehingga semuanya terhapus/ tersingkir sebelum media menjadi beku. Pada agar yang tidak mengandungi bahan protein seperti darah. suhu tersebut mestilah diturunkan kepada 48°C sebelum darah dan bahan lain yang tidak tahan panas dicampurkan. apabila keseluruhan agar menjadi cair. Jika setelah penuangan media. media tersebut perlulah dikeringkan terlebih dahulu kerana penginokulasian di atas media yang berkeadaan sedemikian hanya akan menyulitkan pemencilan mikroorganisma nantinya. 4. pastikan permukaannya tidak basah. Tindakan menggoncang ini hanya akan menyebabkan pembentukan gelembung udara di dalam media dan mengakibatkan media plat yang tidak rata apabila membeku kelak. Elakkan daripada menggoncang media agar sebelum dituangkan ke dalam plat.1. masih terdapat gelembung udara pada permukaan media plat. 2. besar kemungkinan bahan pelengkap (supplement) ini tidak akan bercampur dengan baik dan merata di dalam media. Sungguhpun suhu yang tinggi diperlukan untuk mencairkan agar. Sebaliknya jika agar dibiarkan sehingga terlalu sejuk. 3. Jika didapati demikian. Semasa media agar digunakan. Koloni-koloni bakteria . ada baiknya juga jika media agar dituangkan selepas suhu diturunkan kerana ini akan mengurangkan pemeluapan.

Setelah pensterilan. Bikar air yang mendidih 3. NOTA 1. Tuangkan 10 hingga 15 ml media agar yang telah dicairkan ke dalam setiap tabung atau botol. Tabung/botol TATACARA 1. 47 Tatacara Menyediakan Media Agar Condong/Cerun BAHAN 1.yang seharusnya telah terasing. 3. 4. Tutup tabung atau botol tersebut dan sterilkan. Media agar 2. apatah lagi jika di kalangan bakteria yang ingin dipencilkan terdapat spesies yang dapat bergerak atau menunjukkan kemampuan untuk menyebar (swarming). Penganggas air 4. misalnya Proteus spp. Media agar untuk tujuan persiapan media agar cerun disediakan dan dibahagi-bahagikan ke dalam . letakkan tabung atau botol dalam keadaan condong dan biarkan membeku pada suhu bilik. 2. Simpan media cerun agar pada 4° – 8°C jika tidak digunakan. akan saling bersentuhan dan bercantum semula di antara satu dengan lain.

Teknik plat garisan merupakan teknik yang paling mudah untuk mendapatkan koloni terpisah dan terasing. bahagi-bahagikan media berkenaan dalam isipadu yang ditetapkan ke dalam tabung atau botol yang terlebih dahulu disterilkan. Kemudian. Ini boleh mengelakkan daripada tercemar semasa membahagikan media yang telah disterilkan terlebih dahulu ke dalam tabung atau botol. sungguhpun teknik aseptik diamalkan. maka media dalam isipadu yang besar tersebut perlu disterilkan terlebih dahulu. Umumnya. maka satu koloni akan hanya terdiri daripada satu jenis atau spesies sahaja. jika sesuatu bahan yang ingin dicampurkan ke dalam media adalah daripada jenis yang tidak tahan panas. dinginkan sehingga mencapai suhu sekitar 48°C. Kemudian tambahkan bahan berkenaan yang steril dan campurkan dengan baik dan merata. Selepas pensterilan. Berdasarkan teori bahawa satu koloni bakteria merupakan hasil daripada pertumbuhan yang berasal daripada satu sel bakteria. dengan teknik aseptik. kultur murni diperolehi dengan menggunakan media padat. KULTUR MURNI Plat Garisan Kultur murni adalah kultur yang mengandungi satu jenis atau spesies bakteria sahaja. Sebaliknya.3. 4. 2. Bakteria daripada koloni ini kemudian boleh ditumbuhkan semula supaya semua koloni di dalam sesuatu plat terdiri daripada jenis bakteria . sama ada melalui teknik plat garisan atau teknik plat tuangan (pour plate).tabung atau botol dan kemudian disterilkan.1.

reaksi pewarnaan. ambil spesimen dengannya. Gelung dawai 4. morfologi sel. 4. 2. reaksi imunologi dan kepekaannya terhadap berbagai agen antimikrob. Letakkan plat Petri tersebut dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. Piring Petri yang mengandungi media agar 48 3. Penunu Bunsen TATACARA 1. Kultur bakteria 2. Tatacara Plat Garisan BAHAN 1. misalnya ciri morfologi koloni. Labelkan plat Petri yang mengandungi media pertumbuhan yang steril (pada bahagian dasar atau bawahnya dan bukan di atas penutupnya). .yang sama. 3. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan setelah sejuk. Pegang dan angkat bahagian dasar plat sehingga permukaan media yang terdedah menghadap anda. Kultur murni penting kerana ia diperlukan dalam kajian-kajian mengenai pelbagai ciri sesejenis bakteria. Kultur yang sedemikian ini dikenali sebagai kultur murni dan menunjukkan pertumbuhan koloni yang morfologinya kelihatan serupa di antara satu dengan lain. biokimia.

3.5. 9. berterusan tetapi terpisah serta tidak saling memotong atau bersilang di antara garisan atas dengan yang di bawahnya supaya mendapatkan koloni bakteria yang berasingan. Putarkan plat ~ 90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan mengulangi prosedur di atas sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permukaan media. Gunakan penghujung gelung dawai sahaja untuk menyentuh permukaan media supaya mendapatkan garisan yang halus dan tipis. usahakan menggaris perlahan-lahan supaya anda tidak sampai mencung-kil atau merobek media sehingga mengakibatkan media menjadi pecah-pecah. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan pada suhu tertentu dalam keadaan terbalik. Pastikan garisan yang terakhir tidak menyentuh sebaran inokulum yang pertama. Bermula daripada sebaran di atas gariskan inokulum dengan menggerakkan gelung bolakbalik supaya garisan meliputi satu kawasan seluas kira-kira sepertiga daripada plat. Letakkan gelung yang mengandungi spesimen di atas permukaan media agar kira-kira 1 cm daripada dinding plat Petri tersebut. Dalam membuat garisan. 7. 11. Gelung dawai dibakar semula selepas garisan dibuat pada bahagian pertama piring Petri . NOTA 1. 4. yang penting ialah menyentuh gelung pada permukaan media dan menggariskannya. 2. 10. Bakar semula gelung dawai dan biarkan sejuk. 6. 8. Sebarkan inokulum seluas 1 cm garis pusat. Pastikan juga garisan yang dibuat tersebut rapi. Garisan seterusnya bermula daripada kawasan di sekitar penghujung garisan-garisan pertama.

Dengan gelung dawai steril pindahkan kultur/spesimen ke atas media plat dan inokulum seluas 1 cm garis pusat. CIRI-CIRI KOLONI BAKTERIA Kajian mengenai koloni bakteria adalah penting kerana ia boleh memberikan maklumat lanjut mengenai identiti.1 Cara melakukan plat garisan 4. ciri genetik dan antigenik bakteria berkenaan.4. aktiviti biokimia. 49 RAJAH 4. Seperti juga ciri-ciri morfologi sel bakteria. maka koloni bakteria yang terpisah akan didapati. Jangan bercakap semasa melakukan prosedur ini untuk mengelakkan semburan air liur terjatuh ke atas permukaan media agar.1. 6. Koloni bakteria biasanya diamati berdasarkan pertumbuhannya di atas media padat. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan secara terbalik supaya sebarang pemeluapan yang berlaku pada penutupnya tidak akan menitis ke atas kultur. ciri-ciri koloni bakteria dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti jenis media. Bekerjalah berdekatan dengan sumber api. Terbalikkan plat Petri yang me-ngandungi media dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. suhu pertumbuhan. 5.supaya inokulum (jumlah bakteria) dikurangkan. strain bakteria dan semua keadaan ini biasanya diambil kira dan dinyatakan semasa menghurai sesuatu koloni bakteria. . umur kultur.

Pinggiran/konfigurasi (ditentukan dengan mikroskop): Menyeluruh Beralun Lobate Erose Gariskan inokulum secara bolek-balik bermula daripada sebarannya sehingga meliputi kira-kira sepertiga kawasan plat. Bentuk: Bulat Tidak teratur Berfilamen Berserabut Bertitik bujur 2. Permukaan: Tekstur Licin Kasar Berkontour : permukaan licin dan undulat (beralun) secara tak teratur.1. 50 3. Berkerut . Permukaan: Elevasi Datar Menaik Cembung Umbonat Pulvinat Cembung papilat Cembung berkerut 4. Batasan secara radial : permukaan berbatas-batas yang terpancar dari tengah-tengah koloni. Ulangi kaedah ini sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permu-kaan media. Putarkan plat 60-90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan.

Ciri optik: Luster Legap Lutsinar Opalesens : Seperti warna baiduri (warna putih-kebiruan atau warna susu dengan ciri warna yangkekilatan berubah-ubah) Iridesens : Warna yang berubah dengan sudut (posisi) koloni dipandang. 7. Permukaan: Konsistensi Kelihatan kering & rapuh. 6. Pudar Berkilat Fotogenik – memancar di dalam gelap. Pertumbuhan yang nipis seperti membran. Struktur dalam (ditentukan dengan mikroskop): Bergelung 51 8.5. Likat: Pertumbuhan mengikut bekas garisan dawai inolukasi. Seperti mentega atau lekit. Perubahan kepada media Hemolisis (pada agar darah) Berfilamen Bergranul . Pendaflour – satu warna dengan cahaya transmisi dan warna lain (yang cerah dan terserlah) dengan cahaya pantulan (berpendafluor).

Penghasilan pigmen Perubahan kepada media pembeza Penghasilan bau atau aroma Istilah Bahasa Malaysia dan Istilah Bahasa Inggeris dalam pencirian koloni bakteria tidak teratur irregular berserabut rhizoid bertitik punctiform menyeluruh entire beralun indulate keriting curled datar flat menaik raised cembung convex imbonat imbonate pulvinat pulvinate cembung papilat convex papillate cembung berkerut convex rugose batasan secara radial radially ridged berkerut rugose rapuh brittle seperti mentega/lekit butyrous .

pengkulturan bakteria di dalam makmal hanya dapat dicapai jika keadaan alam persekitarannya dapat diwujudkan.1. Sebaliknya.5. Ada bakteria yang hanya boleh menggunakan oksigen bebas sebagai penerima akhir hidrogen ( aerob obligat). Terdapat pula segolongan bakteria yang dinamakan aerotoleran kerana berkeupayaan untuk tumbuh di dalam udara. terdapat juga bakteria yang sama sekali tidak dapat menggunakan oksigen sebagai penerima akhir hidrogen (anaerob obligat). Justeru itu ia tidak dapat tumbuh dalam keadaan kehadiran oksigen dan kemungkinan akan mengalami kematian apabila terdedah kepada gas berkenaan. Di samping pengaruh kandungan media ke atas pertumbuhan bakteria. Oleh yang demikian ia hanya dapat tumbuh dalam kehadiran oksigen. beberapa faktor lain di alam sekeliling juga mempengaruhi pertumbuhan dan tumbesarannya. maka bakteria dari lingkungan yang berbeza memerlukan keadaan sekeliling yang berbeza pula untuk pertumbuhan yang optimum. osmolariti media dan kepekatan ion hidrogen (pH).pudar dull berkilat glistening. air. glossy 4. aras oksigen. sungguhpun ia tidak menjalankan metabolisme oksidatif. tenaga yang digunakan untuk menjalankan proses biosintesis berpunca daripada tindakan oksidatif ke atas bahan organik. KEADAAN PERTUMBUHAN BAKTERIA DI DALAM MAKMAL Oleh kerana penyesuaian bakteria kepada alam sekelilingnya. Faktor ini termasuk suhu pengeraman. Oleh yang demikian. Bakteria golongan ini melakukan . Pengeraman Bakteria dalam Keadaan Anaerobik Pada bakteria heterotrof.

Walau bagaimanapun.fermentasi meskipun dalam kehadiran oksigen. metabolismenya akan berubah kepada keadaan aerobik dan 52 karbohirat umumnya akan dioksidasi kepada air dan CO 2 . Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik di dalam Balang Anaerobik dengan GasPak tm BAHAN 1. Satu pek katalis . Balang anaerobik (jenama GasPak) 2. Sekumpulan besar bakteria mempunyai sistem enzim yang boleh menggunakan oksigen atau terbitan organik sebagai penerima akhir hidrogen ( aerob fakultatif atau anaerob fakultatif). Pipet 4. apabila ditumbuhkan dalam kehadiran udara (oksigen). Bakteria jenis ini boleh tumbuh secara anaerobik dan dalam keadaan ini akan memfermentasi karbohidrat dengan menghasilkan produk fermentasi seperti berbagai-bagai jenis asid. Air 5. Terdapat segolongan bakteria lagi yang menunjukkan pertumbuhan optimum pada kadar oksigen yang rendah dan bakteria ini dikenal sebagai mikroaerofilik. Penunu Bunsen 6. Satu paket GasPak 3.

Potong salah satu sudut atas paket GasPak dan letakkan sampul GasPak secara menegak di sebelah susunan plat. 8. Gunakan balang anaerobik yang sedia dilengkapi dengan 1 pek mangkin aktif yang dilekatkan kepada penutupnya. Pasang alat pencengkam penutup supaya balang tertutup dengan rapi dan rapat sehingga tidak dapat ditembusi udara. 6. 3. Katalis – biji-biji aluminium disaluti paladium GasPak TM – kit penjana/pembebas hidrogen NOTA 1. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam balang. Eramkan keseluruhan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37°C semalaman.7. Masukkan 10 ml air paip ke dalam GasPak dengan pipet. 5. 4. Indikator redoks TATACARA 1. Kemudian lekapkan penutup tepat pada kedudukannya menutupi mulut balang. Balang jenama GasPak menggunakan katalis atau mangkin „sejuk‟ yang tidak perlukan dipanaskan . Letakkan indikator redoks (oksidasi-reduksi) di sebelah susunan plat. 2. 7.

CO 2 5%. pastikan proses ini dilakukan jauh dari gas yang boleh meletup. Tetapi masa kehilangan warnanya dicapai lebih lewat daripada pencapaian keadaan anaerobik di dalam balang. 2. Dalam keadaan tanpa oksigen metilena biru akan menghilangkan warnanya. 3. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik dengan Pengisian Gas Nitrogen ke dalam Balang Anaerobik BAHAN 1. Tangki silinder gas campuran (N 2 85%. Indikator redoks metilena biru digunakan untuk memastikan keadaan anaerobik dicapai. Mangkin ini kemudian disimpan di dalam tempat kering atau balang pengering (desikator). Butir-butir mangkin yang terpakai dipulihkan kepada aktiviti penuh dengan dipanaskan di dalam ketuhar pada suhu 160-170°C selama 2 jam. H 2 10%) . Balang anaerobik (plastik atau logam)/bekas berbentuk silinder 2.sejurus sebelum GasPak digunakan. Pada balang anaerobik yang menggunakan mangkin yang perlu dipanaskan dengan arus elektrik atau api.

Buka salah satu kepala salur gas dan hubungkan dengan tiub ke sebuah pam vakum dan kemudian sedut keluar udara di dalam balang sehingga terbentuk ruang hampa gas sepenuhnya. Tanggalkan semua tiub penyambung pada balang dan tutup lubang kepala salur gas dengan pita selofan. 7. Buka kepala salur gas kedua ini dan salurkan gas ke dalam balang sehingga terisi penuh kemudian tutup dengan rapat. Gunakan balang anaerobik yang terpakai (atau bekas plastik berbentuk silinder yang mempunyai dua lubang kecil pada penutupnya).53 TATACARA 1. Eramkan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37°C selama semalaman. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam bekas ini dan kemudian tutup rapat dengan bantuan pencengkam penutup tersebut. NOTA Penutup bekas yang digunakan mesti berbentuk bulat kerana bentuk ini mempastikan ia tidak ditembusi . Tutup rapat kepala salur gas pertama ini dan sambungkan sebuah tiub pada kepala kedua yang menghubungkannya dengan tangki silinder gas campuran. 5. 3. 6. 4. 2.

Prosedur ini akan mengelakkan kemungkinan lilin yang sedang menyala daripada terjatuh dari tempatnya semasa tin dipindahkan. Bekas logam dengan penutup berbentuk bulat (tin susu tepung) 2. Slaid mikroskop TATACARA 1. Lekatkan sebatang lilin kepada sebuah slaid kaca mikroskop. Tatacara Balang Lilin dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida BAHAN 1. Gunakan tin dengan penutup berbentuk bulat supaya tin dapat ditutup dengan rapat. 2. 3. Nyalakan lilin tersebut dan masukkannya ke dalam bekas. 2. 3.udara. Keadaan atmosfera yang dicapai di dalam balang lilin adalah CO . Sebatang lilin 3. 4. NOTA 1. Pastikan saiz tin yang digunakan tidak terlalu kecil supaya terdapat sedikit ruangan untuk menempatkan lilin yang menyala pada jarak yang agak berjauhan dengan piring Petri. Tutup tin dengan rapat dan biarkan sebentar sebelum tin dieramkan supaya lilin terpadam dengan sendirinya. Tempatkan lilin berjauhan dengan piring Petri yang mengandungi media yang telah diinokulasi.

Dengan adanya alat ini pengeraman kultur bakteria (ataupun kultur sel) di dalam atmosfera CO 2 adalah lebih mudah dilakukan di samping kehadiran ruang yang boleh memuatkan lebih banyak kultur. NOTA 1.2 5%. Instrumentasi adalah di luar skop buku ini dan haruslah mengikuti arahan dengan teliti di dalam buku operasi (manual) yang dibekalkan 54 bersama-sama dengan alat ini. Tatacara Menggunakan Inkubator Karbon Dioksida dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida Inkubator CO 2 merupakan suatu alat yang lumrah didapati di makmal mikrobiologi. Alat inkubator CO . Apa yang akan dibentangkan di sini hanyalah beberapa nota mengenai jenis inkubator CO 2 dan penggunaan alat ini.

5. 4. Oleh yang demikian. Pastikan juga terlebih dahulu apa yang akan dikeluarkan daripada inkubator CO 2 . 2. Sistem ini mengelakkan pembaziran gas. Alat inkubator CO 2 yang mempunyai sensor jenis inframerah membolehkan paras CO 2 di da-lam inkubator kembali ke paras asalnya dengan lebih cepat berbanding dengan sensor jenis konduktiviti termal (haba).2 yang mempunyai jaket air adalah lebih cekap dalam menstabilkan suhu dan melambatkan penurunan suhu jika bekalan elektrik terputus. ia lebih sesuai bagi inkubator yang kerapkali dibuka. 3. Rancangkan terlebih dahulu dalam tempoh masa kerja. apa yang akan disimpan atau dikeluarkan daripada inkubator CO 2 ini supaya dapat mengelak daripada terlalu kerap membuka-nya. Alat inkubator CO 2 yang lebih moden mempunyai mekanisme yang menghentikan bekalan gas ini secara automatik semasa pintu dibuka dan menyambungnya semula hanya apabila pintu ditutup semula.

Keadaan pH asid dan tanpa bahan yang kaya menghalang pertumbuhan kebanyakan jenis bakteria tetapi membenarkan pertumbuhan fungus.5-2% dan mempunyai pH asid 5. aras CO 2 ditetapkan pada 7% dan kultur sel 5%. Media padat ini terdiri daripada dekstrosa 4%. Pada kultur bakteria.atau dimasukkan supaya dapat mengurangkan lamanya ia dibuka. kecuali Histoplasma capsulatum dan beberapa strain aktinomiset seperti Nocardia asteriodes . Jangan gunakan inkubator CO 2 yang sama untuk kultur bakteriologi dan kultur sel untuk mengelakkan pencemaran bersilang.1. Agar dekstrosa Sabouraud yang dicampurkan dengan cycloheximide 0. MEDIA KULTUR Media kultur utama yang digunakan untuk kultur primer fungus (pengkulturan daripada spesimen klinikal) adalah agar dekstrosa Sabouraud ( SDA) yang merupakan sejenis media dasar seperti juga agar nutrien.2. PENGKULTURAN FUNGUS 4. sama ada kontaminan (fungus saprofitik daripada alam sekitar) atau fungus patogenik. 4. 7. 6.05% dan Chloramphenicol .2.6. pepton 1% yang sesuai untuk fungus dan agar 1.

sungguhpun terdapat banyak juga fungus patogenik yang terhalang pertumbuhannya.2. 55 Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Yis Tatacaranya adalah seperti yang dilakukan dengan bakteria iaitu melalui teknik garisan ke atas plat (sila . PENGKULTURAN FUNGUS Fungus wujud dalam dua bentuk: yis dan hifa atau miselium. Agar infusi otak dan jantung dicampur 5% darah kambing biri-biri merupakan sejenis media yang diperkaya dan digunakan untuk pemencilan Histoplasma dan Nocardia . Ini merupakan suatu ujian diagnostik. manakala koloni berhifa atau miselium seperti kapas atau permaidani pada permukaan media. Media ini biasanya digunakan untuk pengkulturan dermatofit dan Candida albicans kerana spesies-spesies ini tidak sensitif terhadap kedua-dua jenis agen antimikrob tersebut. pengamatan kultur secara in situ dapat dilakukan dengan teknik kultur slaid. Media agar ini boleh dibekukan di dalam piring Petri atau tabung uji.0. Pengkulturan fungus ke atas plat agar boleh menonjolkan dua bentuk ini iaitu koloni yis kelihatan bulat dan agak lekit. Ini memberi peluang yang lebih baik kepada fungus patogenik untuk tumbuh. 4.005% mengurangkan pencemaran oleh bakteria dan fungus bukan patogenik.2. Pengkulturan Candida albicans di dalam serum lembu misalnya boleh menunjukkan penghasilan tiub germa oleh yis berkenaan. Pada fungus berfilamen.

rujuk bahagian 4.1.3) NOTA Kultur fungus dalam bentuk yis dieramkan pada suhu 37°C. Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Berfilamen BAHAN 1. Kultur koloni fungus 2. Plat agar/cerun agar 3. Jarum inokulasi 4. Penunu Bunsen TATACARA 1. Sterilkan jarum inokulasi dengan pembakaran api penunu Bunsen. 2. Masukkan jarum ke dalam koloni fungus pada tapak di antara tengah dan tepi koloni fungus. 3. Cungkilkan sedikit kultur dan letakkan inokulum ini di tengah-tengah plat agar atau tabung cerun agar. 4. Eramkan pada suhu 30°C dan/atau 37°C selama 4 minggu. NOTA 1. Untuk mengelakkan pencemaran oleh fungus khususnya dari udara, penginokulasian kultur disarankan dilakukan di dalam kabinet “biohazard” kelas 2 yang memberi perlindungan kepada pengguna, fungus yang dikulturkan serta alam sekeliling. 2. Inokulum daripada tapak di antara pertengahan dan tepi koloni yang diambil, kerana koloni yang

di tepi mungkin terlalu muda dan belum bersporulasi atau membentuk spora, manakala di bahagian pertengahannya pula mungkin sudah agak tua dan „steril‟, atau tidak mengandungi spora atau badan pembuahan (fruiting body) lagi. 3. Sungguhpun suhu bilik (25°C) digunakan sebagai suhu pengeraman oleh beberapa makmal, perlulah diingat bahawa dalam hal ini, pertumbuhan fungus adalah lebih lambat. Tatacara Membuat Kultur Slaid BAHAN 1. Kultur fungus 2. Agar dekstrosa atau agar dekstrosa kentang 3. Piring Petri 4. Balang alkohol 5. Penunu Bunsen 6. Sebatang kaca berukuran 6 cm 7. Penutup slaid 8. Slaid mikroskop 9. Air suling (steril) 10. Pisau pembedahan (steril) 11. Dawai inokulasi lurus 56 TATACARA

1. Bakarkan sebatang kaca berukuran 6 cm di bahagian tengahnya sehingga menjadi lembut. 2. Bengkokkan batang kaca itu sehingga mencapai bentuk „V‟ dan biarkan sehingga sejuk di udara. 3. Sterilkan batang kaca ini dengan pembakaran alkohol. 4. Biarkannya sejuk dan letakkan di dalam sebuah piring Petri. 5. Sterilkan sekeping slaid mikroskop dengan pembakaran alkohol dan letakkannya di atas batang kaca berbentuk „V‟. 6. Potong seketul agar (agar dekstrosa, agar dekstrosa kentang) berukuran 1 cm persegi dan letakkan di atas slaid. 7. Inokulasi fungus dengan menyentuh keempat-empat sudut ketulan agar. 8. Sterilkan sekeping kaca penutup slaid dengan pembakaran alkohol dan letakkan di atas permukaan ketulan agar. 9. Tekan kaca penutup slaid supaya terdapat kontak yang baik di antara permukaan agar dan penutup tersebut. 10. Tuangkan sekitar 5 ml air suling steril ke dalam piring Petri ini untuk memberikan kelembapan yang berterusan semasa pengeraman kultur. 11. Tutup plat Petri dan eramkan pada suhu bilik. 12. Letakkan piring Petri di atas pentas mikroskop dan amati pertumbuhan fungus dari masa ke

masa. 13. Apabila struktur reproduktif mulai terlihat, lepaskan penutup kaca (yang mempunyai pertumbuhan fungus pada permukaannya) daripada ketulan agar dan amati dengan sediaan pelekapan basah lactophenol cotton blue. 14. Amati juga fungus yang tumbuh pada permukaan slaid dengan pelekapan basah lactophenol cotton blue. NOTA 1. Dalam tatacara ini, 4 objek iaitu batang kaca berbentuk „V‟, slaid mikroskop, penutup slaid dan jarum inokulasi disterilkan dengan pembakaran api atau alkohol. Tunggu sehingga objek yang disterilkan menjadi sejuk sebelum meneruskan dengan prosedur selanjutnya. 2. Semasa pengambilan inokulum, pastikan jarum dimasukkan tepat ke dalam koloni supaya inokulum mengandungi bahagian vegetatif fungus bersama bahagian aerialnya (yang mengandungi spora). 3. Pastikan air di dalam piring Petri yang memberikan kelembapan kepada atmosfera ruangan kultur slaid sentiasa ada dan tidak sampai kering dan tambah jika perlu. 4. Dalam penyediaan pelekapan basah, jangan tekan penutup slaid kerana ini boleh mengakibatkan struktur konidia terpisah daripada hifa. Tatacara Kultur yang Merangsang Penghasilan Tiub Germa

2. 2 jam dan 3 jam. Penutup slaid 7. Slaid mikroskop 6. Masukkan 0. 4.5 ml serum lembu (steril) ke dalam satu tabung uji. dan amati penghasilan tiub germa di bawah mikroskop. Serum lembu (steril) TATACARA 1. Buat pelekapan basah selepas 1 jam. Eramkan pada suhu 37°C selama 3 jam di dalam penganggas air. PERHATIAN Tiub germa akan kelihatan sebagai filamen yang muncul daripada blastospora tanpa adanya penyempitan mahupun pembengkakan pada bahagian-bahagian tertentu di sepanjang filamen tersebut.BAHAN 1. Jarum inokulasi 5. Masukkan 1 koloni yis ke dalam serum dan leraikan sel-sel dari koloni dengan menggoncanggoncangkan jarum inokulasi di dalam serum. Dengan penyempitan Tanda penyempitan NOTA . 57 3. Penganggas air 4. Tabung uji 3. Kultur yis 2.

2. . beberapa faktor lain seperti suhu pengeraman dan umur koloni juga mempengaruhi tekstur koloni fungus. Di samping jenis media. pigmentasi pada fungus sering kali tidak digunakan sebagai ciri pengesahan utama spesies-spesiesnya kerana ciri ini umumnya tidak stabil atau berubah. di dalam struktur itu sendiri. Pastikan ampaian yis yang disediakan tidak tebal kerana inokulum yang besar akan mengurangkan bilangan sel yang menunjukkan tiub germa (10 5 – 10 6 sel/ml adalah kepekatan optimum).1. Serum yang digunakan kali pertama harus diuji dengan suatu strain Candida albicans yang telah dipastikan boleh mengeluarkan tiub germa. sekalipun daripada strain yang sama. adalah penting jenis media pertumbuhannya juga disebutkan kerana fungus boleh mempamerkan ciri yang berbeza-beza menurut jenis media yang digunakan. Pigmentasi pada permukaan fungus biasanya dihasilkan oleh spora dan hifa. manakala pigmentasi pada bahagian dasar koloni ditentukan melalui pigmen hifa vegetatif dan pigmen larut yang meresap ke dalam agar.3.2. 4. CIRI-CIRI KOLONI FUNGUS Dalam catatan mengenai morfologi koloni fungus. Walau bagaimanapun.

PERHATIAN Dalam pengamatan fungus pada kultur plat agar. seboleh-bolehnya elakkan daripada membuka penutup Petri/botol. Tofografi: Mendatar dan berlipat secara terpencar Mendatar dan tepian bulat menyeluruh 58 Mendatar dan berlipat tak teratur Mendatar dan tepian bergerigi Bertimbun dan ala-tombol Bertimbun dan bahagian tengahnya tertekan Menaik ala-butang Kraterforme hingga ke bentuk plikatil Berkerut Serebriforme (serupa otak) 2. tetapi juga mereka yang berada di dalam ruangan yang sama. Morfologi Keseluruhan Koloni Fungus 1. Tekstur: Krim (seperti rupa koloni yis) seperti tekstur lilin Berserbuk . Bagi sesetengah individu ini boleh menimbulkan alahan yang serius. kerana ini akan menyebabkan terjadinya aerosol yang mengandungi spora fungus yang akan bertebaran di udara dan boleh tersedut oleh bukan sahaja orang yang sedang mengkajinya.

Oleh itu kita perlu menumbuhkan sel-sel tertentu terlebih dahulu untuk .3. Pigmentasi: (permukaan dan dasar koloni) Berbeza bergantung kepada umur dan jenis fungus Istilah Bahasa Malaysia – Bahasa Inggeris tepian bulat menyeluruh entire edge tepian bergerigi fringed edge berlipat tak teratur irregular folding tengahnya tertekan depressed center ala-tombol knob-like ala-butang button-like menaik raised ala-tekstur lilin glabrous ala-baldu velvety 59 4. virus hanya boleh beraplikasi di dalam sel hidup. PENGKULTURAN VIRUS Berbeza dengan bakteria dan fungus.Berkapas Bergranul (berpasir/berbutir) seperti baldu 3. sel yang dapat ditumbuhi dan dibiakkan in vitro boleh merupakan suatu sumber „media‟ untuk pembiakan virus. Oleh demikian.

Antibiotik juga dicampurkan ke media untuk mengawal daripada pencemaran serta pertumbuhan mikrob.1.3. Fenol merah digunakan sebagai penunjuk pH. Media Maklumat tentang kesesuaian sesuatu media untuk sesejenis kultur sel boleh didapati dari buku maklumat yang dikeluarkan oleh syarikat yang memasarkan media kultur berkenaan atau dari artikel jurnal. Serum (biasanya serum lembu) diperlukan untuk pengkulturan sel dan sistem fisiologik ini memerlukan suatu sistem pengawalan pH iaitu sejenis larutan tampan.dijadikan kultur bagi pembiakan virus. Jika sesuatu jenis media yang berkepekatan 10X didapati dalam bentuk cecair. Larutan ini dicampurkan dengan asid amino dan vitamin serta glukosa sebagai sumber tenaga. Aspek-aspek mengenai pertumbuhan sel secara in vitro ini dikenal se-bagai kultur sel. maka ia dipilih dan . 4. Media ini mengekalkan pH. tekanan osmotik dan membekalkan tenaga. 1. Media ini umumnya didapati dalam bentuk serbuk atau cecair dan dalam kepekatan 1X atau 10X. KULTUR SEL DALAM VIROLOGI Media Kultur Sel Semua media yang digunakan dalam kultur sel atau tisu pada asasnya mengandungi suatu campuran tiruan yang terdiri daripada garam-garam tak organik yang disebut larutan garam seimbang atau larutan garam fisiologik.

2 µm. serum lembu yang menjadi pilihan. Apabila hendak digunakan media dikeluarkan dari simpanan dan biarkannya pada suhu bilik buat seketika dan kemudian buatkan suatu pencairan berkepekatan 1X dan campurkan bahan-bahan yang diperlukan untuk pertumbuhan.diutamakan daripada bentuk lainnya. Pastikan serum fetus lembu yang diperolehi mempunyai jangka hayat simpanan yang panjang. . Media mesti disterilkan melalui penyaringan dengan penyaring membran berukuran liang 0. Pastikan semua media serbuk dilarutkan sehingga kelihatan betul-betul jernih. Jika media berbentuk serbuk. Media yang pekat boleh disimpan di dalam bekas-bekas yang lebih kecil. Eramkan serum lembu di dalam penganggas air pada suhu 50°C selama 30 minit untuk menghapuskan bahan atau faktor-faktor yang terdapat di dalamnya yang boleh menghalang pertumbuhan sel apabila digunakan nanti. terutama disebabkan ia bebas daripada antibodi yang mungkin dapat menghalang pengkulturan virus dalam kultur sel. Agih-agihkan media ini dalam isipadu 10 atau 20 ml di dalam botol universal dan simpan beku. 2. pada suhu – 20°C jika boleh. Gunakan serum fetus lembu kerana serum ini berbeza dengan serum lembu dewasa atau anak lembu. ia terlebih dahulu dilarutkan di dalam air suling supaya mencapai kepekatan 5X atau 10X. Serum Jenis serum yang diperlukan bergantung kepada jenis kultur sel. Dalam kebanyakan kultur sel.

Kepekatan natrium bikarbonat yang digunakan adalah bergantung . dan tarikh diagihkan. Larutan penampan ini digunakan dalam sistem tertutup (bekas kultur ditutup rapat) yang diseimbangkan dengan udara atau sistem terbuka (seperti piring Petri) yang diseimbangkan dengan atmosfera yang mengandungi kadar CO 2 yang tinggi seperti di dalam inkubator CO 2 . 60 3. Sistem Penampan pH yang Digunakan di dalam Media Kultur Sel Pertumbuhan sel haiwan di dalam media kultur sel yang lengkap biasanya adalah optimum apabila media ditampan dalam julat pH 7. Larutan penampan pH yang sering kali digunakan di dalam media kultur sel adalah natrium bikarbonat . Pastikan sampel dari sesuatu botol itu steril dan dapat menampung pertumbuhan kultur sel dengan baik dengan membandingkannya dengan serum yang diketahui memberikan hasil yang baik.4. Labelkan nombor pengeluaran (batch number).Agihkan ke dalam isipadu 10 atau 20 ml. Simpan beku.2 hingga 7. seharusnya pada suhu – 20°C.

Gaskan dengan CO 2 sehingga warna media menjadi oren.kepada jenis media. Agih-agihkannya ke dalam botol yang kemudian ditutup rapat. Larutan tampan HEPES (asid N-2-Hidroksietilpiperazin-N‟-2-etanasulfonik) yang berfungsi sebagai zwitterion boleh digunakan sebagai larutan penampan menggantikan natrium bikarbonat dalam sistem terbuka dan ia digunakan pada kepekatan mutlak 20 mM . Jika natrium bikarbonat diperlukan juga sebagai nutrien maka kepekatannya seharusnya tidak melebihi 10 m M (0.2 µm atau diautoklaf pada 20 tekanan paun setiap inci (pound per square inch: psi). Larutan natrium bikarbonat disterilkan melalui penyaringan ataupun diautoklaf.5 ml fenol merah 0.4%. Simpan pada suhu bilik. Antibiotik juga .85 g/l).6g NaHCO 3 di dalam 95. Persediaan Natrium Bikarbonat Larutkan 5. Saringkan dengan menggunakan penyaring membran berukuran liang 0. 5.5 ml air suling dan campurkan 0. Adalah sesuai jika ia disediakan dalam kepekatan 10X yang seterusnya hanya perlu dicairkan menjadi 1X apabila hendak digunakan nantinya di dalam media lengkap. 4.

0 ml dan disimpan beku. Kedua-dua agen antimikrob ini disediakan dalam kepekatan 100X di dalam air suling steril (jika dibekalkan dalam bentuk serbuk). Kepekatan yang sesuai digunakan adalah Gentamicin 30 µg/ml dan Amphotericin B 5 µg/ml. disaring melalui penyaring dengan saiz liang 0. Air suling (steril) 6. Pipet bersukat (steril) TATACARA Gentamicin dan Amphotericin B ( Fungizone). Serum fetus lembu 3. diagih-agihkan dalam isipadu 1. Larutan antibiotik dicairkan 1:100 di dalam media. NaHCO 3 5. gunakan gred yang ditentukan khusus untuk kultur sel. Antibiotik yang sesuai adalah antibakteria berspektrum luas (aktif terhadap bakteria Gram-positif dan Gram-negatif) dan berkesan terhadap mikoplasma. Amphotericin B adalah agen antifungus. Tatacara dalam Persediaan Media Kultur Sel BAHAN 1. Antibiotik (Gentamicin dan Amphotericin B) 4. Gentamicin adalah agen .2 µm. Media kultur sel 2. Untuk kedua-dua jenis antibiotik ini. Bekas (steril) 7.Antibiotik dicampurkan ke media kultur untuk menghalang pertumbuhan mikrob.

Tuangkan media ke dalam 1 botol steril jika kesemua kandungannya diperlukan (jika hanya sebahagian sahaja media yang diperlukan. gunakan pipet steril untuk memindahkannya). serum dan antibiotik mencair pada suhu bilik di atas meja. salah satu komponen sesetengah media. Biarkan reagen yang disimpan beku seperti media. PERHATIAN Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau kelas 2. adalah tidak stabil dalam bentuk cecair. Campurkan serum supaya mencapai peratus kepekatan yang diperlukan. 3. L-glutamina. goncangkannya terlebih dahulu untuk menentukan kehadiran pencemaran yang berat yang ditandai dengan kekeruhan pada media tersebut. 5. Jangan masukkan ke dalam penganggas air untuk mengelakkan pencemaran.1. Biasanya media pertumbuhan memerlukan 5 – 10% serum dan media pengekal 0 – 2%. 2. NOTA 1. Lapkan permukaan luar setiap bekas dengan tuala kertas sehingga kering. Oleh yang demikian. Sebelum media digunakan. 6. bagi media yang seharusnya mengandungi L-glutamina. Tempoh simpanan media yang mengandungi serum adalah 4 minggu. 7. asid amino ini perlulah ditambahkan ke dalamnya jika media tersebut disimpan lebih daripada 2 . Simpan media pertumbuhan atau pengekal pada suhu 4°C. Campurkan isipadu air suling yang diperlukan diikuti dengan larutan penampan dan antibiotik. 61 4.

Larutan tripsin-versena 8. 2. Penyaring kasar (steril) 11. Larutan salin ditampan fosfat (phosphate buffered saline: PBS ) yang mengandungi 30 µg/ml Gentamicin dan Fungizone 5 µg/ml 10. Serum yang dibeku dan dicairkan kadangkala mengandungi serpihan-serpihan yang mendap di dasar botol. Kelalang kon 7. Tatacara untuk Tripsinisasi Tisu Seluruh BAHAN 1. TRIPSINISASI Tripsinisasi adalah proses peleraian tisu atau sel selapisan kepada sel-sel individu menggunakan enzim tripsin. Alat pengaduk magnet 5. Gunting bengkok dan tajam 4. Etanol 70% 9. Seluruh haiwan atau tisu 2. Mikroskop cahaya jenis terbalik . Gunting 2 pasang 3.minggu. tetapi seboleh-bolehnya elakkan daripada menggunakannya. Magnet disaluti silikon/teflon 6. Ini bukanlah suatu pencemaran.

Tambahkan air suling sehingga mencapai satu liter. Campurkan kedua-dua jenis larutan ini dalam isipadu yang sama. Larutan tripsin dan versena Larutkan 1. .12.2g KCl. 1.3.0g NaCl.4% versena di dalam PBS .0 % tripsin dan 0. Agih-agihkan larutan ini ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (suhu mencapai aras 115°C) selama 15 minit. PBS tanpa kalsium dan magnesium Larutkan 8. Bekas kultur sel PERSEDIAAN 1. Aturkan nilai pH larutan kepada 7. Simpan pada suhu bilik.2 µm. Simpan pada suhu 4°C.15g Na 2 HPO 4 . 0.2g KH 2 PO 4 di dalam 950 ml air suling. 62 2. Sterilkan dengan menggunakan penyaringan membran dengan liang 0. 0.

Pindahkan potongan tisu ke dalam sebuah kelalang kon yang mengandungi magnet yang disaluti teflon atau silikon. Tambahkan tripsin baru dan aduk semula. 9. 5. Emparkan suspensi sel pada 400 g selama 15-30 minit dan leraikan mendapan sel di dalam media yang sesuai dan lakukan perhitungan hidup. Tuangkan larutan tripsin 10 minit selepas proses ini bermula. . Lap kulit bahagian yang terdedah ini dengan etanol 70% dan bedah/potong untuk mendapatkan organ yang diperlukan. Keluarkan organ dan letakkan di dalam piring Petri di mana ia dipotong menjadi serpihanserpihan kecil berukuran 2 mm3. Masukkan larutan tripsin-versena (lebih kurang 20 ml setiap 1g tisu). Tatacara berikut dilakukan dalam keadaan aseptik dengan menggunakan peralatan yang steril. Saring suspensi sel melalui penyaring kasar untuk memisahkan sel-sel dari serpihan tisu-tisu besar. Goyang piring Petri perlahanlahan untuk membersihkan potongan-potongan tisu. 2. Aduk kandungan kelalang dengan pengaduk magnet pada suhu 37°C. 7. Dari masa ke masa tuangkan sel yang telah dileraikan daripada tisu dan simpan pada 4°C. Tambahkan tripsin baru setiap kali ini dilakukan. 3. 8. Bunuh haiwan yang berkenaan dan letakkan menelentang supaya bahagian tubuh atau tapak di mana pembedahan akan dijalankan terdedah. 6.TATACARA 1. 10. Masukkan PBS yang mengandungi antibiotik dan antifungus. 4.

3. Semua alat dan reagen yang digunakan disterilkan terlebih dahulu. Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel Sesetengah jenis kultur sel wujud sebagai suspensi di dalam bekas kultur. Sebelum sel ini boleh dipindahkan ke tempat lain atau separuh daripadanya dikeluarkan untuk mengelak kesesakan yang akan menghalang pertumbuhan dan menjejaskan keupayaannya untuk hidup (viabilitinya). Elakkan daripada terjadinya pembentukan buih (frothing) semasa tisu diaduk. 2. Ubah kepekatan sel menjadi 2 x 10 5 sel/ml media pertumbuhan dan kulturkan di dalam bekas kultur. NOTA 1.11. kelalang tidak diletakkan secara langsung di atas plat pemanas tetapi dimasukkan ke dalam sebuah bikar berisi air yang ditempatkan di atas plat pemanas tersebut. manakala majoriti akan melekat pada permukaan bekas kultur dan tumbuh membentuk satu lapisan sel. Suhu 37°C dapat dicapai dengan melakukan proses peleraian di dalam bilik panas atau dengan menggunakan alat pengaduk magnet yang juga berfungsi sebagai plat pemanas. Tatacara untuk Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel BAHAN . sel mestilah ditanggalkan dari permukaan bekas kultur. Dalam pilihan kedua.

Campurkan 2 jenis larutan ini dalam isipadu yang sama. PBS tanpa kalsium dan magnesium (steril) 63 3. Kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau 2 PERSEDIAAN 1. 1. Mikroskop cahaya jenis terbalik 5. Campuran tripsin 0.0g NaCl. 2. PBS tanpa kalsium dan magnesium Larutkan 8. Simpan pada suhu 4°C.1.2g KH 2 PO 4 . Sterilkan dengan menggunakan penyaring membran dengan liang 0-2 µm. 0.2g KCl. Pipet bersukat (steril) 4.15g Na 2 HPO 4 dan 0.5% dan versena 0.2% 2.25% dan versena 0. Larutan tripsin dan versena Larutkan tripsin 0.4% di dalam PBS .

Tambahkan air suling sehingga mencapai 1 liter. Masukkan sedikit campuran tripsin dan versena dan goncangkan botol untuk meliputi ke seluruh monolapisan sel. Agihagihkan ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (115°C) selama 15 minit. Dalam masa ini. Cuci 2 kali dengan PBS : pipet PBS ke dalam bekas.di dalam 950 ml air suling. 5. Pipet media pertumbuhan (isipadunya bergantung kepada saiz bekas) ke dalam bekas dan cuci sel daripada permukaan bekas dengan memancutkan media daripada pipet yang dipasang dengan bal penyedut getah untuk meleraikan kelompok sel. goncangkan bekas kultur supaya PBS meliputi sel monolapisan. amati sel dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah menjadi bulat dan/atau telah tanggal. 3. 8. 2.3. Aturkan kepekatan suspensi sel supaya mencapai 1 x 10 5 sel/ml media pertumbuhan. Keluarkan media secara aseptik dengan pipet bersukat. Hitunglah suspensi sel dengan hemositometer. TATACARA 1. Biarkan botol berdiri tegak selama 1 hingga 2 minit sebelum cecair yang mengalir ke dasar bekas dipipet keluar. . Aturkan nilai pH larutan kepada 7. pipet keluar PBS . Simpan pada suhu bilik. Eramkan pada suhu 37°C selama 1 hingga 5 minit. 6. 7. 4.

tutup penutup bekas kultur dengan rapat. kultur sel ini dieramkan di dalam inkubator CO 2 yang mengandungi CO 2 pada kadar 5%. Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan lambat atau perlahan. 81. NOTA 1.5% N 2 ) ke dalam bekas kultur menggantikan udara di dalam ruang bekas sebelum penutupnya ditutup dengan rapat. 11. 10% O 2 . Goncangkan bekas kultur sel sebelum diletakkan di dalam inkubator supaya sel-sel bertaburan sama rata. Sel akan mengalami kerosakan atau mati jika didedahkan terlalu lama. Pada sistem terbuka. 10. alirkan campuran gas (9% CO 2 . Masa yang diambil untuk penanggalan sel daripada permukaan dalam bekas bergantung kepada jenis kultur yang terlibat. Amatilah selalu dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah . Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan pesat.9.

Semasa mencuci sel-sel daripada permukaan bekas kultur. Jika didedahkan terlalu lama kepada tripsin.berbentuk bulat. Peganglah kultur sel hampir tegak lurus dan ketuk permukaan bekas kultur untuk menentukan sama ada sel boleh ditanggalkan (dilepaskan) daripada permukaan atau belum. Tetapi. 2. peganglah bekas supaya permukaan di mana terdapatnya sel adalah di atas. 5. untuk menghalang aktiviti tripsin tersebut. Aktiviti tripsin ini boleh dihapuskan oleh serum. Dalam keadaan tertentu. media yang mengandungi serum digunakan dalam mensuspensikan sel selepas sel-sel ditanggalkan. dalam keadaan yang telah menjadi kebiasaan seperti pertumbuhan sel di dalam bekas kultur yang sama ukurannya. 3. kepekatan sel mestilah ditentukan terlebih dahulu supaya jenis sel dengan kepekatan yang diperlukan boleh ditetapkan. 64 4. kultur sel dari satu bekas kultur dibahagikan (dibelah) kepada dua hingga empat bahagian (bergantung kepada jenis kultur sel) dan setiap bahagian dikulturkan secara berasingan di dalam bekas kultur . tatacara nisbah perpisahan (split ratio) boleh digunakan. Pencairan dengan media pertumbuhan boleh mengurangkan kepekatan tripsin dan versena kepada suatu aras yang tidak akan menjejaskan pertumbuhan sel. sel-sel akan mati. Pada posisi ini lapisan sel lebih mudah diamati dan sel-sel ditanggalkan dengan lebih mudah kerana tidak diselaputi oleh lapisan media semasa dicuci. Dalam cara ini. Oleh itu. sel tidak perlu dicuci melalui emparan dan supernatannya dituang keluar untuk menghilangkan campuran tripsin dan versena tersebut. Jika campuran tripsin dan versena yang digunakan sedikit sahaja.

2.1% tripan biru di dalam PBS 3. Hitunglah sekurang-kurangnya 100 sel (ini bermakna bahawa pada suspensi tidak mengandungi banyak sel. maka sel-sel di dalam kesemua 25 SES kecil dihitung. Simpan di dalam peti beku. .1% tripan biru di dalam 10 ml air suling.1% di dalam PBS Larutkan 0. Suspensi sel 2. Saringkan melalui kertas turas. Hemositometer Neubauer mempunyai sembilan segi empat sama (SES ) yang besar terletak di tengah. Larutkan 1/10 dengan 10X PBS sebelum digunakan. Tatacara Menghitung Sel dengan Menggunakan Hemositometer BAHAN 1. Tetapi jika suspensi mengandungi banyak sel maka perhitungan sel-sel di dalam kesemua SES kecil tidak perlu dilakukan lagi. 3. TATACARA 1. SES ini dibahagikan pula kepada 25 SES yang dipisahkan oleh tiga garis. 0. Hemositometer jenis Neubauer 4. Apa yang perlu hanyalah menghitung sel-sel di dalam SES kecil yang terletak di tengah dan di keempat-empat sudut hemositometer tersebut sahaja).yang mempunyai isipadu yang sama dengan bekas induk. Hitung sel di dalam SES yang kecil ini. 4. Mikroskop cahaya PERSEDIAAN Tripan biru 0.

penjimatan kos. tenaga dan masa boleh dicapai jika kultur sel ini disimpan sewaktu tidak digunakan. ada kemungkinan kultur sel ini boleh terhapus disebabkan kemusnahan akibat pencemaran oleh bakteria atau fungus. walaupun tidak jumlah sel yang dihitung x 25 x 10 4 x faktor pencairan jumlah SES yang digunakan . sel yang menyentuh atau melintang garis sebelah kiri dan atas setiap segi SES dihitung atau diambil kira.5. Satu sebab lain yang penting dalam hal penyimpanan kultur sel ini. Dalam hal ini. atau ia mengalami kematian kerana keadaan pertumbuhan yang tidak sesuai. Bilangan sel ml -1 = Kriopengawetan Sel yang Hidup Oleh kerana kultur sel adalah suatu hidupan. Sebagai panduan. manakala yang menyentuh atau melintang garis bawah dan kanan SES tidak dihitung atau diabaikan. Untuk mengelakkan daripada kehilangan sel-sel ini sebahagian dari-pada kultur sel berkenaan haruslah disimpan dalam keadaan yang boleh mengekalkan viabilitinya tanpa pertumbuhan. 6. Sebab kedua kenapa penyimpanan sel ini diperlukan adalah kerana sesuatu kultur sel itu hanya digunakan pada masa-masa tertentu sahaja.

Kriovial 8. Tatacara Kriopengawetan Sel yang Hidup BAHAN 1. Tangki nitrogen cair untuk menyimpan spesimen 10. Peti beku suhu – 70 ° C 9. Kultur simpanan ini lazimnya masih mempunyai ciri-ciri yang dikehendaki kerana ia merupakan kultur sel yang mempun-yai riwayat pensubkulturan yang awal.02%) 3. kultur ini boleh digantikan dengan kultur sel lain yang disimpan. Alat emparan . Campuran larutan tripsin (0.65 begitu ketara. Media pertumbuhan 4. Apabila sesuatu sel dikulturkan untuk jangka masa yang berlarutan terdapat kemungkinan ciri-cirinya akan berubah: yang paling sering dikesan ialah sensitivitinya terhadap virus menjadi berkurangan.5%) dan versena (0. PBS (steril) 5. Dimetil sulfoksida (DMSO ) 7. Jika perubahan yang tidak sesuai berlaku dalam kultur sel yang sedang digunakan. Kultur sel 2. Tripan biru 6. ialah untuk mengekalkan ciri-ciri kultur sel tertentu.

Keluarkan supernatan dan masukkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO 10%. 7. 2. Campurkan dan hitung jumlah sel untuk menentukan kadar sel hidup. Mikroskop cahaya 12. Emparkan pada 200 g selama 15 minit. Kapas 15. . pensterilan ke atas bahan adalah tidak perlu kerana DMSO dianggap steril. 5. ms 62-64).11. TATACARA 1. 6. 3. Kertas timah nipis PERSEDIAAN Dimetil sulfoksida (DMSO ) 10% v/v di dalam media pertumbuhan Tambahkan 1 ml DMSO ke dalam 9 ml media yang mengandungi serum 10% pada hari kultur sel akan disimpan. Sediakan suspensi sel di dalam media yang mengandungi serum 10% (lihat tatacara tripsinisasi sel. Mikroskop cahaya terbalik 14. Atursuaikan supaya kepekatan sel adalah 2 x 10 6 sel setiap ml. Pindahkan 1 ml ke dalam setiap kriovial. Pindahkan ke dalam 1 tabung atau botol steril dan tambahkan media jika perlu. 4. Dalam hal ini.

2. 10. 3.) dan tarikh. nombor pindahan sel (cell passage no. Adalah penting suhu kultur sel yang disimpan dikurangkan secara beransur-ansur. kemudian balut dengan kertas timah dan masukkan ke dalam satu kotak polistirena (5-10 cm tebal). 5. tukarkan media kultur sekitar 24 jam sebelum sel diproses. Balutkan dengan kapas. adalah lebih selamat . Pilih kultur sel yang sihat. Simpan pada lantai peti bek – 70 ° C semalaman dan segera pindahkan ke dalam bekas yang mengandungi nitrogen cecair. jika ada. Oleh kerana amat sukar untuk mengekalkan suhu peti beku pada – 70 ° C.8. Adukkan suspensi sel sejurus sebelum diagihkan ke dalam botol kriovial untuk memperoleh suspensi sel yang sama rata. Labelkan kriovial dengan nama sel. Jika sel mengambil masa yang lama untuk mencapai keadaan di atas. Jangan tambah DMSO kepada suspensi sel secara langsung ke dalam media pertumbuhan. iaitu dalam fasa tumbesaran logaritmanya dan hampir mencapai lapisan sel yang meliputi keseluruh permukaan bekas kultur. NOTA 1. 6. 4. 9. 66 Tambahkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO yang tersedia kepada sel-sel selepas diemparkan. Ini dicapai dengan kriovial dibalut dengan kapas serta kertas timah dan disimpan di dalam kotak polistirena.

Sebelum sesuatu kumpulan kultur sel yang disimpan dianggap sempurna. Kultur sel yang disimpan pada – 70 ° C harus dikulturkan selepas 6 bulan sebelum disimpan semula. Media pertumbuhan 3. Lagipun. manakala ampul biasanya harus ditutup melalui penaupan dengan pembakaran api. 9. Untuk mengelakkan penyejatan. 8. Tatacara Mengkulturkan Semula Sel yang Dikrioawetkan BAHAN 1. Penganggas air 37° C . Walaupun ampul kaca atau polipropilen boleh digunakan sebagai bekas untuk simpanan. Amalan ini dipraktikkan kerana sel haiwan yang disimpan pada suhu – 70 ° C tidak boleh mengekalkan viabilitinya dalam masa yang begitu lama. bekas nitrogen cair disimpan di dalam bilik sejuk dan dipastikan nitrogen cair ditambahkan semula dalam tempoh masa yang sesuai mengikut kekerapan bekas tersebut dibuka. pastikan salah satu bekas kultur sel daripada kumpulan ini boleh dihidupkan semula tanpa terjadinya sebarang pencemaran mikrob. 7. kriovial lebih mudah dikendalikan kerana dilengkapi dengan penutup. Kriovial kultur sel 2.jika sel disimpan di dalam nitrogen cair. kadangkala ampul yang dimasukkan ke dalam air untuk pencairan boleh meletup jika penaupan tidak dilakukan dengan sempurna. Kita juga harus menyedari bahawa ada kemungkinan suhu – 70 ° C tersebut tidak dicapai di seluruh ruangan simpanan di dalam peti beku.

2. Keringkan permukaan luar ampul dan lap dengan alkohol. Jika ampul kaca digunakan. Bekas kultur sel 5. 5. Pegang kriovial di dalam penganggas air sehingga semua pembekuan menjadi cair. Keluarkan sebuah kriovial dari tempat simpanan dan serta-merta pindahkannya ke dalam penganggas air. 7. selepas sel telah melekat pada permukaan bekas kultur pipet keluar media dan gantikan dengan media baru. Semasa kandungan kriovial dicairkan. 6. Eramkan pada 37 °C. Selepas beberapa jam hingga semalaman. Sama ada kriovial digoncang untuk menggalakkan pembekuan suspensi sel supaya lebih . pastikan aras air tidak mencapai penutupnya untuk mengelak kemungkinan air menyentuh bahagian mulut kriovial dan berlakunya pencemaran. Pindahkan kandungan kriovial atau ampul ke dalam sebuah bekas kultur dan campurkan media pertumbuhan ke dalamnya. 3. Inkubator suhu 37° C TATACARA 1. Keluarkan kriovial/ampul sejurus selepas suspensi sel menjadi cair. 67 2. tudung ampul dengan sehelai kain dan pakai kaca mata pelindung kerana ampul yang tidak ditaup dengan sempurna boleh meletup. 4. 8.4. NOTA 1. Pipet steril 6.

pada peringkat awal tempoh pertumbuhan sel. atau udara di dalam ruangan bekas kultur digantikan dengan campuran gas yang mengandungi CO 2 5%.cepat mencair atau tidak bergantung kepada jenis sel tertentu kerana terdapat jenis sel yang viabilitinya terjejas akibat goncangan dengan kuat. Suspensi virus 2. PBS (steril) . 4. Lap keseluruhan bahagian luar bekas dengan alkohol untuk mengelakkan pencemaran. 3. Media kultur dibuang dan digantikan dengan yang baru secepat boleh supaya DMSO dan selsel yang mati yang boleh menjejaskan pertambahan sel-sel yang hidup disingkirkan. Larutan garam seimbang Hank dengan antibiotik (pencair virus) 3. Untuk memperoleh pemulihan kultur sel yang lebih cepat. Tatacara Inokulasi Kultur Sel dengan Virus BAHAN 1. eramkan kultur di dalam inkubator CO 2 . 5. Kultur sel dalam bentuk monolapisan penuh 4. atau di dalam bekas khas yang mengandungi CO 2 5%.

3. Cuci 2 kali dengan PBS . Masukkan media pertumbuhan dan eramkan pada suhu yang sesuai.i yang terlalu tinggi digunakan ada kemungkinan sebahagian besar virus yang tak lengkap dihasilkan. m.) yang sesuai. 4. 6. Jika kultur berada di dalam bekas kaca. Jika banyak kultur sel perlu diinokulasi dalam masa yang sama. Amati kehadiran kesan sitopatik (untuk virus sitopatik) setiap hari atau selang sehari. Masukkan suspensi virus ke dalam bekas kultur dan sebarkan ke seluruh lapisan sel. kandungannya bolehlah dituang. 5. 7. media boleh dikeluarkan dengan pipet yang dihubungkan kepada sebuah pam udara. Permukaan bekas kaca dibakar sebelum dan sesudah cecair dituang. Pergandaan infektiviti.o. Goncangkan bekas setiap 10-15 minit untuk menyebarkan semula suspensi virus ke seluruh monolapisan. Lakukan pencairan virus supaya mencapai pergandaan infektiviti (multiplicity of infection. Jika m. NOTA 1. 2.i. Eramkan pada suhu yang sesuai (biasanya pada suhu 37 ° C) selama 30-60 minit. 3. adalah nisbah partikel virus berinfeksi dan sel. 9. 8. 2. Keluarkan media dari bekas kultur.o.TATACARA 1. Amati kultur sel dan pilih kultur yang hampir atau baru mencapai monolapisan yang lengkap atau penuh (seluruh permukaan bekas kultur sel diliputi dengan sel). Penjerapan virus dilakukan dalam isipadu cecair yang kecil untuk memudahkan kontak di .

4. Pilih suhu pengeraman yang optimum untuk sesejenis virus yang dikulturkan. 5. Pada kebanyakan virus haiwan. PENGKULTURAN VIRUS DENGAN MENGGUNAKAN TELUR BEREMBRIO Telur ayam berembrio hidup merupakan suatu sistem yang digunakan untuk pengkulturan beberapa jenis virus. suhu pengeraman adalah 37° C sungguhpun pada virus respiratori suhu yang lebih rendah.3.2. tapak yang sesuai untuk suntikan. Sama ada inokulum virus dikeluarkan selepas tempoh penjerapan atau tidak bergantung kepada keperluan. Penjerapan boleh dilakukan pada suhu bilik atau pada suhu pengeraman kultur. yakni 35 ° C merupakan suhu yang optimum. Tiga jenis tapak pada telur – membran amnion. Pengamatan Telur Melalui Transiluminasi (Penyuluhan) Embrio telur dipastikan hidup dengan cara transiluminasi yang diberi istilah candling dalam bahasa . Sebelum inokulasi dilakukan adalah penting untuk menentukan terlebih dahulu sama ada telur yang akan digunakan tersebut mempunyai embrio yang masih hidup dan kedua. Bekas kultur sel digoncang bukan sahaja untuk menyebarkan virus tetapi juga untuk mempastikan seluruh sel monolapisan sentiasa diliputi cecair untuk mengelak daripada kekeringan. 68 4. membran alantoik dan membran korioalantoik – boleh digunakan bergantung kepada jenis virus yang terlibat.antara virus dan sel. 6. Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet biohazard kelas 2. 7.

Pita selofan 5. TATACARA 1. Gunting kedua-dua penghujung kon ini supaya tepinya menjadi sama rata dan garis pusat bahagian yang lebih besar adalah sama dengan ukuran kepala lampu dan bahagian kecil adalah lebih kurang sama dengan ukuran penghujung telur yang lebih bulat. Tatacara Penyuluhan Telur BAHAN 1. Pada masa ini. yang digunakan ialah kotak cahaya atau lampu suluh yang telah diubahsuai. Kertas manila 4. Dengan ini cahaya lampu akan ditujukan ke luar melalui lubang yang lebih kecil. Gunting 6. Pilih tempat yang gelap. Pena penanda PERSEDIAAN Alat untuk penyuluhan Gulungkan sekeping kertas manila supaya berbentuk kon. Gunakan pita selofan untuk melekatkannya dan mengekalkan bentuk ini. Lampu suluh 3. Perkukuhkan kontak ini dengan menambahkan pita selofan. Pasangkan penghujung kon yang besar kepada kepala lampu suluh. Telur berembrio 2.Inggeris kerana pada zaman dahulu cahaya lilin digunakan untuk tujuan ini. .

Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong 5. 4. 3. khususnya mata embrio yang besar dan kehadiran ruang udara. Nyalakan lampu dan amatilah bahagian dalam telur. Semua ini adalah tanda yang menunjukkan bahawa embrio tersebut masih hidup. Pastikan salur darah korioalantoik telur berembrio kelihatan jelas sekali dan embrio bergerak-gerak. 69 Suntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik Pertumbuhan virus di dalam membran alantoik digunakan untuk virus influenza dan paramiksovirus yang telah disesuaikan beraplikasi dalam keadaan makmal. Telur berembrio berumur 10 hingga 12 hari 2. Etanol 70% 4. NOTA Pilih telur yang bersih dan mempunyai cangkerang yang berwarna putih pudar untuk memudahkan pengamatan bahagian dalamnya. Pita selofan . Tekan lubang terowong lampu suluh kepada cangkerang telur.2. bentuk embrio juga jelas kelihatan. Jarum (28 gauge) dan picagari 3. Tatacara Penyuntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik BAHAN 1.

Etanol 70% 4. Tutup celah dengan pita selofan. Jarum panjang (11/4) dan picagari berisipadu 1 ml 3. 7. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi virus di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. 3. Gerudi satu lubang atau celah yang kecil pada cangkerang pada tapak yang ditandakan untuk mendedahkan membran cangkerang. Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong . 6. Tatacara Penyuntikan Virus di dalam Ruang Amniotik BAHAN 1.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup.TATACARA 1. Lap tapak celah tersebut dengan etanol. 5. Suntikkan 0. Telur berembrio berumur 10-12 hari atau 12-14 hari 2. 2. 4. Tandakan dengan pena tanda satu tapak yang agak berjauhan dengan sebarang salur darah. Suntikan Virus ke dalam Ruang Amniotik Cara ini digunakan untuk pemencilan primer (kali pertama virus ditumbuh dalam keadaan makmal) virus influenza dan mumps.

2. Ketuk dan pecahkan cangkerang tepat di atas ruang udara berkenaan dengan pemegang gunting dan guntingkan satu lubang besar sehingga mencapai pinggir ruang udara. 4. Tandakan dengan pena penanda tapak ruang udara.5.1 ml inokulum ke pundi amniotik dengan menusukkan jarum ke tapak yang berhampiran dengan kepala embrio. Tutup lubang dengan pita selofan. Swab steril TATACARA 1. 8. Pita selofan 6. 3. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. Suntikkan 0. 5. Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantoik Pengkulturan virus di atas membran korioalantoik membolehkan perbezaan di antara poksvirus . Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama dua hingga tiga hari pada suhu 37°C. Terbalikkan telur untuk membersihkan membran cangkerang daripada cebisan-cebisan cangkerang. Lapkan membran cangkerang dengan parafin cecair supaya membran cangkerang menjadi jernih. Gunting kecil dengan penghujungnya bengkok 8. 70 6. 7. Parafin cair 7.

Telur berembrio berumur 10 sehingga 12 hari 2. 5. 3. Bal penyedut getah besar 8. Lap tapak celah dengan etanol. 4. Letakkan setitis larutan salin yang steril di atas celah.jenis variola dengan vaksinia dan di antara virus herpes simplex taip 1 dengan taip 2 berdasarkan morfologi poks yang dihasilkan. Tekan bal penyedut getah besar dengan sepenuhnya dan lekapkan penghujungnya pada . Pena penanda 7. Jarum (28 gauge) dan picagari 3. Larutan salin 0. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup.85% (steril) TATACARA 1. Pita selofan 6. Gerudikan satu lubang kecil di kawasan ruang udara. Tatacara Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantik BAHAN 1. Tandakan dengan pena penanda satu tapak yang tidak mendekati mana-mana salur darah. 2. Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong 5. Gerudikan satu celah cangkerang yang kecil pada tapak yang ditandakan tersebut untuk mendedahkan membran cangkerang sahaja. 7. 6. Etanol 70% 4.

. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman 2.lubang di ruang udara. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. Tutup celah dengan pita selofan. Botol (steril) 5. Lepaskan tekanan bal getah. 8. 3. Pipet Pasteur 4. supaya membran korioalantoik di bawah celah tersedut dan kelihatan terjatuh atau terlepas daripada cangkerang dan suatu pundi udara terbentuk. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20° C selama 1 jam. 9. 2. 11. Lap cangkerang di bahagian atas ruang udara telur dengan etanol. Pecahkan cangkerang di atas ruang udara dan guntingkan satu lubang besar. Tatacara Mengumpulkan Cecair Alantoik BAHAN 1.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. Etanol 70% 71 TATACARA 1. Gunting 3. Suntikkan 0. 10.

Pipet Pasteur 4. NOTA Telur disejukkan untuk membunuh embrio serta mengecutkan salur darah supaya pengumpulan cecair yang mengandungi virus dilakukan tanpa pencemaran dengan sel darah merah. Pegang pundi amniotik dengan forseps dan tembusinya dengan pipet Pasteur untuk mengeluarkan cecair amniotik daripada ruang amniotik.85% (steril) TATACARA 1. 2. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20 ° C selama 1 jam. Tatacara Mengumpulkan Cecair Amniotik BAHAN 1.5 ml larutan salin yang steril. NOTA Jika cecair amniotik didapati kurang. Botol (steril) 5. tambahkan 0.4. Forseps 3. Tanggalkan pita selofan yang menutupi ruang udara. 3. Gunakan pipet Pasteur untuk menolak embrio dan pundi kuning telur ke tepi dan kumpulkan cecair alantoik dengan menggunakan pipet Pasteur lain. Larutan salin 0. Sedut dan . Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman 2.

Pegang membran korioalantoik ini dan gunting di sekelilingnya sehingga semuanya terlepas daripada cangkerang. Tatacara Pengambilan Membran Korioalantoik BAHAN 1.keluarkan cecair daripada pipet beberapa kali sebelum dikumpulkan. 2. Tanggalkan pita selofan yang menutupi tapak suntikan pada permukaan telur. Lap tapak suntikan dengan alkohol. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20 ° C selama 1 jam. Gunting 3. 3. Larutan salin 0. Forseps 5. Pecahkan cangkerang di atas celah dengan bahagian pemegang gunting dan potong cangkerang sehingga ke pinggir ruang udara palsu. 5. 72 4. Cuci membran korioalantoik yang dikeluarkan di dalam larutan salin steril dan .85% (steril) 6. 6. Piring Petri 4. Etanol 70% TATACARA 1. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman 2.

faktor ini dengan spesifisiti sesejenis enzim terhadap substrat tertentu membolehkan bakteria dikenal pasti dalam keadaan sekeliling yang terkawal seperti di makmal. 73 5. sesuatu aktiviti biokimia ditentukan oleh enzim-enzim yang dihasilkan oleh bakteria. beberapa kumpulan bakteria tertentu menghasilkan bahan pertengahan metabolisme yang spesifik seperti asetil-metil-karbinol berikutan fermentasi glukos yang boleh digunakan untuk membezakan kumpulan bakteria yang menghasilkannya daripada yang tidak. Dalam pengenalpastian bakteria. Daripada segi genetik. Hasilan aktiviti enzim ini boleh berupa gas atau terbitan bukan gas. kehadiran rekahan atau celahcelah di dalam agar atau melalui tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna dan tidak larut (misalnya H . Kehadiran sesejenis enzim dikenal pasti secara tidak langsung melalui tindakannya terhadap sesuatu substrat. UJIAN MAKMAL DALAM PENGENALPASTIAN BAKTERIA Bakteria mempunyai kisaran aktiviti biokimia yang amat luas. PENGENALPASTIAN AGEN MIKROB 5. Misalnya. Gas yang dihasilkan dikesan secara langsung melalui pengamatan penghasilan gelembung gas atau secara tidak langsung melalui penggantian cecair di dalam tiub Durham dengan gas. Aktiviti yang luas ini dikawal oleh faktor genetik serta alam sekelilingnya.rentangkannya di dalam piring Petri.1. yang merangkumi proses kemusnahan dan proses pembinaan (atau sintesis).

Andrade: neutral – kuning pucat. jenis dan kuantiti asid campuran (mixed acids) – pelbagai jenis asid organik yang berasal dari asid piruvik yang dihasilkan serta kemampuan menghasilkan gas. Penghasilan asid ditunjukkan oleh perubahan warna indikator pH (sesuatu jenis pewarna) yang bergantung kepada jenis indikator yang digunakan (contoh. bromthymol blue: neutral – hijau. Hasilan bukan gas ditunjukkan oleh tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna. alkali – biru). Bakteria berbeza dalam jenis karbohidrat yang boleh digunakan sebagai sumber tenaga melalui proses fermentasi. Dalam fermentasi karbohidrat beberapa produk dihasilkan termasuk pelbagai jenis asid dan gas. perbezaan ini merupakan salah satu ciri penting dalam pengenalpastian spesis bakteria. asid – kuning. Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas Fermentasi adalah suatu proses kimia yang melibatkan oksidasi-reduksi. Proses in berlaku dalam keadaan anaerobik. dan substrat organik merupakan penerima terakhir elektron. Akan tetapi penurunan pH boleh dicapai . Enzim juga boleh ditunjukkan dalam tindakan serologi yang menghasilkan kompleks enzim (sebagai antigen) – antibodi yang muncul sebagai presipitasi. Dalam ujian bakteriologi. asid – merah. iaitu tanpa oksigen bebas. fermentasi dipastikan secara tidak langsung melalui pengamatan perubahan warna indikator pH akibat penghasilan asid. alkalin – tanpa warna.2 S). Oleh yang demikian.

Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan biarkan sehingga dingin. istilah gula meliputi senarai substrat berkenaan. Walau bagaimana pun. Sentuhkan pada 1 koloni bakteria pada media plat. 2. Oleh yang demikian. iaitu bukan fermentasi.melalui proses penggunaan karbohidrat yang bukan anaerobik. Dalam hal ini sungguhpun tidak semua substrat yang digunakan dalam ujian fermentasi adalah gula. Gelung dawai 4. Kultur bakteria pada plat agar 2. misalnya manitol adalah sejenis alkohol. istilah „fermentasi‟ digunakan secara longgar dalam konteks ujian bakteriologi diagnostik. Tatacara Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas BAHAN 1. ataupun dari menggunakan substrat bukan karbohidrat. serta dilengkapi dengan tiub Durham) TATACARA 1. 3. tidak semua ujian yang digunakan untuk menguji kebolehan sesejenis bakteria mendegradasikan secara enzimatik „gula‟ menjadi produk asid merupakan proses fermentatif. Inokulasikan kultur ini ke dalam media cecair yang mengandungi sejenis gula. Penunu Bunsen 74 Media cecair gula: (media dasar yang mengandungi jenis-jenis gula atau karbohidrat tertentu dan indikator pH. Media cecair gula di dalam tabung reaksi atau botol Bijou 3. Ulangkan .

6. Jika pada mulanya tiub ini hanya dipenuhi dengan media. Penghasilan asid Ujian positif: Media berwarna merah Ujian negatif: Tanpa perubahan warna media . 7. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN 1. Tutup rapat media yang telah diinokulasi dan tunggangkan sekali supaya keseluruhan tiub Durham dipenuhi media dan sama sekali tidak mengandungi gelembung udara di dalamnya. Tegakkan semula botol media. Biasanya media ini juga disertakan sejenis indikator pH. gas ini akan mengganti media yang dimaksudkan dan akan terperangkap di dalam tiub maka kehadiran ruang tanpa media menunjukkan kehadiran gas. Eramkan pada 37°C selama semalaman. 3.inokulasi ke dalam media yang mengandungi gula lain. 5. Tiub Durham adalah sebuah tabung/tiub kecil yang boleh dimuatkan di dalam botol Bijou dan diletakkan terbalik (dengan mulutnya di bawah). NOTA 1. Media cecair terdiri daripada gula 1% di dalam air pepton 1%. setelah penghasilan gas oleh mikroorganisma. 4. Amati perubahan warna media dan penghasilan gas (yang terperangkap di dalam tiub Durham). 2. Catatkan hasil selepas 24 jam pengeraman dan seterusnya pengeraman dilanjutkan selama beberapa hari sebelum hasilnya dinyatakan sebagai negatif.

8 (keadaan asid).1%) . laktos atau sukros atau kombinasi daripada ketiga-tiga gula tersebut.Pentafsiran hasil positif: Bakteria dapat menfermentasikan gula berkenaan 2. sebagai penunjuk fermentasi. adalah fenol merah yang akan menjadi kuning pada pH 6. Gula yang digunakan adalah glukosa (0.4 iaitu pH alkali maka warna agar kelihatan oren-kemerahan atau merah.0%) dan sukrosa (1. Media TSI ditampan pada pH 7. Penghasilan gas Ujian positif: Ruang kosong di dalam tiub Durham Ujian negatif: Tiub Durham masih dipenuhi media Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan gas semasa menfermentasi gula Ujian Tiga Gula-Besi Media tiga gula-besi atau Triple Sugar Iron ( TSI) merupakan sejenis media campuran yang digunakan untuk membezakan spesies bakteria dalam famili Enterobacteriaceae dengan berdasarkan kepada kemampuan spesies-spesies ini untuk memfermentasi gula dekstros. Bahagian permukaan agar (agar condong) (slant) adalah terdedah kepada udara maka wujud dalam keadaan aerobik. Indikator pH. bahagian puntung agar (di bahagian dasar tabung) (butt) dilindungi dari udara dan wujud dalam keadaan anaerobik (walaupun bukan 100%). . penghasilan gas dan penghasilan hidrogen sulfid.0%). Sebaliknya. laktosa (1. Media TSI disediakan dalam agar condong.

pH asid di bahagian permukaan agar akan berubah semula menjadi alkali (ungu-merah) manakala bahagian puntung agar (bahagian dasar tabung) akan kekal asid (kuning) kerana di situ amina yang dihasilkan tidak mencukupi untuk mengatasi kesan asid. walaupun amina dihasilkan kuantiti asid yang . atau kedua-duanya difermentasi kuantiti asid yang dihasilkan daripada salah satu di antara kedua gula ini adalah besar kerana konsentrasi kedua-dua gula ini adalah tinggi iaitu masing-masing 1%. amina dihasilkan dan lama kelamaan (18-24 jam selepas pengeraman) kuantitinya mencapai aras yang mampu mengatasi kesan kuantiti rendah asid yang dihasilkan.75 Peptid dan asid amino yang berasal dari pepton di dalam media TSI didegradasikan melalui proses dekarboksilasi oksidatif kepada amina. Jika bakteria yang diinokulasi tidak menfermentasi karbohidrat.1%). oksigen di dalam udara tidak dapat sampai maka proses dekarboksilasi oksidatif adalah pada tahap minimum. sejenis terbitan alkali. kuantiti ini mencukupi untuk bahagian permukaan dan puntung agar menjadi kuning. Jika laktosa atau sukrosa. asid tidak dihasilkan dan warna merah akan kekal di seluruh media. kuantiti asid yang dihasilkan adalah terhad kerana kuantiti glukosa yang digunakan adalah rendah (0. Di bahagian puntung. Proses in dipercepatkan oleh bakteria yang tumbuh di bahagian permukaan agar. Jadi. Tetapi di permukaan agar yang terdedah kepada oksigen udara. Jika bakteria hanya boleh menfermentasi glukosa. Walau bagaimanapun.

Sterilkan keseluruhan dawai lurus melalui pembakaran dan biarkan supaya sejuk. Tarik semula dawai dan gariskan organisma di atas permukaan agar yang condong. Kultur bakteria 2. Penghasilan gas ditunjukkan dengan kehadiran gelembung gas atau bahagian puntung agar akan kelihatan pecah-pecah. . Eramkan semalaman dan teruskan selama 48 jam (jika perlu).dihasilkan terlalu besar untuk perubahan pH kembali kepada keadaan alkali maka bahagian condong mahupun bahagian puntung agar akan tetap berkeadaan asid (kuning). Penunu Bunsen (Reagen TSI: Dari sumber komersial) TATACARA 1. 3. Hidrogen sulfid yang dihasilkan akan bertindakbalas dengan ferrous sulfat dan suatu presipitasi hitam (ferik sulfid) akan terbentuk di dalam media. 2. Cerun agar TSI di dalam tabung uji 3. 5. Dawai inokulasi lurus (dawai lurus) 4. Sukrosa dicampurkan untuk menyaringkan spesies Salmonella dan Shigella kerana kedua-dua bakteria ini tidak menfermentasi sukrosa atau laktosa. Tusukkan inokulum menembusi cerun agar TSI di dalam tabung sehingga ke dasarnya. Tatacara Ujian Tiga Gula Besi BAHAN 1. 4. Sentuhkan penghujung dawai kepada koloni bakteria.

Sungguhpun tindak balas kimia asas dalam pengesanan indol adalah sama. manakala Proteus. Walau bagaimanapun. reagen Kovac merupakan yang paling popular digunakan di masa kini. Indol bertindak dengan para-dimetil-aminobenzaldehid dan menghasilkan pewarna rosindole (warna merah tua).PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Rujuk kepada Jadual 5. Kultur bakteria . maka untuk membezakan spesies-spesies ini ujian urease dilakukan. 2. terdapat beberapa jenis reagen untuk mengesannya.1 76 NOTA 1. urease-positif). Oleh kerana sesetengah spesies Proteus dan beberapa spesies lainnya boleh memberikan reaksi pada TSI yang serupa dengan Salmonella ataupun Shigella. Tabung TSI harus ditutup secara longgar sahaja selepas diinokulasi supaya udara dapat masuk ke dalam tiub kultur untuk membolehkan berlakunya oksidasi dan perubahan balik condong agar daripada asid (kuning) ke alkali (ungu-kemerahan). (Salmonella dan Shigella adalah urease-negatif. Tatacara Ujian Indol BAHAN 1. Ujian Indol Bakteria menghasilkan indol (benzopyrrole) daripada asid amino triptofan akibat tindakan enzim triptofanase.

morganii.P. proteus rettgeri.Arizona. Pseudomonas.Ed-wardsiella Kuning Kuning Fermentasi glukosa & – – Hafnia.M. Proteus rettgeri. Proteus mira bilis.Klebsiella. sonnei. P. Morganella morganii.2. Citrobacter.1 Pola Hasil Tindakan Bakteria ke atas TSI Rupa Agar Penghasilan Tafsiran Kemungkinan Condong Puntung Gas H 2 S Bakteria (Jenis) Merah* Merah Tiada fermentasi gula – – Alcaligenes. Edwardsiella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + + Salmonella typhimurium. Pro-teus mirabilis. vulgaris. Broth triptofan di dalam tabung uji JADUAL 5. .S. Arizona. S. Serratia Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + – Salmonella cholera-suis.Staphylococcus. schottmuelleri. Mimae Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa – – Shigella dysenteriae. Shigella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa _ + Salmonella typhosa. Providencia. Air pepton di dalam tabung uji 3.S.vulgaris.enteriti-dis paratyphi.Citro-bacter. S.Providencia. enter itidis.

Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. laktosa atau sukrosa E. cloacae. . Reagen Kovac PERSEDIAAN Reagen Kovac Masukkan 10 g p-dimetilaminobenzaldehid ke dalam 150 ml alkohol jenis amilalkohol. Arizona * Atau tiada perubahan dan warna agar seperti warna sebelum diinokulasi 77 4. Pipet Pasteur (steril) 5. Reagen ini berwarna kuning muda. Serratia Kuning Kuning Fermentasi glukosa & + – Aerobacter aerogenes. P. coli. Biarkan sehingga dingin. Panaskan di dalam penganggas air pada 56°C sehingga larut. Reagen ini stabil selama beberapa tahun. mirabilis. isoamilalkohol atau butilalkohol.laktosa atau sukrosa Streptococcus. laktosa atau sukrosa Citrobacter. Proteus rettgeri. A. .Providencia Kuning Kuning Fermentasi glukosa & + + Proteus vulgaris. Dengan perlahan dan hati-hati campurkan 50 ml HCl pekat (Lakukan di dalam kabinet asap). TATACARA 1. Simpan di dalam botol gelap dengan penutup kaca di dalam peti beku. Klebsiella.

NOTA Di samping reagen Kovac. Ciri ini digunakan untuk membezakan di antara spesies bakteria yang menghasilkan asid „kuat‟ (strong acids) dalam kuantiti besar dan spesies . 3. 4.2. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth triptofan. media diuji biasanya dicampurkan kloroform sejenis bahan kimia yang toksik. dalam ujian yang menggunakan reagen Ehrlich. 6. Ujian indol yang dilakukan dengan reagen Kovac tidak memerlukan kloroform.4. Ujian Metil-Merah Metil-merah pada pH neutral dan asid sederhana (nilai 7-6) berwarna kuning tetapi menjadi merah pada pH yang agak rendah iaitu di bawah nilai 4. Goncang dan biarkan selama 10 minit.5 ml) reagen Kovac (berwarna kuning). Eramkan selama 24 – 48 jam. 5. reagen Ehrlich juga boleh digunakan dalam ujian Indol. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah tua Ujian negatif: Kuning Pentafsiran hasil positif: Penghasilan indol akibat degradasi protein triptofan oleh bakteria. Amatilah pembentukan lapisan warna (cincin) pada permukaan suspensi. Walau bagaimanapun. Masukkan 5 titis (~ 0.

Tatacara Ujian Metil-Merah BAHAN 1. Air pepton 3. Campurkan air suling sehingga 500 ml.bakteria yang tidak berbuat demikian. Bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi asid campuran dalam katabolisme glukosa biasanya menghasilkan kuantiti pelbagai jenis asid organik (formik. Kultur bakteria 2.4 manakala bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi butilena glikol tidak menghasilkan asid. kepekatan komponen media yang sesuai untuk ujian metilmerah serta ujian Voges Proskauer telah ditentukan dan media untuk kedua-dua ujian ini kemudian dipasarkan sebagai media MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer). TATACARA 1. laktik) yang mencukupi untuk menurunkan pH media di bawah nilai 4. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. Dalam penciptaan ujian metil-merah. asetik. . Metil-merah (Media MR-VP: Dari sumber komersial) 78 PERSEDIAAN Reagen metil-merah Larutkan 0. Broth MR-VP di dalam tabung uji 4.1 g metil-merah di dalam 300 ml etanol 95%.

Inokulum yang tebal adalah penting supaya kuantiti asid yang besar dapat dihasilkan untuk membolehkan ujian dibaca berikutan pengeraman selama 18-24 jam.5 ml broth MR-VP. 3. 6. 2. 5. 4. Ujian Voges-Proskauer Asetil-metil karbinol (atau asetoin) adalah metabolit pertengahan/perantaraan dalam proses penghasilan butilena glikol pada fermentasi glukosa.5 ml kultur. Jika hasil yang kurang pasti didapati. NOTA 1. Goncang dan biarkan seketika. Amatilah pembentukan warna di permukaan media PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Warna merah jambu sehingga merah. warna pertengahan di antara kuning dan merah tidak dianggap positif. Pentafsiran hasil positif: Menunjukkan penghasilan asid dalam kuantiti tinggi hasil fermentasiglukosa oleh bakteria. Ujian negatif: Warna kuning. Eramkan selama 24 jam pada 37°C. Dalam . Warna oren. ujian diulangi ke atas kultur dengan pengeraman yang lebih lama. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam 0.2. 3. Masukkan 2 titis metil-merah ke dalam setiap 0. Penghasilan asetoin merupakan salah satu kriteria dalam fermentasi glukosa oleh bakteria yang digunakan dalam pengenalpastian.

Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. 3.0 ml broth MR-VP. KOH (40% yang mengandungi 0. Masukkan pula 0. 6. Eramkan pada 37°C selama 24 – 48 jam. Goncang dengan baik dan biarkan selama 5 – 20 minit. Kultur bakteria 2. Air pepton 3. 4. 5. a -naftol 5% dalam alkohol pekat 95% 5. Tambahkan 0. Masukkan dua titis suspensi ini ke dalam 1. Broth MR-VP (0.6 ml larutan a -naftol. Tatacara Ujian Voges-Proskauer BAHAN 1. Diasetil kemudian bertindak dengan kumpulan NH 2 bebas daripada kumpulan guanidina (kreatin adalah sumber kumpulan guanidina) untuk menghasilkan kompleks berwarna merah. Sensitiviti ujian ini dipertingkatkan dengan penambahan a -naftol.5% kreatin) TATACARA 1.2 ml larutan KOH. . diasetil. 2.kehadiran KOH dan oksigen (dari udara) asetoin secara spontan (tidak melibatkan enzim) dioksidasi menjadi metabolit pertengahan.5 ml) di dalam tabung uji 4.

digunakan untuk membezakan streptokokus kumpulan A Lancefield daripada streptokokus b-hemolitik lainnya. Ujian negatif: Tiada perubahan atau kuning. sejenis antibiotik. Amati pembentukan warna.7. Kadangkala tindak balas mengambil masa yang lama (~ 2 jam) sebelum kemunculan warna yang dimaksudkan. Pentafsiran hasil positif: dalam proses fermentasi glukosa oleh sesetengah bakteria. 79 PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah. Ujian ini Kehadiran asetil-metil-karbinol (asetoin). suatu hasil pertengahan menunjukkan . NOTA Oleh kerana suatu perubahan warna akan berlaku di antara permukaan campuran kultur dan reagen. Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin Sensitiviti terhadap Bacitracin. Kajian yang telah dilakukan menunjukkan bahawa kebanyakan streptokokus kumpulan A (93-98%) sensitif terhadap konsentrasi rendah Bacitracin dan sebaliknya streptokokus bukan kumpulan A amnya resistan. Sensitiviti terhadap Optochin (ethylhydrocuprein hydrochloride) pula digunakan untuk membezakan Streptococcus pneumoniae daripada streptokokus a -hemolitik lainnya. maka elakkan daripada menggerak-gerakkan tabung sehingga membolehkan warna tersebut muncul segera selepas reagen dicampurkan dan tabung digoncang supaya sebati.

streptokokus selain daripada kedua spesies ini menunjukkan keresistanan sama ada terhadap Bacitracin bagi kumpulan b-hemolitik atau terhadap Optochin bagi kumpulan a -hemolitik menurut ujian yang dilakukan di atas. Streptokokus a -hemolitik yang lainnya pula tumbuh sehingga mencapai ke pinggir disk atau kadangkala hanya menghasilkan zon rencatan pertumbuhan yang biasanya dibaca sebagai resistan. . Streptococcus pyogenes (atau streptokokus kumpulan A Lancefield) sensitif terhadap Bacitracin. adalah sensitif terhadap Optochin dan menghasilkan zon rencatan pertumbuhan di sekeliling disk tersebut. Tatacara Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin BAHAN 1. Agar darah 3. manakala Sebaliknya. Disk Bacitracin dan disk Optochin Streptococcus pneumoniae sensitif terhadap Optochin. Swab (steril) 4. Jarum/forseps steril 6.korelasi yang rapat dengan ujian kelarutan hempedu. Kesimpulannya. Pneumokokus ( Streptococcus pneumoniae ) selain larut di dalam hempedu. Gelung dawai 5. Kultur bakteria 2.

Ulangi kaedah di atas dengan menggunakan kultur streptokokus a -hemolitik dan disk Optochin. Ambil 1 koloni bakteria streptokokus b-hemolitik dan buat garisan-garisan pada permukaan agar darah. Amati zon perencatan pertumbuhan bakteria. 6. 2. 5.(Reagen Bacitracin dan Optochin: Dari sumber komersial) TATACARA 1. 3. Pengeraman seharusnya dilakukan dalam CO 2 5-10% untuk mencapai pertumbuhan optimum. Tekan disk pada permukaan agar dengan forseps atau jarum steril supaya tidak tanggal. Eramkan pada 37°C selama 18 sehingga 24 jam. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif Bacitracin: Zon kepekatan perencatan pertumbuhan. Letakkan secara aseptik dengan menggunakan jarum atau forseps steril 1 disk Bacitracin ke atas agar sejurus sebelum pengeraman kultur. 80 4. saiz yang bergantung kepada . Sapukan permukaan agar dengan menggunakan swab steril pada arah 90° daripada arah garisan pertama bakteria untuk mendapatkan lapisan bakteria yang tersebar dan sama rata di atas permukaan media. 7.

Tatacara Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V BAHAN 1. Kultur bakteria 2. juga dinamakan koenzim I) supaya pertumbuhan bakteria dapat berlaku. V. Pentafsiran hasil positif: Bakteria sensitif terhadap Bacitracin/Optochin. Koloni spesies bakteria yang menunjukkan pertumbuhan di sekeliling disk yang mengandungi faktor tumbesaran X. Disk dengan 15 mg Optochin: 18 mm atau lebih dari tepi disk. ia tidak mempunyai kemampuan untuk mensintesis faktor berkenaan dalam kuantiti yang optimum. dan X bersama V tertentu menandakan ia memerlukan faktor tersebut dan sebaliknya. code DD1: 5 mm atau lebih zon perencatan yang diukur dari tepi disk. Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V Disk kertas yang diserap dengan faktor tumbesaran digunakan untuk membezakan antara spesies bakteria genus berdasarkan sama ada media dasar memerlukan penambahan faktor tumbesaran X (hemin) dan faktor V ( NAD. Ujian positif Optochin: Disk Optochin jenama Oxoid. Spesies Haemophilus dan Bordetella boleh dikenal pasti . Agar nutrien Haemophilus. Disk dengan dua unit Bacitracin: 15 – 20 mm garis pusat (termasuk garis pusat disk).reagen yang digunakan.

2. Disk faktor X. Jarum/forseps (steril) 7. tepat pada jam 8. V.3. Air pepton 4. 4. 3. XV (Disk faktor X. Eramkan pada suhu 37°C selama 18 dan teruskan sehingga 48 jam. jika perlu dalam atmosfera CO 2 5-10%. disk faktor V : tepat pada jam 4. V dan XV : Dari sumber komersial) TATACARA 1. manakala disk XV. Buat suspensi murni bakteria di dalam air pepton. Inokulasi seluruh permukaan plat agar nutrien dengan bakteria berkenaan dengan menggaris-gariskannya menggunakan gelung dawai. Gelung dawai 6. Swab (steril) 5. Amati kehadiran atau tidaknya pertumbuhan di sekeliling disk. Letakkan disk-disk yang mengandungi faktor tumbesaran secara aseptik di atas agar kira-kira 1 atau 2 cm daripada pinggir media dalam pola sebagai berikut: misalnya disk Faktor X : tepat pada titik jam tangan yang menunjukkan jam 12. 5. 81 PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN .

Penggunaan Sitrat Koser mencipta sejenis media broth asas yang mengandungi natrium ammonium fosfat sebagai sumber tunggal nitrogen. dan natrium sitrat sebagai sumber tunggal karbon. hasilnya ditafsir berdasarkan berlakunya kekeruhan pada media broth akibat pertumbuhan bakteria. Seterusnya. Elakkan daripada menggunakan agar darah. NOTA 1. 2. pertussis . manakala golongan koliform tidak. Perhatikan bahawa media yang digunakan berupa media minimum. Simmons mengubahsuai media Koser . Bakteria golongan aerogen boleh menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. apatah lagi agar coklat dalam melakukan ujian ini. Dalam ujian yang menggunakan media Koser. manakala yang tidak memerlukan faktor X atau V adalah B. iaitu agar nutrien yang mana spesies-spesies yang diuji tidak mungkin tumbuh padanya tanpa penambahan faktor tumbesaran tertentu.Pertumbuhan di sekeliling disk dengan: Faktor X dan XV – memerlukan faktor X sahaja Faktor V dan XV – memerlukan faktor V sahaja Faktor XV sahaja – memerlukan faktor X mahupun faktor V Bakteria yang memerlukan faktor X dan V atau salah satu di antaranya adalah spesies Haemophilus. Simpan disk pada suhu 4°C dan bukan pada 0°C.

tetapi sama ada terdapat atau tidaknya pertumbuhan bakteria pada garis inokulasi di atas media. pertussis ++++ 82 Ujian Penggunaan Sitrat BAHAN 1. hemolyticus –+++ H.1 Keperluan bakteria untuk faktor X dan V Pertumbuhan Berlaku Dengan Faktor: Spesies – XVX V H. influenzae –––+ H. parainfluenzae ––++ H. yang kelihatan hijau pada pH 6. JADUAL 5. suatu tindak balas alkali berlaku dan ini ditunjukkan dengan perubahan pada warna media daripada hijau kepada biru tua.8 dan biru pada pH lebih 7.6. Kultur bakteria . bromthymol blue. dan hasil ujian dinyatakan sebagai positif untuk sitrat. ducreyi –+–+ H. Kadangkala bacaan hasil ujian tidak semata-mata berdasarkan kepada perubahan warna. mempermudahkan lagi pembacaan hasil ujian. aegyptius –––+ H. Pengubahsuaian ini membolehkan pertumbuhan bakteria dikesan dengan lebih mudah kerana dalam metabolisme karbon pada sitrat (pertumbuhan positif). Perubahan warna.tersebut dengan menambahkan agar dan indikator. dalam hal ini. Kehadiran pertumbuhan bererti kemampuan bakteria mengurai sitrat sebagai sumber karbon. parahemolyticus ––++ B.

Pentafsiran ujian positif: Kemampuan menggunakan sitrat sebagai sumber tunggal karbon. Eramkan pada 37°C selama semalaman atau 48 jam. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pertumbuhan dengan/tanpa media menjadi biru. 2. 2. Kultur yang menunjukkan pertumbuhan tanpa perubahan pH (perubahan warna) juga . NOTA 1. Ujian negatif: Tiada pertumbuhan atau media tetap hijau. Amatilah perubahan warna pada media. Sentuhkan pada koloni bakteria dengan penghujung dawai. 3. 3. jika perlu. 4. 5. Gunakan sedikit sahaja inokulum supaya semasa penginokulasian inokulum ini tidak kelihatan sama sekali pada garis inokulasi dan untuk mengelakkan reaksi positif palsu akibat bakteria yang mati membebaskan karbon dan nitrogen dalam kuantiti yang boleh menampung pertumbuhan. Elakkan daripada mengambil sebarang bahan nutrien daripada media kultur di mana inokulum diambil.2. Cerun agar sitrat Simmons di dalam botol Bijou (Agar sitrat Simmons: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Buatkan 1 garisan tipis bakteria pada permukaan agar. Sterilkan keseluruhan dawai lurus dan biarkan sehingga sejuk. Dawai lurus 3.

Terdapat beberapa jenis ujian urease dengan sensitiviti yang berbeza-beza. Ujian Urease Urea adalah substrat spesifik yang dihidrolisis oleh enzim urease kepada ammonia dan karbon dioksida. Pengeraman selama 48 jam mungkin diperlukan untuk bakteria yang lambat tumbuh supaya warna biru dapat muncul. Tahap sensitiviti ini ditentukan terutamanya oleh kandungan larutan penampan. bakteria-bakteria lain yang juga penting dalam perubatan mempunyai kemampuan untuk menghasilkan urease. Tanda kehadiran urease dapat dikesan melalui indikator pH yang menunjukkan perubahan warna media daripada oren (pH 6. Pemilihan dari segi jenis ujian ini adalah bergantung kepada kegunaannya. Walau bagaimanapun. 83 Tatacara Ujian Urease . Oleh kerana pH media boleh ditingkatkan melalui sesuatu tindak balas lain.dianggap positif kerana pada sesetengah bakteria yang lambat tumbuh keadaan tindak balas alkali tidak dapat dicapai dalam tempoh pengeraman yang ditetapkan.8) kepada merah jambu (pH 8. maka hasil positif palsu untuk urease memang terdapat.1) Ujian untuk mengesan penghasilan enzim urease oleh bakteria biasanya digunakan dalam pengenalpastian bakteria genus Proteus. Ammonia menyebabkan campuran tindak balas menjadi alkali. Untuk mengesan keadaan seperti ini ujian kawalan terhadap media yang tidak mengandungi urea diperlukan.

Broth urea di dalam botol Bijou 4. Ujian Oksidase Ujian oksidase menentukan kehadiran sitokrom C. Air pepton 3. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. Enzim oksidase sitokrom tidak bertindak secara langsung . Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth urea. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Positif: Merah. 2. Negatif: Kuning.BAHAN 1. Eramkan selama 24 jam. ujian ini hanya positif untuk bakteria yang memiliki sitokrom C. Dalam ujian oksidase tatacara Kovacs. Sitokrom adalah protein yang mengandungi heme dan merupakan enzim oksidatif dalam kitaran respiratori yang terlibat dalam fosforilasi oksidatif. 3. Pentafsiran hasil positif: Kehadiran enzim urease yang menghidrolisis urea kepada ammonia. Pipet Pasteur steril TATACARA 1. reagen oksidase adalah tetrametil-pfenilena-diamina dihidroklorida 1%. Kultur bakteria 2. sejenis enzim respiratori. Oleh yang demikian. Gelung dawai 5. Amati warna broth urea. 4.

dengan reagen oksidase. 2. Reagen oksidase (tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida 1%) 5. . Kultur bakteria 2. Ambil koloni bakteria dengan kayu aplikator dan goreskan ke atas kertas turas pada bahagian yang menyerap reagen oksidase. Sitokrom C yang direduksi (ditambah elektron) dalam tindakan ini diubah secara tidak langsung kepada bentuk yang teroksidasi oleh oksidase sitokrom yang menerima elektronnya. Kepingan kecil kertas turas Whatman No. Enzim oksidase sitokrom kemudian menggantikan elektron tersebut kepada oksigen untuk menghasilkan air dengan ion hidrogen. Kayu aplikator TATACARA 1. Letakkan sekeping kertas turas kecil di atas slaid mikroskop bersih. Ujian ini digunakan untuk membezakan streptokokus (oksidase-negatif) daripada neisseria (oksidase-positif). 1 4. Tatacara Ujian Oksidase BAHAN 1. Titiskan 2 hingga 3 titis reagen oksidase ke atas kertas turas. tetapi menyebabkan oksidasi sitokrom C yang kemudian menyebabkan oksidasi tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida sehingga membentuk sejenis bahan kimia berwarna biru yang disebut biru Wunster. Slaid mikroskop 3. 84 3.

2. Dawai nikrom juga boleh mempengaruhi hasil ujian dan memberikan hasil positif palsu. 5. Pentafsiran hasil positif: Perubahan segera ke warna biru/ungu menunjukkan bakteria memilikim sitokrom C. 4. Tatacara alternatif ujian oksidase ini adalah dengan membanjiri kultur pada piring Petri dengan reagen dan kemudian segera menyingkirkan bahan yang berlebihan ini dengan pipet. Gunakan kayu aplikator atau dawai platinum untuk mengambil koloni. Hasilnya ditunjukkan dengan perubahan warna koloni bakteria kepada warna ungu . Reagen ini mesti disediakan segar kerana sifatnya yang tidak stabil. Pastikan dan patuhi tempoh masa yang ditetapkan untuk mentafsirkan hasil ujian ini kerana pada ujian yang disimpan lama sebelum dibaca hasil positif palsu boleh berlaku kerana warna biru atau ungu boleh muncul akibat auto-oksidasi yang berlaku ke atas reagen. NOTA 1. Auto-oksidasi oleh oksigen bebas dari udara boleh berlaku dan oleh yang demikian reagen ini dengan sendirinya akan berubah menjadi biru atau ungu jika dibiarkan di udara agak lama. 3. Amati kemunculan warna dalam beberapa saat. Reagen yang baru disediakan perlu dibiarkan selama 15 minit untuk menjadi “masak” sebelum digunakan. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Kemunculan warna lavender (ungu pudar) yang cepat (dalam beberapa saat) menjadi biru/ungu. Ujian negatif: Tiada perubahan warna atau warna muncul hanya setelah beberapa minit.4.

Slaid mikroskop 4.(oksidase-positif) atau tiada perubahan warna (oksidase-negatif). Ujian Koagulase Ujian untuk menentukan penghasilan enzim koagulase oleh stafilokokus adalah suatu ujian penting dalam mikrobiologi diagnostik. Ia membezakan stafilokokus patogenik kerana berkemampuan untuk menghasilkan enzim ini. Enzim bentuk ini bertindak secara langsung ke atas fibrinogen haiwan-haiwan tertentu dan menghasilkan fibrin yang memerangkap Sebaliknya.85% 3. dan yang satu jenis lagi dirembeskan oleh sel ke dalam media atau cairan (koagulase bebas). Tatacara Ujian Koagulase Slaid BAHAN 1. Larutan salin 0. Kultur bakteria 2. koagulase yang dihasilkan secara bebas bertindak dengan protrombin untuk menghasilkan trombin. Terdapat dua jenis koagulase. daripada yang tidak menghasilkannya atau tidak patogenik. . Ujian slaid di mana penggumpalan atau pengelompokan bakteria dihasilkan dipercayai disebabkan oleh koagulase terikat yang terdapat pada dinding sel. Gelung dawai bakteria sehingga berlakunya penggumpalan/pengelompokan tersebut. yang satu terikat pada dinding sel bakteria (koagulase terikat) dan tidak bebas. yang seterusnya bertindak ke atas fibrinogen untuk menghasilkan fibrin (pembekuan).

Letakkan setitis larutan salin steril di atas sebuah slaid mikroskop yang bersih dan kering. Plasma arnab 85 TATACARA 1. 3. 4. Buatkan suspensi bakteria ini di dalam titisan salin. 2. Oleh yang demikian. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan gumpalan bakteria. Ujian negatif: Tiada penggumpalan dan suspensi bakteria kelihatan homogen. Ambil beberapa koloni bakteria dengan gelung dawai steril.5. Tambahkan setitis plasma arnab kepada suspensi dan campurkan dengan gelung dawai. dan ujian ini digunakan semata-mata untuk membezakan antara strain yang menghasilkan koagulase daripada yang tidak. NOTA 1. adalah amat penting untuk mempastikan bahawa bakteria yang diuji adalah benar-benar kultur murni stafilokokus. Gunakan plasma arnab atau manusia dan bukan spesies mamalia lain kerana kebanyakan . Mana-mana bakteria yang boleh menggunakan sitrat sebagai sumber tenaga boleh membebaskan kalsium yang akan mengakibatkan pembekuan plasma jika plasma tersebut diambil daripada darah yang bercampur sitrat. 5. 2. Goncangkan slaid dan amatilah penggumpalan (clumping) bakteria yang akan kelihatan sebagai kelompak-kelompak putih dalam masa 15 saat.

Perlu juga diperhatikan bahawa kadangkala plasma manusia yang digunakan mengandungi bahan perencat yang akan memberikan hasil negatif palsu. Plasma arnab 6. Larutan salin 0. 5. aureus yang menghasilkan hanya koagulase bebas yang tidak bertindak dalam ujian koagulase slaid. 4. Tatacara Ujian Koagulase Tabung BAHAN 1. Gelung dawai 5. Seterusnya. Pastikan koloni bakteria boleh diemulsifikasi di dalam salin supaya tidak menimbulkan masalah dalam pembacaan hasilnya nanti.85% 3. Hasil positif yang berlaku lewat atau negatif diuji semula dengan ujian koagulase tabung kerana terdapat strain S. Ujian positif palsu boleh berlaku jika penggumpalan yang berlaku lewat diambil kira. Tabung uji steril 4. Plasma perlulah diuji terlebih dahulu dengan strain kawalan positif dan negatif sebelum digunakan. Kultur bakteria 2. positif lemah dan kawalan negatif. ujian haruslah dilakukan juga ke atas beberapa jenis bakteria kawalan yang memberikan hasil positif kuat. supaya hasil ujian boleh dipercayai dan diterima tanpa ragu-ragu.plasma daripada spesies lain tidak bertindak dengan koagulase stafilokokus. Penganggas air pada 37°C . 6. 3.

Pastikan tabung tidak digoncang semasa mengamati dan membaca hasil ujian (penghasilan pembekuan) kerana ini akan mengakibatkan pembekuan menjadi terlerai dan tidak dapat . Sediakan suspensi stafilokokus di dalam larutan salin (atau gunakan kultur broth). 3. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan pembekuan. Jangan campur dengan goncangan.TATACARA 1. 86 4. Sesetengah strain stafilokokus menghasilkan enzim fibrinolisin yang akan melisis semula pembekuan plasma yang dihasilkan. Untuk mengelakkan daripada memperolehi hasil yang negatif palsu. 3 dan 6 jam dan selepas semalaman. Pembekuan jika hadir. Campurkan 1 isipadu suspensi bakteria dengan 5 isipadu larutan plasma. Sediakan 1:9 pencairan plasma arnab atau manusia di dalam larutan salin. 2. tabung haruslah diamati beberapa kali di sepanjang tempoh pengeraman. Ujian negatif: Campuran tetap cair. akan kekal di dasar tabung uji. tabung uji dicondongkan. Eramkan pada suhu 37°C di dalam penganggas air dan amati selepas 1. Campurkan dengan memutarkan tabung uji di antara kedua dua tapak tangan. Untuk memudahkan pembekuan diamati. 5. 2. jika masih negatif. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase NOTA 1.

Tatacara Ujian Katalase . Tindak balas kimia yang berlaku dalam ujian katalase adalah : 2H 2 O 2 Æ 2H 2 O + O 2 •. aureus yang kadar penghasilan koagulasenya adalah rendah maka masa yang panjang diperlukan untuk koagulase mencapai aras yang memberi hasil yang positif (hasil positif yang lewat) Ujian Katalase Katalase adalah enzim dengan bahagian (moieti) yang mengandungi besi. Penghasilan gelembung gas (oksigen) adalah tanda bagi ujian yang positif. 3. Spesimen yang memberi hasil negatif pada masa pengeraman 6 jam dieramkan semula semalaman kerana terdapat strain S.dikesan. Ujian katalase digunakan khususnya untuk membezakan antara stafilokokus (katalase positif) dengan streptokokus (katalase negatif) dan juga kadangkala digunakan dalam pengenalpastian pelbagai jenis bakteria.

rancak dan berterusan. 2. Hidrogen peroksida 3% TATACARA 1. 87 Ujian negatif: Tiada sebarang tindak balas. Slaid mikroskop 3. Penghasilan segelintir gelembung kecil selepas 20-30 saat tidak dianggap positif. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Penghasilan dan pembebasan gas dengan cepat dicirikan dengan gelembunggelembung gas yang dibebaskan dengan rancak.BAHAN 1. Letakkan setitis larutan hidrogen peroksida di atas sebuah slaid kaca bersih dan kering. Amatilah kehadiran gelembung-gelembung gas yang dihasilkan dengan cepat. Jangan gunakan kultur yang berusia lebih daripada 24 jam untuk mengelak daripada . 4. Masukkan organisma ke dalam titisan reagen di atas slaid. NOTA 1. Sentuhkan penghujung kayu aplikator kepada koloni bakteria. Kultur bakteria 2. Jangan gunakan dawai gelung kerana positif palsu boleh berlaku. Kayu aplikator 4. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim katalase. 2. 3.

Ujian katalase plat: Ujian ini boleh dilakukan ke atas koloni di atas plat kultur dengan me-nuangkan reagen ke atas koloni berkenaan KECUALI jika media kultur tersebut adalah agar darah kerana ia boleh memberikan hasil positif palsu. Pada kultur anaerobik. 3. Seboleh-bolehnya elakkan daripada mengambil koloni yang tumbuh pada permukaan media agar darah. berhati-hatilah dalam pengambilan tersebut untuk mempastikan hasil yang tepat dan betul. dedahkan kultur kepada udara selama setengah jam sebelum ujian dilakukan untuk membolehkan oksidasi aerobik ke atas katalase yang tereduksi berlaku. Gunakan H 2 O 2 pada kepekatan 3% untuk mendapatkan hasil ujian yang terbaik atau optimum. 6. 4. sekiranya hal ini tidak dapat dielakkan. 5.memperolehi hasil negatif palsu kerana enzim ini hanya dapat dikesan pada kultur hidup yang masih segar dan mungkin tiada lagi pada kultur tua. Tetapi. Perlu ditekankan di sini bahawa . Larutan H 2 O 2 disimpan di dalam botol gelap di dalam peti beku. Ini untuk mengelakkan daripada terambil bersama sel darah dan mendapatkan hasil yang positif palsu seperti di atas.

Penghasilan H 2 S oleh sesejenis bakteria menandakan keupayaan bakteria tersebut untuk mereduksi sulfur kepada sulfida. Ujikan juga se-bahagian daripada plat agar yang belum diinokulasi dengan bakteria dengan menuangkan sedikit reagen di atasnya sebelum meneruskan dengan ujian katalase plat ini untuk mengelak-kan hasil positif palsu.darah juga mengandungi enzim katalase yang dapat bertindak balas dengan reagen. Oleh yang demikian. Ini adalah kerana sesetengah media mungkin mengandungi sedikit katalase yang boleh memberikan tindak balas yang lemah dan lambat serta boleh menyulitkan pembacaan hasil. H 2 S yang dihasilkan oleh bakteria . Sesetengah bakteria yang menghasilkan H 2 S tidak dapat tumbuh pada media yang mengandungi terbitan ferum (besi). Penghasilan Hidrogen Sulfida Bakteria boleh menghasilkan H 2 S daripada terbitan sulfur organik yang didapati di dalam pepton yang digunakan atau daripada terbitan sulfur tak organik yang dicampurkan dengan media kultur.

Gantung kertas ini pada sisi mulut tabung uji dan pastikan kertas ini tidak menyentuh permukaan agar. 2. Serapkan sekeping kertas turas dengan plumbum asetat 5% dan biarkan sehingga kering. . Gariskan bakteria ke atas cerun agar di dalam tabung uji. Plumbum asetat 5% TATACARA 1. 88 3. Kertas ini hanya diletakkan pada sisi mulut tabung di atas kultur bakteria pada agar condong. Tatacara Ujian Penghasilan Hidrogen Sulfida BAHAN 1. tanpa menyentuh permukaan agar tersebut kerana plumbum asetat boleh menghalang pertumbuhan sesetengah bakteria. Kertas turas 5.golongan ini dikesan dengan kertas yang diserapkan dengan larutan plumbum asetat 5%. Kultur bakteria 2. Gas H 2 S yang dibebaskan akan dikesan melalui perubahan warna kertas putih kepada warna hitam akibat pembentukan plumbum sulfida. Cerun agar nutrien di dalam tabung 3. Dawai lurus 4.

hasilnya menunjukkan kehadiran suatu zon opalesens (antibodi anti-lesitinase) di sekeliling koloni yang menandakan penghasilan lesitinase oleh bakteria. Pentafsiran hasil positif: Bakteria boleh menghasilkan H 2 S daripada sulfur. Enzim lesitinase C menghidrolisis lesitin (lecithin-phosphatidyl choline) kepada fosforilkolin dan sejenis digliserid.4. dan lesitinase A. Enzim ini juga bertindak ke atas fosfolipid lainnya. Fenomena ini kali pertama dilaporkan oleh Nagler yang pada waktu itu menggunakan serum . Ujian Nagler Penentuan penghasilan enzim lesitinase oleh bakteria adalah berfaedah dalam pengenalpastian bakteria genus Clostridium khususnya Clostridium perfringens ( Clost. Ujian Nagler pada mulanya dilakukan dengan menumbuhkan bakteria pada media agar kuning telur. welchii ) sungguhpun terdapat laporan yang menyatakan bahawa bakteria lain seperti Pseudomonas aeruginosa juga boleh menghasilkan enzim ini. Ujian hasil negatif: Tiada perubahan warna pada kertas. Selepas pengeraman. Eramkan pada 37°C semalaman. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian hasil positif: Kertas menjadi hitam. B dan D juga bertindak ke atas lesitin tetapi terhadap terbitan-terbitan lain yang dihasilkan.

Cairkan 20 ml agar nutrien yang steril (Difco: Blood Agar Base CM55). Penganggas air pada 50°C 4. Gelung dawai (Reagen agar Nagler dan kuning telur : Dari sumber komersial) TATACARA 1.sebagai sumber lesitin. vitellenin) daripada kuning telur yang mempresipitasikan lemak bebas. Kultur bakteria 2. 3. Ekstrak Fildes 5. Swab (steril) 9. Emulsi kuning telur pekat 6. Piring Petri 7. Mekanisme penghasilan opalesens dipercayai disebabkan oleh tiga faktor iaitu lemak digliserid yang dihasilkan. . Campurkan 1 ml ekstrak Fildes. welchii) (antibodi anti-lesitinase) 8. Turunkan suhu kepada 50°C dengan membiarkan media di dalam penganggas air selama 15 minit. Agar nutrien 3. lemak bebas daripada kuning telur selepas lesitin dihancurkan dan protein tak larut air (vitellin. Antitoksin Clostridium perfringens ( Cl. 2. Tatacara Ujian Nagler BAHAN 1.

perfringens pada setengah bahagian daripada media plat. 5. 8. 89 PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Lesitinase dihasilkan jika zon opalesens hanya kelihatan di sekeliling koloni di bahagian setengah plat agar tanpa antitoksin. Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan serta merembeskan enzim lesitinase yang dikenal pasti kerana aktivitinya menghasilkan zon opalesens dihalang oleh antibodi anti-lesitinase (antitoksin).4. Titiskan 2 titis antitoksin (antilesitinase) Cl. Eramkan secara anaerobik. 6. Ujian Elek . Biarkan kering. 7. manakala pada bahagian setengah plat agar yang disapu dengan antitoksin tidak terbentuk zon opalesens. Ujian negatif: Tidak terbentuk zon opalesens di sekeliling koloni pada keseluruhannya (pada kedua-dua kawasan disapu antitoksin dan tidak). Buatkan 1 garisan bakteria melintasi kedua-dua bahagian setengah plat agar ini (bahagian yang disapu antitoksin dan yang tidak). Campurkan emulsi “kuning telur pekat” (Difco: SR47) untuk mencapai kepekatan 5% dan tuangkan agar campuran ini ke dalam sebuah piring Petri. Sebarkan antitoksin ini sama rata ke atas permukaan setengah plat agar dan biarkan ia meresap dan kering.

Kultur bakteria kawalan positif (disahkan menghasilkan toksin difteria) 3. Cairkan 10 ml agar dasar Elek. Serum lembu 7. Agar dasar Elek 5. Kertas turas 8. Kultur bakteria kawalan negatif (disahkan tidak menghasilkan toksin difteria) 4. .Strain melalui Corynebacteria diphtheriae yang menghasilkan toksin dapat dikesan secara in vitro penghasilan presipitasi apabila toksin ini bertindak dengan antitoksin. Tatacara Ujian Elek BAHAN 1. secara tradisi ujian ini dimasukkan ke bahagian ujian biokimia. Penganggas air 50°C 6. Antitoksin difteria 10. Piring Petri yang steril 9. Inkubator (Reagen agar dasar jenis Elek: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Kultur bakteria yang diuji 2. Walau bagaimanapun. Penghasilan garis presipitasi adalah hasil suatu tindak balas serologi yang melibatkan antigen (toksin) dan antibodi (antitoksin).

5. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Garis presipitasi kelihatan muncul daripada sudut pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan positif. Biarkan agar menjadi kering. Letakkan kertas yang mengandungi antitoksin di tengah piring agar sejurus selepas agar mem-beku. 7. . 8. 4. 6. Inokulasi permukaan agar dengan bakteria (kawalan positif. Tuangkan agar campur serum ke dalam piring Petri. 10. Turunkan suhu kepada 50°C dengan membiarkan di dalam penganggas air selama 15 minit. Eramkan dan amati selepas 24 jam dan 48 jam. Plat harus disediakan pada hari ujian dilakukan. kawalan negatif dan yang diuji) secara tegak lurus (90°) melintasi jalur kertas antitoksin. 9.2. 2. Letakkan sekeping kertas turas ke dalam 1 piring Petri kosong yang steril. 90 NOTA 1. Campurkan 2 ml serum lembu. Ujian negatif: Tiada garis presipitasi. Pentafsiran ujian positif: Bakteria menghasilkan toksin difteria. Titiskan 1 ml antitoksin difteria (1000 unit) ke atas jalur kertas supaya diserap dan biarkan kering. 3. Gunakan inokulum yang tebal.

Tatacara Ujian Motiliti (Pergerakan) pada Agar Separuh Pejal BAHAN 1.3. Ujian Motiliti dengan Menggunakan Agar Separuh Pejal Media pertumbuhan dengan kepekatan agar yang rendah (0. Garam tetrazolium digunakan dalam ujian motiliti ini kerana ia memudahkan pengesanan pertumbuhan serta penyebaran bakteria secara visual di dalam media. Dawai lurus 4. kemungkinan garis presipitin juga dihasilkan oleh strain kawalan negatif (dan juga Corynebacterium akibat antigen yang umum kepada semua korinebakteria). Agar nutrien (0. kompleks tak larut berwarna merah hasil pereduksian oleh bakteria yang tumbuh. Jika bakteria mempunyai kemampuan untuk bergerak atau bersifat motil ia akan menunjukkan penyebaran yang bermula dari garis inokulasi. Bakteria yang tak motil akan tetap pada garis inokulasi dan sama sekali tidak akan tersebar.4% atau <) yang mengandungi indikator (garam tetrazolium) di dalam tabung uji 3.4% atau <) merupakan suatu media separuh pejal yang membolehkan bakteria bergerak dan menyebar ke pelbagai arah di dalamnya. 4. Garam tetrazolium adalah tanpa warna dan akan diubah kepada formazan. Jika plat dieramkan lebih 48 jam. Pastikan strain kawalan negatif dan strain kawalan positif diikut sertakan. Inkubator . Kultur bakteria 2.

2. 2. NOTA 1. Pentafsiran ujian: Ujian positif – bakteria motif. Amati pola pertumbuhan bakteria. Pertumbuhan beberapa jenis bakteria tertentu mungkin dihalang oleh garam tetrazolium. Oleh kerana keseluruhan dawai lurus akan ditusuk ke dalam agar maka pastikan keseluruhan dawai ini dibakar untuk mensterilkannya.TATACARA 1. Dawai yang ditusuk ke dalam media dikeluarkan seboleh-bolehnya bertepatan dengan garis kemasukannya. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pertumbuhan bakteria (merah) tersebar daripada garis tusukan dawai lurus. 5. 4. 4. Tusukkan hujung dawai ke dalam agar separuh pejal sehingga ke dasar tabung. Sterilkan keseluruhan dawai lurus. 3. Ujian negatif: Pertumbuhan bakteria terhad kepada garis tusukan. Sentuh koloni bakteria dengan penghujung dawai. Beberapa bakteria seperti Pseudomonas adalah aerobik dan akan hanya menunjukkan motiliti pada bahagian atas media ini. 91 . 3. Elakkan daripada menggerakkan dawai ke kiri atau ke kanan semasa dikeluarkan (dan juga semasa dawai ditusuk) kerana ini akan menyebabkan pertumbuhan yang kelihatan tersebar dan memberi tafsiran positif palsu mengenai mobiliti. Eramkan semalaman. ujian negatif – bakteria tak motil.

Kemudian disk diletakkan di atas inokulum yang telah disebarkan pada permukaan agar atau pada permukaan . Biasanya larutan antibiotik ini tidak terus diletakkan ke atas agar. namun demikian kebanyakannya tidak mempunyai nilai perubatan kerana sesetengahnya mungkin terlalu toksik terhadap pengguna atau sukar diperolehi. Maklumat ini boleh diperolehi di makmal umumnya melalui dua teknik atau pendekatan iaitu ujian resapan disk dan asai pencairan tiub. UJIAN RESAPAN DISK Dalam ujian resapan disk. UJIAN SENSITIVITI ANTIBIOTIK IN VITRO Rawatan penyakit dengan sesuatu bahan atau sebatian kimia dinamakan kemoterapi.6. 6. Senarai antibiotik yang dipencilkan dan dikenal pasti sememangnya cukup panjang. Pada masa ini kebanyakan antibiotik dan terbitannya yang digunakan dalam rawatan dihasilkan secara sintetik atau buatan.1. Agen kemoterapi yang dihasilkan berikutan aktiviti metabolik bakteria atau fungus disebut antibiotik. Seseorang doktor haruslah mengetahui mengenai tahap kerentanan (susceptibility) sesuatu mikroorganisma terhadap antibiotik tertentu supaya memudahkannya membuat keputusan yang sesuai dalam rawatan serta pengurusan seseorang pesakit. organisma yang diuji digariskan (atau diinokulasi dan kemudian disebarkan) memenuhi permukaan media agar di dalam piring Petri. Cara lain ialah organisma dicampurkan dengan media agar yang masih cecair dan kemudian dituangkan ke dalam piring. tetapi terlebih dahulu diserapkan ke dalam disk-disk kertas (satu disk satu jenis antibiotik dengan satu unit pencairan).

Tatacara Membuat Inokulasi Bakteria pada Keseluruhan Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. pada keseluruhan permukaan media plat agar. Sapukan swab sambil memutarkannya pada permukaan media agar untuk penginokulasian mengikut corak seperti diterangkan di bawah: . Celupkan swab steril ke dalam suspensi bakteria yang berada di dalam tabung uji. Plat agar darah Mueller-Hinton TATACARA 1. Dalam ujian resapan disk. Jika kultur bakteria sensitif terhadap sesuatu antibiotik. atau bersama bakteria kawalan. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton 2. Swab (steril) 3. Sebaliknya. jika ia resistan. iaitu tatacara Stoke dan tatacara perbandingan. Pendekatan ini disebut sebagai ujian resapan disk dan terdapat dua tatacara yang umum. pertumbuhan akan berlaku sehinggalah mencapai ke pinggir disk. 2. 3. bahkan kadangkala boleh tumbuh di bawah disk. Antibiotik tersebut akan merembes keluar daripada disk dan meresap ke dalam media. prosedur pertama (awal) adalah penginokulasian hanya bakteria yang diuji.media agar yang telah dicampur organisma sebelum pengeraman. suatu zon rencatan pertumbuhan akan terbentuk di sekeliling disk yang mengandungi antibiotik tersebut. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan.

Swab (steril) 4. . Celupkan swab yang steril ke dalam suspensi bakteria kawalan. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung uji berkenaan untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. Buka penutup plat Petri dan inokulasi media dengan mula-mula menyentuh bahagian tengah plat dengan swab yang mengandungi bakteria kawalan sehinggalah penginokulasian ini memenuhi suatu kawasan bulatan kira-kira 5 cm garis pusat. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton 2. Letakkan plat agar di atas pentas pemutar plat Petri. Alat pemutar plat Petri TATACARA 1. 3. 2. 4. Plat agar darah Mueller-Hinton 5. Suspensi bakteria kawalan 3.Sapukan swab mula-mula ke satu arah sehingga memenuhi keseluruhan permukaan media dan kemudian sapukan pula menurut arah kira-kira 90 darjah daripada arah sapuan semula. 4. 92 Tatacara Membuat Inokulasi 2 Jenis Bakteria di Bahagian yang Berasingan pada Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. Kaedah ini dilaksanakan sejajar dengan pergerakan alat pemutar plat. Buangkan swab ke dalam bekas khas yang mengandungi disinfektan.

Penunu Bunsen 4. Jarum atau forseps (steril) 7. Suatu garis perbatasan antara kedua-dua jenis bakteria kawalan dan ujian akan diperolehi di mana disk-disk antibiotik akan diletakkan nanti. Sentuhkan dengan swab yang mengandungi bakteria yang diuji bahagian tepi plat dan liputi kawasan permukaan agar ini dengan inokulum ini sehingga hampir menyentuh pinggir kawasan inokulum pertama. Lakukan kaedah 2 dan 3 untuk bakteria yang akan diuji. Inkubator 9. Swab (steril) 6. Pembaris TATACARA Hari pertama . 6.5. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) 2. NOTA Pastikan swab tidak terlalu basah atau meninggalkan kesan yang tidak diingini pada permukaan agar. Ujian Resapan Disk: Tatacara Perbandingan BAHAN 1. Disk antibiotik 8. Tabung air pepton 5. Gelung dawai 3.

Pastikan terdapat jarak yang sekurang-kurangnya 1. separuh sensitif (intermediate) atau resistan.1.5 cm antara 1 dengan lain mahupun antara disk dengan dinding plat. Bandingkan hasil sensitiviti kedua-dua strain terhadap antibiotik dan tentukan sama ada strain yang diuji sensitif. 10. 9. Hari kedua 8. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan adalah secara kuantitatif hampir sama. Goncangkan untuk mendapatkan suspensi yang homogenus. NOTA 1. Sterilkan gelung dawai. ujian ke atas strain kawalan . Pindahkan 3 koloni bakteria (garis pusat 1-2 mm) ke dalam 1 tabung air pepton. 2. 3. Biarkan supaya permukaan media menjadi kering dan kemudian letakkan disk-disk antibiotik di atas media dengan menggunakan jarum atau forseps steril dan tekan disk ke atas permukaan agar. 4. Ulangi kaedah 1 hingga 5 untuk strain kawalan pada plat lain yang mengandungi media yang sama. Inokulasi strain bakteria ini pada keseluruhan permukaan media agar dengan swab steril (rujuk kepada tatacara di ms. Eramkan plat pada 37°C semalaman. Jika suatu carta rujukan piawai diperolehi atau sudah tersedia. 93). 7. 6. Balikkan plat dan ukurlah garis pusat zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan). 93 5.

Jarum atau forseps (steril) 8. Disk antibiotik 9. Penunu Bunsen 4. Inkubator 10. Alat pemutar plat Petri 7. separuh sensitif. Swab (steril) 6. 2. Tatacara perbandingan berdasarkan carta atau suatu piawai yang tersedia dikenali sebagai Tatacara Kirby-Bauer.tidak perlu dijalankan. Inokulasi bakteria yang diuji dan bakteria kawalan di atas plat yang sama di bahagian yang . Gelung dawai 3. Tabung air pepton 5. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) 2. Seseorang hanya perlu merujuk kepada carta tersebut untuk menentukan pola sensitiviti strain bakteria yang diuji menurut senarai yang ditetapkan di dalam carta berkenaan. atau resistan. Ini bagi menyatakan sama ada bakteria tersebut sensitif. Pembaris TATACARA Hari pertama 1. Ujian Resapan Disk: Tatacara Stoke BAHAN 1.

94 Hari kedua 4. 2. Disk antibiotik harus diletakkan sejurus selepas inokulasi dilakukan. Bagi bakteria yang sukar tumbuh pada media ini bolehlah dicampurkan darah 5% sebagai nutrien tambahan. 94).5 cm antara satu disk dengan yang lain dan juga disk dengan dinding plat. 3. Kelewatan meletakkan disk menyebabkan bakteria tumbuh sebelum antibiotik dapat meresap ke dalam media dan bertindak ke atas bakteria. 5. NOTA 1. Pastikan terdapat jarak sekurang-kurangnya 1. Agar Mueller-Hinton merupakan media yang paling sesuai untuk ujian sensitiviti resapan disk. Eramkan plat pada 37°C semalaman. 2.berasingan (rujuk kepada bahagian tatacara di m. Buat perbandingan antara zon tanpa pertumbuhan yang dihasilkan terhadap strain ujian dengan zon yang dihasilkan terhadap strain kawalan untuk menentukan keresistanan bakteria kepada sesuatu antibiotik. Gunakan isipadu agar yang sama setiap kali supaya ketebalan agar dalam piring Petri . Ini menghasilkan pembacaan yang kurang tepat. bermula daripada titik pusat disk).s. 3. Letak dan tekan disk antibiotik tepat di atas garis perbatasan antara kedua-dua kultur supaya sebelah disk berada di kawasan kultur kawalan dan sebelah lagi di kawasan kultur yang diuji. Balikkan plat dan ukurlah jejari zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan.

Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan kawalan hampir sama secara kuantitatif untuk memberikan perbandingan yang tepat di antara kedua-duanya. 4. 7. Zon rencatan yang berbentuk bujur boleh disebabkan oleh disk yang tergeser di atas permukaan media atau disk diletakkan terlalu rapat dengan pinggir piring. Jika ini tidak dipatuhi. 8.2. UJIAN PENCAIRAN TABUNG Pendekatan yang lebih kuantitatif untuk menguji sensitiviti bakteria terhadap sesuatu antibiotik adalah tatacara pencairan tabung. 5. 6. Ia memakan masa lebih lama. oleh itu tidak disyorkan sebagai tatacara rutin. Dalam keadaan ini.sentiasa sama. 6. kepekatan antibiotik yang meresap ke dalam media agar juga akan sentiasa sama. tetapi memperlihatkan juga pertumbuhan bakteria yang berbonjol di sekitar pinggir zon harus dilaporkan sebagai resistan. Kemudian setiap tiub diinokulasi dengan organisma . antibiotik disediakan dalam pencairan dua kali ganda di dalam suatu siri tabung media pertumbuhan. Kultur plat harus dieramkan sejurus selepas disk diletakkan. Dalam keadaan ini. ukuran garis pusat atau jejari yang terkecil yang diambil kira. Stafilokokus yang menghasilkan zon rencatan yang jelas. Fenomena ini mungkin ditemui di kalangan stafilokokus penghasil enzim betalaktamase yang diuji dengan disk antibiotik yang mengandungi penisilin dan terbitannya. Jangan gunakan disk antibiotik yang telah tamat tempoh penggunaannya atau melebihi tarikh pelupusannya. besar kemungkinan zon rencatan pertumbuhan yang lebih besar akan dihasilkan kerana resapan antibiotik terlebih dahulu berlaku sebelum pertumbuhan bakteria bermula. Dalam prosedur ini.

Tabung-tabung uji (steril) 4. Ini dilakukan dengan mengamati tiub berkepekatan antibiotik terendah atau paling minimum dalam siri pencairan yang menghalang pertumbuhan bakteria (tiub yang jernih tepat disebelah tiub yang mula menunjukkan kekeruhan). 95 Tatacara Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) BAHAN 1. Sama ada antibiotik berkenaan bersifat bakterisiadal (membunuh bakteria) atau bakteriostatik (merencat pertumbuhan bakteria) dapat dipastikan dengan melakukan pensubkulturan daripada tiub yang tidak menunjukkan pertumbuhan tersebut ke atas media agar tanpa antibiotik. Kultur broth bakteria yang diuji 2. Kultur broth bakteria kawalan 3. Inkubator bersuhu 37°C TATACARA kepekatan bakterisidal . Kepekatan terendah untuk antibiotik yang menunjukkan hasil “tiada pertumbuhan bakteria” pada subkultur dianggap sebagai kepekatan antibiotik terendah yang berupaya membunuh bakteria tersebut – minimum (minimum bactericidal concentration: MBC). Antibiotik 6. Pipet bersukat 5.berkenaan dan kepekatan perencatan minimum (minimum inhibitory concentration: MIC ) ditentukan.

4. 2. termasuk satu tabung yang mengandungi broth tanpa antibiotik (tabung kawalan positif). Eramkan pada 37°C semalaman.keruh.5 ml).jernih). 2. Kultur tabung harus dieramkan sejurus selepas bakteria dicampurkan. 3. NOTA 1.5 ml ke dalam setiap tabung. dan tabung kawalan negatif yang mengandungi antibiotik sahaja (jernih). 5. 3. isipadu larutan 0. negatif . Pastikan terdapat juga 1 tabung yang mengandungi antibiotik dengan broth yang tidak mengandungi bakteria (tabung kawalan negatif).1. 4. Untuk memastikan sama ada berlaku pertumbuhan atau tidak. cara yang mudahnya adalah dengan merujuk kepada tabung kawalan positif yang mengandungi bakteria tanpa antibiotik (keruh). Masukkan 0. Bakteria kawalan adalah bakteria yang sensitif terhadap antibiotik yang digunakan dalam . Lakukan pencairan kultur broth semalaman bakteria yang diuji dan bakteria kawalan sebanyak 1:1000 di dalam broth baru untuk memperoleh ~ 10 5 bakteria hidup setiap ml. Goncang dan amatilah setiap tabung daripada kedua-dua siri tabung ini untuk menentukan pertumbuhan bakteria (positif . Sediakan 2 siri tabung yang mengandungi siri pencairan 2 kali ganda antibiotik yang diuji di dalam broth dengan kepekatan tertinggi antibiotik 200 µg atau 200 unit setiap ml (tabung bersaiz 13 mm x 100 mm. Pastikan tabung yang steril digunakan dan pencairan dibuat secara teknik aseptik.

ujian ini dan mesti beri hasil yang positif sebelum hasil bakteria yang diuji boleh diterima. Mulakan penitisan dari separuh tabung dengan kepekatan antibiotik yang tertinggi hinggalah kepada tabung dengan kepekatan yang paling rendah. 3. Plat-plat agar 3. 5. Gunakan pena penanda untuk membahagikan permukaan dasar setiap plat media kepada 2 bahagian sama besar untuk mendapatkan 2 „separuh plat‟ bagi setiap plat media. titiskan (secara terpisah) 3 titis kandungan setiap tabung yang didapati jernih sahaja dalam siri tabung ujian MIC ke atas separuh plat. Biarkan titisan larutan mengering sebelum mengeramkan plat pada 37°C semalaman. 7. Tatacara Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum) BAHAN 1. Ini merupakan kepekatan bakterisidal minimum. 97 . Amati pertumbuhan koloni di atas plat bagi setiap pencairan. Tuliskan nombor siri tabung (atau kepekatan antibiotik) pada setiap separuh plat. 2. 96 6. Tentu dan pastikan pencairan yang terendah di mana tidak terdapat pertumbuhan bakteria lagi. Siri tabung ujian MIC 2. Dengan menggunakan pipet yang sama. 4. Pastikan permukaan agar betul-betul kering. Pipet Pasteur TATACARA 1.

maka adalah sukar untuk menentukan identiti kebanyakan mikrob berdasarkan pengamatan secara langsung. terdapat banyak ujian serologi dan banyak variasi sesuatu ujian. Percantuman antibodi dengan enzim membolehkan antibodi yang melekat kepada antigen dikesan apabila tindakan enzim menukar warna substratnya. kebanyakan mikrob seperti bakteria memiliki morfologi kasar yang sama. mikrob berkemampuan menghasilkan antibodi yang bertindak secara spesifik dengannya. UJIAN SEROLOGI DALAM MIKROBIOLOGI Suatu aspek yang penting dalam bidang mikrobiologi adalah pengesanan jenis mikrob yang merupakan agen etiologi sesuatu penyakit. Ada juga . Tindakan antigen mikrob dengan antibodi dapat dikenal pasti dengan beberapa cara seperti mewujudkan presipitasi atau aglutinasi. Jika percantuman adalah dengan fluorokrom. Oleh yang demikian.7. Sungguhpun mikroskop boleh digunakan. Di bidang mikrobiologi. tindakan sesuatu mikrob dengan antibodi yang spesifik terhadapnya adalah suatu pendekatan yang digunakan dalam pengenalan identiti sesuatu mikrob. Oleh kerana mikrob merupakan antigen yang baik. pancaran cahaya berwarna tertentu – seperti warna hijau-kuning oleh fluorokrom FITC adalah tanda kehadiran kompleks antigenantibodi. Dalam hal ini. pengesanan identiti sesejenis mikrob adalah sukar kerana ia mempunyai saiz yang amat kecil dan tidak dapat dilihat dengan mata kasar.

tatacara dwilapisan antibodi. ELISA terdiri daripada beberapa jenis asai: tatacara persaingan. Dalam bahagian ini hanya tiga ujian mikrobiologi. 1 ELISA Asai imunosorben bergabung enzim (enzyme-linked immunosorbent assay) atau lebih terkenal dengan singkatan ELISA adalah sejenis imunoasai yang antigen atau antibodi larut dilekatkan kepada suatu permukaan pepejal seperti permukaan manik atau telaga tanpa menghilangkan reaktiviti komponen imunologiknya. iaitu ELISA . fasa pepejal anti-IgM dan dan aglutinasi lateks biasanya dilakukan dengan reagen .ujian yang merupakan ujian rekaan makmal sendiri (in-house) di samping ujian komersial. ELISA komersial. aglutinasi lateks dan imunopendafluor. Walau bagaimanapun. Oleh yang demikian. Asai ini merupakan imunoasai heterogenus kerana ia mempunyai suatu peringkat di mana komponen yang dilabelkan (gabungkan) enzim yang telah bertindak dengan ligannya dipisahkan daripada komponen yang sama yang tidak bertindak. aspek umum kedua-dua ujian berkenaan akan dibentangkan. rasanya tidaklah sesuai untuk dibahaskan tentang tatacara masing-masing. tatacara perencatan. diterangkan kerana ketiga-tiga ujian berkenaan mempunyai aplikasi dalam bidang bakteriologi. Pemisahan ini dilakukan melalui pencucian. maka kit daripada pengeluar yang berbeza mempunyai tatacara tersendiri. mikologi dan virologi. tatacara dwilapisan antibodi yang diubahsuai. 7 .

sungguhpun kebanyakan ELISA untuk kegunaan dalam mikrobiologi adalah termasuk dalam golongan kedua ini. Ikuti arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. sungguhpun tindak balas enzim ke atas substratnya telah dihentikan dengan bahan kimia yang sesuai. ELISA boleh merupakan asai kuantitatif atau kualitatif. 5. NOTA 1. Rancangkan kekerapan ujian yang akan dijalankan untuk mengoptimumkan penggunaan sesuatu kit kerana reagen dan fasa pepejal (telaga. Dalam sesetengah sistem enzim-indikator. penyimpanan lama. 2. Jangan tunggu terlalu lama selepas hasil asai dibaca. . 98 4. sama ada daripada segi masa cucian mahupun bilangan cucian yang dilakukan. Reagen komersial biasanya mempunyai sensitiviti yang amat tinggi dan ini boleh menimbulkan hasil positif palsu jika pencucian antara peringkat pengeraman dengan reagen tidak dilakukan dengan sempurna. manik) yang disaluti antigen atau antibodi juga digunakan kerana sampel kawalan positif dan negatif turut diasaikan dengan sampel ujian setiap kali ujian dijalankan. jika ia dilakukan dengan menggunakan alat pembaca ELISA . Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan bagi mengelakkan kemungkinan hasil negatif palsu.tatacara secara tidak langsung (asai untuk pengesanan antibodi). khususnya. umpamanya semalaman sungguhpun pada suhu peti beku. 3. akan menukar warna hasil ujian daripada apa yang didapati sejurus selepas asai tamat.

ujian ini tidak membazirkan reagen jika dilakukan ke atas sebilangan sampel yang kecil. Ujian Aglutinasi Lateks Slaid Antibodi atau antigen boleh digabungkan dengan partikel polistirin (digelarkan „lateks‟ kerana warna putihnya menyerupai lateks tumbuhan) bagi mengesan antigen atau antibodi masingmasing. Ujian ini adalah cepat serta mudah dilakukan dan tidak memerlukan alat radas yang mahal atau canggih. Tambahan pula. NOTA . terdapat berbagai-bagai jenama ujian aglutinasi lateks untuk pengesanan berbagaibagai antigen/antibodi. Para pengguna harus mempastikan sesuatu ujian itu bermutu tinggi dan sesuai untuk tujuan mereka. Sungguhpun ujian aglutinasi lateks slaid mudah dilakukan. Pergabungan antigen dengan antibodi akan menyebabkan kelompok-kelompok besar partikel lateks yang dapat diamati dengan mata kasar. Pastikan sisa asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal. Tidak semuanya boleh dianggap memuaskan dari segi spesifisiti dan sensitiviti. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. Di pasaran. 7. beberapa peraturan harus dipatuhi supaya hasil yang didapati boleh diyakini.6.

2. 7. 99 . Goncang botol-botol reagen supaya memperolehi suspensi reagen lateks yang sama rata sebelum reagen lateks digunakan. 4. Titisan besar reagen daripada botol reagen mungkin menggalakkan para pengguna berusaha untuk mengurangkan isipadu reagen bagi mengurangkan kos. Titisan reagen lateks yang dititiskan daripada botol reagen adalah berbeza-beza. Biarkan reagen mencapai suhu bilik sebelum ujian dilakukan kerana penggunaan kit sejurus selepas dikeluarkan dari peti beku mungkin memberikan hasil yang kurang memuaskan. 8.1. Baca hasil ujian pada masa yang ditetapkan selepas ujian dimulakan. 3. Amalan ini seharusnya jangan dilakukan kerana mengurangkan isipadu reagen boleh menimbulkan hasil negatif palsu. ada kemungkinan hasil negatif palsu didapati jika sampel diuji lebih daripada masa yang ditetapkan. Titisan dengan isipadu yang sama boleh dicapai dengan menggunakan mikropipet. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan supaya mengelakkan kemungkinan hasil positif palsu. 9. atau pun hasil negatif palsu. Oleh kerana ujian direka dengan sensitiviti yang tinggi. 6. 5. Ikut arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. Pastikan sisa daripada asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal.

. Fluorokrom adalah sebatian semula jadi atau sintetik yang boleh menyerap cahaya gelombang tertentu dan sejurus selepas itu mengeluarkan tenaga sebagai cahaya dengan gelombang yang lebih panjang. komponen mikrob) dapat dikenal pasti secara tidak langsung melalui pengamatan mikroskop apabila antigen berkenaan digabung secara spesifik dengan antibodi yang secara langsung tercantum fluorokrom ( ujian langsung ). fluoresein adalah fluorokrom yang paling umum digunakan kerana ia mempunyai beberapa kelebihan: 1. 2. Sungguhpun terdapat berbagai jenis fluorokrom seperti rodamin dan Texas Red. Dalam pendekatan lain. Nisbah amaun tenaga yang dikeluarkan kepada tenaga yang diserap adalah amat tinggi (~85%) maka ia memberi sensitiviti yang baik.Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung Kehadiran sejenis antigen (misalnya. 3. cahaya suatu warna diserap dan cahaya warna lain dikeluarkan oleh fluorokrom. Dalam lain perkataan. maka ia meningkatkan spesifisiti. Autopendafluor berwarna hijau-kuning jarang berlaku. Jenis warna (gelombang cahaya) yang dikeluarkan adalah khas untuk sejenis fluorokrom. Pancaran cahayanya pada gelombang 520 mµ adalah di kawasan sensitiviti pengamatan yang paling baik maka ia memberi sensitiviti yang baik. gabungan secara spesifik antibodi dengan sesuatu antigen dikenal pasti melalui gabungan antibodi berkenaan dengan antibodi terhadapnya yang tercantum fluorkrom ( ujian tak langsung ).

Mikroskop imunopendafluor TATACARA Penyediaan spesimen sel yang diuji ke atas slaid mikroskop 1. Tatacara Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung BAHAN 1. Kayu aplikator 5. Antiserum 7. Konjugat antibodi terhadap antiserum dan FITC („konjugat‟) 8. Larutan PBS 90% dan gliserol 10% 12. Kertas turas 4. Metanol 10. Air suling 11. Fluoresein digunakan dalam bentuk fluorescein isothiocyanate ( FITC) kerana kehadiran kumpulan sianat yang mempunyai afiniti untuk protein membolehkan antibodi dicantum dengannya.4. Slaid mikroskop atau slaid khas untuk ujian imunopendafluor 2. Inkubator bersuhu 37°C 13. Varnis kuku 6. Larutan salin yang ditampankan fosfat ( PBS ) 9. Titiskan suspensi sampel (sel diinfeksi mikrob dan ditanggalkan dari permukaan bekas . Piring Petri 3.

3. Tindak balas dengan reagen antibodi 7. Letakkan spesimen yang berada pada penutup slaid di atas slaid yang diletakkan di atas kayu aplikator. Celup di dalam metanol pada suhu 4°C selama 2 minit. Letakkan slaid di atas kayu aplikator supaya slaid berada lebih tinggi daripada aras kertas turas. 6. Biarkan kering. 11. 9. Sebarkan sehingga meliputi kawasan bulat seluas 1 cm garis pusat slaid mikroskop atau memenuhi seluruh telaga. 8. Kelilingi spesimen dengan 1 bulatan varnis kuku.kultur. atau sel dari spesimen klinikal) ke atas sekeping slaid mikroskop atau di dalam telaga cetak slaid mikroskop khas untuk ujian imunopendafluor. 10. 2. Titiskan persediaan antiserum (sumber antibodi terhadap virus) ke atas spesimen dan . 5. Keluarkan dan biarkan kering. Patahkan sebatang kayu aplikator di bahagian tengahnya dan letakkan dalam bentuk „V‟ di atas kertas turas di dalam piring Petri (Ini merupakan bekas lembap). Fiksasi spesimen (spesimen yang dititiskan kepada slaid mikroskop atau sel yang ditumbuhkan di atas slaid penutup dan diinfeksi dengan virus) 100 4. Alas satu piring Petri dengan sekeping kertas turas dan basahkan dengan air.

Amati dengan mikroskop pendafluor. Tutup piring Petri dan eramkan dalam alat inkubator bersuhu 37°C selama 30-60 minit. 24. 19.sebarkan supaya meliputi seluruh spesimen. penutup slaid berkenaan ditekan. 20. Bilas spesimen ke atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS . Fiksasi spesimen yang terlalu lama mungkin menimbulkan pendafluor yang tak spesifik. 18. 17. Masukkan di dalam bekas lembap. 23. Spesimen di atas penutup slaid dilekapkan di atas setitis kecil larutan PBS gliserol. Titiskan persediaan konjugat ke atas spesimen dan sebarkan supaya meliputi ke seluruh spesimen. 2. 12. . 13. 22. Cuci semula 2 kali. Cuci 3 kali dengan PBS . Rendam dalam PBS selama 3 minit di dalam piring Petri (cuci). Pencucian yang dilakukan selepas pengeraman boleh dipendekkan serta lebih berkesan jika PBS dalam bekas yang mengandungi slaid spesimen dikacau dengan alat magnet yang berputar. 16. Biarkan kering di dalam tempat gelap seperti laci yang tertutup. 21. Bilas spesimen yang ada di atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS . Bilas dengan air suling. NOTA 1. Tutup piring Petri dan eramkan di dalam inkubator bersuhu 37°C selama 30-60 minit. 14. 15.

Jika reagen bermutu tinggi dan ujian dilakukan dengan sempurna. amaun yang kecil digunakan setiap kali. Spesimen harus dibaca (diamati dengan mikroskop pendafluor) secepat mungkin kerana intensiti cahaya pendafluor akan berkurang. 13 Balang anaerobik-penggunaan. 7. reagen berkenaan boleh disimpan pada suhu – 20°C tanpa dibeku jika ia dicampurkan dengan isipadu sama gliserol. biasanya digunakan dalam pencairan yang amat tinggi. Reagen konjugat antibodi-fluorokrom biasanya diperolehi daripada sumber komersial. Untuk mengelakkan kehilangan aktiviti biologinya akibat reagen selalu dicairkan dan dibeku. 5.3. 6. 4. Reagen konjugat. spesimen masih boleh dibaca selepas disimpan semalaman. Oleh yang demikian. Sinaran pendafluor latar belakang boleh ditindaskan dengan spesimen dieramkan dengan metilin biru selepas tindakan dengan konjugat antibodi-fluorokrom. Penyimpanan spesimen di dalam tempat yang gelap akan melambatkan proses ini. 52 . dan lebih-lebih lagi antiserum. Pastikan mikroskop imunopendafluor dinyalakan sekurang-kurangnya 20 minit sebelum ia dipadamkan supaya jangka hayat lampu raksa dapat dikekalkan lama. pastikan ia berfungsi dengan baik sebelum amaun yang lebih besar dibeli. Oleh yang demikian. 20-21 Asepsis-pemindahan benda dari botol yang tertutup. Biarkan lampu raksa mikroskop bernyala kira-kira 15 minit bagi menstabilkan pancaran cahayanya sebelum spesimen diamati. 8. 101 Apusan bakteria-membuat.

10 Disinfektan-penggunaan. 22 GasPak-mewujudkan keadaan anaerobik. 60-61 Kultur sel-tripsinisasi seluruh tisu.penggunaan. 92 Inkubator CO 2 . 61-62 Kultur sel-tripsinisasi sel selapisan dan pengermaan . 10 Fiksasi bakteria dengan haba-membuat. 64 Kultur sel-pengkulturan semula sel yang dikrioawetkan. 53 Bantuan pemula-rawatan. 53-54 Kultur sel-inokulasi dengan virus. 66 Kultur sel-persediaan media. 64-65 Kultur sel-penghitungan dengan menggunakan hemosi-ometer. 52 Inokulasi plat agar dengan kultur yis. 67 Kultur sel-kriopengawetan kultur sel yang hidup. 91 Inokulasi plat agar dengan 2 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik.Balang lilin-mewujudkan atmosfera karbon dioksida. 47-49 Inokulasi plat agar dengan 1 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik.

41 Mikroskop elektron-pewarnaan negatif. 23 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen virus. 26 . 12-13 Pewarnaan Albert (pewarnaan granul metakromatik). 47 Media bakteria-jenis. 38-39 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen bakteria. 14-15 Pensterilan gelung dawai dengan api. 16 Mikroskop cahaya-pembersihan kanta. 11 Pensterilan menggunakan alkohol yang membakar. 40 Mikroskop cahaya-mengelakkan pertumbuhan fungus. 56-57 Media agar-menyediakan di dalam plat Petri. 44-45 Mikroskop elektron-menyaluti grid dengan Formvar. 46 Media agar-menyediakan sebagai cerun. 16 Mikroskop cahaya-penggunaan. 39-40 Mikroskop elektron-tatacara imun. 55-56 Kultur yis-merangsang penghasilan tiub germa. 62-63 Kultur slaid fungus-membuat.kultur sel.

27 Pewarnaan tahan asid (rujuk kepada pewarnaan Ziehl-Neelsen). 34-35 INDEKS Pewarnaan negatif dengan dakwat India. 25 Pewarnaan Ziehl-Neelsen. 23 Pewarnaan Gram untuk fungus. 30 Pelekapan titisan tergantung untuk bakteria. 25 Pelekapan basah bakteria.Pewarnaan asid periodik-Schiff. 17 Pelekapan basah KOH untuk fungus. 32 Pelekapan basah salin untuk fungus. 34 Pewarnaan Gram untuk bakteria. 27 Pewarnaan Kinyoun (terubahsuai) untuk fungus. 33 Pewarnaan metenamina-argentum Gomori. 33 Pewarnaan kapsul (rujuk kepada pewarnaan negatif dengan dakwat India). 31 Pelekapan basah lactophenol coton blue untuk fungus. 17-19 Plat garisan-teknik. 47-49 . 26-27 Pewarnaan spora (rujuk kepada pewarnaan Schaeffer Fulton). 36 Pewarnaan Schaeffer-Fulton.

80-81 Ujian Koagulase. 71 Telur-mengambil membran korioalantoik. 83-84 Ujian Metil-merah. 77-78 Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) tabung. 97-98 Ujian Elek.Prosedur umum makmal mikrobiologi. 76-77 Ujian Imunopendafluor. 98 Ujian ELISA . 69 Telur-mengumpulkan cecair alantoik. 68 Telur-membuat inokulasi membran korioalantoik. . 71-72 Ujian aglutinasi lateks slaid. 73-74 Ujian Indol. 70-71 Telur-mengumpulkan cecair amniotik. 84-86 Ujian Oksidase. 70 Telur-membuat inokulasi ruang amniotik. 9 Slaid mikroskop-membersihkan dan simpanan. 99-100 Ujian Katalase. 86-87 Ujian keperluan faktor pertumbuhan X dan V. 69 Telur-membuat inokulasi ruang alantoik. 89 Ujian Fermentasi gula dan penghasilan gas. 20 Telur-melakukan penyuluhan.

95 Ujian Motiliti bakteria di dalam agar separuh pepejal. 93-94 Ujian Sensitiviti: Bacitracin. 92-93 Ujian Resapan disk: Tatacara Stokes. 78 .95 Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum). 79 Ujian Sensitiviti: Optochin. 82-83 Ujian Voges-Proskauer. 74-76 Ujian Urease. 90 Ujian Resapan disk: Tatacara perbandingan. 79 Ujian Tiga gula besi.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful