PRAKATA Mikrobiologi merupakan suatu sains praktik.

Oleh itu, selain mempelajari dan mengumpul fakta serta konsep adalah penting bagi pelajar dan pengamal mikrobiologi mahir dan cekap dalam mengendalikan kaedah-kaedah makmal mikrobiologi.Sungguhpun kaedah yang digunakan dalam mikrobiologi banyak dan berbagai-bagai, terdapat beberapa kaedah seperti pewarnaan bakteria yang boleh dianggap sebagai teknik asas dalam amalan sains ini. Teknik asas ini biasanya diajarkan kepada pelajar mikrobiologi dalam sesi amali yang terancang. Daripada pengalaman kami dalam mengendalikan sesi amali mikrobiologi terdapat beberapa kesilapan serta amalan yang tidak sewajarnya diulangi oleh setiap kumpulan pelajar baru. Sering juga terdapat soalan serta kemusykilan yang sama yang diajukan oleh mereka. Oleh yang demikian, sebuah buku yang menyentuh tentang teknik-teknik dasar makmal dan tradisional mikrobiologi amat diperlukan. Menyedari hakikat di atas, kami menulis buku ini yang bukan sahaja memaparkan kaedah serta pelaksanaan yang sempurna, tetapi juga merangkumi pengenalan ringkas dan tepat mengenai teknik-teknik tersebut. Ini dilakukan supaya pelajar dapat memahami teori serta penggunaan teknik-teknik di atas dengan lebih mendalam kerana buku ini menyertakan beberapa petunjuk dan petua bagi mencapai hasil yang baik dan diharapkan. Buku ini mengandungi 81 teknik dan maklumat teknikal. Penggunaan setiap teknik ini sengaja diolah berdasarkan konsep yang dimaksudkan di atas. Kami menaruh harapan agar buku ini berguna dalam mempertingkatkan lagi kemahiran pelajar mahupun pengamal mikrobiologi, di samping menambahkan sebuah lagi judul teks ke dalam senarai buku-buku teknikal dalam Bahasa Melayu yang tercinta. Yap Kok Leong Abdul Hamid Abdul Aziz Mohd Salleh Mohd Yasin

Jabatan Sains Bioperubatan Fakulti Sains Kesihatan Bersekutu UKM

9 1. AMALAN DAN PERATURAN DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI 1.1. PROSEDUR UMUM DI DALAM MAKMAL MIKROBIOLOGI Mikroorganisma boleh menyebabkan penyakit pada manusia. Oleh itu adalah penting bagi kita menyedari dan mengawasi prosedur dan perilaku dengan betul serta penuh tanggungjawab semasa bekerja dengannya. Mikrobiologi adalah mengenai mikroorganisma atau jasad renik yang mempunyai saiz kecil seperti fungus (kulat), bakteria dan virus. Tumpuan khusus perlu diberikan kepada aspek-aspek keselamatan dan ketelitian di dalam makmal mikrobiologi demi kepentingan diri sendiri mahupun pekerja-pekerja lain. Untuk mencapai matlamat ini sentiasalah mengingati dan mematuhi peraturan-peraturan umum makmal berikut: 1. Pakai kot makmal dan kasut pada setiap waktu anda bekerja di dalam makmal. Kot makmal janganlah dipakai di luar makmal. 2. Basuh tangan dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum anda memulakan sebarang pekerjaan di makmal. 3. Jangan membawa bahan-bahan makmal yang rosak, pecah atau tercemar kepada instruktor. Panggillah instruktor dengan segera jika berlaku sebarang KEMALANGAN terutama yang

berkaitan dengan kultur mikroorganisma. 4. Jangan menyentuh kawasan muka atau mulut anda semasa bekerja. 5. Jangan makan, minum atau merokok di dalam makmal pada setiap waktu. 6. Jangan memasukkan pensil, jari atau sebarang objek ke dalam mulut atau membasahkan pelekat dengan menggunakan lidah. 7. Jangan menyedut sebarang cairan ke dalam pipet dengan mulut. Gunakan penyedut getah atau alat penyedut khas untuk tujuan ini. 8. Jangan membawa keluar dari makmal sebarang kultur atau bahan-bahan dalam kelas amali. 9. Simpan buku dan catatan berjauhan daripada tempat bekerja anda di dalam makmal untuk menghindari daripada tercemar. 10. Buangkan semua bahan dan kultur yang tercemar ke dalam bekas khusus yang disediakan, misalnya bikar yang berisi disinfektan atau bekas yang disediakan khas. 11. Jangan nyalakan mancis semasa bekerja dengan/atau berdekatan dengan reagen meruap seperti alkohol dan eter. 12. Tutup gas dan paip air dengan rapat dan bersihkan meja setelah anda selesai bekerja dan bersiap sedia untuk meninggalkan makmal. 13. Periksa penunu Bunsen dari semasa ke semasa untuk memastikan tidak berlaku kebocoran gas. Gantikan tiubnya jika perlu. 14. Basuh tangan anda semula dengan sabun dan air atau dengan disinfektan kulit sebelum meninggalkan makmal. 1.2. BANTUAN PEMULA KECEMASAN DI DALAM MAKMAL

Oleh kerana kemalangan boleh berlaku di dalam makmal, pekerja makmal haruslah mempunyai sedikit sebanyak pengetahuan mengenai bantuan pemula dan tindakan yang perlu diambil serta sedar akan keperluan ini, khususnya dalam kes-kes kecederaan ringan. Bekalan Bantuan Pemula Kecemasan 1. Antiseptik ringan untuk luka dan luka terbakar 2. Kain kasa (gauz) atau pembalut steril 3. Larutan asid asetik 2% 4. Natrium bikarbonat 5. Jeli petroleum/vaselin 10 Tatacara Rawatan Bantuan Pemula 1. Luka bakar asid. Segera simbah dengan sabun dan air dan sapukan dengan natrium bikarbonat. 2. Luka bakar alkali. Elak daripada menggunakan air kerana boleh menyebarkan alkali berkenaan. Bilas bersungguh-sungguh dengan asid asetik 2%. 3. Luka bakar api. Untuk luka bakar kulit yang ringan (kulit kemerahan tetapi tidak sampai mengelupas), sapukan lapisan tipis jeli petroleum di kawasan berkenaan. Bagi luka bakar yang lebih serius, jangan berikan sebarang rawatan tetapi bawalah mangsa ke hospital. 4. Luka. Untuk luka ringan dan cakaran, cuci luka dan teliti sama ada terdapat bendasing (kaca) di dalam luka. Bilas dengan alkohol 70% atau dengan antiseptik. Balut dengan kain pembalut berperekat atau dengan balutan longgar. Jika luka kelihatan parah, jangan

Disinfektan Jenis Fenolik Jernih 1. Sebatian kimia halogen dan fenol adalah di antara agen yang penting sebagai disinfektan. Untuk mengelakkan penyebaran patogen. bahan tuberkulosis dan bahan bakteriologi umum. Di samping ini. Segera berjumpa doktor. tidak digunakan untuk darah dan virus. Aktiviti antimikrobnya tidak banyak dikurangkan oleh bahan organik dan tidak bertindak . Jika formalin atau mana-mana cairan tersimbah ke dalam mata. iaitu pemusnahan semua bentuk hidupan.menggunakan antiseptik. Namun demikian.3. 2. pastikan mata dicuci dengan air yang banyak dengan air paip. Disinfektan adalah bahan kimia yang dimaksudkan di atas yang digunakan untuk memusnahkan mikrob patogenik pada sesuatu objek tak bernyawa (inanimate). tahap pemusnahan di peringkat ini tidaklah perlu mencapai tahap pensterilan. objek seperti spesimen klinikal dan pipet dikumpulkan di dalam bekas yang sesuai sebelum disterilkan dan dibuang. Umumnya. objek di dalam makmal seperti tempat kerja. 1. DISINFEKTAN UNTUK KEGUNAAN MAKMAL Pekerja di makmal mikrobiologi sentiasa berhadapan dengan bahan-bahan berbahaya terutamanya yang mengandungi mikrob patogenik. pipet dan slaid mikroskop juga sering tercemar. jumpalah doktor. Jika keradangan pada mata tersebut masih berterusan. spesimen dan bahan terpakai terlebih dahulu disimpan buat sementara di dalam bahan kimia tertentu sehingga pekerjaan di makmal tersebut selesai. Digunakan untuk kebanyakan bahan organik.

Contoh: Chloros. 3. 6. Sesuai untuk kerja mikrobiologi umum. Hipoklorit sesuai digunakan dengan detergen anionik dan bukan ionik tetapi tidak sesuai 11 dengan detergen kationik. Boleh digunakan dalam bidang virologi.4. 4. Digunakan pada pencairan seperti yang ditetapkan oleh pengeluar disinfektan. 2. 4. 5. 7. 3. tetapi tidak digunakan untuk bahan tuberkulosis atau yang diperbuat daripada logam. Contoh: Clearsol. Sudol. balang pipet terpakai dan untuk mendisinfeksi permukaan. sesuai untuk menginaktivasi virus. Aktiviti antimikrobnya dikurangkan oleh bahan organik. Balang pipet: 2500 ppm klorin bebas. Penggunaan umum: 1000 ppm klorin bebas. Presept. TATACARA ASEPTIK Teknik aseptik bukan sahaja bertujuan untuk menjamin kesterilan bahan yang anda sedang kendalikan (iaitu tanpa berlakunya sebarang pencemaran ke atas bahan berkenaan) tetapi juga .terhadap logam. 1. hematologi dan patologi kimia di dalam balang buangan sisa makmal. 5. balang buangan sisa makmal. Gunakan hipoklorit untuk bahan yang mengandungi hanya sedikit bahan organik atau sedikit darah. Bahan antimikrob ini menyerang logam. Disinfektan Jenis Hipoklorit 1.

pakaian mahupun tempat anda bekerja di makmal) dan juga ke atas pekerja-pekerja lain. Pensterilan Gelung Dawai dengan Api Gelung dawai adalah sejenis dawai yang umumnya terdiri daripada nichrome atau platinum dengan garis pusat berukuran 0. Tatacara Pensterilan Gelung Dawai dengan Api BAHAN 1. gelung dawai ini disterilkan setiap kali selepas digunakan.5 mm yang dibentuk melingkar seperti gelung pada salah satu penghujungnya. Gelung dawai ini merupakan alat utama di makmal bakteriologi yang digunakan untuk memindahkan bakteria daripada suatu kultur ke tempat-tempat lain. gelung dawai ini terlebih dahulu dibakar supaya semua mikrooganisma yang terdapat pada permukaannya musnah dan terhapus serta tidak akan tercampur atau mencemari kultur bakteria murni yang akan diambil dengannya nanti. Gelung dawai 2. gelung dawai ini disterilkan. Adalah penting juga dalam mengamalkan teknik aseptik. Rak gelung dawai 3. Sebelum digunakan. Dengan perkataan lain. Penghujung lainnya dicantumkan kepada sebatang pemegang dawai.merangkumi tindakan menghindari daripada berlakunya pencemaran mikroorganisma yang sedang dikaji ke atas diri anda sendiri (tangan. Penunu Bunsen .

3. Pastikan gelung dawai yang steril ini tidak tersentuh sebarang objek sebelum digunakan. 4. PERHATIAN 1. Dalam tempoh alkohol pada permukaan objek tersebut terbakar. Elakkan daripada meletakkannya langsung di atas meja. Masukkan gelung dawai ke dalam api penunu Bunsen seperti yang ditunjukkan pada Rajah 1. mikroorganisma yang terdapat pada permukaan . Nyalakan penunu Bunsen dan buka sepenuhnya liang kemasukan udaranya. Keluarkan dawai.1. seperti bahagian memotong gunting ialah dengan mencelupkan objek atau bahagian daripada objek berkenaan ke dalam alkohol dan kemudian membakar objek beralkohol tersebut. 2. 2. Biarkan ia supaya dingin semula (sama ada dengan memegang atau meletakkannya di atas rak khas) sebelum digunakan. Gelung dawai haruslah sentiasa disterilkan melalui pembakaran merah membara seperti di atas sebelum dan sesudah digunakan. Lakukan pembakaran sehingga peringkat keseluruhan dawai menjadi merah membara. 12 Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar Suatu tatacara cepat untuk mensterilkan objek kecil atau sebahagian daripada sesuatu objek.TATACARA 1. Letakkan ia di atas rak khas atau pegang sahaja sementara menunggu dingin.

RAJAH 1. Singkirkan alkohol yang berlebihan. Sentuhkan objek beralkohol kepada api penunu Bunsen supaya alkohol terbakar. 3. ia kurang meyakinkan dibandingkan dengan pensterilan yang diperolehi dengan menggunakan autoklaf. Balang alkohol (mengandungi etanol 70%) 2. 4. Penunu Bunsen TATACARA 1. Tatacara Pensterilan Alat dengan Alkohol yang Membakar BAHAN 1. Pegang objek kecil seperti slaid mikroskop atau penutup slaid dengan forseps dan objek yang lebih besar pada pemegangnya.1 Cara membakar gelung dawai Mulakan dengan memasukkan gelung dawai langsung ke dalam api (biru) di bahagian gas tak terbakar. Sungguhpun ini merupakan suatu kaedah pensterilan yang boleh digunakan dalam keadaan-keadaan tertentu. Naikkan gelung perlahan-lahan sehingga bahagian gelung keluar dari kemuncak api biru dan biarkan terbakar sehingga merah .objek tersebut juga turut terbakar dan akhirnya dihapuskan. 2. misalnya. Celup objek atau bahagian yang akan disterilkan ke dalam balang alkohol.

Jauhkan objek daripada api penunu Bunsen dan biarkan sehingga api pembakaran alkohol tersebut padam dengan sendirinya. Peganglah botol/tabung di bahagian dasarnya (iaitu agak berjauhan daripada mulut botol/ . Seterusnya bakar keseluruhan dawai sehingga menjadi merah sebelum dikeluar dan didinginkan di udara. 2.membara. 13 5. Bahan kaca seperti slaid atau penutupnya akan pecah sekiranya dibiarkan dalam api pembakar terlalu lama. 2. Letakkan balang berisi alkohol berjauhan daripada api penunu Bunsen untuk mengelak daripada disambar api tersebut. Tatacara Mengeluarkan dan Memasukkan Bahan daripada Botol yang Tertutup 1. 3. PERHATIAN 1. Mata gunting mestilah dalam keadaan terbuka semasa proses pensterilan supaya bahagian tajamnya terdedah kepada alkohol dan pembakaran. NOTA 1. Sentiasalah memegang objek supaya parasnya lebih rendah daripada paras tangan untuk mengelak daripada alkohol yang sedang terbakar mengalir ke tangan dan mengakibatkan kebakaran pada diri sendiri. Kaedah ini hanya boleh digunakan untuk objek kaca dan logam sahaja.

5. . 4. segera lalukan mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali dan kemudian masukkan sesuatu yang diambil dengan gelung dawai atau pipet steril dengan tangan kanan. Tanggalkan penutup botol/tabung tersebut dengan jari kelengkeng kanan dan pegang terus penutup ini dengan jari berkenaan. NOTA 1. Longgarkan dahulu penutup botol/tabung yang ketat dengan tangan kanan. Lalukan semula mulut botol/tabung ke dalam api beberapa kali sebelum botol/tabung tersebut ditutup. iaitu mensterilkan mulut botol/tabung sambil menghindari daripada berlakunya pencemaran udara dan mengambil inokulum daripada sejenis media kultur ataupun memasukkan inokulum ke dalam media. tanpa meletakkannya (lakukan prosedur ini berdekatan dengan api penunu Bunsen). 2. 3. Teknik ini membolehkan anda melakukan dua perkara secara serentak dengan kedua-dua tangan. ATA U dengan peralatan yang sama keluarkan sesuatu bahan (misalnya kultur) daripada botol/tabung berkenaan.tabung) dengan tangan kiri. Dengan tangan kiri. PERINGATAN Amalkan prosedur ini setiap kali anda melakukan penginokulasian supaya pencemaran khususnya dari udara di sekitar kita dapat dihindari.

api penunu Bunsen menghasilkan arus perolakan. Jadi udara di persekitaran api akan terbawa arus ini ke atas dan akan mencegah partikel kecil seperti debu dan sebagainya daripada mendap di kawasan persekitaran ini. 14 2. Sungguhpun kini terdapat pelbagai jenis mikroskop.2. ia dapat mengelak daripada berlakunya pencemaran dari udara disebabkan partikel-partikel yang kecil apatah lagi spora fungus dan bakteria yang biasanya terapung atau berterbangan akan bergerak ke atas menurut arus dan tidak akan terjatuh ke dalam mana-mana media yang terdedah di bawahnya berdekatan dengan api. dipercayai bahawa bekerja berdekatan dengan sesuatu sumber api umumnya boleh mengurangkan kadar pencemaran dari udara. Pada prinsipnya.1). Berdasarkan konsep ini. Dengan demikian. yang lazim dan paling sering digunakan ialah mikroskop cahaya jenis kompaun iaitu mempunyai dua set kanta (Rajah 2. MIKROSKOP CAHAYA DALAM MIKROBIOLOGI Antara teknik asas makmal yang seharusnya diketahui oleh seseorang penuntut mikrobiologi ialah pengamatan ke atas mikrooganisma serta sel-sel yang terinfeksi mikroorganisma dengan menggunakan mikroskop. Oleh itu. iaitu arus udara yang bergerak ke atas disebabkan haba dari api tersebut. untuk melaksanakan pengambilan inokulum dari spesimen tertentu atau penginokulasian sesuatu media. bekerja berdekatan dengan api ini amat digalakkan dan seharusnyalah menjadi amalan di bidang mikrobiologi. Mikroskop makmal .

sebahagian besar daripada cahaya akan dibiaskan disebabkan perbezaan indeks refraktif yang besar antara kaca dan udara. Keadaan ini memberikan imej yang lebih terang kerana cahaya yang melalui slaid mikroskop dan terkena pada spesimen yang sedang diamati tidak dibiaskan dan oleh yang demikian disalurkan ke dalam kanta rendaman minyak sebab indeks refraktif kaca dan minyak rendaman adalah hampir sama. Oleh yang demikian. Cahaya menjadi tertumpu dengan intensiti yang meningkat dan akan memberikan resolusi yang tinggi.yang biasa mempunyai sekurang-kurangnya tiga kanta objektif: objektif kuasa rendah (pembesaran 10X). Kanta okular (mata) biasanya mempunyai kuasa pembesaran 10X. Jumlah kuasa pembesaran adalah kuasa pembesaran objektif darab kuasa pembesaran kanta okula. kuasa sederhana (40-45X) dan kuasa tinggi (100X) atau rendaman minyak (kuasa yang paling tinggi). jika ruang antara spesimen dan kanta adalah udara. Sebaliknya. Dengan menggunakan cahaya biasa untuk memancarkan imej objek. cahaya yang dibiaskan pasti tidak akan masuk ke dalam kanta. Spesimen dihubungkan secara fizikal dengan kanta rendaman minyak melalui minyak rendaman. peringkat yang paling halus sekali .

yang boleh kita lihat (kuasa resolusi) adalah 0. struktur dan saiznya amat sukar dipastikan. 4. 2. Kertas/tisu kanta TATACARA 1. Slaid apusan bakteria yang telah diwarnai 3. resolusi mikroskop cahaya biasa ialah 300 nm. Pusingkan tombol pengatur fokus kasar perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga . Amatilah apusan melalui kanta okular (mata). 5. Sebenarnya. Putarkan objektif (40X) supaya berada tepat di atas apusan. Letakkan slaid di atas pentas/dataran mikroskop dengan apusan di sebelah atas. Minyak rendaman 4. Walau bagaimanapun. Turunkan objektif dengan memutarkan tombol pengatur fokus kasar sehingga jarak objektif berada kira-kira 1 mm di atas slaid.2 mikron (µm) atau 200 nm kerana ini adalah had yang ditentukan oleh gelombang cahaya yang dapat dilihat. 3. TATACARA MIKROSKOP CAHAYA Tatacara Menggunakan Mikroskop Cahaya Biasa BAHAN 1. Mikroskop cahaya 2.1. 2. kuasa resolusi 200 nm ini adalah dalam keadaan optimum dan sungguhpun objek boleh „diamati‟.

7. 14. 6. 9. Ulangi prosedur di atas dengan kanta objektif rendaman minyak (100X). Sebelum memulakannya terlebih dahulu naikkan kanta objektif (100X) sehingga ke had maksimum. 12.anda dapat melihat dan memfokus sesuatu pada slaid. Amatilah apusan melalui kanta okular. 15 11. Kemudian. Sambil mengamati melalui kanta okular. letakkan satu titis minyak rendaman di dalam lingkaran apusan pada slaid. Turunkan objektif semula sehingga terendam di dalam minyak rendaman dan hampir-hampir menyentuh slaid. 13. Setelah selesai pengamatan. 10. Tukarkan kepada kanta objektif (100X) dan turunkannya sehingga hampir-hampir menyentuh permukaan slaid. Lapkan minyak rendaman daripada objektif dengan kertas kanta kering atau dibasahi dengan sedikit . Pusingkan tombol pengatur fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga dapat memfokus sesuatu objek pada slaid. gerakkan objektif ke atas menjauhi slaid. Putarkan pula tombol pengatur fokus halus untuk mendapatkan imej objek yang tajam dan terang. putarkan tombol fokus halus perlahan-lahan supaya objektif bergerak ke atas sehingga anda dapat memfokus dan meneliti morfologi sel bakteria dengan jelas. 8.

objektif dapat diturunkan sehingga boleh melampaui paras pentas mikroskop dan apabila ini berlaku semasa pemfokusan besar kemungkinan penghujung objektif akan menekan ke atas slaid dan boleh menyebabkan slaid pecah. atau minyak rendaman yang diletakkan di atas apusan tidak mencukupi.xilena diikuti dengan kertas kanta kering yang bersih lainnya sejurus selepas setiap kali anda selesai melakukan pengamatan minyak rendaman. 3. Ini kerana dalam sesetengah jenis/jenama mikroskop. Sebelum melakukan pengamatan. 2. NOTA 1. pastikan terlebih dahulu apusan pada permukaan slaid berada di sebelah atas atau slaid tidak diletakkan dalam keadaan terbalik. Jika spesimen masih tidak kelihatan dengan kanta rendaman minyak ada kemungkinan spesimen tidak dapat difokus kerana tombol pengatur objektif mikroskop diputarkan terlalu cepat. Adalah suatu amalan yang baik jika dalam melaksanakan pemfokusan ke atas sesuatu objek. atau slaid melekat kepada kanta objektif dan turut bergerak ke atas semasa kanta digerakkan (masalah ini boleh diatasi dengan menekan slaid dengan satu jari semasa objektif digerakkan). atau mungkin juga slaid dalam keadaan terbalik . yang digerakkan adalah objektif mikroskop daripada permukaan slaid ke arah atas dan bukan sebaliknya.

5.1 Komponen-komponen mikroskop cahaya Tiub binokular Bahagian mata ( eye piece ) Bahagian mercu yang berputar Objektif Pentas Kondenser Pentas mikroskop Lampu Tombol pengatur fokus 16 4.dan apusan berada di sebelah bawah. lambat-laun debu akan melekat dan menutupi kanta tersebut dan akan menyebabkan pengamatan kabur serta . RAJAH 2. Penggunaan kertas tisu lain seperti kertas tisu muka. Jika minyak rendaman pada kanta rendaman minyak tidak dilap dengan baik. atau tisu tandas atau sapu tangan untuk membersihkan permukaan kanta hanya akan mengakibatkan calar ke atas kanta dan ini akan mempersulitkan pengamatan seterusnya.

menimbulkan kesulitan. Tatacara Penjagaan Mikroskop Cahaya Iklim di Malaysia adalah lembap dan keadaan ini menggalakkan pertumbuhan fungus pada permukaan kanta mikroskop. Terdapat jenama mikroskop yang kantanya dilapisi dengan bahan kimia untuk mencegah masalah ini, tetapi perlindungan ini, dipercayai tidak berkekalan. Ia perlu dirawat secara berterusan khususnya dengan menyalutkan semula bahan kimia berkenaan pada waktu tertentu. Cara yang mudah dan baik untuk mengatasi hal ini adalah dengan menyimpan mikroskop di dalam bilik atau ruangan tertutup yang dilengkapi dengan alat penyahlembap (dehumidifier) yang akan mempastikan suasana udara di dalam bilik atau ruangan tersebut sentiasa kering. 17 3. PENGAMATAN MIKROB 3.1. PENGAMATAN BAKTERIA 3.1.1. PENGAMATAN PERGERAKAN BAKTERIA DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Bakteria dalam keadaan semulajadi susah untuk diamati dengan mikroskop cahaya kerana bersifat transparen atau tidak mempunyai warna. Walau bagaimanapun, pengamatan dalam keadaan seperti ini terpaksa dilakukan juga, misalnya untuk menentukan pergerakannya (motiliti). Dalam hal ini terdapat dua tatacara yang boleh digunakan, iaitu pelekapan basah

dan titisan tergantung. Pengamatan motiliti bakteria di dalam suspensi cairan digunakan khusus untuk bakteria yang dikulturkan dalam media broth kerana tidak dapat tumbuh dengan baik pada media padat (agar). Tatacara Pelekapan Basah Bakteria BAHAN 1. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) 2. Slaid mikroskop 3. Penutup slaid 4. Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. 2. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sekeping slaid mikroskop bersih. 3. Sentuhkan gelung dawai steril kepada 1 koloni bakteria pada plat kultar. 4. Buatkan suspensi bakteria dari gelung dawai di dalam titisan salin di atas. 5. Letakkan sekeping penutup slaid di atas suspensi bakteria seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3.1. 6. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X. Sekiranya menggunakan kultur broth tukarkan langkah 4 kepada berikut: 4a. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk. 4b. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair bakteria (yang agak keruh atau tebal) ke atas slaid mikroskop.

Tatacara Pelekapan Titisan Tergantung BAHAN 1. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur) 2. Slaid mikroskop 3. Penutup slaid 4. Plastisin 5. Botol larutan salin (steril) TATACARA 1. Sediakan 1 titis suspensi bakteria di tengah-tengah sebuah penutup slaid mengikut tatacara pelekapan basah. 2. Buatkan 1 lingkaran/cincin plastisin berukuran tidak melebihi luas penutup slaid. 3. Letakkan lingkaran tersebut di atas penutup slaid supaya titisan suspensi berada tepat di tengah-tengah lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya lingkaran ini melekat kepada penutup slaid. 18 4. Letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas lingkaran plastisin dan tekan sedikit supaya ia melekat kepada plastisin. 5. Angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat supaya penutup slaid berada di atas dan suspensi bakteria menjadi tergantung. 6. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X. NOTA

1. Intensiti cahaya perlu dikurangkan dengan menurunkan kondenser dan mengecilkan diafragma untuk memberikan kontras yang secukupnya. Ini membolehkan sel bakteria kelihatan lebih jelas dan pergerakannya dapat diamati dengan mudah. 2. Semasa melakukan pengamatan jangan letakkan tangan di atas meja ataupun menekan meja di mana mikroskop berada. Ini adalah untuk mengelak daripada suspensi bakteria mengalami gegaran goncangan yang akan menyulitkan pengamatan. 3. Dalam pergerakan Brown, partikel (termasuk bakteria) bergerak perlahan-lahan secara bolak-balik (to and fro) tanpa arah tertentu. Kadangkala kesemua partikel bergerak ke satu arah menurut aliran cecair, atau disebabkan mikroskop tergoncang, atau berlakunya RAJAH 3.1 Tatacara melakukan pelekapan basah Letakkan setitis larutan salin di atas slaid mikroskop bersih dan sentuh 1 koloni bakteria dengan gelung dawai dan buatkan suspensi. Letakkan sebuah penutup slaid mikroskop dan dengan berhati-hati lekapkan di atas suspensi bakteria (usahakan supaya tidak terbentuk gelembung udara). Amatilah pelekapan basah ini di bawah kanta objektif pembesaran 40X. Rajah muka surat 18 19 penyejatan dari sisi kaca penutup. Motiliti sebenarnya ditunjukkan dengan gerakan yang

atau partikel individu bergerak dengan pantas menuju ke sesuatu arah tertentu. . dalam hal ini. atau buatkan suspensi bakteria di atasnya. untuk melakukan ujian motiliti. disarankan agar kultur cecair digunakan. Oleh yang demikian. Kemudian letakkan sebuah slaid mikroskop yang bersih di atas plastisin dan tekan sedikit supaya melekat kepada plastisin. 4. 5. Dengan demikian suatu suspensi bakteria yang tergantung akan dihasilkan.aktif bercorak putaran. suhu pengeramannya adalah di bawah 37°C. adalah kira-kira 2 jam dan bagi kebanyakan bakteria. RAJAH 3. Kebanyakan spesies yang diambil daripada kultur padat sering memberikan hasil yang negatif untuk motiliti (memperlihatkan tidak motil). Pengeraman optimum yang biasanya digunakan. Kelebihan tatacara ini daripada tatacara pelekapan basah adalah perubahan rupa bentuk (distortion) bakteria dikurangkan kerana tidak ditindih oleh penutup kaca. yakni 22°C atau 25°C.2 Tatacara melakukan pelekapan titisan tergantung Letakkan kaca penutup slaid di atas permukaan yang bersih dan titiskan. Dengan hati-hati letakkan cincin plastisin melingkari suspensi tanpa menyentuhnya. Dengan berhati-hati sekali angkat dan terbalikkan slaid mikroskop dengan cepat.

Cuci dengan air suling. Tatacara Membuat Apusan Bakteria BAHAN .2. Campurkan 5 ml asid hidroklorik pekat kepada 1 liter etanol 70%. PENYEDIAAN UNTUK PEWARNAAN BAKTERIA Tatacara Membersihkan dan Menyimpan Slaid Mikroskop BAHAN 1. Rendam slaid kaca di dalam alkohol asid semalaman. PERHATIAN Pastikan balang slaid tidak diletak berhampiran penunu Bunsen atau sebarang sumber api kerana alkohol mudah terbakar.20 3. Etanol 70% 3. Metanol 95% 4. Slaid mikroskop 2.1. 3.5%. Simpan di dalam balang tertutup yang mengandungi metanol 95%. TATACARA 1. Asid hidroklorik pekat PERSEDIAAN REAGEN Alkohol asid 0. Lakukan di dalam kabinet asap. 2.

2. Jauhkan bekas slaid yang mengandungi alkohol daripada api. Jangan pegang slaid yang dibakar dengan forseps secara tegak untuk mengelak kemungkinan alkohol mengalir ke atas tangan dan menyebabkan kebakaran. Kertas turas 4. 21 Kultur bakteria dari broth 1. 2. Penunu Bunsen 5. Keluarkan slaid mikroskop yang disimpan di dalam bekas yang mengandungi alkohol dengan menggunakan sebuah forseps bersih. Pensil gris/pena tanda (marker) kalis air 7. Sterilkan gelung dawai. Pegang slaid supaya aras tangan berada lebih tinggi daripada slaid. Hapuskan alkohol dengan membakarnya dengan api penunu Bunsen. .85% (steril) TATACARA 1. Kultur bakteria 8. Larutan salin 0. Slaid mikroskop yang disimpan di dalam metanol 95% di dalam bekas yang tertutup 2.1. Forseps 3. Letakkan slaid di atas kertas penyerap dan biarkan sehingga sejuk. Gelung dawai 6. 4. PERHATIAN 1. 3.

2. 2. 6. 4. Biarkan sehingga kering di udara. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid bersih. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Sebarkan suspensi bakteria sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 – 2 cm garis pusat. 5. 6. 8. 4. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair di atas sebuah slaid bersih. Swab yang mengandungi spesimen klinikal Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid dan emulsifikasikan spesimen dari swab di dalam titisan salin ini. Nanah dan eksudat . 3. Terbalikkan slaid dan buatkan lingkaran di sekeliling kawasan apusan dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Tandakan sudut kiri atas slaid dengan pensil gris atau pena tanda kalis air. Kultur bakteria dari media padat (agar) 1. Sterilkan gelung dawai. Sebarkan sehingga membentuk bulatan seluas kira-kira 1 cm garis pusat. 3. Biarkan supaya kering di udara. Sentuh 1 koloni bakteria yang terasing dengan gelung dawai. 7. Buatkan suspensi bakteria daripada gelung dawai di dalam titisan salin. 5.

Suspensi bakteria harus disebarkan dengan baik supaya menghasilkan apusan yang sama rata. Kacau. 4. . NOTA 1. Gunakan setitis suspensi sahaja supaya apusan cepat kering. Urin dan cecair serebrospina 1. 2. Kahak (sputum) Pindahkan sedikit kahak dari bekas spesimen dengan swab steril ke atas sebuah slaid bersih dan sebarkan seluas 1.000 g selama 10 minit pada suhu bilik.Ambil 1 gelung penuh spesimen dan sebarkannya di atas slaid supaya mencapai seluas 1. Pada apusan yang terlalu tebal. Gunakan sedikit kultur bakteria supaya apusan yang disediakan membentuk filem yang agak tipis.5 cm. Jika tidak. Tuangkan supernatan dan masukkan beberapa titis salin steril ke dalam tiub emparan ini. sel-sel bakteria akan kelihatan tersusun terlalu rapat dan padat sehingga sukar untuk menentukan morfologinya. 2. Buat apusan dengan suspensi bakteria yang diperolehi.5 cm. 3. Emparkan urin dan cecair serebrospina pada tekanan emparan 10. 3. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sebuah slaid. sel bakteria berada dalam keadaan berkelompok dan kemungkinan pewarnaan yang didapati juga tidak sama rata dan morfologi sel individu sukar untuk ditentukan.5 x 2.5 x 2.

Fiksasi Bakteria dengan Haba Sebarang proses yang membeku serta memejalkan sel bakteria dan strukturnya dikenali sebagai fiksasi . Sebelum bakteria diwarnai. Permukaan slaid di mana terdapatnya apusan ini dapat dipastikan dengan tanda pensil gris yang dapat dikikis atau pena tanda kalis air pada permukaan bawah slaid. pembunuhan bakteria adalah penting dalam pewarnaan kerana pada umumnya bakteria yang masih hidup sering bersifat kurang telap terhadap kebanyakan pewarna yang digunakan. Fiksasi boleh dilakukan dengan cara fizikal (haba. Justeru. di sekeliling kawasan apusan (di sebelah bawah slaid) dilingkari dengan pensil gris atau pena tanda kalis air supaya tapak di mana terdapatnya apusan mudah dikesan untuk diletak tepat di bawah kanta objektif serta untuk meletakkan titisan minyak rendaman. dehidrasi) dan cara kimia. Di samping kebaikan dari segi kesihatan. ia terlebih dahulu difiksasi. tetapi juga untuk mengekalkan (mengawet) struktur sel bakteria tersebut serta meningkatkan daya penglihatan ke atasnya. 5. pastikan bahawa permukaan slaid mikroskop yang mengandungi apusan berada di sebelah atas menghadap kanta objektif. Lazimnya. fiksasi juga boleh membunuh bakteria. Cara yang popular memfiksasi bakteria adalah dengan suatu menggunakan haba dari .22 4. Proses ini tidaklah semata-mata bertujuan untuk melekatkan sel bakteria kepada slaid. Dalam pengamatan ke atas sesuatu apusan dengan mikroskop.

Biarkan slaid dingin di udara. biarkan apusan sehingga benar-benar kering sebelum melakukan fiksasi. Pegang salah satu penghujung slaid dengan ibu jari dan jari telunjuk dengan apusan di sebelah atas. Akibatnya pewarnaan yang diusahakan akan sia-sia sahaja. Sebaik-baiknya. Lalukan slaid sekali dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen. sebab tidak akan memberikan hasil seperti yang diharapkan dan sebaliknya apa yang diperoleh ialah suatu keadaan yang dikenal sebagai artifak. 5. Dengan cepat sentuhkan slaid ke atas tapak tangan. NOTA 1. Pemanasan yang berlebihan akan menyebabkan perubahan besar dalam bentuk sel bakteria atau sel bakteria menjadi pecah dan mengalami kerosakan. Pemanasan ke atas apusan yang basah dipercayai boleh mengakibatkan perubahan rupa (distortion) morfologi bakteria yang ketara. Penunu Bunsen TATACARA 1. Adalah lumrah jika di dalam kelas amali terdapat pelajar yang memegang slaid dengan . Apusan bakteria ke atas slaid mikroskop 2. 3. 2. 2.sumber api. 4. Ulangi prosedur ini sebanyak 3 kali (kesemuanya). 3. Tatacara Memfiksasi Bakteria dengan Haba BAHAN 1.

Amalan ini tidak digalakkan kerana dengan cara demikian adalah sukar untuk menentukan sama ada fiksasi tercapai atau apusan telah terdedah kepada haba terlalu lama. Slaid disentuhkan ke atas tapak tangan selepas setiap kali pemanasan. perbezaan indeks biasan yang kecil antara komponen-komponen sel bakteria juga menyulitkan substruktur bakteria untuk dilihat. Pewarnaan juga digunakan untuk menunjukkan taburan dan jenis kimia berbagai-bagai komponen sel serta membezakan antara golongan-golongan bakteria. Melalukan slaid dengan cepat ke dalam api penunu Bunsen sebanyak 3 kali adalah mencukupi bagi tujuan pemfiksasian. Keadaan ini mengakibatkan sel bakteria sukar untuk diamati.1. Sekiranya slaid dirasakan terlalu panas pada tapak tangan maka besar kemungkinan sel bakteria pada apusan telah mengalami kehancuran atau telah berlaku artifak. juga akan menghilangkan haba dari slaid. Ini selain mempastikan slaid tidak terlalu panas. PEWARNAAN BAKTERIA Oleh kerana perbezaan indeks biasan antara bakteria dan kawasan sekelilingnya tidak besar. Sebagai langkah untuk mengatasi masalah ini perbezaan warna digunakan untuk memudahkan melihat keseluruhan sel bakteria dan juga untuk mempamerkan substruktur bakteria dan segala-galanya mengenai bakteria dengan lebih terperinci.forseps dan memasukkannya ke dalam api penunu Bunsen dengan tujuan untuk mengeringkan dan sekaligus memfiksasi apusan. maka jurang perbezaan optikalnya juga adalah sedemikian.3. Tambahan pula. Pewarna dan Jenis Pewarnaan . 23 3.

keseluruhan sel bakteria diwarnakan secara sama rata dan substruktur atau komponen-komponen selnya tidak dibezakan. ciri pewarnaan bergantung kepada kationnya (ion positif). Tindakan aksentuator ini tidak melibatkan . dengan demikian hanya latar belakang (kawasan di luar bakteria) sahaja yang diwarnai. ciri pewarnaan adalah bergantung kepada anion (ion negatif) dan pada pewarna bes . fenol atau anilin. tatacara pewarnaan perbezaan yang menggunakan dua atau lebih pewarna digunakan. pewarnaan ini disebut pewarnaan sederhana (simple staining).Bahan pewarna boleh dibahagikan kepada dua golongan: pewarna asid dan pewarna bes. mampu menyusup masuk ke dalam sel dengan lebih baik dan pewarnaannya lebih kekal. Bakteria menunjukkan kecenderungan atau afiniti yang kuat terhadap pewarna bes (contoh: safranin. Pada umumnya dalam pewarnaan ini. cas yang negatif ini akan bertindak dengan ion positif pewarna bes. Untuk menunjukkan perbezaan yang wujud di kalangan sel bakteria tertentu. berasal daripada terbitan garam asid bebas kerana bentuk ini lebih larut. Pewarna yang digunakan. Intensiti pewarnaan boleh dipertingkatkan (ataupun supaya sasaran dapat diwarnakan) dengan menggunakan haba dalam keadaan tertentu atau menggunakan bahan kimia ( aksentuator) seperti asid asetik. Apabila diwarnakan dengan pewarna bes. kristal ungu) kerana protoplasma bakteria mempunyai kandungan asid nukleik bercas negatif yang tinggi. Pada pewarna asid. Apabila sel bakteria diwarnakan dengan satu jenis pewarna sahaja. Sebaliknya cas negatif ini akan menolak pewarna asid. umumnya. metilena biru.

pergabungannya dengan pewarna seperti yang berlaku pada mordan. Mordan adalah bahan kimia yang membolehkan sesuatu pewarna mewarnakan sesuatu bahan, atau mordan mempertingkatkan afiniti ataupun kecenderungan pewarna terhadap struktur tertentu. Pewarnaan yang diterangkan setakat ini dikenal sebagai pewarnaan positif kerana yang diwarnakan ialah bakteria. Dalam pewarnaan negatif, satu filem pewarna gelap meliputi ruang dan celah di antara bakteria-bakteria (latar belakang) dan bakteria tidak diwarnakan. Perlu disedari bahawa ciri-ciri pewarnaan bakteria (serta morfologi) dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti umur kultur dan sumber bakteria, iaitu sama ada berasal daripada spesimen klinikal atau dari kultur pertumbuhan. Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram adalah tatacara pewarnaan utama di bidang bakteriologi. Di samping membolehkan bakteria dilihat dengan lebih mudah, pewarnaan ini juga digunakan untuk menggolongkan bakteria. Dalam tatacara pewarnaan Gram, pewarna digunakan secara berlebihan dan kemudian agen penghapus warna atau pembeza digunakan untuk 24 menghilangkan pewarna berkenaan. Bakteria yang mengekalkan pewarna pertama (kristal ungu) disebut sebagai Gram-positif, manakala yang kehilangan pewarna ini dan diwarnai dengan pewarna kedua dinyatakan sebagai Gram-negatif. Larutan iodin Lugol yang berfungsi sebagai mordan dan pelarut organik seperti alkohol dan aseton digunakan digunakan sebagai

pembeza atau pengnyahwarna. Pewarna yang digunakan untuk menggantikan pewarna pertama yang dihilangkan oleh pembeza disebut pewarna balas (counter stain). Hasil tindak balas pewarnaan Gram adalah bergantung kepada komposisi dinding sel bakteria yang berkemampuan untuk mengikat pewarna pertama atau tidak. Protoplasma bakteria, dalam hal ini, sentiasa memberikan tindak balas Gram-negatif. Tatacara Pewarnaan Gram BAHAN 1. Kultur bakteria 2. Kristal ungu 3. Iodin Lugol 4. Aseton-alkohol 5. Safranin/karbol fuksin 6. Kertas turas Tatacara 1. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop, keringkan di udara dan fiksasi apusan tersebut. 2. Liputi apusan dengan kristal ungu selama 1 minit. 3. Cuci dengan air, kemudian singkirkan keseluruhan air tersebut. 4. Liputi pula apusan dengan iodin Lugol selama 1 minit, kemudian buangkan. 5. Pegang slaid di dalam sinki secara condong dan titiskan dengan cepat aseton-alkohol ke atas apusan sehingga tiada warna biru (kristal ungu) terlihat keluar dari apusan (lebih kurang 3-10 saat bergantung kepada ketebalan apusan).

6. Segera cuci dengan air. 7. Kemudian liputi apusan dengan safranin atau karbol fuksin cair selama 30 saat. 8. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas penyerap (lipat kertas turas/penyerap, masukkan slaid ke dalam lipatan dan tekan kertas dari luar sehingga semua air terserap daripada slaid tanpa menggosok permukaan slaid atau apusan). Nota: peringkat No. 8 = cuci & keringkan Pengamatan dan Pentafsiran Sel bakteria berwarna biru: Gram-positif. Sel bakteria berwarna merah/merah jambu: Gram-negatif. NOTA 1. Dalam kebanyakan spesies bakteria, reaksi Gram berubah dengan umur kultur. Kultur tua bakteria Gram-positif memberikan reaksi Gram tak tetap (Gram variable) – ada sel yang terwarna biru dan ada yang terwarna merah bercampur di antara satu dengan lainnya. Ada juga bakteria Gram-positif seperti Corynebacterium yang mudah kehilangan warna pertamanya dan seringkali kelihatan sebagai Gram-negatif. 2. Pada beberapa spesies basilus aerobik yang menghasilkan spora (contoh, Bacillus subtilis), sel vegetatifnya akan terwarna Gram-negatif atau granul-granul di dalam sel diwarnakan Grampositif selama beberapa generasi selepas spora bergerminasi. 25 Pewarnaan Ziehl-Neelsen (Pewarnaan Tahan Asid) Mikobakteria yang diwarnakan dengan pewarna fenilmetana (contoh: fuksin bes) dalam larutan anilin

atau fenol akan mengekalkan warna tersebut meskipun telah didedahkan kepada asid yang kuat berbanding dengan bakteria jenis lain. Oleh yang demikian, bakteria golongan pertama ini disebut sebagai bakteria tahan asid . Sifat tahan asid ini merupakan ciri yang berfaedah dan penting dalam membezakan mikobakteria dengan bakteria lain. (Beberapa spesies aktinomiset juga tahan asid). Pada bakteria tahan asid, pewarna fenol mempunyai kelarutan yang tinggi di dalam sel dibandingkan dengan pembeza (penghilang warna). Oleh yang demikian, apabila bakteria yang didedahkan kepada penghilang warna, pewarna berkenaan kekal di dalam sel, manakala pada bakteria tak tahan asid pewarna tersebut akan hanya masuk ke dalam sel dan oleh penghilang warna. Di samping ciri-ciri ini, kadar resap pewarna pada sel yang tahan asid adalah rendah berbanding dengan sel tak tahan asid. Ciri-ciri ini disebabkan oleh perbezaan komposisi kimia (secara dan kualitatif) bakteria tahan asid dan bakteria tak tahan asid. Mikobakteria yang tahan asid mempunyai karbohidrat, alkohol dan asid lemak (seperti asid mikolik) yang tersendiri. Oleh yang demikian, dalam tatacara ini slaid perlu dipanaskan sehingga wap keluar kerana, dalam hal ini, kuantitatif kemudian disingkirkan daripada sel telah diwarnakan

Alkohol asid 4. Karbol fuksin Ziehl-Neelsen 3. (Pastikan pewarna tidak mendidih atau menjadi kering). Sebatang kaca yang satu penghujungnya dibalut kain kasa (gauz) 7. untuk membolehkan pewarnaan terlaksana dalam jangka masa yang Tatacara Pewarnaan Ziehl-Neelsen BAHAN 1. Metilena biru 5. Kultur bakteria 2. Penunu Bunsen TATACARA 1. Biarkan sejuk dan cuci dengan air.haba digunakan munasabah. Tambahkan alkohol-asid (penghilang warna) selama 25-30 saat. Kertas turas 8. Buat apusan bakteria pada slaid mikroskop. keringkan di udara dan fiksasikan apusan tersebut. . Banjirkan apusan dengan pewarna karbol fuksin Ziehl-Neelsen. Alkohol 6. 2. Lakukan ini sehingga keluar wap dari apusan selama 5-10 minit. Panaskan slaid dengan api pembakaran kain gauz yang dibasahi dengan alkohol. 3. 5. 4.

Elakkan daripada memanaskan slaid dan pewarna dengan memegang slaid dengan forseps dan memasukkannya langsung ke dalam api penunu Bunsen. Ini adalah suatu artifak yang disebabkan oleh beberapa faktor seperti kemurnian pewarna karbol fuksin. 7. NOTA 1. Liputi pula apusan dengan metilena biru selama 30 saat. Cuci dengan air. Kadangkala sel mikobakteria tidak terwarna sama rata dan kelihatan berjalur merah berselang-seli dengan bahagian tanpa warna atau kelihatan berbutir. Cuci dan keringkan dengan kertas penyerap. Volutin ini terdiri .6. Sel bakteria berwarna biru kehijauan: bakteria tak tahan asid. 2. Sebaliknya boleh juga dengan menggunakan sebatang kaca yang salah satu penghujungnya 26 dibalut dengan kain yang dicelup di dalam alkohol dan kemudian dinyalakan. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Sel bakteria berwarna merah: bakteria tahan asid. 8. 3. Pewarnaan Albert (Pewarna Granul Metakromatik) Volutin bakteria (granul metakromatik) adalah bahan basofilik yang refraktif. Pemanasan dilakukan dari bahagian bawah slaid (apusan di permukaan atas) yang diletakkan di atas rak pewarnaan iaitu dengan menggunakan api kecil penunu Bunsen. Jika spesimen klinikal digunakan. sel pesakit akan berwarna biru-kehijauan. daya kelarutan fenol di dalam air dan kehadiran elektrolit di dalam larutan pewarna.

granul volutin akan kelihatan merah dan bukan biru.daripada polimetafosfat yang mempunyai berat molekul tinggi dan dihubungkaitkan dengan bakteria genus Corynebacterium. Iodin Gram 4. Dalam keadaan ini. Jika diwarnai dengan kelihatan berwarna biru kehitaman dan bukan biru. volutin ini mengubahkan spektrum serapan (absorption) toluidina biru supaya pada mata kasar pewarna ini kelihatan telah berubah warnanya dari biru kepada biru kehitaman. komponen ini akan . Toluidina biru adalah pewarna metakromatik: apabila pewarna ini masuk ke dalam kompleks granul volutin yang besar. Tetapi jika metilena biru digunakan. Pewarna Albert 3. Tatacara Pewarnaan Albert BAHAN 1. pendedahan metilena biru kepada udara menyebabkan sebahagian kecil daripada pewarna ini dioksidasi menjadi metilena ungu pada pH tinggi dan metilena ungu secara selektif mewarnakan volutin tersebut. keadaan ini sebenarnya bukanlah merupakan fenomena metakromasi sungguhpun di dalam bidang bakteriologi ia dinyatakan demikian. Kertas turas toluidina biru. Walau bagaimanapun. Keadaan ini disebabkan oleh fenomena metakromasi yang melibatkan perubahan di dalam warna sesuatu bahan. Apusan kultur bakteria 2.

5. sedangkan pada sel tanpa butir-butir berwarna biru kehitaman di . 4. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna biru kehitaman di dalam sitoplasma bakteria yang berwarna hijau: Kehadiran granul metakromatik. Sitoplasma bakteria yang berwarna hijau dalamnya: Tiada granul metakromatik. Buat apusan pada slaid mikroskop. Tapak atau kedudukan spora di dalam sel serta saiz spora berbanding dengan sel yang mengandunginya mempunyai kepentingan taksonomi. Liputi apusan dengan pewarna Albert selama 5 minit. keringkan dan fiksasikannya. Cuci dengan air dan keringkan. Spora bakteria hanya dapat diwarnakan jika mordan atau haba digunakan.TATACARA 1. Pemanasan meningkatkan ketelapan dinding spora sehingga pewarna malakit hijau dapat dengan mudah masuk dan mewarnai struktur ini. 3. Semasa pendinginan/pencucian pewarna terperangkap di dalamnya. Liputi pula apusan dengan iodin Gram selama 1 minit. Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) Bakteria Genus Bacillus dan Clostridium dicirikan dengan kehadiran struktur bulat atau bujur yang dinamakan spora (atau endospora ). Cuci dengan air. 2.

. Apusan kultur bakteria 2. Pewarna malakit hijau nampaknya merupakan pewarna terbaik untuk pewarnaan spora bakteria. Biarkan selama 1 hingga 3 minit. 5. keringkan dan fiksasikannya. 6. Malakit hijau 5% 3. Cuci dengan air. Alkohol TATACARA 1. Batang kaca yang dibalut kain kasa pada salah satu penghujungnya 5. Kertas turas 6. Liputi apusan dengan malakit hijau 5%. Pewarna balas memberikan warna yang kontras supaya spora dapat dikesan dengan mudah. Panaskan sehingga wap keluar beberapa kali tetapi jangan sampai mendidih (tambah pewarna jika akan mengalami kekeringan).27 vegetatif. 7. 4. Cuci dengan air dan keringkan dengan kertas turas. 3. Tatacara Pewarnaan Schaeffer-Fulton (Pewarnaan Spora) BAHAN 1. Liputi pula apusan dengan safranin selama 30 saat. ia tercuci bersih. Safranin 4. 2. Buat apusan pada slaid mikroskop.

Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) Pewarnaan negatif dengan dakwat India membolehkan bakteria diamati dalam keadaan masih utuh dan tanpa perubahan rupa bentuk yang disebabkan oleh agen kimia (contoh: pewarna) dan agen fisikal (contoh: haba) serta membolehkan morfologinya ditentukan dengan cepat. Walau bagaimanapun. Disebabkan ketumpatan kapsul lebih rendah daripada sel. NOTA 1. 28 . tetapi granulgranul halus dakwat India hanya menghasilkan latar belakang yang gelap dalam bidang penglihatan. Butir berwarna hijau adalah spora bakteria. iaitu suatu struktur yang menyelubungi keseluruhan sel bakteria dan sukar untuk diwarnai. maka ia kelihatan lebih terang (di sekeliling sel). di dalam apusan akan kelihatan spora yang bebas. 2. tatacara ini jarang digunakan kecuali untuk mengamati kapsul. manakala bahagian sel vegetatif bakteria berwarna merah. Teknik ini sebenarnya tidak mewarnai sebarang struktur pada mikroorganisma. spora akan kelihatan tanpa warna atau berwarna pudar.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Butir-butir berwarna hijau di dalam sel bakteria yang berwarna merah ATAU butir-butir berwarna hijau bertaburan di luar sel bakteria. Oleh kerana sebahagian daripada sel telah mengalami lisis. Jika apusan bakteria tidak dipanaskan secukupnya.

Tutup campuran dengan penutup slaid. 2. Penutup slaid 4. Kultur bakteria 2. Dakwat India (Pelican TM atau Pilot TM ) TATACARA 1. 4.85% (steril) 3. Larutan salin 0. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN . Slaid mikroskop 5. 3.Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India (Pewarnaan Kapsul) BAHAN 1. Kurangkan cahaya mikroskop dengan menurunkan kondensernya dan amati kultur dengan objektif 40X (untuk fungus) atau objektif minyak rendaman (untuk bakteria). Campurkan dengan baik satu gelung kecil dakwat India ke dalam suspensi mikroorganisma yang telah disediakan. Letakkan setitis kecil kultur cecair ke atas slaid mikroskop atau buatkan suspensi organisma dari sedikit pertumbuhan kultur muda mikroorganisma pada media padat di dalam setitis salin dengan menggunakan dawai inokulasi.

Forseps jenis tukang jam tangan. NOTA 1. Tatacara Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1. Intensiti cahaya perlu dikurangkan untuk memberikan kontras yang lebih baik. Pewarnaan Negatif Flagela dengan Asid Fosfotungstik Pengamatan flagela bakteria dapat dilihat dengan mikroskop cahaya selepas berlakunya pewarnaan seperti pewarnaan tatacara Gray. ia melibatkan penggunaan logam berat yang akan menyumbang kepada pencemaran alam sekitar. bengkok No. tatacara pewarnaan flagela yang hasilnya kemudian diamati dengan mikroskop cahaya adalah sukar dilakukan. ia mempunyai nilai diagnostik. Jika terlalu banyak dakwat digunakan bakteria mungkin tidak dapat dilihat kerana transmisi cahaya terhalang. Sebagai pilihan lain. Namun demikian.7 . struktur flagela serta tapaknya lebih mudah dipastikan dengan mikroskop elektron melalui pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik. 2. 3.Kapsul kelihatan sebagai suatu lapisan cincin lutcahaya atau bersinar melingkari keseluruhan sel di atas latar belakang yang gelap. Klebsiella pneumoniae dan fungus Cryptococcus neoformans. Dalam hal ini. Tambahan pula. Kultur bakteria 2. Ia merupakan tatacara yang paling mudah untuk mengesan kehadiran kapsul dan sering digunakan ke atas spesies bakteria seperti Streptococcus pneumoniae.

Pindahkan 1 titis larutan asid fosfotungstik ke atas grid berkenaan dan biarkan 1 minit. Tatacara Pengamatan Grid yang Disaluti Spesimen Bakteria Selepas Pewarnaan Negatif Tatacaranya adalah seperti pengamatan partikel virus (lihat muka surat 41-42). 1 6. 3.85% (steril) 7. Gelung dawai 9. Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar 4. Penunu Bunsen 10. Tabung yang steril 8. Alat penyimpan grid atau piring Petri yang dialas dengan kertas turas 29 TATACARA 1. Kepingan kertas turas gred Whatman No. Larutan salin 0.5%. 5. Pindahkan 1 ml salin ke dalam tabung. Pindahkan 1 titis suspensi bakteria ke atas grid pada permukaan yang disaluti Formvar.3. Asid fosfotungstik 1. Walau . 4. 7. Biarkan 1 minit sebelum cairan diserap oleh kepingan kertas turas. 6. Sterilkan gelung dawai dan pindahkan 1 koloni bakteria ke dalam tabung. 2. pH 6. Serapkan larutan asid fosfotungstik dengan menyentuhkan pinggir grid dengan kepingan kertas turas.5 5. Simpan grid di atas alat penyimpan grid atau di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas.

. oleh kerana saiz bakteria lebih besar daripada virus.1. pengamatan fungus boleh dilakukan sama ada melalui pemeriksaan secara langsung ke atas spesimen yang diambil. Ini merupakan suatu kriteria yang berfaedah dalam pengenalpastian bakteria. Susunan sel-sel basilus: Tak teratur Spiroket Berfilamen Sel tunggal Berpasangan Berantai 30 Susunan sel-sel kokus: Kokus tunggal Diplokokus Tetrad (berempat) Palisad Basilus Vibrio Spirilla 3. 3. Berbagai-bagai susunan sel bakteria dikenali dan telah ditentukan berdasarkan perbezaan dari segi pertumbuhan serta strukturnya.bagaimanapun. kuasa pembesaran yang digunakan adalah di antara 5000 – 10 000 kali ganda sahaja. ataupun ke atas kultur dari sesuatu spesimen klinikal.2.4. PENGKELASAN BENTUK DAN SUSUNAN SEL VEGETATIF BAKTERIA Bentuk Kokus Susunan Bakteria yang membiak secara aktif mempunyai kecenderungan untuk mengekalkan susunan selnya yang menjadi ciri bakteria tersebut. PENGAMATAN FUNGUS Seperti juga bakteria.

perhitungan jumlah sel epitelium dan sel darah putih dapat dilakukan.85% 3. keutuhan sel dan organisma tersebut dapat dikekalkan. Letakkan 1 titis salin ke atas slaid mikroskop. 3.1. Kaca penutup slaid TATACARA 1. pelekapan basah fungus berperanan penting dalam pengenalpastian fungus serta diagnosis penyakit yang disebabkan olehnya. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN . di mana pelekapan basahnya hanya terhad kepada ujian motiliti. Larutan salin 0. Tambahkan 1 titis spesimen. PENGAMATAN FUNGUS DI DALAM SUSPENSI CAIRAN Pelekapan basah fungus di dalam salin dilakukan dalam pengamatan secara langsung fungus. 3. dan jika perlu.2.Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dalam bentuk pelekapan basah atau terhadap apusan fungus yang telah diwarnai. Spesimen yang disyaki mengandungi fungus 2. Tutup dengan kaca penutup slaid. 4. 2. Di dalam salin. Tatacara Pelekapan Basah Salin BAHAN 1. Amati dengan objektif 10X (jumlah kuasa 100X) dan kemudian 40X (jumlah kuasa 400X). Beberapa pewarnaan yang digunakan dalam bidang bakteriologi juga digunakan dalam bidang mikologi sungguhpun prosedurnya disesuaikan untuk fungus. Berbeza dengan bakteria.

Pelekapan Basah Kalium Hidroksida ( KOH) Spesimen kikisan kulit dan rambut diamati secara langsung untuk pengesanan fungus dalam pelekapan Berkelompok .Fungus akan kelihatan refraktil. 4. berkilat atau hijau pudar. NOTA Intensiti cahaya dikurangkan. Mosaik fungus (artifak): Jaringan jisim yang mempunyai bentuk yang berbeza-beza dan tidak teratur. Perbezaan di antara hifa dengan benang kapas: Pinggiran atau lebar (kaliber) benang kapas tidak teratur dan serat benang sering berpilin atau kelihatan melingkari sesuatu paksi dan penghujungnya berumbai. Berantai 31 2. bentuk kristal berbeza-beza dan larut air. dengan kondenser mikroskop diturunkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. biasanya terletak di penghujung atau perbatasan sel. PERHATIAN 1. Perbezaan hifa dengan kristal panjang: Penghujung kristal tidak bersambung atau terputus-putus. 3. Perbezaan di antara yis dengan gelembung udara dan sel darah merah: Sel yis mengandungi badan inklusi.

PERHATIAN Pelekapan KOH juga boleh digunakan untuk spesimen kahak ( sputum) atau spesimen daripada vagina yang banyak mengandungi bahan mukoid.basah yang terdiri daripada larutan penjernih . KOH (20%) melarutkan keratin dan memudahkan pengamatan ke atas hifa fungus. Jenis larutan kalium hidroksida penjernih termasuklah natrium lauryl 5% di dalam air suling. Penjernihan biasanya dilakukan dengan KOH mungkin kerana bahan kimia ini mudah didapati di dalam makmal. Spesimen 2. Tatacara Pelekapan Basah Kalium Hidroksida ( KOH) BAHAN 1. adalah legap dan latar belakang ini boleh menyelubungi fungus. rambut dan kuku. Kaca penutup slaid . Proses penjernihan dapat dipercepatkan melalui pemanasan. Kulit. Gliserin yang ditambah mengakibatkan pelekapan menjadi lambat kering dan menghalang presipitasi KOH. natrium sulfida 10% di dalam alkohol 20% dan larutan kalium hidroksida ( KOH) atau natrium hidroksida (NaOH). yang mengandungi keratin. Masalah ini boleh diatasi dengan menggunakan beberapa persediaan yang boleh menghancurkan serta melarutkan keratin supaya latar belakang menjadi jernih. KOH 10-20% 3.

tatacara ini dapat diubahsuai dengan penambahan dimetil sulfoksida ( DMSO ) 40%. Amati dengan objektif 10X dan kemudian 40X (jumlah kuasa. 6. Penutup slaid ditekan untuk memperoleh sediaan yang tipis dan untuk mengeluarkan KOH yang berlebihan. 32 PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Hifa adalah dalam bentuk filamen kurus dengan bahagian tepinya sejajar dan disusun secara rawak berbanding dengan sel. Masukkan spesimen ke dalam titisan KOH. Tekan kaca penutup slaid. masing-masing 100X dan 400X). 4. Pelekapan ini tidak dipanaskan dan diamati dalam masa 20 minit. Letakkan 1 titis larutan KOH di tengah slaid mikroskop. Panaskan dengan api pilot penunu Bunsen sehingga pelekapan basah ini menjadi jernih tanpa pendidihan (5-20 minit). NOTA 1. 2. Penunu Bunsen TATACARA 1.4. Intensiti cahaya dikurangkan untuk memberikan kontras yang secukupnya. 2. . 3. Tutup spesimen dengan kaca penutup perlahan-lahan. Untuk kuku dan kikisan kulit yang keras. 5.

Spesimen fungus 2. Jangan panaskan pelekapan KOH terlalu lama atau dengan suhu yang terlalu tinggi kerana akan terbentuk hablur KOH. fungus lebih mudah dapat diamati jika dibiarkan 1 hingga 2 jam. persediaan lactophenol cotton blue digunakan untuk membuat pelekapan basah fungus sama ada dari spesimen ataupun dari kultur untuk pengamatan mikroskop. Tatacara Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) BAHAN 1. 5. Dalam pengamatan ke atas fungus. Asid laktik mengekalkan struktur fungus serta menjernihkan latar belakang. 6. Pelekapan Basah Lactophenol Cotton Blue (LCB) Pelekapan basah yang juga mengandungi sejenis pewarna akan memudahkan pengamatan fungus. Pelekapan yang tidak jernih mungkin mengandungi artifak yang mirip dengan struktur fungus.3. Kaca penutup slaid . 4. Persediaan menjadi lebih jernih dan oleh yang demikian. gliserol mengelak pelekapan basah menjadi kering dan pewarna cotton blue diserap oleh struktur kitin fungus dan mewarnainya. jangan tersalah anggapan bahawa bahagian tepi sel (dinding sel) adalah hifa. maka memudahkan fungus diamati. fenol membunuh fungus. Slaid mikroskop 3. Dalam hal ini.

3. Jarum atau dawai dengan penghujungnya dibengkokkan 5. Ambil sebahagian kecil bahan fungus dari kultur dengan menggunakan jarum atau dawai bengkok di atas. Tutup spesimen dengan kaca penutup dengan perlahan tanpa menekan spesimen. Leraikan bahan fungus ini dengan menggunakan 2 dawai. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Miselium (dinding dan septum sel) serta struktur spora (fruiting structures) kelihatan biru tua di atas latar belakang yang berwarna pudar (muda). 5. 2. Struktur fungus lebih mudah dilihat jika pelekapan ini dibiarkan selama kira-kira 10 minit.4. Pada kultur fungus. 7. Bakar jarum atau dawai apabila sudah selesai. Titiskan 1 titis kecil LCB di tengah-tengah slaid mikroskop. 6. ambillah spesimen daripada bahagian koloni yang terletak di antara tepi dan tengahnya: bahagian tepi dan tengah koloni biasanya terdiri daripada struktur yang sama ada terlalu muda atau terlalu tua dari segi pembentukan spora dan berkemungkinan . Masukkan spesimen ke dalam titisan LCB . 4. Lactophenol cotton blue ( LCB ) TATACARA 1. Amati dengan objektif pembesaran 10X dan 40X. 2. 33 NOTA 1.

PEWARNAAN FUNGUS Pewarnaan Gram Semua fungus adalah Gram-positif. Pewarna tahan asid yang digunakan untuk mikobakteria mungkin menyahwarnakan pewarna secara berlebihan ke atas spesies ini dan memberikan hasil yang negatif palsu.2. Aktinomiset adalah golongan bakteria yang hampir menyerupai fungus dan secara tradisional dirangkumkan ke dalam bidang mikologi. muka surat 23-24). Sebaliknya fungsi haba diambil alih oleh sejenis detergen (Tergitol) yang bertindak di atas permukaan sel. . Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun Tatacara ini tidak menggunakan haba untuk memudahkan pewarna memasuki sel. Oleh yang demikian. 3. Nocardia adalah aktinomiset yang bersifat separuh tahan asid.akan memberikan hasil pengamatan yang kurang memuaskan.2. Tatacara Pewarnaan Gram Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan untuk bakteria (lihat pewarnaan Gram. Kapsul Cryptococcus neoformans lazimnya menghalang sel yis ini daripada diwarnai dengan sempurna dan seringkali mengakibatkan ia kelihatan seperti bahan lemak Gram-negatif berwarna merah jambu pucat (lavender) dengan badan inklusi yang bergranul berwarna ungu (Gram-positif).

Banjiri slaid dengan karbol fuksin Kinyoun dan biarkan selama 5 minit. . Hilangkan pewarna dengan asid sulfurik 1% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar. 6. 5. Karbol fuksin Kinyoun 3. 3. Metilena biru 2. kultur yang diuji) 2. Cuci dengan air yang mengalir. Penunu Bunsen TATACARA 1. Buatkan 3 apusan tipis. 8. Tatacara Pewarnaan Tahan Asid Diubahsuai Kinyoun BAHAN 1. Etanol 50% 4. 4.5% di dalam etanol 95% 6. Cuci dengan air.suatu pengubahsuaian pewarnaan tahan asid perlu dilakukan khususnya untuk Nocardia . kontrol kultur positif dan negatif dan biarkan kering di udara. Masing-masing daripada kultur yang diuji. Kultur fungus (kontrol kultur positif. Kertas turas 7. Asid sulfurik 1% 5. negatif. Banjiri dengan etanol 50% sehingga tiada lagi pewarna yang keluar (biasanya sejurus selepas alkohol ditambah). 7. Fiksasi apusan dengan haba. 2. Cuci dengan air.

Asid periodik 1% 4. asid periodik . Air suling PA S ). Tatacara Pewarnaan Asid Periodik-Schiff BAHAN 1. Liputi dengan larutan metilena biru selama 1 minit. Apusan spesimen pada slaid mikroskop 2. Reagen Schiff 5. Metanol mutlak 3. Askus yis kelihatan merah manakala blastokonidia berwarna biru. 10. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Nocardia kelihatan merah manakala bakteria lain dan fungus kelihatan biru. Pewarnaan Asid Periodik-Schiff Dalam pewarnaan asid periodik-Schiff (periodic acid-Schiff – mengoksidasi gugusan 1. Grup aldehid yang reaktif ini bergabung dengan reagen Schiff-leuko-fuksin untuk menghasilkan warna fuksin merah ungu.2-glikol daripada polisakarid fungus ke gugusan aldehid. Metil hijau 2% 6.34 9. Cuci dengan air dan keringkan. Pewarnaan ini amat berguna untuk mengesan fungus pada keratan tisu serta apusan seperti kikisan kulit.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Fungus (dan juga komponen tisu) yang mempunyai polisakarida di dalam strukturnya kelihatan merah ungu. Titiskan larutan asid periodik selama 10 minit. Pewarnaan Metenamin-Argentum Gomori Pewarnaan metenamin-argentum Gomori dianggap sebagai pewarnaan yang amat berguna dalam penyaringan spesimen klinikal bagi fungus. 2. NOTA 1. Aktinomiset tidak diwarnakan dengan baik atau langsung tidak diwarnakan dengan tatacara ini. nukleus kelihatan biru dan latar belakang adalah hijau. 4. Bilas seketika dengan air suling. 6. 3. 7. Titiskan reagen Schiff selama 20 minit. 5. Reagen ini masih boleh digunakan jika ia cepat berubah menjadi ungu-merah. 2. Cuci dengan air suling selama 15 minit dan keringkan. Pewarnaan ini memberi kontras yang lebih ketara dan . Fiksasikan apusan dengan metanol mutlak selama 5 – 15 minit. Keberkesanan tindakan pewarna Schiff boleh diuji dengan menitiskannya ke dalam formalin 40%. Sebaliknya. Cuci dengan air paip selama 10 minit sehingga warna merah jambu muncul. Balas warna dengan metil hijau selama 5 – 10 minit.TATACARA 1. ia tidak boleh digunakan lagi jika tiada warna yang muncul atau warnanya ungubiru.

Letakkan slaid yang mengandungi apusan di dalam larutan asid kromik selama 1 jam. Alkohol mutlak. 2. Forseps yang disaluti parafin 12.04% 9. Xilena 11. alkohol 70% 10. Asid kromik 5% 4. Ketuhar 3. Apusan spesimen pada slaid mikroskop 2. alkohol 95%. Natrium thiosulfat 2% 8. . Natrium bisulfit 1% 5.biasanya mewarnakan elemen fungus yang tidak ditunjukkan oleh pewarnaan lain. Aurum (emas) klorid 0. Cuci dengan air paip selama 15 saat. 35 Tatacara Metenamin-Argentum Gomori BAHAN 1. Permount TM TATACARA 1. Larutan metenamin-argentum nitrat (pewarna Gomori) 6.1% 7. Larutan light green 0. Bilas dengan natrium bisulfit selama 1 minit. 3.

6. 7. 13. Lekapkan dengan media pelekap Permount TM .4. Liputi apusan dengan larutan emas klorid 0. Letakkan slaid di dalam bekas yang mengandungi larutan metenamin-argentum nitrat dan eramkan bekas berkenaan di dalam ketuhar pada suhu 58-60°C. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN . Balas warna dengan pewarna light green selama 30-45 saat. Cuci dengan air paip selama 5 – 10 minit. 9. Keringkan dengan 2 pertukaran masing-masing alkohol 70%. 5. 17. 12. Bilas dengan air suling. 14. Cuci 3 kali dengan air suling. Jernihkan spesimen dengan 2 hingga 3 kali pertukaran xilena. 16. Bilas 6 kali dengan air suling apabila kontrol menunjukkan pewarnaan yang optimum telah dicapai. 95% dan mutlak. 11. 10. 8. Periksa apusan dengan mikroskop untuk menentukan sama ada fungus telah terwarna perang tua atau memerlukan pengeraman yang lebih lama. Hilangkan argentum yang tidak tereduksi dengan natrium thiosulfat selama 2 hingga 5 minit. 15.1% selama 2 hingga 5 minit. Cuci dengan air. Gunakan forseps yang diselaputi dengan parafin untuk mengeluarkan slaid dari larutan metenamin-argentum nitrat dan celupkannya ke dalam air suling.

Larutan stok metenamin-argentum nitrat adalah stabil jika disimpan di dalam peti beku. Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India . Nocardia serta fungus tua dan yang telah mati mungkin memerlukan masa pengeraman yang lebih lama (sehingga 90 minit) dengan larutan metenamin-argentum nitrat untuk diwarnai. Presipitasi putih yang muncul berikutan penyimpanan boleh dihilangkan dengan menggoncangnya. 5. keratan tisu terlebih dahulu dihilangkan parafinnya dengan 2 pertukaran rendaman di dalam xilena dan kemudian dihidrasikan melalui suatu urutan rendaman di dalam alkohol mutlak. Sesetengah bakteria (termasuk Nocardia spp) serta sesetengah komponen tisu juga diwarnakan. alkohol 95% dan air suling. 36 3. manakala bahagian di dalam miselium dan hifa diwarnakan kelabu tua dan latar belakang adalah hijau muda. Oleh yang demikian semua yang diwarnakan kelabu tua tidak semestinya fungus. NOTA 1. 2. Komponen tisu sebagai latar belakang diwarnai kuning dengan nukleus berwarna hitam. Tatacara ini boleh juga digunakan untuk keratan tisu dari ketulan parafin. Cryptococcus neoformans diwarnai merah muda gelap atau merah. Pastikan pewarnaan tidak menjadi telalu gelap hingga struktur morfologi halus tidak dapat diamati. 4. Dengan spesimen jenis ini.Dinding sel fungus (serta fiber retikulum dan fiber elastik tisu) terwarna hitam.

3. Bercabang Tak bercabang Membengkak Artrokonidia (artrospora) Blastokonidia (blastospora) Klamidokonidia (klamidospora) 37 Bentuk konidiofor: .2. khususnya bagi Cryptococcus neoformans di dalam mendapan cairan serebrospina dalam diagnosis kes meningitis. Morfologi mikroskopik Morfologi fungus bermiselium Hifa: Saiz: garis pusat yang berbeza Pigmentasi: tanpa warna atau berwarna Berseptum atau tak berseptum Bercabang atau tak bercabang Spora aseksual: Bentuk spora yang dihasilkan secara langsung dari miselium vegetatif. Spora asekual (konidia) yang dihasilkan daripada hifa khas yang disebut konidiofor. Tatacara Pewarnaan Negatif Kapsul dengan Dakwat India Tatacara tersebut adalah seperti yang dilakukan ke atas bakteria (Rujuk tatacara yang sama bagi bakteria) 3.Pewarnaan ini digunakan untuk menunjukkan kehadiran kapsul yis. BENTUK DAN STRUKTUR FUNGUS DALAM KULTUR 1.

spesimen yang akan diamati diletakkan pada sebuah slaid kaca yang kemudian diletak di atas pentas mikroskop. Dalam mikroskopi elektron. PENGAMATAN VIRUS DENGAN MIKROSKOP ELEKTRON Dalam pengamatan bakteria dan fungus dengan mikroskop cahaya. Filem yang nipis serta lembut ini diletak ke atas suatu jaringan halus berbentuk Bertunas Multipel Gada Sigar Bengkok dan berkeadaan tidak sempurna (distorted) .Konidia Makrokonidia (konidia bersaiz besar pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil) Septum: Berseptum atau tanpa septum Bujur Bentuk: Berasingan Berkelompok Berantai Raket Berbentuk gada (clavate) Bernodul Susunan dari konidiofor: Mikrokonidia (konidia bersaiz kecil pada fungus yang menghasilkan konidia yang besar dan kecil). spesimen diletakkan di atas satu lapisan tipis plastik atau karbon yang disebut filem sokongan . Bulut/sfera Bujur (ovoid) Ala buah pear (piriform) Bentuk: Tunggal Sabit 38 3.3.

Seperti juga bakteria dan fungus. Pengamatan ke atasnya boleh dilakukan dengan teknik mikroskopi elektron langsung ataupun dalam bentuk teknik pengubahsuaian mikroskopi elektron imun kesensitifan – yang dapat meningkatkan . diwarnakan secara negatif dan kemudian diamati dengan mikroskop elektron. sama ada ke atas spesimen yang diambil ataupun ke atas kultur daripada sesuatu spesimen klinikal. Dalam elektron mikroskop jenis transmisi. pengamatan terhadap virus boleh dilakukan secara langsung. Dua elektromagnet mempunyai fungsi seperti kondenser mikroskop cahaya untuk memfokuskan aliran elektron ini ke atas spesimen tersebut. Mikroskop elektron transmisi mempunyai julat kuasa pembesaran di antara 1500 hingga 500000 kali dan had kuasa resolusi 0.bulat yang dinamakan grid. dan satu siri kanta magnetik yang digunakan untuk membelok dan memfokuskan aliran elektron. Fokus yang halus boleh didapati dengan binokular berkuasa rendah. Komponen asas mikroskop elektron adalah sumber elektron.5 nm berbanding dengan kuasa pembesar mikroskop cahaya yang hanya berkisar di antara 30 sehingga 1500 kali dan had resolusi 200 nm. Penaburan elektron oleh spesimen menghasilkan imej yang diperbesar di atas layar pendaflour. Spesimen virus diletakkan di atas lapisan filem ini. aliran elektron yang digunakan sebagai sumber radiasi diarahkan ke atas spesimen.

Mangkuk kaca ~ 10 cm isipadu 6. Air suling .dalam pengesanan virus melalui mikroskopi elektron tersebut. Forseps 7. Filem sokongan ini diletakkan di atas grid kuprum berbentuk jaringan halus. Bahan-bahan yang berfungsi sebagai filem sokongan adalah plastik nitroselulos (contoh Parlodion TM ). plastik formal polivinil (Formvar TM ). Formvar E larutan 0. karbon murni. Tatacara Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar BAHAN 1. Grid kuprum 400 mesh.5% di dalam kloroform 2. Penyalutan Grid dengan Lapisan Formvar Virus perlu diletak di atas filem sokongan sebelum partikel virus dapat “diwarnakan” dan diamati. dan kedua-dua jenis plastik tersebut yang distabilkan oleh karbon. garis pusatnya bergantung kepada jenis mikroskop elektron 3. Slaid mikroskop 4. Pisau cukur 5.

7. Isikan bekas air dengan air suling sehingga penuh. 9. 8. 4. 39 5. Potong filem di bahagian yang berhampiran dengan tepi slaid supaya terdapat filem berbentuk segi empat. 2. Letakkan sekeping kertas turas di atas filem dan apabila kertas ini tenggelam ia dikeluarkan dan filem dibiarkan sehingga menjadi kering. Tekan grid perlahan-lahan dengan forseps untuk mencapai sentuhan yang baik di antara filem dan grid. Slaid yang dicuci dengan teliti (dengan asid alkohol) akan melekatkan filem dengan kuat sehingga . 6. Masukkan slaid ke dalam air pada sudut 30 darjah supaya filem terapung bebas pada permukaan air. Slaid dicelupkan ke dalam larutan formvar selama 15 – 20 saat. Pegang slaid berdekatan dengan mulut dan keluarkan nafas dengan kuat supaya permukaan filem diliputi dengan wap yang terkondensasi dari mulut. 3. NOTA 1. Tunggu sehingga semua gelembung udara bergerak ke permukaan air.TATACARA 1. Letakkan grid dalam 2 barisan di atas filem yang terapung-apung di atas air tersebut. Gunakan slaid mikroskop baru yang sengaja dilap dengan kertas pengering tangan. Slaid berkenaan kemudian dikeluarkan dan permukaan slaid dipegang secara tegak dengan paksi panjangnya agak disendengkan dan biarkan sehingga kering.

seperti virus. seperti pewarnaan virus. natrium tungstat dan garam . Terdapat beberapa pewarna negatif seperti natrium fosfotungstat. Proses perlekatan bahan protein ke atas filem memerlukan beberapa saat sahaja dan selepas itu. Penyalutan Virus Ke atas Grid dan Pewarnaan Negatif: Teknik Mikroskop Elektron Secara Langsung Spesimen diletakkan di atas filem sokongan melalui kaedah pemindahan titisan tunggal sebelum pewarnaan dilakukan. ke dalam suatu lapisan bahan berketumpatan tinggi supaya spesimen dapat diamati sebagai objek yang cerah di atas latar belakang gelap. 2. Pewarnaan negatif melibatkan penanaman (embedding) bahan kecil yang berpartikel. Pastikan air yang digunakan bersih. Oleh yang demikian. proses yang berikutnya. Keadaan ini wujud kerana kawasan yang mempunyai lebih “pewarna” seperti kawasan di sekeliling virus dan celah-celah permukaan virus akan menaburkan lebih elektron berbanding dengan kawasan yang kurang “pewarna”. jumlah elektron yang sampai ke layar dari kawasan yang mempunyai lebih “pewarna” adalah lebih rendah dan menyebabkan kawasan ini kelihatan lebih gelap daripada kawasan lainnya.membuatkannya sukar untuk ditanggalkan daripada slaid. ia tidak akan tanggal lagi kecuali jika dilarutkan atau dihadamkan. Oleh yang demikian. dapat dilakukan tanpa kehilangan virus.

Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus di atas titisan air suling selama 30 saat. 5. Kertas lilin 6. pH 6.5%. Asid fosfotungstik 1. 2. Letakkan grid tersebut di atas kertas gris dan biarkan sehingga kering. Tatacara Pewarnaan Negatif dengan Asid Fosfotungstik BAHAN 1. air suling dan pewarna dalam 1 barisan di atas sekeping kertas gris. Kepingan kertas turas gred Whatman No. Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar 4.5 TATACARA 1. Apungkan 1 grid dengan permukaan filem sokongannya bersentuhan dengan titis suspensi virus selama 3 minit. .7 3. 1 5. Forseps halus jenis tukang jam yang bengkok No. Tetapi natrium fosfotungstat merupakan pewarna negatif yang utama. Letakkan setitis (~ 20 µl) suspensi virus. Dengan forseps halus keluar dan sentuhkan tepi grid dengan sekeping kertas turas supaya dapat menghilangkan cairan yang berlebihan. 3. 40 4.uranium seperti uranil asetat. Sampel virus 2.

elakkan daripada berlakunya pencemaran silang dengan menggunakan forseps yang berbeza atau mencelupkan forseps yang telah digunakan di dalam air mendidih setiap kali sebelum digunakan semula. Bagi spesimen multipel. Permukaan grid yang disaluti dengan filem yang digunakan untuk melekatkan virus adalah permukaan di sebelah atas kertas turas.6. 5. 4. Keluar dan hilangkan cairan yang berlebihan. 3. 7. NOTA 1. Apungkan grid dengan permukaan yang didedahkan kepada virus ke atas titis pewarna selama 30 saat. Keluar serta hilangkan cairan yang berlebihan. Kertas turas yang dikoyak adalah lebih berkesan daripada yang digunting. Cecair yang berlebihan disingkirkan dengan menyentuhkan bahagian tepi grid sambil dipegang dengan penghujung forseps. 9. Pindahkan grid ke sekeping kertas turas yang terletak di dalam sebuah piring Petri. Ia diagihagihkan dalam jumlah kecil ke dalam botol dan disimpan beku kecuali satu botol untuk kegunaan semasa yang seharusnya disimpan di dalam peti beku. 2. Buang sediaan ini apabila didapati berubah kepada warna kebiruan. Asid fosfotungstik seharusnya disediakan dengan menggunakan air suling steril. Pegang grid dengan kemas dengan menggunakan forseps kerana grid-grid ini amat ringan dan mudah terlepas daripada forseps akibat tarikan tegangan permukaan titisan cecair. Teknik Mikroskopi Elektron Imun . 8.

Antiserum yang spesifik terhadap virus berkenaan 8. pH 6. 4. 1 6. Letakkan kertas lilin dengan campuran virus/antiserum di dalam piring Petri yang dialas dengan kertas turas lembap. Kertas lilin 7. Asid fosfotungstik 1.Kesensitifan mikroskopi elektron (ME) boleh dipertingkatkan iaitu dengan menggunakan antibodi yang spesifik untuk mengelompokkan partikel-partikel virus. Tatacara Mikroskopi Elektron Imun BAHAN 1. 2. Campurkan 15 µl virus dengan 15 µl tiap larutan antiserum ke atas sekeping kertas lilin.5 5. Forseps halus jenis tukang jam tangan 3. Larutkan antiserum dalam larutan salin ditampan fosfat (nisbah antiserum: larutan salin yang digunakan bergantung kepada sediaan antiserum). Grid mikroskop elektron yang disaluti filem Formvar 4. Kepingan kertas turas gred Whatman No. Eramkan campuran virus/antiserum di dalam bekas ini selama satu jam pada 37°C. Cara ini juga digunakan untuk menentukan identiti virus yang tidak mempunyai morfologi permukaan yang khusus. Sampel virus 2.5%. . 3. Larutan salin ditampan fosfat TATACARA 1.

4. Dalam tatacara ini. Suspensi virus murni boleh menyebabkan partikel virus dikelompokkan secara spontan. partikel virus akan disaluti dengan suatu lapisan protein yang tebal dan ini akan menyukarkan pengamatan ke atas struktur virus serta menyebabkan perubahan bentuk vitus berkenaan. tidak semestinya IgG atau IgM yang murni digunakan. Oleh yang demikian. Tatacara Pengamatan Spesimen Virus dengan Mikroskop Elektron . adalah amat penting sekali. Dalam keadaan antibodi yang berlebihan. Letakkan campuran ke atas grid dan warnakan mengikut bahagian “tatacara menyaluti grid dengan virus & tatacara pewarnaan negatif dengan asid fosfotungstik” di muka surat 39-40. 41 NOTA 1. Campuran virus dan antiserum daripada satu siri pencairan dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi antibodi yang optimum untuk menghasilkan pengelompokan virus. Pengamatan Spesimen Virus Terletak di atas Grid Mikroskop Elektron Persediaan penggunaan mikroskop memerlukan seseorang yang terlatih di dalam bidang ini. 3.5. jika teknik ini dilakukan dengan menggunakan spesimen tanpa campuran antibodi sebagai kontrol. Serum haruslah didedahkan kepada suhu tinggi (56°C) sebelum digunakan untuk menghapuskan komplemen yang boleh melisiskan sampul (envelop) virus. Apa yang akan dibentangkan dalam bahagian ini adalah cara untuk memasukkan spesimen ke dalam mikroskop dan beberapa petua untuk mengamati virus. 2. Serum biasa pun sudah mencukupi.

2. Untuk mengamati sesuatu objek dengan lebih teliti dan mendalam. gunakan binokular. Naikkan kuasa pembesaran kepada 60. 5. Kurangkan kuasa pembesaran kepada 80 kali dan pilih satu kawasan (segi empat sama) untuk diamati. Grid yang diliputi dengan spesimen yang diwarnakan 2. Mikroskop elektron jenis transmisi TATACARA 1. iaitu sebagai isyarat bahawa ruang hampas udara telah pun dicapai di dalam ruang spesimen. Letakkan spesimen dengan menggunakan forseps di dalam ruang khas pemegang spesimen (berhati-hati supaya tidak tersentuh bahagian pemegang spesimen yang akan diletakkan di dalam ruang hampas udara). 3.BAHAN 1. 8. Putarkan tombol fokus sehingga memperolehi imej yang paling jelas.000 kali ganda dan dalam masa yang sama pusatkan semula pancaran elektron serta tingkatkan intensitinya. 7. Skan secara teratur kawasan di dalam segi empat tepat yang dipilih supaya seluruh kawasan diamati. 6. supaya spesimen mencapai tempat yang ditetapkan. Letakkan batang pemegang spesimen ke dalam tapak yang ditetapkan dan tunggu sehingga lampu merah padam. Amati layar melalui tingkap pengamatan. 4. Putarkan batang pemegang ke arah lawan pusingan jam. NOTA .

janganlah mendapatkan kawasan yang gelap kerana virus akan terlindung/tersembunyi dan susah untuk diamati. Saiz serta bentuk virus. bawah. jika diketahui. REAGEN PEWARNAAN: RUMUSAN DAN PERSEDIAAN 1. 3. 2. Alkohol asid Campurkan 5 ml asid hidroklorik dengan 95 ml etanol 95%. 42 3. 2. iaitu yang berada di tengah. 3. Campurkan 1 ml asid asetik dan tambahkan 100 ml air suling. Dalam memilih segi empat tepat untuk diamati. dalam hal ini. atas serta kiri dan kanan grid sebelum spesimen tersebut dapat dianggap sebagai tidak mengandungi virus (iaitu pada tahap kesensitifan mikroskop elektron dalam mengesan virus). Oleh kerana terdapat kemungkinan bahawa taburan virus di atas filem grid tidak rata. Albert.1. Asid sulfurik . akan banyak membantu dalam proses pencarian virus berkenaan. amatilah 5 segi empat tepat.4. larutan pewarna Albert Larutkan 0. janganlah memilih segi empat yang kelihatan terlalu “bersih” kerana ia tidak dapat memberikan kontras yang baik di antara virus dengan latar belakangnya.15 g toluidina biru dan 0. Aseton-alkohol Campurkan aseton dan etil alkohol 95% dalam nisbah isipadu yang sama. 4.2 g malakit hijau di dalam 2 ml etanol 95%. Juga.

Campurkan 1 ml asid sulfurik pekat ke dalam 100 ml air suling. Lakukan di dalam almari asap. 5. Karbol fuksin Ziehl-Neelsen Larutkan 4 g fuksin bes di dalam 20 ml etanol 95%. Larutkan 5 g fenol di dalam 100 ml air suling. Campurkan kedua-dua sediaan ini. 6. Karbol fuksin Kinyoun Larutkan 2 g fuksin bes di dalam 10 ml etanol 95%. Larutkan 8 g fenol di dalam 100 ml air suling. Campurkan kedua-dua sediaan ini. 7. Karbol fuksin (0.05%) Larutan 0.05g fuksin bes di dalam 100 ml air suling. 8. Iodin Gram Larutkan 1 g kalium iodid di dalam 70 ml air suling. Tambahkan 0.5 g iodin dan tambah air sehingga mencapai 100 ml. Goncang sehingga keseluruhan iodin tersebut larut. 9. Kristal ungu Larutkan 1 g kristal ungu di dalam 100 ml air suling. 10. Lactophenol cotton blue Campurkan 20 ml asid laktik dengan 40 ml gliserol dan 40 ml air suling. Tambahkan 20 g kristal fenol dan larutkan dengan air panas di dalam penganggas air pada suhu 70°C. Kemudian tambahkan 0.075 g cotton blue. Larutkan pewarna cotton blue dengan meletakkan bekas di dalam penganggas air. Saring larutan ini dengan kertas turas. 11. Light green, Larutan pewarna

Larutkan 0.2 g Light Green, SF yellowish di dalam 100 ml air suling dan tambah 0.2 ml asid asetik glacial . Campurkan 1 bahagian larutan stok ini dengan 5 bahagian air suling untuk digunakan dalam pewarnaan. 12. Malakit hijau (5.0%) Larutkan 5 g pewarna di dalam 100 ml air suling. 13. Metilena biru (0.3%) Larutkan 0.3 g metilena biru di dalam 30 ml etanol dan tambahkan 100 ml air suling. 43 14. Metenamin-argentum nitrat, larutan stok Campurkan 50 ml larutan argentum nitrat 5% yang disediakan di dalam air suling dengan 100 ml metenamin (heksa-metilena-tetra-amin) 3% yang disediakan di dalam air suling. 15. Metenamin-argentum nitrat, larutan pewarnaan Larutkan 2 ml boraks (borax) 5% di dalam 25 ml air dan kemudian campurkan larutan ini dengan 25 ml larutan stok metenamin-argentum nitrat. 16. Reagan Schiff-leuko-fuksin Larutkan 1g fuksin bes di dalam 200 ml air suling yang mendidih. Kemudian kurangkan suhu kepada 50°C dan saringkan dengan kertas turas. Tambahkan 20 ml 1N HCl dan 1g kalium metabisulfit bentuk kontang. Biarkan di tempat gelap selama 2 hari. Tambahkan 0.5 g arang kayu yang teraktivasi dan goncang sekali-sekala dalam tempoh 1 jam. Saring dengan kertas turas dan simpan larutan reagen Schiff ini di dalam botol gelap di dalam peti beku. 17. Safranin (0.5%)

Larutkan 0.5 g safranin di dalam 100 ml air suling. 44 4. PENGKULTURAN MIKROB Mikroorganisma dan virus dikulturkan untuk beberapa tujuan. Dalam mikrobiologi diagnostik, ujian yang dijalankan ke atas kultur sesuatu mikrob tertentu dapat membantu mengenal pasti atau menentukan identiti mikrob berkenaan. Jika mikrob ini merupakan suatu agen “baru” yang mungkin belum dikenali, melalui pengkulturan dapatlah diwujudkan satu sumber atau bekalan kultur agen berkenaan supaya kajian boleh dijalankan untuk menentukan ciri-cirinya. Dalam bidang perindustrian dan bioteknologi, mikrob merupakan salah satu komponen yang harus diperolehi bagi penghasilan sesuatu produk, misalnya vaksin. Keadaan pengkulturan mikrob adalah berbeza-beza bergantung kepada jenis mikrob, misalnya bakteria ataupun virus. Kadangkala keadaan yang berbeza ini wujud walaupun di kalangan mikrob daripada golongan yang sama. 4.1. PENGKULTURAN BAKTERIA 4.1.1. JENIS MEDIA KULTUR Media kultur digunakan terutama untuk pertumbuhan bakteria (dan mikroorganisma lain) dan terdapat dalam bentuk pepejal, separuh pepejal dan cecair. Di samping pertumbuhan, media

juga digunakan untuk pemencilan, ujian motiliti dan menentukan ciri-ciri metabolik dan fisiologi bakteria. Media boleh dibahagikan kepada media sintetik (media yang diketahui kandungannya) dan media tiruan atau kompleks. Media sintetik adalah media yang semua komponennya merupakan bahan kimia yang nyata dan spesifik daripada segi kandungannya; manakala media tiruan adalah media yang mengandungi bahan-bahan kompleks seperti ekstrak daging lembu, yis atau darah di mana kandungannya kurang jelas atau tidak dapat dipastikan. Dari segi penggunaan, media kultur dibahagikan kepada beberapa golongan: Media dasar (juga dipanggil media nutrien atau media basal) yang mengandungi infusi , pepton , garam dan air. Infusi – Ekstraks daging. Pepton – Hasil daripada penghadaman enzim ke atas bahan organik. Contoh; Pepton soya disediakan daripada tindakan enzim terhadap kacang soya, pepton P adalah penghadaman daging oleh pepsin. Contoh: Agar nutrien, broth nutrien, broth infusi (otak-jantung, jantung, otak atau hati). Media diperkaya (enriched media) adalah media dasar yang dicampurkan dengan bahan yang boleh menggalakkan pertumbuhan seperti cecair tubuh (contohnya darah, serum), vitamin tertentu, asid amino, protein atau sebarang nutrien yang memiliki ciri yang khas dan tepat. Media pengaya (enrichment media) digunakan untuk pertumbuhan bakteria yang tidak tumbuh

Media pembeza (differential) adalah media dasar atau media diperkaya yang mengandungi bahan kimia . Contoh media diperkaya Nama media Bahan campuran khas Agar darah Darah utuh Agar coklat Darah yang dipanaskan Broth (atau agar) serum Serum Agar darah triptos Darah.baik pada media dasar atau kerana pertumbuhannya pada media ini lebih baik dan cepat berbanding dengan bakteria yang lazimnya tumbuh dengan pesat dan seringkali mengatasi kecepatan pertumbuhannya dalam media dasar. 45 1. Media pemilih (selective) adalah media dasar atau media diperkaya yang dicampurkan dengan bahan yang menghalang pertumbuhan majoriti jenis bakteria dan memberikan kelebihan kepada segolongan kecil bakteria lain yang diinginkan untuk tumbuh. arnab atau kuda. Media ini juga meningkatkan peluang untuk memencilkan bakteria tertentu di dalam sesuatu kultur campuran. triptos Agar Mueller-Hinton Kanji Sumber darah: kambing biri-biri.

Media pengaya (enrichment) digunakan untuk pemencilan (misalnya patogen usus) dengan merencat atau menekan pertumbuhan saprofit dan/atau flora normal tubuh. Pada hakikatnya.khusus yang akan bertindak ke atas sesetengah jenis bakteria melalui cara yang membolehkan bakteria berkenaan dikenali. Sebagai contoh. dalam broth selenit F natrium selenit pada pH 7. 2. Dari segi fungsi. ia memberi peluang kepada Salmonella dan/atau persaingan pertumbuhan spesies koliform lainnya. misalnya dalam bentuk perubahan warna koloni (fermentasi) ataupun perubahan kepada media itu sendiri (hemolisis). Contoh media yang mempunyai ciri pemilih dan pembeza Nama media Bahan pemilih Ciri pembezaan Ciri Indikator MacConkey Hempedu Fermentasi laktosa Neutral red Potassium telurit Kalium telurit Reduksi telurit Kalium telurit Shigella untuk membiak dengan lebih baik kerana kekurangan atau ketiadaan . kebanyakan media pembeza juga mempunyai reagen yang dapat menghalang pertumbuhan bakteria tertentu dan dalam hal ini. ia juga dianggap sebagai media pemilih. media pengaya boleh juga disifatkan sebagai media pemilih.0 adalah toksik terhadap bakteria koliform dan dengan demikian.

Deoksikolat sitrat Natrium deoksikolat Fermentasi laktosa Neutral red Kesan penghasilan H 2 S Ferik ammonium Sitrat Garam manitol Natrium klorida Fermentasi manitol Fenol merah Lowenstein-Jensen Malakit hijau – Fermentasi laktosa akan menyebabkan koloni menjadi merah atau merah jambu.1. bakteria dikulturkan ke atas plat media agar melalui teknik plat garisan untuk mendapatkan koloni bakteria yang terpencil. Penghasilan H 2 S akan menukar ferik ammonium sitrat kepada ferik sulfida dan pembentukan warna hitam pada koloni bakteria. Pada umumnya. 46 4. Reduksi telurit akan menghasilkan koloni berwarna hitam. Fermentasi manitol menghasilkan koloni bakteria berwarna kuning. BENTUK MEDIA AGAR Media kultur dipadatkan dengan agar dan disediakan dalam 2 bentuk. manakala pengkulturan pada cerun agar digunakan . sebagai satu lapisan rata di dalam plat Petri (juga dipanggil „plat agar‟/„piring agar‟) dan dalam bentuk cerun (agar cerun/ condong) di dalam tabung atau botol. Tiap-tiap bentuk agar mempunyai fungsi tersendiri.2.

4. Media agar 2. Tatacara Menyediakan Plat Media Agar BAHAN 1. 2. Bikar air yang mendidih 3. Penganggas air 4. Putarkan plat supaya agar tersebar sama rata. Larutkan media agar berisipadu kecil di dalam bikar air mendidih dan media agar berisipadu besar di dalam penganggas air atau autoklaf. 8. Letakkan larutan media agar ke dalam penganggas air bersuhu 50°C. Biarkan sehingga beku. 3. 5. Tutup plat dan simpan pada suhu 4 – 8°C jika tidak digunakan. Pada keesokan harinya pastikan tiada pertumbuhan (bakteria/fungus) atau kontaminasi berlaku ke atas media. Eramkan secara terbalik dengan penutup dalam keadaan terbuka pada suhu 37°C selama semalaman.untuk ujian biokimia atau sebagai kultur simpanan. 6. Piring Petri TATACARA 1. 7. Tuangkan 15 – 20 ml agar ke dalam setiap piring Petri bergaris pusat 90 cm. NOTA .

Sungguhpun suhu yang tinggi diperlukan untuk mencairkan agar. 2. Jika didapati demikian. Jika setelah penuangan media. Elakkan daripada menggoncang media agar sebelum dituangkan ke dalam plat. Semasa media agar digunakan. masih terdapat gelembung udara pada permukaan media plat. 3. segera hilangkan dengan mengarahkan/ melalukan api penunu Bunsen ke atas gelembung-gelembung tersebut sehingga semuanya terhapus/ tersingkir sebelum media menjadi beku. Pada agar yang tidak mengandungi bahan protein seperti darah. Koloni-koloni bakteria . pastikan permukaannya tidak basah. 4. Sebaliknya jika agar dibiarkan sehingga terlalu sejuk. besar kemungkinan bahan pelengkap (supplement) ini tidak akan bercampur dengan baik dan merata di dalam media. ada baiknya juga jika media agar dituangkan selepas suhu diturunkan kerana ini akan mengurangkan pemeluapan.1. media tersebut perlulah dikeringkan terlebih dahulu kerana penginokulasian di atas media yang berkeadaan sedemikian hanya akan menyulitkan pemencilan mikroorganisma nantinya. suhu tersebut mestilah diturunkan kepada 48°C sebelum darah dan bahan lain yang tidak tahan panas dicampurkan. apabila keseluruhan agar menjadi cair. Tindakan menggoncang ini hanya akan menyebabkan pembentukan gelembung udara di dalam media dan mengakibatkan media plat yang tidak rata apabila membeku kelak.

4. NOTA 1. Bikar air yang mendidih 3. Penganggas air 4. Tuangkan 10 hingga 15 ml media agar yang telah dicairkan ke dalam setiap tabung atau botol.yang seharusnya telah terasing. akan saling bersentuhan dan bercantum semula di antara satu dengan lain. 3. apatah lagi jika di kalangan bakteria yang ingin dipencilkan terdapat spesies yang dapat bergerak atau menunjukkan kemampuan untuk menyebar (swarming). Media agar untuk tujuan persiapan media agar cerun disediakan dan dibahagi-bahagikan ke dalam . 2. Simpan media cerun agar pada 4° – 8°C jika tidak digunakan. Tutup tabung atau botol tersebut dan sterilkan. 47 Tatacara Menyediakan Media Agar Condong/Cerun BAHAN 1. misalnya Proteus spp. Setelah pensterilan. Media agar 2. letakkan tabung atau botol dalam keadaan condong dan biarkan membeku pada suhu bilik. Tabung/botol TATACARA 1.

1. dengan teknik aseptik.tabung atau botol dan kemudian disterilkan. Kemudian tambahkan bahan berkenaan yang steril dan campurkan dengan baik dan merata. sama ada melalui teknik plat garisan atau teknik plat tuangan (pour plate). Ini boleh mengelakkan daripada tercemar semasa membahagikan media yang telah disterilkan terlebih dahulu ke dalam tabung atau botol. kultur murni diperolehi dengan menggunakan media padat. Selepas pensterilan. Teknik plat garisan merupakan teknik yang paling mudah untuk mendapatkan koloni terpisah dan terasing. maka media dalam isipadu yang besar tersebut perlu disterilkan terlebih dahulu. bahagi-bahagikan media berkenaan dalam isipadu yang ditetapkan ke dalam tabung atau botol yang terlebih dahulu disterilkan. Sebaliknya. jika sesuatu bahan yang ingin dicampurkan ke dalam media adalah daripada jenis yang tidak tahan panas. maka satu koloni akan hanya terdiri daripada satu jenis atau spesies sahaja. Umumnya. KULTUR MURNI Plat Garisan Kultur murni adalah kultur yang mengandungi satu jenis atau spesies bakteria sahaja. 4. dinginkan sehingga mencapai suhu sekitar 48°C. 2. Berdasarkan teori bahawa satu koloni bakteria merupakan hasil daripada pertumbuhan yang berasal daripada satu sel bakteria. Bakteria daripada koloni ini kemudian boleh ditumbuhkan semula supaya semua koloni di dalam sesuatu plat terdiri daripada jenis bakteria . Kemudian.3. sungguhpun teknik aseptik diamalkan.

Piring Petri yang mengandungi media agar 48 3. Tatacara Plat Garisan BAHAN 1. Kultur yang sedemikian ini dikenali sebagai kultur murni dan menunjukkan pertumbuhan koloni yang morfologinya kelihatan serupa di antara satu dengan lain. 4. reaksi imunologi dan kepekaannya terhadap berbagai agen antimikrob. 2.yang sama. ambil spesimen dengannya. reaksi pewarnaan. 3. morfologi sel. biokimia. Labelkan plat Petri yang mengandungi media pertumbuhan yang steril (pada bahagian dasar atau bawahnya dan bukan di atas penutupnya). Letakkan plat Petri tersebut dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. Gelung dawai 4. Penunu Bunsen TATACARA 1. Kultur murni penting kerana ia diperlukan dalam kajian-kajian mengenai pelbagai ciri sesejenis bakteria. Pegang dan angkat bahagian dasar plat sehingga permukaan media yang terdedah menghadap anda. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan setelah sejuk. . misalnya ciri morfologi koloni. Kultur bakteria 2.

6. 10. Sebarkan inokulum seluas 1 cm garis pusat. Bermula daripada sebaran di atas gariskan inokulum dengan menggerakkan gelung bolakbalik supaya garisan meliputi satu kawasan seluas kira-kira sepertiga daripada plat. 9. 8. Pastikan garisan yang terakhir tidak menyentuh sebaran inokulum yang pertama. 3. Pastikan juga garisan yang dibuat tersebut rapi. usahakan menggaris perlahan-lahan supaya anda tidak sampai mencung-kil atau merobek media sehingga mengakibatkan media menjadi pecah-pecah. Letakkan gelung yang mengandungi spesimen di atas permukaan media agar kira-kira 1 cm daripada dinding plat Petri tersebut. 2. yang penting ialah menyentuh gelung pada permukaan media dan menggariskannya. 4. Garisan seterusnya bermula daripada kawasan di sekitar penghujung garisan-garisan pertama. Gunakan penghujung gelung dawai sahaja untuk menyentuh permukaan media supaya mendapatkan garisan yang halus dan tipis. Gelung dawai dibakar semula selepas garisan dibuat pada bahagian pertama piring Petri . Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan pada suhu tertentu dalam keadaan terbalik. berterusan tetapi terpisah serta tidak saling memotong atau bersilang di antara garisan atas dengan yang di bawahnya supaya mendapatkan koloni bakteria yang berasingan. Dalam membuat garisan. 7.5. Putarkan plat ~ 90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan mengulangi prosedur di atas sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permukaan media. Bakar semula gelung dawai dan biarkan sejuk. 11. NOTA 1.

4. maka koloni bakteria yang terpisah akan didapati. ciri genetik dan antigenik bakteria berkenaan.1. Koloni bakteria biasanya diamati berdasarkan pertumbuhannya di atas media padat.supaya inokulum (jumlah bakteria) dikurangkan. 49 RAJAH 4. 6. suhu pertumbuhan. Jangan bercakap semasa melakukan prosedur ini untuk mengelakkan semburan air liur terjatuh ke atas permukaan media agar. Bekerjalah berdekatan dengan sumber api. CIRI-CIRI KOLONI BAKTERIA Kajian mengenai koloni bakteria adalah penting kerana ia boleh memberikan maklumat lanjut mengenai identiti. . aktiviti biokimia. Terbalikkan plat Petri yang me-ngandungi media dengan bahagian dasarnya di sebelah atas. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan secara terbalik supaya sebarang pemeluapan yang berlaku pada penutupnya tidak akan menitis ke atas kultur. Dengan gelung dawai steril pindahkan kultur/spesimen ke atas media plat dan inokulum seluas 1 cm garis pusat.1 Cara melakukan plat garisan 4. ciri-ciri koloni bakteria dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti jenis media. umur kultur. 5. Seperti juga ciri-ciri morfologi sel bakteria. strain bakteria dan semua keadaan ini biasanya diambil kira dan dinyatakan semasa menghurai sesuatu koloni bakteria.

1. Batasan secara radial : permukaan berbatas-batas yang terpancar dari tengah-tengah koloni. Putarkan plat 60-90 darjah dan buatkan pula beberapa garisan. Bentuk: Bulat Tidak teratur Berfilamen Berserabut Bertitik bujur 2. Permukaan: Tekstur Licin Kasar Berkontour : permukaan licin dan undulat (beralun) secara tak teratur. Berkerut . Pinggiran/konfigurasi (ditentukan dengan mikroskop): Menyeluruh Beralun Lobate Erose Gariskan inokulum secara bolek-balik bermula daripada sebarannya sehingga meliputi kira-kira sepertiga kawasan plat. 50 3. Permukaan: Elevasi Datar Menaik Cembung Umbonat Pulvinat Cembung papilat Cembung berkerut 4. Ulangi kaedah ini sehingga garisan meliputi keseluruhan kawasan permu-kaan media.

Struktur dalam (ditentukan dengan mikroskop): Bergelung 51 8. Seperti mentega atau lekit. 7. Pertumbuhan yang nipis seperti membran. Ciri optik: Luster Legap Lutsinar Opalesens : Seperti warna baiduri (warna putih-kebiruan atau warna susu dengan ciri warna yangkekilatan berubah-ubah) Iridesens : Warna yang berubah dengan sudut (posisi) koloni dipandang. Pendaflour – satu warna dengan cahaya transmisi dan warna lain (yang cerah dan terserlah) dengan cahaya pantulan (berpendafluor). Permukaan: Konsistensi Kelihatan kering & rapuh.5. 6. Perubahan kepada media Hemolisis (pada agar darah) Berfilamen Bergranul . Likat: Pertumbuhan mengikut bekas garisan dawai inolukasi. Pudar Berkilat Fotogenik – memancar di dalam gelap.

Penghasilan pigmen Perubahan kepada media pembeza Penghasilan bau atau aroma Istilah Bahasa Malaysia dan Istilah Bahasa Inggeris dalam pencirian koloni bakteria tidak teratur irregular berserabut rhizoid bertitik punctiform menyeluruh entire beralun indulate keriting curled datar flat menaik raised cembung convex imbonat imbonate pulvinat pulvinate cembung papilat convex papillate cembung berkerut convex rugose batasan secara radial radially ridged berkerut rugose rapuh brittle seperti mentega/lekit butyrous .

beberapa faktor lain di alam sekeliling juga mempengaruhi pertumbuhan dan tumbesarannya. glossy 4.5. tenaga yang digunakan untuk menjalankan proses biosintesis berpunca daripada tindakan oksidatif ke atas bahan organik. Terdapat pula segolongan bakteria yang dinamakan aerotoleran kerana berkeupayaan untuk tumbuh di dalam udara. maka bakteria dari lingkungan yang berbeza memerlukan keadaan sekeliling yang berbeza pula untuk pertumbuhan yang optimum. Di samping pengaruh kandungan media ke atas pertumbuhan bakteria. terdapat juga bakteria yang sama sekali tidak dapat menggunakan oksigen sebagai penerima akhir hidrogen (anaerob obligat). Oleh yang demikian. Faktor ini termasuk suhu pengeraman. Bakteria golongan ini melakukan . Oleh yang demikian ia hanya dapat tumbuh dalam kehadiran oksigen.pudar dull berkilat glistening. aras oksigen. Sebaliknya. Ada bakteria yang hanya boleh menggunakan oksigen bebas sebagai penerima akhir hidrogen ( aerob obligat). air. KEADAAN PERTUMBUHAN BAKTERIA DI DALAM MAKMAL Oleh kerana penyesuaian bakteria kepada alam sekelilingnya. osmolariti media dan kepekatan ion hidrogen (pH).1. pengkulturan bakteria di dalam makmal hanya dapat dicapai jika keadaan alam persekitarannya dapat diwujudkan. Justeru itu ia tidak dapat tumbuh dalam keadaan kehadiran oksigen dan kemungkinan akan mengalami kematian apabila terdedah kepada gas berkenaan. Pengeraman Bakteria dalam Keadaan Anaerobik Pada bakteria heterotrof. sungguhpun ia tidak menjalankan metabolisme oksidatif.

Satu pek katalis . Penunu Bunsen 6. apabila ditumbuhkan dalam kehadiran udara (oksigen). Satu paket GasPak 3. Sekumpulan besar bakteria mempunyai sistem enzim yang boleh menggunakan oksigen atau terbitan organik sebagai penerima akhir hidrogen ( aerob fakultatif atau anaerob fakultatif). Bakteria jenis ini boleh tumbuh secara anaerobik dan dalam keadaan ini akan memfermentasi karbohidrat dengan menghasilkan produk fermentasi seperti berbagai-bagai jenis asid. Pipet 4. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik di dalam Balang Anaerobik dengan GasPak tm BAHAN 1. Terdapat segolongan bakteria lagi yang menunjukkan pertumbuhan optimum pada kadar oksigen yang rendah dan bakteria ini dikenal sebagai mikroaerofilik. metabolismenya akan berubah kepada keadaan aerobik dan 52 karbohirat umumnya akan dioksidasi kepada air dan CO 2 .fermentasi meskipun dalam kehadiran oksigen. Air 5. Balang anaerobik (jenama GasPak) 2. Walau bagaimanapun.

Kemudian lekapkan penutup tepat pada kedudukannya menutupi mulut balang. Pasang alat pencengkam penutup supaya balang tertutup dengan rapi dan rapat sehingga tidak dapat ditembusi udara. Gunakan balang anaerobik yang sedia dilengkapi dengan 1 pek mangkin aktif yang dilekatkan kepada penutupnya. 3. 8. Masukkan 10 ml air paip ke dalam GasPak dengan pipet. 5. Potong salah satu sudut atas paket GasPak dan letakkan sampul GasPak secara menegak di sebelah susunan plat. Letakkan indikator redoks (oksidasi-reduksi) di sebelah susunan plat. Balang jenama GasPak menggunakan katalis atau mangkin „sejuk‟ yang tidak perlukan dipanaskan . Katalis – biji-biji aluminium disaluti paladium GasPak TM – kit penjana/pembebas hidrogen NOTA 1. 7. Indikator redoks TATACARA 1. 4. 2.7. 6. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam balang. Eramkan keseluruhan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37°C semalaman.

Tetapi masa kehilangan warnanya dicapai lebih lewat daripada pencapaian keadaan anaerobik di dalam balang. CO 2 5%. 2. Mangkin ini kemudian disimpan di dalam tempat kering atau balang pengering (desikator). 3. Tatacara Mewujudkan Keadaan Anaerobik dengan Pengisian Gas Nitrogen ke dalam Balang Anaerobik BAHAN 1. H 2 10%) . Dalam keadaan tanpa oksigen metilena biru akan menghilangkan warnanya. Pada balang anaerobik yang menggunakan mangkin yang perlu dipanaskan dengan arus elektrik atau api. Tangki silinder gas campuran (N 2 85%.sejurus sebelum GasPak digunakan. Indikator redoks metilena biru digunakan untuk memastikan keadaan anaerobik dicapai. pastikan proses ini dilakukan jauh dari gas yang boleh meletup. Butir-butir mangkin yang terpakai dipulihkan kepada aktiviti penuh dengan dipanaskan di dalam ketuhar pada suhu 160-170°C selama 2 jam. Balang anaerobik (plastik atau logam)/bekas berbentuk silinder 2.

3. Eramkan balang bersama isi kandungannya di dalam inkubator 37°C selama semalaman. Gunakan balang anaerobik yang terpakai (atau bekas plastik berbentuk silinder yang mempunyai dua lubang kecil pada penutupnya). 7. 6. Buka salah satu kepala salur gas dan hubungkan dengan tiub ke sebuah pam vakum dan kemudian sedut keluar udara di dalam balang sehingga terbentuk ruang hampa gas sepenuhnya. NOTA Penutup bekas yang digunakan mesti berbentuk bulat kerana bentuk ini mempastikan ia tidak ditembusi . Buka kepala salur gas kedua ini dan salurkan gas ke dalam balang sehingga terisi penuh kemudian tutup dengan rapat. 2. 5. 4. Masukkan media plat yang telah diinokulasi ke dalam bekas ini dan kemudian tutup rapat dengan bantuan pencengkam penutup tersebut. Tutup rapat kepala salur gas pertama ini dan sambungkan sebuah tiub pada kepala kedua yang menghubungkannya dengan tangki silinder gas campuran.53 TATACARA 1. Tanggalkan semua tiub penyambung pada balang dan tutup lubang kepala salur gas dengan pita selofan.

4. Sebatang lilin 3. NOTA 1. Nyalakan lilin tersebut dan masukkannya ke dalam bekas. Prosedur ini akan mengelakkan kemungkinan lilin yang sedang menyala daripada terjatuh dari tempatnya semasa tin dipindahkan. Tutup tin dengan rapat dan biarkan sebentar sebelum tin dieramkan supaya lilin terpadam dengan sendirinya. 2. 3. Bekas logam dengan penutup berbentuk bulat (tin susu tepung) 2. Slaid mikroskop TATACARA 1. Gunakan tin dengan penutup berbentuk bulat supaya tin dapat ditutup dengan rapat. Lekatkan sebatang lilin kepada sebuah slaid kaca mikroskop. Tempatkan lilin berjauhan dengan piring Petri yang mengandungi media yang telah diinokulasi.udara. Tatacara Balang Lilin dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida BAHAN 1. Pastikan saiz tin yang digunakan tidak terlalu kecil supaya terdapat sedikit ruangan untuk menempatkan lilin yang menyala pada jarak yang agak berjauhan dengan piring Petri. 3. 2. Keadaan atmosfera yang dicapai di dalam balang lilin adalah CO .

NOTA 1. Alat inkubator CO . Apa yang akan dibentangkan di sini hanyalah beberapa nota mengenai jenis inkubator CO 2 dan penggunaan alat ini. Tatacara Menggunakan Inkubator Karbon Dioksida dalam Pengeraman Kultur dalam Keadaan Atmosfera Karbon Dioksida Inkubator CO 2 merupakan suatu alat yang lumrah didapati di makmal mikrobiologi. Instrumentasi adalah di luar skop buku ini dan haruslah mengikuti arahan dengan teliti di dalam buku operasi (manual) yang dibekalkan 54 bersama-sama dengan alat ini. Dengan adanya alat ini pengeraman kultur bakteria (ataupun kultur sel) di dalam atmosfera CO 2 adalah lebih mudah dilakukan di samping kehadiran ruang yang boleh memuatkan lebih banyak kultur.2 5%.

Alat inkubator CO 2 yang mempunyai sensor jenis inframerah membolehkan paras CO 2 di da-lam inkubator kembali ke paras asalnya dengan lebih cepat berbanding dengan sensor jenis konduktiviti termal (haba). 3. 4. Sistem ini mengelakkan pembaziran gas.2 yang mempunyai jaket air adalah lebih cekap dalam menstabilkan suhu dan melambatkan penurunan suhu jika bekalan elektrik terputus. Rancangkan terlebih dahulu dalam tempoh masa kerja. 2. Alat inkubator CO 2 yang lebih moden mempunyai mekanisme yang menghentikan bekalan gas ini secara automatik semasa pintu dibuka dan menyambungnya semula hanya apabila pintu ditutup semula. ia lebih sesuai bagi inkubator yang kerapkali dibuka. 5. Oleh yang demikian. Pastikan juga terlebih dahulu apa yang akan dikeluarkan daripada inkubator CO 2 . apa yang akan disimpan atau dikeluarkan daripada inkubator CO 2 ini supaya dapat mengelak daripada terlalu kerap membuka-nya.

sama ada kontaminan (fungus saprofitik daripada alam sekitar) atau fungus patogenik.6. Media padat ini terdiri daripada dekstrosa 4%. Jangan gunakan inkubator CO 2 yang sama untuk kultur bakteriologi dan kultur sel untuk mengelakkan pencemaran bersilang. Pada kultur bakteria.atau dimasukkan supaya dapat mengurangkan lamanya ia dibuka.2. MEDIA KULTUR Media kultur utama yang digunakan untuk kultur primer fungus (pengkulturan daripada spesimen klinikal) adalah agar dekstrosa Sabouraud ( SDA) yang merupakan sejenis media dasar seperti juga agar nutrien. 7. aras CO 2 ditetapkan pada 7% dan kultur sel 5%. Agar dekstrosa Sabouraud yang dicampurkan dengan cycloheximide 0.5-2% dan mempunyai pH asid 5. pepton 1% yang sesuai untuk fungus dan agar 1. 6.05% dan Chloramphenicol . PENGKULTURAN FUNGUS 4.2. 4. kecuali Histoplasma capsulatum dan beberapa strain aktinomiset seperti Nocardia asteriodes . Keadaan pH asid dan tanpa bahan yang kaya menghalang pertumbuhan kebanyakan jenis bakteria tetapi membenarkan pertumbuhan fungus.1.

005% mengurangkan pencemaran oleh bakteria dan fungus bukan patogenik. sungguhpun terdapat banyak juga fungus patogenik yang terhalang pertumbuhannya. Media ini biasanya digunakan untuk pengkulturan dermatofit dan Candida albicans kerana spesies-spesies ini tidak sensitif terhadap kedua-dua jenis agen antimikrob tersebut.0. 55 Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Yis Tatacaranya adalah seperti yang dilakukan dengan bakteria iaitu melalui teknik garisan ke atas plat (sila . manakala koloni berhifa atau miselium seperti kapas atau permaidani pada permukaan media. Media agar ini boleh dibekukan di dalam piring Petri atau tabung uji. Agar infusi otak dan jantung dicampur 5% darah kambing biri-biri merupakan sejenis media yang diperkaya dan digunakan untuk pemencilan Histoplasma dan Nocardia . 4. Pada fungus berfilamen. Ini memberi peluang yang lebih baik kepada fungus patogenik untuk tumbuh. Ini merupakan suatu ujian diagnostik. PENGKULTURAN FUNGUS Fungus wujud dalam dua bentuk: yis dan hifa atau miselium. pengamatan kultur secara in situ dapat dilakukan dengan teknik kultur slaid. Pengkulturan Candida albicans di dalam serum lembu misalnya boleh menunjukkan penghasilan tiub germa oleh yis berkenaan.2. Pengkulturan fungus ke atas plat agar boleh menonjolkan dua bentuk ini iaitu koloni yis kelihatan bulat dan agak lekit.2.

rujuk bahagian 4.1.3) NOTA Kultur fungus dalam bentuk yis dieramkan pada suhu 37°C. Tatacara Penginokulasian Plat Agar dengan Kultur Berfilamen BAHAN 1. Kultur koloni fungus 2. Plat agar/cerun agar 3. Jarum inokulasi 4. Penunu Bunsen TATACARA 1. Sterilkan jarum inokulasi dengan pembakaran api penunu Bunsen. 2. Masukkan jarum ke dalam koloni fungus pada tapak di antara tengah dan tepi koloni fungus. 3. Cungkilkan sedikit kultur dan letakkan inokulum ini di tengah-tengah plat agar atau tabung cerun agar. 4. Eramkan pada suhu 30°C dan/atau 37°C selama 4 minggu. NOTA 1. Untuk mengelakkan pencemaran oleh fungus khususnya dari udara, penginokulasian kultur disarankan dilakukan di dalam kabinet “biohazard” kelas 2 yang memberi perlindungan kepada pengguna, fungus yang dikulturkan serta alam sekeliling. 2. Inokulum daripada tapak di antara pertengahan dan tepi koloni yang diambil, kerana koloni yang

di tepi mungkin terlalu muda dan belum bersporulasi atau membentuk spora, manakala di bahagian pertengahannya pula mungkin sudah agak tua dan „steril‟, atau tidak mengandungi spora atau badan pembuahan (fruiting body) lagi. 3. Sungguhpun suhu bilik (25°C) digunakan sebagai suhu pengeraman oleh beberapa makmal, perlulah diingat bahawa dalam hal ini, pertumbuhan fungus adalah lebih lambat. Tatacara Membuat Kultur Slaid BAHAN 1. Kultur fungus 2. Agar dekstrosa atau agar dekstrosa kentang 3. Piring Petri 4. Balang alkohol 5. Penunu Bunsen 6. Sebatang kaca berukuran 6 cm 7. Penutup slaid 8. Slaid mikroskop 9. Air suling (steril) 10. Pisau pembedahan (steril) 11. Dawai inokulasi lurus 56 TATACARA

1. Bakarkan sebatang kaca berukuran 6 cm di bahagian tengahnya sehingga menjadi lembut. 2. Bengkokkan batang kaca itu sehingga mencapai bentuk „V‟ dan biarkan sehingga sejuk di udara. 3. Sterilkan batang kaca ini dengan pembakaran alkohol. 4. Biarkannya sejuk dan letakkan di dalam sebuah piring Petri. 5. Sterilkan sekeping slaid mikroskop dengan pembakaran alkohol dan letakkannya di atas batang kaca berbentuk „V‟. 6. Potong seketul agar (agar dekstrosa, agar dekstrosa kentang) berukuran 1 cm persegi dan letakkan di atas slaid. 7. Inokulasi fungus dengan menyentuh keempat-empat sudut ketulan agar. 8. Sterilkan sekeping kaca penutup slaid dengan pembakaran alkohol dan letakkan di atas permukaan ketulan agar. 9. Tekan kaca penutup slaid supaya terdapat kontak yang baik di antara permukaan agar dan penutup tersebut. 10. Tuangkan sekitar 5 ml air suling steril ke dalam piring Petri ini untuk memberikan kelembapan yang berterusan semasa pengeraman kultur. 11. Tutup plat Petri dan eramkan pada suhu bilik. 12. Letakkan piring Petri di atas pentas mikroskop dan amati pertumbuhan fungus dari masa ke

masa. 13. Apabila struktur reproduktif mulai terlihat, lepaskan penutup kaca (yang mempunyai pertumbuhan fungus pada permukaannya) daripada ketulan agar dan amati dengan sediaan pelekapan basah lactophenol cotton blue. 14. Amati juga fungus yang tumbuh pada permukaan slaid dengan pelekapan basah lactophenol cotton blue. NOTA 1. Dalam tatacara ini, 4 objek iaitu batang kaca berbentuk „V‟, slaid mikroskop, penutup slaid dan jarum inokulasi disterilkan dengan pembakaran api atau alkohol. Tunggu sehingga objek yang disterilkan menjadi sejuk sebelum meneruskan dengan prosedur selanjutnya. 2. Semasa pengambilan inokulum, pastikan jarum dimasukkan tepat ke dalam koloni supaya inokulum mengandungi bahagian vegetatif fungus bersama bahagian aerialnya (yang mengandungi spora). 3. Pastikan air di dalam piring Petri yang memberikan kelembapan kepada atmosfera ruangan kultur slaid sentiasa ada dan tidak sampai kering dan tambah jika perlu. 4. Dalam penyediaan pelekapan basah, jangan tekan penutup slaid kerana ini boleh mengakibatkan struktur konidia terpisah daripada hifa. Tatacara Kultur yang Merangsang Penghasilan Tiub Germa

Buat pelekapan basah selepas 1 jam. Masukkan 0. 2. 57 3. Tabung uji 3. Serum lembu (steril) TATACARA 1. 2 jam dan 3 jam.BAHAN 1. 4. Penutup slaid 7. Kultur yis 2. Dengan penyempitan Tanda penyempitan NOTA . Slaid mikroskop 6. Eramkan pada suhu 37°C selama 3 jam di dalam penganggas air. PERHATIAN Tiub germa akan kelihatan sebagai filamen yang muncul daripada blastospora tanpa adanya penyempitan mahupun pembengkakan pada bahagian-bahagian tertentu di sepanjang filamen tersebut. Penganggas air 4. Masukkan 1 koloni yis ke dalam serum dan leraikan sel-sel dari koloni dengan menggoncanggoncangkan jarum inokulasi di dalam serum.5 ml serum lembu (steril) ke dalam satu tabung uji. Jarum inokulasi 5. dan amati penghasilan tiub germa di bawah mikroskop.

manakala pigmentasi pada bahagian dasar koloni ditentukan melalui pigmen hifa vegetatif dan pigmen larut yang meresap ke dalam agar. . Walau bagaimanapun.1. adalah penting jenis media pertumbuhannya juga disebutkan kerana fungus boleh mempamerkan ciri yang berbeza-beza menurut jenis media yang digunakan. Pastikan ampaian yis yang disediakan tidak tebal kerana inokulum yang besar akan mengurangkan bilangan sel yang menunjukkan tiub germa (10 5 – 10 6 sel/ml adalah kepekatan optimum). Di samping jenis media.2. sekalipun daripada strain yang sama. Serum yang digunakan kali pertama harus diuji dengan suatu strain Candida albicans yang telah dipastikan boleh mengeluarkan tiub germa. CIRI-CIRI KOLONI FUNGUS Dalam catatan mengenai morfologi koloni fungus. pigmentasi pada fungus sering kali tidak digunakan sebagai ciri pengesahan utama spesies-spesiesnya kerana ciri ini umumnya tidak stabil atau berubah. beberapa faktor lain seperti suhu pengeraman dan umur koloni juga mempengaruhi tekstur koloni fungus. Pigmentasi pada permukaan fungus biasanya dihasilkan oleh spora dan hifa.3. di dalam struktur itu sendiri. 4. 2.

tetapi juga mereka yang berada di dalam ruangan yang sama. Bagi sesetengah individu ini boleh menimbulkan alahan yang serius. Tofografi: Mendatar dan berlipat secara terpencar Mendatar dan tepian bulat menyeluruh 58 Mendatar dan berlipat tak teratur Mendatar dan tepian bergerigi Bertimbun dan ala-tombol Bertimbun dan bahagian tengahnya tertekan Menaik ala-butang Kraterforme hingga ke bentuk plikatil Berkerut Serebriforme (serupa otak) 2. Morfologi Keseluruhan Koloni Fungus 1. kerana ini akan menyebabkan terjadinya aerosol yang mengandungi spora fungus yang akan bertebaran di udara dan boleh tersedut oleh bukan sahaja orang yang sedang mengkajinya.PERHATIAN Dalam pengamatan fungus pada kultur plat agar. seboleh-bolehnya elakkan daripada membuka penutup Petri/botol. Tekstur: Krim (seperti rupa koloni yis) seperti tekstur lilin Berserbuk .

3. sel yang dapat ditumbuhi dan dibiakkan in vitro boleh merupakan suatu sumber „media‟ untuk pembiakan virus. Oleh demikian. Oleh itu kita perlu menumbuhkan sel-sel tertentu terlebih dahulu untuk . PENGKULTURAN VIRUS Berbeza dengan bakteria dan fungus. Pigmentasi: (permukaan dan dasar koloni) Berbeza bergantung kepada umur dan jenis fungus Istilah Bahasa Malaysia – Bahasa Inggeris tepian bulat menyeluruh entire edge tepian bergerigi fringed edge berlipat tak teratur irregular folding tengahnya tertekan depressed center ala-tombol knob-like ala-butang button-like menaik raised ala-tekstur lilin glabrous ala-baldu velvety 59 4. virus hanya boleh beraplikasi di dalam sel hidup.Berkapas Bergranul (berpasir/berbutir) seperti baldu 3.

tekanan osmotik dan membekalkan tenaga. Fenol merah digunakan sebagai penunjuk pH.3.1. Serum (biasanya serum lembu) diperlukan untuk pengkulturan sel dan sistem fisiologik ini memerlukan suatu sistem pengawalan pH iaitu sejenis larutan tampan. 1. Larutan ini dicampurkan dengan asid amino dan vitamin serta glukosa sebagai sumber tenaga. Media ini mengekalkan pH. Media ini umumnya didapati dalam bentuk serbuk atau cecair dan dalam kepekatan 1X atau 10X. Jika sesuatu jenis media yang berkepekatan 10X didapati dalam bentuk cecair.dijadikan kultur bagi pembiakan virus. Media Maklumat tentang kesesuaian sesuatu media untuk sesejenis kultur sel boleh didapati dari buku maklumat yang dikeluarkan oleh syarikat yang memasarkan media kultur berkenaan atau dari artikel jurnal. 4. Antibiotik juga dicampurkan ke media untuk mengawal daripada pencemaran serta pertumbuhan mikrob. Aspek-aspek mengenai pertumbuhan sel secara in vitro ini dikenal se-bagai kultur sel. KULTUR SEL DALAM VIROLOGI Media Kultur Sel Semua media yang digunakan dalam kultur sel atau tisu pada asasnya mengandungi suatu campuran tiruan yang terdiri daripada garam-garam tak organik yang disebut larutan garam seimbang atau larutan garam fisiologik. maka ia dipilih dan .

Pastikan semua media serbuk dilarutkan sehingga kelihatan betul-betul jernih.diutamakan daripada bentuk lainnya. ia terlebih dahulu dilarutkan di dalam air suling supaya mencapai kepekatan 5X atau 10X. . Dalam kebanyakan kultur sel. Agih-agihkan media ini dalam isipadu 10 atau 20 ml di dalam botol universal dan simpan beku. 2. Pastikan serum fetus lembu yang diperolehi mempunyai jangka hayat simpanan yang panjang. Jika media berbentuk serbuk. Apabila hendak digunakan media dikeluarkan dari simpanan dan biarkannya pada suhu bilik buat seketika dan kemudian buatkan suatu pencairan berkepekatan 1X dan campurkan bahan-bahan yang diperlukan untuk pertumbuhan. Media yang pekat boleh disimpan di dalam bekas-bekas yang lebih kecil. Gunakan serum fetus lembu kerana serum ini berbeza dengan serum lembu dewasa atau anak lembu. pada suhu – 20°C jika boleh. terutama disebabkan ia bebas daripada antibodi yang mungkin dapat menghalang pengkulturan virus dalam kultur sel.2 µm. serum lembu yang menjadi pilihan. Serum Jenis serum yang diperlukan bergantung kepada jenis kultur sel. Eramkan serum lembu di dalam penganggas air pada suhu 50°C selama 30 minit untuk menghapuskan bahan atau faktor-faktor yang terdapat di dalamnya yang boleh menghalang pertumbuhan sel apabila digunakan nanti. Media mesti disterilkan melalui penyaringan dengan penyaring membran berukuran liang 0.

2 hingga 7.Agihkan ke dalam isipadu 10 atau 20 ml. Larutan penampan pH yang sering kali digunakan di dalam media kultur sel adalah natrium bikarbonat . 60 3. Pastikan sampel dari sesuatu botol itu steril dan dapat menampung pertumbuhan kultur sel dengan baik dengan membandingkannya dengan serum yang diketahui memberikan hasil yang baik.4. Simpan beku. Labelkan nombor pengeluaran (batch number). Kepekatan natrium bikarbonat yang digunakan adalah bergantung . seharusnya pada suhu – 20°C. dan tarikh diagihkan. Sistem Penampan pH yang Digunakan di dalam Media Kultur Sel Pertumbuhan sel haiwan di dalam media kultur sel yang lengkap biasanya adalah optimum apabila media ditampan dalam julat pH 7. Larutan penampan ini digunakan dalam sistem tertutup (bekas kultur ditutup rapat) yang diseimbangkan dengan udara atau sistem terbuka (seperti piring Petri) yang diseimbangkan dengan atmosfera yang mengandungi kadar CO 2 yang tinggi seperti di dalam inkubator CO 2 .

Larutan natrium bikarbonat disterilkan melalui penyaringan ataupun diautoklaf.85 g/l).2 µm atau diautoklaf pada 20 tekanan paun setiap inci (pound per square inch: psi). Adalah sesuai jika ia disediakan dalam kepekatan 10X yang seterusnya hanya perlu dicairkan menjadi 1X apabila hendak digunakan nantinya di dalam media lengkap.5 ml fenol merah 0. 5. Jika natrium bikarbonat diperlukan juga sebagai nutrien maka kepekatannya seharusnya tidak melebihi 10 m M (0.4%.6g NaHCO 3 di dalam 95. Larutan tampan HEPES (asid N-2-Hidroksietilpiperazin-N‟-2-etanasulfonik) yang berfungsi sebagai zwitterion boleh digunakan sebagai larutan penampan menggantikan natrium bikarbonat dalam sistem terbuka dan ia digunakan pada kepekatan mutlak 20 mM . Persediaan Natrium Bikarbonat Larutkan 5.5 ml air suling dan campurkan 0. Gaskan dengan CO 2 sehingga warna media menjadi oren. 4. Saringkan dengan menggunakan penyaring membran berukuran liang 0. Agih-agihkannya ke dalam botol yang kemudian ditutup rapat. Simpan pada suhu bilik. Antibiotik juga .kepada jenis media.

Tatacara dalam Persediaan Media Kultur Sel BAHAN 1. NaHCO 3 5. Antibiotik (Gentamicin dan Amphotericin B) 4. Air suling (steril) 6. gunakan gred yang ditentukan khusus untuk kultur sel. Pipet bersukat (steril) TATACARA Gentamicin dan Amphotericin B ( Fungizone). Gentamicin adalah agen . Larutan antibiotik dicairkan 1:100 di dalam media. Untuk kedua-dua jenis antibiotik ini. Antibiotik yang sesuai adalah antibakteria berspektrum luas (aktif terhadap bakteria Gram-positif dan Gram-negatif) dan berkesan terhadap mikoplasma. diagih-agihkan dalam isipadu 1. Amphotericin B adalah agen antifungus.2 µm. Serum fetus lembu 3.0 ml dan disimpan beku. Kepekatan yang sesuai digunakan adalah Gentamicin 30 µg/ml dan Amphotericin B 5 µg/ml.Antibiotik dicampurkan ke media kultur untuk menghalang pertumbuhan mikrob. Media kultur sel 2. Kedua-dua agen antimikrob ini disediakan dalam kepekatan 100X di dalam air suling steril (jika dibekalkan dalam bentuk serbuk). disaring melalui penyaring dengan saiz liang 0. Bekas (steril) 7.

serum dan antibiotik mencair pada suhu bilik di atas meja. adalah tidak stabil dalam bentuk cecair. asid amino ini perlulah ditambahkan ke dalamnya jika media tersebut disimpan lebih daripada 2 . Biarkan reagen yang disimpan beku seperti media. Lapkan permukaan luar setiap bekas dengan tuala kertas sehingga kering. salah satu komponen sesetengah media. L-glutamina. Simpan media pertumbuhan atau pengekal pada suhu 4°C. Oleh yang demikian. 7. 6. gunakan pipet steril untuk memindahkannya). Campurkan isipadu air suling yang diperlukan diikuti dengan larutan penampan dan antibiotik. 5. Campurkan serum supaya mencapai peratus kepekatan yang diperlukan. 2. Tuangkan media ke dalam 1 botol steril jika kesemua kandungannya diperlukan (jika hanya sebahagian sahaja media yang diperlukan. PERHATIAN Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau kelas 2. Tempoh simpanan media yang mengandungi serum adalah 4 minggu. Jangan masukkan ke dalam penganggas air untuk mengelakkan pencemaran. Biasanya media pertumbuhan memerlukan 5 – 10% serum dan media pengekal 0 – 2%. Sebelum media digunakan. 61 4. goncangkannya terlebih dahulu untuk menentukan kehadiran pencemaran yang berat yang ditandai dengan kekeruhan pada media tersebut. 3. NOTA 1.1. bagi media yang seharusnya mengandungi L-glutamina.

TRIPSINISASI Tripsinisasi adalah proses peleraian tisu atau sel selapisan kepada sel-sel individu menggunakan enzim tripsin. Kelalang kon 7. Etanol 70% 9. Serum yang dibeku dan dicairkan kadangkala mengandungi serpihan-serpihan yang mendap di dasar botol. Alat pengaduk magnet 5. Ini bukanlah suatu pencemaran.minggu. Tatacara untuk Tripsinisasi Tisu Seluruh BAHAN 1. Gunting bengkok dan tajam 4. Gunting 2 pasang 3. 2. Larutan salin ditampan fosfat (phosphate buffered saline: PBS ) yang mengandungi 30 µg/ml Gentamicin dan Fungizone 5 µg/ml 10. Penyaring kasar (steril) 11. Larutan tripsin-versena 8. Magnet disaluti silikon/teflon 6. Mikroskop cahaya jenis terbalik . tetapi seboleh-bolehnya elakkan daripada menggunakannya. Seluruh haiwan atau tisu 2.

2 µm. PBS tanpa kalsium dan magnesium Larutkan 8.12. Campurkan kedua-dua jenis larutan ini dalam isipadu yang sama. 0. Simpan pada suhu 4°C. Aturkan nilai pH larutan kepada 7. 0. Tambahkan air suling sehingga mencapai satu liter.3. 62 2.15g Na 2 HPO 4 . Bekas kultur sel PERSEDIAAN 1.4% versena di dalam PBS .2g KH 2 PO 4 di dalam 950 ml air suling. . Larutan tripsin dan versena Larutkan 1. Agih-agihkan larutan ini ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (suhu mencapai aras 115°C) selama 15 minit.0g NaCl.2g KCl. 1.0 % tripsin dan 0. Sterilkan dengan menggunakan penyaringan membran dengan liang 0. Simpan pada suhu bilik.

8. Tambahkan tripsin baru dan aduk semula. 9. Pindahkan potongan tisu ke dalam sebuah kelalang kon yang mengandungi magnet yang disaluti teflon atau silikon. Aduk kandungan kelalang dengan pengaduk magnet pada suhu 37°C. Emparkan suspensi sel pada 400 g selama 15-30 minit dan leraikan mendapan sel di dalam media yang sesuai dan lakukan perhitungan hidup. 7. Dari masa ke masa tuangkan sel yang telah dileraikan daripada tisu dan simpan pada 4°C. 5. Keluarkan organ dan letakkan di dalam piring Petri di mana ia dipotong menjadi serpihanserpihan kecil berukuran 2 mm3. . 6.TATACARA 1. Bunuh haiwan yang berkenaan dan letakkan menelentang supaya bahagian tubuh atau tapak di mana pembedahan akan dijalankan terdedah. 4. Tatacara berikut dilakukan dalam keadaan aseptik dengan menggunakan peralatan yang steril. Saring suspensi sel melalui penyaring kasar untuk memisahkan sel-sel dari serpihan tisu-tisu besar. Lap kulit bahagian yang terdedah ini dengan etanol 70% dan bedah/potong untuk mendapatkan organ yang diperlukan. Tambahkan tripsin baru setiap kali ini dilakukan. Tuangkan larutan tripsin 10 minit selepas proses ini bermula. 2. Masukkan PBS yang mengandungi antibiotik dan antifungus. 10. Goyang piring Petri perlahanlahan untuk membersihkan potongan-potongan tisu. 3. Masukkan larutan tripsin-versena (lebih kurang 20 ml setiap 1g tisu).

Dalam pilihan kedua. Semua alat dan reagen yang digunakan disterilkan terlebih dahulu. Suhu 37°C dapat dicapai dengan melakukan proses peleraian di dalam bilik panas atau dengan menggunakan alat pengaduk magnet yang juga berfungsi sebagai plat pemanas. 3. manakala majoriti akan melekat pada permukaan bekas kultur dan tumbuh membentuk satu lapisan sel. Sebelum sel ini boleh dipindahkan ke tempat lain atau separuh daripadanya dikeluarkan untuk mengelak kesesakan yang akan menghalang pertumbuhan dan menjejaskan keupayaannya untuk hidup (viabilitinya). NOTA 1. 2. Tatacara untuk Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel BAHAN . Elakkan daripada terjadinya pembentukan buih (frothing) semasa tisu diaduk. sel mestilah ditanggalkan dari permukaan bekas kultur. Tripsinisasi Sel Selapisan dan Pengeraman Kultur Sel Sesetengah jenis kultur sel wujud sebagai suspensi di dalam bekas kultur. Ubah kepekatan sel menjadi 2 x 10 5 sel/ml media pertumbuhan dan kulturkan di dalam bekas kultur.11. kelalang tidak diletakkan secara langsung di atas plat pemanas tetapi dimasukkan ke dalam sebuah bikar berisi air yang ditempatkan di atas plat pemanas tersebut.

5% dan versena 0. Pipet bersukat (steril) 4. Larutan tripsin dan versena Larutkan tripsin 0. Campurkan 2 jenis larutan ini dalam isipadu yang sama.4% di dalam PBS .2g KH 2 PO 4 .15g Na 2 HPO 4 dan 0. 0. Simpan pada suhu 4°C. Campuran tripsin 0.2% 2.1.2g KCl. Sterilkan dengan menggunakan penyaring membran dengan liang 0-2 µm. PBS tanpa kalsium dan magnesium Larutkan 8.0g NaCl. Kabinet aliran udara laminar kelas 1 atau 2 PERSEDIAAN 1. 1.25% dan versena 0. 2. PBS tanpa kalsium dan magnesium (steril) 63 3. Mikroskop cahaya jenis terbalik 5.

Keluarkan media secara aseptik dengan pipet bersukat. 8. Tambahkan air suling sehingga mencapai 1 liter. 7. Agihagihkan ke dalam botol dan sterilkan dengan autoklaf pada 10 psi (115°C) selama 15 minit. 4. pipet keluar PBS . Dalam masa ini. Hitunglah suspensi sel dengan hemositometer.di dalam 950 ml air suling. Pipet media pertumbuhan (isipadunya bergantung kepada saiz bekas) ke dalam bekas dan cuci sel daripada permukaan bekas dengan memancutkan media daripada pipet yang dipasang dengan bal penyedut getah untuk meleraikan kelompok sel. goncangkan bekas kultur supaya PBS meliputi sel monolapisan. 2. Cuci 2 kali dengan PBS : pipet PBS ke dalam bekas. Eramkan pada suhu 37°C selama 1 hingga 5 minit. Biarkan botol berdiri tegak selama 1 hingga 2 minit sebelum cecair yang mengalir ke dasar bekas dipipet keluar. amati sel dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah menjadi bulat dan/atau telah tanggal. Masukkan sedikit campuran tripsin dan versena dan goncangkan botol untuk meliputi ke seluruh monolapisan sel. 3. TATACARA 1. Aturkan kepekatan suspensi sel supaya mencapai 1 x 10 5 sel/ml media pertumbuhan. 5. 6. Aturkan nilai pH larutan kepada 7.3. Simpan pada suhu bilik. .

Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan lambat atau perlahan. tutup penutup bekas kultur dengan rapat. 10.9. 10% O 2 . kultur sel ini dieramkan di dalam inkubator CO 2 yang mengandungi CO 2 pada kadar 5%. Pada sistem terbuka. alirkan campuran gas (9% CO 2 . Pada jenis kultur sel yang tumbuh dengan pesat. Goncangkan bekas kultur sel sebelum diletakkan di dalam inkubator supaya sel-sel bertaburan sama rata. Masa yang diambil untuk penanggalan sel daripada permukaan dalam bekas bergantung kepada jenis kultur yang terlibat.5% N 2 ) ke dalam bekas kultur menggantikan udara di dalam ruang bekas sebelum penutupnya ditutup dengan rapat. NOTA 1. Amatilah selalu dengan mikroskop untuk menentukan sama ada sel telah . 11. Sel akan mengalami kerosakan atau mati jika didedahkan terlalu lama. 81.

tatacara nisbah perpisahan (split ratio) boleh digunakan. untuk menghalang aktiviti tripsin tersebut. Peganglah kultur sel hampir tegak lurus dan ketuk permukaan bekas kultur untuk menentukan sama ada sel boleh ditanggalkan (dilepaskan) daripada permukaan atau belum. kultur sel dari satu bekas kultur dibahagikan (dibelah) kepada dua hingga empat bahagian (bergantung kepada jenis kultur sel) dan setiap bahagian dikulturkan secara berasingan di dalam bekas kultur .berbentuk bulat. Aktiviti tripsin ini boleh dihapuskan oleh serum. Dalam cara ini. Pada posisi ini lapisan sel lebih mudah diamati dan sel-sel ditanggalkan dengan lebih mudah kerana tidak diselaputi oleh lapisan media semasa dicuci. media yang mengandungi serum digunakan dalam mensuspensikan sel selepas sel-sel ditanggalkan. Jika campuran tripsin dan versena yang digunakan sedikit sahaja. 2. Oleh itu. sel tidak perlu dicuci melalui emparan dan supernatannya dituang keluar untuk menghilangkan campuran tripsin dan versena tersebut. peganglah bekas supaya permukaan di mana terdapatnya sel adalah di atas. kepekatan sel mestilah ditentukan terlebih dahulu supaya jenis sel dengan kepekatan yang diperlukan boleh ditetapkan. 64 4. Tetapi. Jika didedahkan terlalu lama kepada tripsin. Pencairan dengan media pertumbuhan boleh mengurangkan kepekatan tripsin dan versena kepada suatu aras yang tidak akan menjejaskan pertumbuhan sel. 3. 5. sel-sel akan mati. Dalam keadaan tertentu. Semasa mencuci sel-sel daripada permukaan bekas kultur. dalam keadaan yang telah menjadi kebiasaan seperti pertumbuhan sel di dalam bekas kultur yang sama ukurannya.

4. Saringkan melalui kertas turas.1% tripan biru di dalam PBS 3. Apa yang perlu hanyalah menghitung sel-sel di dalam SES kecil yang terletak di tengah dan di keempat-empat sudut hemositometer tersebut sahaja). Mikroskop cahaya PERSEDIAAN Tripan biru 0. Hemositometer jenis Neubauer 4. maka sel-sel di dalam kesemua 25 SES kecil dihitung. Hemositometer Neubauer mempunyai sembilan segi empat sama (SES ) yang besar terletak di tengah. Simpan di dalam peti beku. Larutkan 1/10 dengan 10X PBS sebelum digunakan. Tetapi jika suspensi mengandungi banyak sel maka perhitungan sel-sel di dalam kesemua SES kecil tidak perlu dilakukan lagi. Hitung sel di dalam SES yang kecil ini.1% tripan biru di dalam 10 ml air suling. Tatacara Menghitung Sel dengan Menggunakan Hemositometer BAHAN 1.1% di dalam PBS Larutkan 0. Hitunglah sekurang-kurangnya 100 sel (ini bermakna bahawa pada suspensi tidak mengandungi banyak sel.yang mempunyai isipadu yang sama dengan bekas induk. 2. TATACARA 1. SES ini dibahagikan pula kepada 25 SES yang dipisahkan oleh tiga garis. 3. . 0. Suspensi sel 2.

penjimatan kos. Satu sebab lain yang penting dalam hal penyimpanan kultur sel ini. ada kemungkinan kultur sel ini boleh terhapus disebabkan kemusnahan akibat pencemaran oleh bakteria atau fungus. 6. walaupun tidak jumlah sel yang dihitung x 25 x 10 4 x faktor pencairan jumlah SES yang digunakan . manakala yang menyentuh atau melintang garis bawah dan kanan SES tidak dihitung atau diabaikan. Untuk mengelakkan daripada kehilangan sel-sel ini sebahagian dari-pada kultur sel berkenaan haruslah disimpan dalam keadaan yang boleh mengekalkan viabilitinya tanpa pertumbuhan.5. Sebab kedua kenapa penyimpanan sel ini diperlukan adalah kerana sesuatu kultur sel itu hanya digunakan pada masa-masa tertentu sahaja. sel yang menyentuh atau melintang garis sebelah kiri dan atas setiap segi SES dihitung atau diambil kira. Dalam hal ini. tenaga dan masa boleh dicapai jika kultur sel ini disimpan sewaktu tidak digunakan. Bilangan sel ml -1 = Kriopengawetan Sel yang Hidup Oleh kerana kultur sel adalah suatu hidupan. atau ia mengalami kematian kerana keadaan pertumbuhan yang tidak sesuai. Sebagai panduan.

5%) dan versena (0. Campuran larutan tripsin (0. kultur ini boleh digantikan dengan kultur sel lain yang disimpan. Dimetil sulfoksida (DMSO ) 7. Tripan biru 6. Peti beku suhu – 70 ° C 9. Tangki nitrogen cair untuk menyimpan spesimen 10. ialah untuk mengekalkan ciri-ciri kultur sel tertentu. Tatacara Kriopengawetan Sel yang Hidup BAHAN 1. Jika perubahan yang tidak sesuai berlaku dalam kultur sel yang sedang digunakan. Media pertumbuhan 4. Kultur simpanan ini lazimnya masih mempunyai ciri-ciri yang dikehendaki kerana ia merupakan kultur sel yang mempun-yai riwayat pensubkulturan yang awal.65 begitu ketara. Apabila sesuatu sel dikulturkan untuk jangka masa yang berlarutan terdapat kemungkinan ciri-cirinya akan berubah: yang paling sering dikesan ialah sensitivitinya terhadap virus menjadi berkurangan.02%) 3. Kultur sel 2. Alat emparan . PBS (steril) 5. Kriovial 8.

Mikroskop cahaya terbalik 14. Sediakan suspensi sel di dalam media yang mengandungi serum 10% (lihat tatacara tripsinisasi sel. pensterilan ke atas bahan adalah tidak perlu kerana DMSO dianggap steril. 3.11. Mikroskop cahaya 12. 7. Dalam hal ini. Emparkan pada 200 g selama 15 minit. TATACARA 1. 5. Pindahkan ke dalam 1 tabung atau botol steril dan tambahkan media jika perlu. . ms 62-64). Kapas 15. Campurkan dan hitung jumlah sel untuk menentukan kadar sel hidup. Atursuaikan supaya kepekatan sel adalah 2 x 10 6 sel setiap ml. Pindahkan 1 ml ke dalam setiap kriovial. 2. Kertas timah nipis PERSEDIAAN Dimetil sulfoksida (DMSO ) 10% v/v di dalam media pertumbuhan Tambahkan 1 ml DMSO ke dalam 9 ml media yang mengandungi serum 10% pada hari kultur sel akan disimpan. 4. 6. Keluarkan supernatan dan masukkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO 10%.

nombor pindahan sel (cell passage no. Adukkan suspensi sel sejurus sebelum diagihkan ke dalam botol kriovial untuk memperoleh suspensi sel yang sama rata. 2. Jika sel mengambil masa yang lama untuk mencapai keadaan di atas. Labelkan kriovial dengan nama sel. 6. Simpan pada lantai peti bek – 70 ° C semalaman dan segera pindahkan ke dalam bekas yang mengandungi nitrogen cecair. 3. Jangan tambah DMSO kepada suspensi sel secara langsung ke dalam media pertumbuhan. jika ada.8. Pilih kultur sel yang sihat. NOTA 1. 5. Balutkan dengan kapas. Ini dicapai dengan kriovial dibalut dengan kapas serta kertas timah dan disimpan di dalam kotak polistirena. Adalah penting suhu kultur sel yang disimpan dikurangkan secara beransur-ansur.) dan tarikh. 9. Oleh kerana amat sukar untuk mengekalkan suhu peti beku pada – 70 ° C. 4. iaitu dalam fasa tumbesaran logaritmanya dan hampir mencapai lapisan sel yang meliputi keseluruh permukaan bekas kultur. kemudian balut dengan kertas timah dan masukkan ke dalam satu kotak polistirena (5-10 cm tebal). adalah lebih selamat . 66 Tambahkan media pertumbuhan yang mengandungi DMSO yang tersedia kepada sel-sel selepas diemparkan. 10. tukarkan media kultur sekitar 24 jam sebelum sel diproses.

manakala ampul biasanya harus ditutup melalui penaupan dengan pembakaran api. bekas nitrogen cair disimpan di dalam bilik sejuk dan dipastikan nitrogen cair ditambahkan semula dalam tempoh masa yang sesuai mengikut kekerapan bekas tersebut dibuka. Tatacara Mengkulturkan Semula Sel yang Dikrioawetkan BAHAN 1. Kita juga harus menyedari bahawa ada kemungkinan suhu – 70 ° C tersebut tidak dicapai di seluruh ruangan simpanan di dalam peti beku. Lagipun. Kriovial kultur sel 2. 7. pastikan salah satu bekas kultur sel daripada kumpulan ini boleh dihidupkan semula tanpa terjadinya sebarang pencemaran mikrob. Kultur sel yang disimpan pada – 70 ° C harus dikulturkan selepas 6 bulan sebelum disimpan semula.jika sel disimpan di dalam nitrogen cair. Amalan ini dipraktikkan kerana sel haiwan yang disimpan pada suhu – 70 ° C tidak boleh mengekalkan viabilitinya dalam masa yang begitu lama. Walaupun ampul kaca atau polipropilen boleh digunakan sebagai bekas untuk simpanan. kriovial lebih mudah dikendalikan kerana dilengkapi dengan penutup. 9. 8. Untuk mengelakkan penyejatan. Penganggas air 37° C . Media pertumbuhan 3. Sebelum sesuatu kumpulan kultur sel yang disimpan dianggap sempurna. kadangkala ampul yang dimasukkan ke dalam air untuk pencairan boleh meletup jika penaupan tidak dilakukan dengan sempurna.

4. Pindahkan kandungan kriovial atau ampul ke dalam sebuah bekas kultur dan campurkan media pertumbuhan ke dalamnya. selepas sel telah melekat pada permukaan bekas kultur pipet keluar media dan gantikan dengan media baru. Keringkan permukaan luar ampul dan lap dengan alkohol. Semasa kandungan kriovial dicairkan. 7. 67 2.4. Inkubator suhu 37° C TATACARA 1. 3. tudung ampul dengan sehelai kain dan pakai kaca mata pelindung kerana ampul yang tidak ditaup dengan sempurna boleh meletup. Sama ada kriovial digoncang untuk menggalakkan pembekuan suspensi sel supaya lebih . Pegang kriovial di dalam penganggas air sehingga semua pembekuan menjadi cair. NOTA 1. Jika ampul kaca digunakan. Keluarkan sebuah kriovial dari tempat simpanan dan serta-merta pindahkannya ke dalam penganggas air. 2. Selepas beberapa jam hingga semalaman. 5. Keluarkan kriovial/ampul sejurus selepas suspensi sel menjadi cair. Pipet steril 6. Bekas kultur sel 5. Eramkan pada 37 °C. pastikan aras air tidak mencapai penutupnya untuk mengelak kemungkinan air menyentuh bahagian mulut kriovial dan berlakunya pencemaran. 8. 6.

Lap keseluruhan bahagian luar bekas dengan alkohol untuk mengelakkan pencemaran. 4. atau udara di dalam ruangan bekas kultur digantikan dengan campuran gas yang mengandungi CO 2 5%. 3. Kultur sel dalam bentuk monolapisan penuh 4. Tatacara Inokulasi Kultur Sel dengan Virus BAHAN 1. Larutan garam seimbang Hank dengan antibiotik (pencair virus) 3. Media kultur dibuang dan digantikan dengan yang baru secepat boleh supaya DMSO dan selsel yang mati yang boleh menjejaskan pertambahan sel-sel yang hidup disingkirkan. 5. Untuk memperoleh pemulihan kultur sel yang lebih cepat. pada peringkat awal tempoh pertumbuhan sel. Suspensi virus 2.cepat mencair atau tidak bergantung kepada jenis sel tertentu kerana terdapat jenis sel yang viabilitinya terjejas akibat goncangan dengan kuat. atau di dalam bekas khas yang mengandungi CO 2 5%. PBS (steril) . eramkan kultur di dalam inkubator CO 2 .

adalah nisbah partikel virus berinfeksi dan sel. Amati kultur sel dan pilih kultur yang hampir atau baru mencapai monolapisan yang lengkap atau penuh (seluruh permukaan bekas kultur sel diliputi dengan sel). Amati kehadiran kesan sitopatik (untuk virus sitopatik) setiap hari atau selang sehari.i yang terlalu tinggi digunakan ada kemungkinan sebahagian besar virus yang tak lengkap dihasilkan. Keluarkan media dari bekas kultur. 3. 3.) yang sesuai. 2. Pergandaan infektiviti.o. Lakukan pencairan virus supaya mencapai pergandaan infektiviti (multiplicity of infection. NOTA 1.o. 9. 4. Eramkan pada suhu yang sesuai (biasanya pada suhu 37 ° C) selama 30-60 minit. Goncangkan bekas setiap 10-15 minit untuk menyebarkan semula suspensi virus ke seluruh monolapisan. Masukkan suspensi virus ke dalam bekas kultur dan sebarkan ke seluruh lapisan sel. 6. media boleh dikeluarkan dengan pipet yang dihubungkan kepada sebuah pam udara. Permukaan bekas kaca dibakar sebelum dan sesudah cecair dituang. Jika m. Masukkan media pertumbuhan dan eramkan pada suhu yang sesuai. kandungannya bolehlah dituang. 5.i.TATACARA 1. 2. Penjerapan virus dilakukan dalam isipadu cecair yang kecil untuk memudahkan kontak di . Cuci 2 kali dengan PBS . m. Jika banyak kultur sel perlu diinokulasi dalam masa yang sama. 8. Jika kultur berada di dalam bekas kaca. 7.

antara virus dan sel. Tiga jenis tapak pada telur – membran amnion. 5. membran alantoik dan membran korioalantoik – boleh digunakan bergantung kepada jenis virus yang terlibat. 7. Sebelum inokulasi dilakukan adalah penting untuk menentukan terlebih dahulu sama ada telur yang akan digunakan tersebut mempunyai embrio yang masih hidup dan kedua. Pada kebanyakan virus haiwan. Sama ada inokulum virus dikeluarkan selepas tempoh penjerapan atau tidak bergantung kepada keperluan. 68 4. Penjerapan boleh dilakukan pada suhu bilik atau pada suhu pengeraman kultur. yakni 35 ° C merupakan suhu yang optimum. Pilih suhu pengeraman yang optimum untuk sesejenis virus yang dikulturkan. Pengamatan Telur Melalui Transiluminasi (Penyuluhan) Embrio telur dipastikan hidup dengan cara transiluminasi yang diberi istilah candling dalam bahasa . 4. tapak yang sesuai untuk suntikan. suhu pengeraman adalah 37° C sungguhpun pada virus respiratori suhu yang lebih rendah. 6. PENGKULTURAN VIRUS DENGAN MENGGUNAKAN TELUR BEREMBRIO Telur ayam berembrio hidup merupakan suatu sistem yang digunakan untuk pengkulturan beberapa jenis virus.3. Persediaan ini dilakukan dengan menggunakan kabinet biohazard kelas 2. Bekas kultur sel digoncang bukan sahaja untuk menyebarkan virus tetapi juga untuk mempastikan seluruh sel monolapisan sentiasa diliputi cecair untuk mengelak daripada kekeringan.2.

Inggeris kerana pada zaman dahulu cahaya lilin digunakan untuk tujuan ini. yang digunakan ialah kotak cahaya atau lampu suluh yang telah diubahsuai. Pasangkan penghujung kon yang besar kepada kepala lampu suluh. Gunakan pita selofan untuk melekatkannya dan mengekalkan bentuk ini. Dengan ini cahaya lampu akan ditujukan ke luar melalui lubang yang lebih kecil. Gunting kedua-dua penghujung kon ini supaya tepinya menjadi sama rata dan garis pusat bahagian yang lebih besar adalah sama dengan ukuran kepala lampu dan bahagian kecil adalah lebih kurang sama dengan ukuran penghujung telur yang lebih bulat. . Pena penanda PERSEDIAAN Alat untuk penyuluhan Gulungkan sekeping kertas manila supaya berbentuk kon. Tatacara Penyuluhan Telur BAHAN 1. Pilih tempat yang gelap. Gunting 6. Telur berembrio 2. Kertas manila 4. Pita selofan 5. TATACARA 1. Lampu suluh 3. Perkukuhkan kontak ini dengan menambahkan pita selofan. Pada masa ini.

bentuk embrio juga jelas kelihatan. Pastikan salur darah korioalantoik telur berembrio kelihatan jelas sekali dan embrio bergerak-gerak. Tatacara Penyuntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik BAHAN 1. Tekan lubang terowong lampu suluh kepada cangkerang telur. NOTA Pilih telur yang bersih dan mempunyai cangkerang yang berwarna putih pudar untuk memudahkan pengamatan bahagian dalamnya. Jarum (28 gauge) dan picagari 3.2. khususnya mata embrio yang besar dan kehadiran ruang udara. 3. 69 Suntikan Virus ke dalam Ruang Alantoik Pertumbuhan virus di dalam membran alantoik digunakan untuk virus influenza dan paramiksovirus yang telah disesuaikan beraplikasi dalam keadaan makmal. 4. Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong 5. Etanol 70% 4. Nyalakan lampu dan amatilah bahagian dalam telur. Telur berembrio berumur 10 hingga 12 hari 2. Pita selofan . Semua ini adalah tanda yang menunjukkan bahawa embrio tersebut masih hidup.

Suntikan Virus ke dalam Ruang Amniotik Cara ini digunakan untuk pemencilan primer (kali pertama virus ditumbuh dalam keadaan makmal) virus influenza dan mumps. Gerudi satu lubang atau celah yang kecil pada cangkerang pada tapak yang ditandakan untuk mendedahkan membran cangkerang. Tandakan dengan pena tanda satu tapak yang agak berjauhan dengan sebarang salur darah. 3. 6. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi virus di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. 2. Telur berembrio berumur 10-12 hari atau 12-14 hari 2.TATACARA 1. Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong . Tutup celah dengan pita selofan. Jarum panjang (11/4) dan picagari berisipadu 1 ml 3. Tatacara Penyuntikan Virus di dalam Ruang Amniotik BAHAN 1. Suntikkan 0. Lap tapak celah tersebut dengan etanol. 4. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. Etanol 70% 4. 7.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. 5.

Pita selofan 6. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. Suntikkan 0. Parafin cair 7. 2. Lapkan membran cangkerang dengan parafin cecair supaya membran cangkerang menjadi jernih. Terbalikkan telur untuk membersihkan membran cangkerang daripada cebisan-cebisan cangkerang. Tutup lubang dengan pita selofan. 7. Swab steril TATACARA 1. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama dua hingga tiga hari pada suhu 37°C. Tandakan dengan pena penanda tapak ruang udara. Ketuk dan pecahkan cangkerang tepat di atas ruang udara berkenaan dengan pemegang gunting dan guntingkan satu lubang besar sehingga mencapai pinggir ruang udara. 5.5. Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantoik Pengkulturan virus di atas membran korioalantoik membolehkan perbezaan di antara poksvirus . 3. 8. Gunting kecil dengan penghujungnya bengkok 8.1 ml inokulum ke pundi amniotik dengan menusukkan jarum ke tapak yang berhampiran dengan kepala embrio. 70 6. 4.

Telur berembrio berumur 10 sehingga 12 hari 2.85% (steril) TATACARA 1. 7. Gerudikan satu celah cangkerang yang kecil pada tapak yang ditandakan tersebut untuk mendedahkan membran cangkerang sahaja. Larutan salin 0. Bal penyedut getah besar 8. Tatacara Penyuntikan Virus ke atas Membran Korioalantik BAHAN 1. Tekan bal penyedut getah besar dengan sepenuhnya dan lekapkan penghujungnya pada . 2. Etanol 70% 4. Suluh telur untuk menentukan embrio masih hidup. Tandakan dengan pena penanda satu tapak yang tidak mendekati mana-mana salur darah.jenis variola dengan vaksinia dan di antara virus herpes simplex taip 1 dengan taip 2 berdasarkan morfologi poks yang dihasilkan. 5. Penggerudi berputar yang dipasang dengan cakera pemotong 5. Pita selofan 6. 6. Jarum (28 gauge) dan picagari 3. Lap tapak celah dengan etanol. 4. 3. Letakkan setitis larutan salin yang steril di atas celah. Gerudikan satu lubang kecil di kawasan ruang udara. Pena penanda 7.

Pipet Pasteur 4. Tutup celah dengan pita selofan. 11. Lepaskan tekanan bal getah.lubang di ruang udara. 8. Botol (steril) 5. Tatacara Mengumpulkan Cecair Alantoik BAHAN 1. Eramkan dengan tapak yang diinokulasi di sebelah atas selama 1 hingga 3 hari mengikut keperluan. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20° C selama 1 jam. Etanol 70% 71 TATACARA 1. 10. 9. 2. Gunting 3. . Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman 2. Lap cangkerang di bahagian atas ruang udara telur dengan etanol. 3. Pecahkan cangkerang di atas ruang udara dan guntingkan satu lubang besar.1 ml inokulum ke dalam celah ini dengan jarum yang dimasukkan beberapa mm ke dalam celah. Suntikkan 0. supaya membran korioalantoik di bawah celah tersedut dan kelihatan terjatuh atau terlepas daripada cangkerang dan suatu pundi udara terbentuk.

tambahkan 0. Larutan salin 0. NOTA Telur disejukkan untuk membunuh embrio serta mengecutkan salur darah supaya pengumpulan cecair yang mengandungi virus dilakukan tanpa pencemaran dengan sel darah merah. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20 ° C selama 1 jam. NOTA Jika cecair amniotik didapati kurang.85% (steril) TATACARA 1. Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman 2. Pipet Pasteur 4. Forseps 3. Sedut dan . 3. Gunakan pipet Pasteur untuk menolak embrio dan pundi kuning telur ke tepi dan kumpulkan cecair alantoik dengan menggunakan pipet Pasteur lain.5 ml larutan salin yang steril.4. Botol (steril) 5. Pegang pundi amniotik dengan forseps dan tembusinya dengan pipet Pasteur untuk mengeluarkan cecair amniotik daripada ruang amniotik. 2. Tatacara Mengumpulkan Cecair Amniotik BAHAN 1. Tanggalkan pita selofan yang menutupi ruang udara.

Pegang membran korioalantoik ini dan gunting di sekelilingnya sehingga semuanya terlepas daripada cangkerang. Letakkan telur di dalam peti sejuk selama beberapa jam atau di dalam peti beku suhu – 20 ° C selama 1 jam. 5.85% (steril) 6. Forseps 5. Cuci membran korioalantoik yang dikeluarkan di dalam larutan salin steril dan . Telur berembrio selepas penyuntikan virus dan pengeraman 2. 3. Piring Petri 4. Etanol 70% TATACARA 1. Pecahkan cangkerang di atas celah dengan bahagian pemegang gunting dan potong cangkerang sehingga ke pinggir ruang udara palsu. Tatacara Pengambilan Membran Korioalantoik BAHAN 1. 2. 72 4. Lap tapak suntikan dengan alkohol. Larutan salin 0.keluarkan cecair daripada pipet beberapa kali sebelum dikumpulkan. Tanggalkan pita selofan yang menutupi tapak suntikan pada permukaan telur. Gunting 3. 6.

Dalam pengenalpastian bakteria. PENGENALPASTIAN AGEN MIKROB 5. yang merangkumi proses kemusnahan dan proses pembinaan (atau sintesis).rentangkannya di dalam piring Petri. Misalnya. Gas yang dihasilkan dikesan secara langsung melalui pengamatan penghasilan gelembung gas atau secara tidak langsung melalui penggantian cecair di dalam tiub Durham dengan gas. sesuatu aktiviti biokimia ditentukan oleh enzim-enzim yang dihasilkan oleh bakteria. Daripada segi genetik. Aktiviti yang luas ini dikawal oleh faktor genetik serta alam sekelilingnya. Kehadiran sesejenis enzim dikenal pasti secara tidak langsung melalui tindakannya terhadap sesuatu substrat.1. kehadiran rekahan atau celahcelah di dalam agar atau melalui tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna dan tidak larut (misalnya H . beberapa kumpulan bakteria tertentu menghasilkan bahan pertengahan metabolisme yang spesifik seperti asetil-metil-karbinol berikutan fermentasi glukos yang boleh digunakan untuk membezakan kumpulan bakteria yang menghasilkannya daripada yang tidak. 73 5. UJIAN MAKMAL DALAM PENGENALPASTIAN BAKTERIA Bakteria mempunyai kisaran aktiviti biokimia yang amat luas. Hasilan aktiviti enzim ini boleh berupa gas atau terbitan bukan gas. faktor ini dengan spesifisiti sesejenis enzim terhadap substrat tertentu membolehkan bakteria dikenal pasti dalam keadaan sekeliling yang terkawal seperti di makmal.

alkali – biru). fermentasi dipastikan secara tidak langsung melalui pengamatan perubahan warna indikator pH akibat penghasilan asid. Akan tetapi penurunan pH boleh dicapai . perbezaan ini merupakan salah satu ciri penting dalam pengenalpastian spesis bakteria. Andrade: neutral – kuning pucat. Penghasilan asid ditunjukkan oleh perubahan warna indikator pH (sesuatu jenis pewarna) yang bergantung kepada jenis indikator yang digunakan (contoh. Oleh yang demikian. Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas Fermentasi adalah suatu proses kimia yang melibatkan oksidasi-reduksi. alkalin – tanpa warna. bromthymol blue: neutral – hijau. jenis dan kuantiti asid campuran (mixed acids) – pelbagai jenis asid organik yang berasal dari asid piruvik yang dihasilkan serta kemampuan menghasilkan gas. Enzim juga boleh ditunjukkan dalam tindakan serologi yang menghasilkan kompleks enzim (sebagai antigen) – antibodi yang muncul sebagai presipitasi. Dalam ujian bakteriologi.2 S). Dalam fermentasi karbohidrat beberapa produk dihasilkan termasuk pelbagai jenis asid dan gas. asid – kuning. asid – merah. iaitu tanpa oksigen bebas. Proses in berlaku dalam keadaan anaerobik. Hasilan bukan gas ditunjukkan oleh tindakan kimia yang menghasilkan terbitan yang berwarna. Bakteria berbeza dalam jenis karbohidrat yang boleh digunakan sebagai sumber tenaga melalui proses fermentasi. dan substrat organik merupakan penerima terakhir elektron.

3. Tatacara Ujian Fermentasi Gula: Penghasilan Asid dan Gas BAHAN 1. Gelung dawai 4. Walau bagaimana pun. istilah „fermentasi‟ digunakan secara longgar dalam konteks ujian bakteriologi diagnostik. tidak semua ujian yang digunakan untuk menguji kebolehan sesejenis bakteria mendegradasikan secara enzimatik „gula‟ menjadi produk asid merupakan proses fermentatif. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan biarkan sehingga dingin. Dalam hal ini sungguhpun tidak semua substrat yang digunakan dalam ujian fermentasi adalah gula. iaitu bukan fermentasi. istilah gula meliputi senarai substrat berkenaan. 2. serta dilengkapi dengan tiub Durham) TATACARA 1. Penunu Bunsen 74 Media cecair gula: (media dasar yang mengandungi jenis-jenis gula atau karbohidrat tertentu dan indikator pH. Inokulasikan kultur ini ke dalam media cecair yang mengandungi sejenis gula. Sentuhkan pada 1 koloni bakteria pada media plat.melalui proses penggunaan karbohidrat yang bukan anaerobik. ataupun dari menggunakan substrat bukan karbohidrat. Ulangkan . misalnya manitol adalah sejenis alkohol. Kultur bakteria pada plat agar 2. Media cecair gula di dalam tabung reaksi atau botol Bijou 3. Oleh yang demikian.

6. Tiub Durham adalah sebuah tabung/tiub kecil yang boleh dimuatkan di dalam botol Bijou dan diletakkan terbalik (dengan mulutnya di bawah). setelah penghasilan gas oleh mikroorganisma. Tegakkan semula botol media. Eramkan pada 37°C selama semalaman. 4. Tutup rapat media yang telah diinokulasi dan tunggangkan sekali supaya keseluruhan tiub Durham dipenuhi media dan sama sekali tidak mengandungi gelembung udara di dalamnya. Amati perubahan warna media dan penghasilan gas (yang terperangkap di dalam tiub Durham). NOTA 1. gas ini akan mengganti media yang dimaksudkan dan akan terperangkap di dalam tiub maka kehadiran ruang tanpa media menunjukkan kehadiran gas. 3. Jika pada mulanya tiub ini hanya dipenuhi dengan media.inokulasi ke dalam media yang mengandungi gula lain. 2. Penghasilan asid Ujian positif: Media berwarna merah Ujian negatif: Tanpa perubahan warna media . 5. Media cecair terdiri daripada gula 1% di dalam air pepton 1%. Biasanya media ini juga disertakan sejenis indikator pH. Catatkan hasil selepas 24 jam pengeraman dan seterusnya pengeraman dilanjutkan selama beberapa hari sebelum hasilnya dinyatakan sebagai negatif. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN 1. 7.

0%). Indikator pH.1%) . laktosa (1. laktos atau sukros atau kombinasi daripada ketiga-tiga gula tersebut. Bahagian permukaan agar (agar condong) (slant) adalah terdedah kepada udara maka wujud dalam keadaan aerobik.Pentafsiran hasil positif: Bakteria dapat menfermentasikan gula berkenaan 2. adalah fenol merah yang akan menjadi kuning pada pH 6. sebagai penunjuk fermentasi.0%) dan sukrosa (1.8 (keadaan asid). Media TSI ditampan pada pH 7. Sebaliknya. Media TSI disediakan dalam agar condong.4 iaitu pH alkali maka warna agar kelihatan oren-kemerahan atau merah. Penghasilan gas Ujian positif: Ruang kosong di dalam tiub Durham Ujian negatif: Tiub Durham masih dipenuhi media Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan gas semasa menfermentasi gula Ujian Tiga Gula-Besi Media tiga gula-besi atau Triple Sugar Iron ( TSI) merupakan sejenis media campuran yang digunakan untuk membezakan spesies bakteria dalam famili Enterobacteriaceae dengan berdasarkan kepada kemampuan spesies-spesies ini untuk memfermentasi gula dekstros. penghasilan gas dan penghasilan hidrogen sulfid. Gula yang digunakan adalah glukosa (0. bahagian puntung agar (di bahagian dasar tabung) (butt) dilindungi dari udara dan wujud dalam keadaan anaerobik (walaupun bukan 100%). .

sejenis terbitan alkali. kuantiti asid yang dihasilkan adalah terhad kerana kuantiti glukosa yang digunakan adalah rendah (0.75 Peptid dan asid amino yang berasal dari pepton di dalam media TSI didegradasikan melalui proses dekarboksilasi oksidatif kepada amina. Tetapi di permukaan agar yang terdedah kepada oksigen udara. amina dihasilkan dan lama kelamaan (18-24 jam selepas pengeraman) kuantitinya mencapai aras yang mampu mengatasi kesan kuantiti rendah asid yang dihasilkan. Walau bagaimanapun. kuantiti ini mencukupi untuk bahagian permukaan dan puntung agar menjadi kuning. Jika laktosa atau sukrosa. pH asid di bahagian permukaan agar akan berubah semula menjadi alkali (ungu-merah) manakala bahagian puntung agar (bahagian dasar tabung) akan kekal asid (kuning) kerana di situ amina yang dihasilkan tidak mencukupi untuk mengatasi kesan asid. Proses in dipercepatkan oleh bakteria yang tumbuh di bahagian permukaan agar. oksigen di dalam udara tidak dapat sampai maka proses dekarboksilasi oksidatif adalah pada tahap minimum. Jadi. Di bahagian puntung. asid tidak dihasilkan dan warna merah akan kekal di seluruh media. atau kedua-duanya difermentasi kuantiti asid yang dihasilkan daripada salah satu di antara kedua gula ini adalah besar kerana konsentrasi kedua-dua gula ini adalah tinggi iaitu masing-masing 1%. Jika bakteria yang diinokulasi tidak menfermentasi karbohidrat. Jika bakteria hanya boleh menfermentasi glukosa.1%). walaupun amina dihasilkan kuantiti asid yang .

Kultur bakteria 2. 2. Penunu Bunsen (Reagen TSI: Dari sumber komersial) TATACARA 1. 4. Dawai inokulasi lurus (dawai lurus) 4. Eramkan semalaman dan teruskan selama 48 jam (jika perlu). Cerun agar TSI di dalam tabung uji 3. 5. Penghasilan gas ditunjukkan dengan kehadiran gelembung gas atau bahagian puntung agar akan kelihatan pecah-pecah. Tarik semula dawai dan gariskan organisma di atas permukaan agar yang condong. 3. Sukrosa dicampurkan untuk menyaringkan spesies Salmonella dan Shigella kerana kedua-dua bakteria ini tidak menfermentasi sukrosa atau laktosa. Sterilkan keseluruhan dawai lurus melalui pembakaran dan biarkan supaya sejuk. . Tusukkan inokulum menembusi cerun agar TSI di dalam tabung sehingga ke dasarnya. Sentuhkan penghujung dawai kepada koloni bakteria.dihasilkan terlalu besar untuk perubahan pH kembali kepada keadaan alkali maka bahagian condong mahupun bahagian puntung agar akan tetap berkeadaan asid (kuning). Hidrogen sulfid yang dihasilkan akan bertindakbalas dengan ferrous sulfat dan suatu presipitasi hitam (ferik sulfid) akan terbentuk di dalam media. Tatacara Ujian Tiga Gula Besi BAHAN 1.

Tatacara Ujian Indol BAHAN 1. Tabung TSI harus ditutup secara longgar sahaja selepas diinokulasi supaya udara dapat masuk ke dalam tiub kultur untuk membolehkan berlakunya oksidasi dan perubahan balik condong agar daripada asid (kuning) ke alkali (ungu-kemerahan). maka untuk membezakan spesies-spesies ini ujian urease dilakukan. 2. Oleh kerana sesetengah spesies Proteus dan beberapa spesies lainnya boleh memberikan reaksi pada TSI yang serupa dengan Salmonella ataupun Shigella. urease-positif). Sungguhpun tindak balas kimia asas dalam pengesanan indol adalah sama. terdapat beberapa jenis reagen untuk mengesannya. manakala Proteus. Ujian Indol Bakteria menghasilkan indol (benzopyrrole) daripada asid amino triptofan akibat tindakan enzim triptofanase.1 76 NOTA 1. Indol bertindak dengan para-dimetil-aminobenzaldehid dan menghasilkan pewarna rosindole (warna merah tua). Kultur bakteria . (Salmonella dan Shigella adalah urease-negatif. reagen Kovac merupakan yang paling popular digunakan di masa kini.PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Rujuk kepada Jadual 5. Walau bagaimanapun.

Providencia.M.S.Ed-wardsiella Kuning Kuning Fermentasi glukosa & – – Hafnia. Serratia Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + – Salmonella cholera-suis. Pro-teus mirabilis. Proteus rettgeri. S. proteus rettgeri. Pseudomonas. morganii. Edwardsiella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa + + Salmonella typhimurium.vulgaris.P. Providencia. . P.1 Pola Hasil Tindakan Bakteria ke atas TSI Rupa Agar Penghasilan Tafsiran Kemungkinan Condong Puntung Gas H 2 S Bakteria (Jenis) Merah* Merah Tiada fermentasi gula – – Alcaligenes.enteriti-dis paratyphi.Klebsiella.S. vulgaris. Air pepton di dalam tabung uji 3. Shigella Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa _ + Salmonella typhosa.2. enter itidis. Morganella morganii.Arizona. Citrobacter.Citro-bacter. Mimae Ungu-kemerahan Kuning Fermentasi glukosa – – Shigella dysenteriae.Staphylococcus. S. schottmuelleri. Broth triptofan di dalam tabung uji JADUAL 5. sonnei. Proteus mira bilis. Arizona.

laktosa atau sukrosa Streptococcus. Serratia Kuning Kuning Fermentasi glukosa & + – Aerobacter aerogenes. . coli.Providencia Kuning Kuning Fermentasi glukosa & + + Proteus vulgaris. . Pipet Pasteur (steril) 5. laktosa atau sukrosa Citrobacter. Reagen Kovac PERSEDIAAN Reagen Kovac Masukkan 10 g p-dimetilaminobenzaldehid ke dalam 150 ml alkohol jenis amilalkohol. A. Panaskan di dalam penganggas air pada 56°C sehingga larut. Simpan di dalam botol gelap dengan penutup kaca di dalam peti beku. TATACARA 1. cloacae. P. laktosa atau sukrosa E. Reagen ini berwarna kuning muda. Reagen ini stabil selama beberapa tahun. mirabilis. Dengan perlahan dan hati-hati campurkan 50 ml HCl pekat (Lakukan di dalam kabinet asap). isoamilalkohol atau butilalkohol. Biarkan sehingga dingin. Proteus rettgeri. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. Klebsiella. Arizona * Atau tiada perubahan dan warna agar seperti warna sebelum diinokulasi 77 4.

4. Eramkan selama 24 – 48 jam. 5. Goncang dan biarkan selama 10 minit. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah tua Ujian negatif: Kuning Pentafsiran hasil positif: Penghasilan indol akibat degradasi protein triptofan oleh bakteria. Amatilah pembentukan lapisan warna (cincin) pada permukaan suspensi.5 ml) reagen Kovac (berwarna kuning). NOTA Di samping reagen Kovac. Ujian Metil-Merah Metil-merah pada pH neutral dan asid sederhana (nilai 7-6) berwarna kuning tetapi menjadi merah pada pH yang agak rendah iaitu di bawah nilai 4. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth triptofan. dalam ujian yang menggunakan reagen Ehrlich. 3. 6. Masukkan 5 titis (~ 0. reagen Ehrlich juga boleh digunakan dalam ujian Indol.4. Ujian indol yang dilakukan dengan reagen Kovac tidak memerlukan kloroform. Walau bagaimanapun.2. Ciri ini digunakan untuk membezakan di antara spesies bakteria yang menghasilkan asid „kuat‟ (strong acids) dalam kuantiti besar dan spesies . media diuji biasanya dicampurkan kloroform sejenis bahan kimia yang toksik.

Tatacara Ujian Metil-Merah BAHAN 1. asetik. Metil-merah (Media MR-VP: Dari sumber komersial) 78 PERSEDIAAN Reagen metil-merah Larutkan 0.4 manakala bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi butilena glikol tidak menghasilkan asid. kepekatan komponen media yang sesuai untuk ujian metilmerah serta ujian Voges Proskauer telah ditentukan dan media untuk kedua-dua ujian ini kemudian dipasarkan sebagai media MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer). Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. Kultur bakteria 2.bakteria yang tidak berbuat demikian. Bakteria yang menggunakan tapak jalan fermentasi asid campuran dalam katabolisme glukosa biasanya menghasilkan kuantiti pelbagai jenis asid organik (formik.1 g metil-merah di dalam 300 ml etanol 95%. Broth MR-VP di dalam tabung uji 4. TATACARA 1. Campurkan air suling sehingga 500 ml. laktik) yang mencukupi untuk menurunkan pH media di bawah nilai 4. Dalam penciptaan ujian metil-merah. . Air pepton 3.

Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam 0.2. Warna oren. Goncang dan biarkan seketika. Penghasilan asetoin merupakan salah satu kriteria dalam fermentasi glukosa oleh bakteria yang digunakan dalam pengenalpastian. Pentafsiran hasil positif: Menunjukkan penghasilan asid dalam kuantiti tinggi hasil fermentasiglukosa oleh bakteria. ujian diulangi ke atas kultur dengan pengeraman yang lebih lama. 2. Inokulum yang tebal adalah penting supaya kuantiti asid yang besar dapat dihasilkan untuk membolehkan ujian dibaca berikutan pengeraman selama 18-24 jam. 4. Masukkan 2 titis metil-merah ke dalam setiap 0. Amatilah pembentukan warna di permukaan media PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Warna merah jambu sehingga merah. Eramkan selama 24 jam pada 37°C. 6. NOTA 1. 3.5 ml broth MR-VP. warna pertengahan di antara kuning dan merah tidak dianggap positif. 5. Ujian negatif: Warna kuning.5 ml kultur. Dalam . 3. Jika hasil yang kurang pasti didapati. Ujian Voges-Proskauer Asetil-metil karbinol (atau asetoin) adalah metabolit pertengahan/perantaraan dalam proses penghasilan butilena glikol pada fermentasi glukosa.

kehadiran KOH dan oksigen (dari udara) asetoin secara spontan (tidak melibatkan enzim) dioksidasi menjadi metabolit pertengahan. Tatacara Ujian Voges-Proskauer BAHAN 1. 4. Kultur bakteria 2.6 ml larutan a -naftol. a -naftol 5% dalam alkohol pekat 95% 5. Masukkan pula 0. Air pepton 3. 6.2 ml larutan KOH. Goncang dengan baik dan biarkan selama 5 – 20 minit. diasetil. Diasetil kemudian bertindak dengan kumpulan NH 2 bebas daripada kumpulan guanidina (kreatin adalah sumber kumpulan guanidina) untuk menghasilkan kompleks berwarna merah. KOH (40% yang mengandungi 0. 3. . Masukkan dua titis suspensi ini ke dalam 1.5% kreatin) TATACARA 1. Broth MR-VP (0. 2.0 ml broth MR-VP. 5.5 ml) di dalam tabung uji 4. Tambahkan 0. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. Sensitiviti ujian ini dipertingkatkan dengan penambahan a -naftol. Eramkan pada 37°C selama 24 – 48 jam.

Ujian negatif: Tiada perubahan atau kuning. sejenis antibiotik. NOTA Oleh kerana suatu perubahan warna akan berlaku di antara permukaan campuran kultur dan reagen. maka elakkan daripada menggerak-gerakkan tabung sehingga membolehkan warna tersebut muncul segera selepas reagen dicampurkan dan tabung digoncang supaya sebati. Kajian yang telah dilakukan menunjukkan bahawa kebanyakan streptokokus kumpulan A (93-98%) sensitif terhadap konsentrasi rendah Bacitracin dan sebaliknya streptokokus bukan kumpulan A amnya resistan. Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin Sensitiviti terhadap Bacitracin. 79 PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Merah. digunakan untuk membezakan streptokokus kumpulan A Lancefield daripada streptokokus b-hemolitik lainnya. Kadangkala tindak balas mengambil masa yang lama (~ 2 jam) sebelum kemunculan warna yang dimaksudkan. Ujian ini Kehadiran asetil-metil-karbinol (asetoin). suatu hasil pertengahan menunjukkan . Sensitiviti terhadap Optochin (ethylhydrocuprein hydrochloride) pula digunakan untuk membezakan Streptococcus pneumoniae daripada streptokokus a -hemolitik lainnya.7. Amati pembentukan warna. Pentafsiran hasil positif: dalam proses fermentasi glukosa oleh sesetengah bakteria.

adalah sensitif terhadap Optochin dan menghasilkan zon rencatan pertumbuhan di sekeliling disk tersebut. streptokokus selain daripada kedua spesies ini menunjukkan keresistanan sama ada terhadap Bacitracin bagi kumpulan b-hemolitik atau terhadap Optochin bagi kumpulan a -hemolitik menurut ujian yang dilakukan di atas. Kesimpulannya. Disk Bacitracin dan disk Optochin Streptococcus pneumoniae sensitif terhadap Optochin. Kultur bakteria 2. Pneumokokus ( Streptococcus pneumoniae ) selain larut di dalam hempedu. manakala Sebaliknya. Streptococcus pyogenes (atau streptokokus kumpulan A Lancefield) sensitif terhadap Bacitracin. Tatacara Ujian Sensitiviti Terhadap Bacitracin dan Optochin BAHAN 1. Jarum/forseps steril 6. Gelung dawai 5. . Swab (steril) 4. Agar darah 3. Streptokokus a -hemolitik yang lainnya pula tumbuh sehingga mencapai ke pinggir disk atau kadangkala hanya menghasilkan zon rencatan pertumbuhan yang biasanya dibaca sebagai resistan.korelasi yang rapat dengan ujian kelarutan hempedu.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif Bacitracin: Zon kepekatan perencatan pertumbuhan. Ulangi kaedah di atas dengan menggunakan kultur streptokokus a -hemolitik dan disk Optochin. 3. 5. 7. 6. Tekan disk pada permukaan agar dengan forseps atau jarum steril supaya tidak tanggal. Eramkan pada 37°C selama 18 sehingga 24 jam. Ambil 1 koloni bakteria streptokokus b-hemolitik dan buat garisan-garisan pada permukaan agar darah.(Reagen Bacitracin dan Optochin: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Sapukan permukaan agar dengan menggunakan swab steril pada arah 90° daripada arah garisan pertama bakteria untuk mendapatkan lapisan bakteria yang tersebar dan sama rata di atas permukaan media. Amati zon perencatan pertumbuhan bakteria. 80 4. saiz yang bergantung kepada . Letakkan secara aseptik dengan menggunakan jarum atau forseps steril 1 disk Bacitracin ke atas agar sejurus sebelum pengeraman kultur. 2. Pengeraman seharusnya dilakukan dalam CO 2 5-10% untuk mencapai pertumbuhan optimum.

ia tidak mempunyai kemampuan untuk mensintesis faktor berkenaan dalam kuantiti yang optimum. Kultur bakteria 2. Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V Disk kertas yang diserap dengan faktor tumbesaran digunakan untuk membezakan antara spesies bakteria genus berdasarkan sama ada media dasar memerlukan penambahan faktor tumbesaran X (hemin) dan faktor V ( NAD. Spesies Haemophilus dan Bordetella boleh dikenal pasti . Tatacara Ujian Keperluan Faktor Tumbesaran X dan V BAHAN 1. V. Disk dengan dua unit Bacitracin: 15 – 20 mm garis pusat (termasuk garis pusat disk). code DD1: 5 mm atau lebih zon perencatan yang diukur dari tepi disk. Ujian positif Optochin: Disk Optochin jenama Oxoid. juga dinamakan koenzim I) supaya pertumbuhan bakteria dapat berlaku. Agar nutrien Haemophilus. dan X bersama V tertentu menandakan ia memerlukan faktor tersebut dan sebaliknya.reagen yang digunakan. Koloni spesies bakteria yang menunjukkan pertumbuhan di sekeliling disk yang mengandungi faktor tumbesaran X. Disk dengan 15 mg Optochin: 18 mm atau lebih dari tepi disk. Pentafsiran hasil positif: Bakteria sensitif terhadap Bacitracin/Optochin.

3. Eramkan pada suhu 37°C selama 18 dan teruskan sehingga 48 jam. Disk faktor X. disk faktor V : tepat pada jam 4. XV (Disk faktor X. Swab (steril) 5. tepat pada jam 8. manakala disk XV. jika perlu dalam atmosfera CO 2 5-10%. Gelung dawai 6. Amati kehadiran atau tidaknya pertumbuhan di sekeliling disk. 4. Jarum/forseps (steril) 7.3. V dan XV : Dari sumber komersial) TATACARA 1. 5. 81 PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN . Buat suspensi murni bakteria di dalam air pepton. Letakkan disk-disk yang mengandungi faktor tumbesaran secara aseptik di atas agar kira-kira 1 atau 2 cm daripada pinggir media dalam pola sebagai berikut: misalnya disk Faktor X : tepat pada titik jam tangan yang menunjukkan jam 12. Air pepton 4. Inokulasi seluruh permukaan plat agar nutrien dengan bakteria berkenaan dengan menggaris-gariskannya menggunakan gelung dawai. 2. V.

Simmons mengubahsuai media Koser . Dalam ujian yang menggunakan media Koser. apatah lagi agar coklat dalam melakukan ujian ini. NOTA 1.Pertumbuhan di sekeliling disk dengan: Faktor X dan XV – memerlukan faktor X sahaja Faktor V dan XV – memerlukan faktor V sahaja Faktor XV sahaja – memerlukan faktor X mahupun faktor V Bakteria yang memerlukan faktor X dan V atau salah satu di antaranya adalah spesies Haemophilus. pertussis . iaitu agar nutrien yang mana spesies-spesies yang diuji tidak mungkin tumbuh padanya tanpa penambahan faktor tumbesaran tertentu. dan natrium sitrat sebagai sumber tunggal karbon. Bakteria golongan aerogen boleh menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Perhatikan bahawa media yang digunakan berupa media minimum. Simpan disk pada suhu 4°C dan bukan pada 0°C. 2. Seterusnya. Penggunaan Sitrat Koser mencipta sejenis media broth asas yang mengandungi natrium ammonium fosfat sebagai sumber tunggal nitrogen. Elakkan daripada menggunakan agar darah. manakala yang tidak memerlukan faktor X atau V adalah B. manakala golongan koliform tidak. hasilnya ditafsir berdasarkan berlakunya kekeruhan pada media broth akibat pertumbuhan bakteria.

JADUAL 5. bromthymol blue.6. Perubahan warna. parahemolyticus ––++ B. dan hasil ujian dinyatakan sebagai positif untuk sitrat. ducreyi –+–+ H. yang kelihatan hijau pada pH 6.8 dan biru pada pH lebih 7. Pengubahsuaian ini membolehkan pertumbuhan bakteria dikesan dengan lebih mudah kerana dalam metabolisme karbon pada sitrat (pertumbuhan positif). pertussis ++++ 82 Ujian Penggunaan Sitrat BAHAN 1.1 Keperluan bakteria untuk faktor X dan V Pertumbuhan Berlaku Dengan Faktor: Spesies – XVX V H. Kultur bakteria . parainfluenzae ––++ H. tetapi sama ada terdapat atau tidaknya pertumbuhan bakteria pada garis inokulasi di atas media. influenzae –––+ H. suatu tindak balas alkali berlaku dan ini ditunjukkan dengan perubahan pada warna media daripada hijau kepada biru tua. Kehadiran pertumbuhan bererti kemampuan bakteria mengurai sitrat sebagai sumber karbon. hemolyticus –+++ H. dalam hal ini. mempermudahkan lagi pembacaan hasil ujian. Kadangkala bacaan hasil ujian tidak semata-mata berdasarkan kepada perubahan warna.tersebut dengan menambahkan agar dan indikator. aegyptius –––+ H.

2. Cerun agar sitrat Simmons di dalam botol Bijou (Agar sitrat Simmons: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Elakkan daripada mengambil sebarang bahan nutrien daripada media kultur di mana inokulum diambil. Sterilkan keseluruhan dawai lurus dan biarkan sehingga sejuk. jika perlu. NOTA 1. 4. Eramkan pada 37°C selama semalaman atau 48 jam. 3. Amatilah perubahan warna pada media. Gunakan sedikit sahaja inokulum supaya semasa penginokulasian inokulum ini tidak kelihatan sama sekali pada garis inokulasi dan untuk mengelakkan reaksi positif palsu akibat bakteria yang mati membebaskan karbon dan nitrogen dalam kuantiti yang boleh menampung pertumbuhan. 2. Kultur yang menunjukkan pertumbuhan tanpa perubahan pH (perubahan warna) juga . 5. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pertumbuhan dengan/tanpa media menjadi biru. 3. Dawai lurus 3. Sentuhkan pada koloni bakteria dengan penghujung dawai.2. Pentafsiran ujian positif: Kemampuan menggunakan sitrat sebagai sumber tunggal karbon. Ujian negatif: Tiada pertumbuhan atau media tetap hijau. Buatkan 1 garisan tipis bakteria pada permukaan agar.

dianggap positif kerana pada sesetengah bakteria yang lambat tumbuh keadaan tindak balas alkali tidak dapat dicapai dalam tempoh pengeraman yang ditetapkan.8) kepada merah jambu (pH 8. Pengeraman selama 48 jam mungkin diperlukan untuk bakteria yang lambat tumbuh supaya warna biru dapat muncul. bakteria-bakteria lain yang juga penting dalam perubatan mempunyai kemampuan untuk menghasilkan urease. Terdapat beberapa jenis ujian urease dengan sensitiviti yang berbeza-beza. maka hasil positif palsu untuk urease memang terdapat. Ujian Urease Urea adalah substrat spesifik yang dihidrolisis oleh enzim urease kepada ammonia dan karbon dioksida. 83 Tatacara Ujian Urease .1) Ujian untuk mengesan penghasilan enzim urease oleh bakteria biasanya digunakan dalam pengenalpastian bakteria genus Proteus. Tanda kehadiran urease dapat dikesan melalui indikator pH yang menunjukkan perubahan warna media daripada oren (pH 6. Tahap sensitiviti ini ditentukan terutamanya oleh kandungan larutan penampan. Untuk mengesan keadaan seperti ini ujian kawalan terhadap media yang tidak mengandungi urea diperlukan. Pemilihan dari segi jenis ujian ini adalah bergantung kepada kegunaannya. Ammonia menyebabkan campuran tindak balas menjadi alkali. Walau bagaimanapun. Oleh kerana pH media boleh ditingkatkan melalui sesuatu tindak balas lain.

Ujian Oksidase Ujian oksidase menentukan kehadiran sitokrom C. Negatif: Kuning. Buatkan suspensi kultur yang tebal di dalam air pepton. Enzim oksidase sitokrom tidak bertindak secara langsung .BAHAN 1. Oleh yang demikian. Gelung dawai 5. Sitokrom adalah protein yang mengandungi heme dan merupakan enzim oksidatif dalam kitaran respiratori yang terlibat dalam fosforilasi oksidatif. 2. 3. Broth urea di dalam botol Bijou 4. Amati warna broth urea. reagen oksidase adalah tetrametil-pfenilena-diamina dihidroklorida 1%. Pipet Pasteur steril TATACARA 1. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Positif: Merah. 4. Air pepton 3. Pentafsiran hasil positif: Kehadiran enzim urease yang menghidrolisis urea kepada ammonia. Dalam ujian oksidase tatacara Kovacs. Masukkan 2 titis suspensi ini ke dalam broth urea. Eramkan selama 24 jam. ujian ini hanya positif untuk bakteria yang memiliki sitokrom C. sejenis enzim respiratori. Kultur bakteria 2.

dengan reagen oksidase. Sitokrom C yang direduksi (ditambah elektron) dalam tindakan ini diubah secara tidak langsung kepada bentuk yang teroksidasi oleh oksidase sitokrom yang menerima elektronnya. Kultur bakteria 2. Letakkan sekeping kertas turas kecil di atas slaid mikroskop bersih. Kepingan kecil kertas turas Whatman No. 84 3. Enzim oksidase sitokrom kemudian menggantikan elektron tersebut kepada oksigen untuk menghasilkan air dengan ion hidrogen. Ujian ini digunakan untuk membezakan streptokokus (oksidase-negatif) daripada neisseria (oksidase-positif). Reagen oksidase (tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida 1%) 5. 2. Slaid mikroskop 3. tetapi menyebabkan oksidasi sitokrom C yang kemudian menyebabkan oksidasi tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida sehingga membentuk sejenis bahan kimia berwarna biru yang disebut biru Wunster. Ambil koloni bakteria dengan kayu aplikator dan goreskan ke atas kertas turas pada bahagian yang menyerap reagen oksidase. Kayu aplikator TATACARA 1. Titiskan 2 hingga 3 titis reagen oksidase ke atas kertas turas. 1 4. Tatacara Ujian Oksidase BAHAN 1. .

Tatacara alternatif ujian oksidase ini adalah dengan membanjiri kultur pada piring Petri dengan reagen dan kemudian segera menyingkirkan bahan yang berlebihan ini dengan pipet.4. 2. Pastikan dan patuhi tempoh masa yang ditetapkan untuk mentafsirkan hasil ujian ini kerana pada ujian yang disimpan lama sebelum dibaca hasil positif palsu boleh berlaku kerana warna biru atau ungu boleh muncul akibat auto-oksidasi yang berlaku ke atas reagen. Reagen yang baru disediakan perlu dibiarkan selama 15 minit untuk menjadi “masak” sebelum digunakan. Dawai nikrom juga boleh mempengaruhi hasil ujian dan memberikan hasil positif palsu. Ujian negatif: Tiada perubahan warna atau warna muncul hanya setelah beberapa minit. Amati kemunculan warna dalam beberapa saat. 3. 4. Auto-oksidasi oleh oksigen bebas dari udara boleh berlaku dan oleh yang demikian reagen ini dengan sendirinya akan berubah menjadi biru atau ungu jika dibiarkan di udara agak lama. Hasilnya ditunjukkan dengan perubahan warna koloni bakteria kepada warna ungu . Pentafsiran hasil positif: Perubahan segera ke warna biru/ungu menunjukkan bakteria memilikim sitokrom C. Reagen ini mesti disediakan segar kerana sifatnya yang tidak stabil. Gunakan kayu aplikator atau dawai platinum untuk mengambil koloni. 5. NOTA 1. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Kemunculan warna lavender (ungu pudar) yang cepat (dalam beberapa saat) menjadi biru/ungu.

Kultur bakteria 2. koagulase yang dihasilkan secara bebas bertindak dengan protrombin untuk menghasilkan trombin. daripada yang tidak menghasilkannya atau tidak patogenik. Larutan salin 0. Tatacara Ujian Koagulase Slaid BAHAN 1. Gelung dawai bakteria sehingga berlakunya penggumpalan/pengelompokan tersebut. Slaid mikroskop 4. yang satu terikat pada dinding sel bakteria (koagulase terikat) dan tidak bebas.85% 3. Terdapat dua jenis koagulase. Enzim bentuk ini bertindak secara langsung ke atas fibrinogen haiwan-haiwan tertentu dan menghasilkan fibrin yang memerangkap Sebaliknya.(oksidase-positif) atau tiada perubahan warna (oksidase-negatif). dan yang satu jenis lagi dirembeskan oleh sel ke dalam media atau cairan (koagulase bebas). Ujian Koagulase Ujian untuk menentukan penghasilan enzim koagulase oleh stafilokokus adalah suatu ujian penting dalam mikrobiologi diagnostik. yang seterusnya bertindak ke atas fibrinogen untuk menghasilkan fibrin (pembekuan). . Ujian slaid di mana penggumpalan atau pengelompokan bakteria dihasilkan dipercayai disebabkan oleh koagulase terikat yang terdapat pada dinding sel. Ia membezakan stafilokokus patogenik kerana berkemampuan untuk menghasilkan enzim ini.

Mana-mana bakteria yang boleh menggunakan sitrat sebagai sumber tenaga boleh membebaskan kalsium yang akan mengakibatkan pembekuan plasma jika plasma tersebut diambil daripada darah yang bercampur sitrat. 2. NOTA 1. adalah amat penting untuk mempastikan bahawa bakteria yang diuji adalah benar-benar kultur murni stafilokokus. Letakkan setitis larutan salin steril di atas sebuah slaid mikroskop yang bersih dan kering. Ambil beberapa koloni bakteria dengan gelung dawai steril. Tambahkan setitis plasma arnab kepada suspensi dan campurkan dengan gelung dawai. Ujian negatif: Tiada penggumpalan dan suspensi bakteria kelihatan homogen. Goncangkan slaid dan amatilah penggumpalan (clumping) bakteria yang akan kelihatan sebagai kelompak-kelompak putih dalam masa 15 saat. Buatkan suspensi bakteria ini di dalam titisan salin. Oleh yang demikian. 4. Gunakan plasma arnab atau manusia dan bukan spesies mamalia lain kerana kebanyakan . Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase. Plasma arnab 85 TATACARA 1.5. 2. 3. dan ujian ini digunakan semata-mata untuk membezakan antara strain yang menghasilkan koagulase daripada yang tidak. 5. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan gumpalan bakteria.

Kultur bakteria 2. Plasma arnab 6. Penganggas air pada 37°C . Tatacara Ujian Koagulase Tabung BAHAN 1. Pastikan koloni bakteria boleh diemulsifikasi di dalam salin supaya tidak menimbulkan masalah dalam pembacaan hasilnya nanti. 3. 4. Hasil positif yang berlaku lewat atau negatif diuji semula dengan ujian koagulase tabung kerana terdapat strain S. Larutan salin 0. Gelung dawai 5. 5. 6. Seterusnya. positif lemah dan kawalan negatif.85% 3. Perlu juga diperhatikan bahawa kadangkala plasma manusia yang digunakan mengandungi bahan perencat yang akan memberikan hasil negatif palsu. supaya hasil ujian boleh dipercayai dan diterima tanpa ragu-ragu.plasma daripada spesies lain tidak bertindak dengan koagulase stafilokokus. Ujian positif palsu boleh berlaku jika penggumpalan yang berlaku lewat diambil kira. ujian haruslah dilakukan juga ke atas beberapa jenis bakteria kawalan yang memberikan hasil positif kuat. aureus yang menghasilkan hanya koagulase bebas yang tidak bertindak dalam ujian koagulase slaid. Plasma perlulah diuji terlebih dahulu dengan strain kawalan positif dan negatif sebelum digunakan. Tabung uji steril 4.

Pastikan tabung tidak digoncang semasa mengamati dan membaca hasil ujian (penghasilan pembekuan) kerana ini akan mengakibatkan pembekuan menjadi terlerai dan tidak dapat . tabung haruslah diamati beberapa kali di sepanjang tempoh pengeraman. Eramkan pada suhu 37°C di dalam penganggas air dan amati selepas 1. 2. Sediakan suspensi stafilokokus di dalam larutan salin (atau gunakan kultur broth). akan kekal di dasar tabung uji. 5. 3. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase NOTA 1. tabung uji dicondongkan. 86 4. Sediakan 1:9 pencairan plasma arnab atau manusia di dalam larutan salin. 3 dan 6 jam dan selepas semalaman. Pembekuan jika hadir. Ujian negatif: Campuran tetap cair. Campurkan dengan memutarkan tabung uji di antara kedua dua tapak tangan. 2. Jangan campur dengan goncangan. Sesetengah strain stafilokokus menghasilkan enzim fibrinolisin yang akan melisis semula pembekuan plasma yang dihasilkan. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pembentukan pembekuan. jika masih negatif. Campurkan 1 isipadu suspensi bakteria dengan 5 isipadu larutan plasma.TATACARA 1. Untuk memudahkan pembekuan diamati. Untuk mengelakkan daripada memperolehi hasil yang negatif palsu.

Tatacara Ujian Katalase . Penghasilan gelembung gas (oksigen) adalah tanda bagi ujian yang positif. Ujian katalase digunakan khususnya untuk membezakan antara stafilokokus (katalase positif) dengan streptokokus (katalase negatif) dan juga kadangkala digunakan dalam pengenalpastian pelbagai jenis bakteria.dikesan. Tindak balas kimia yang berlaku dalam ujian katalase adalah : 2H 2 O 2 Æ 2H 2 O + O 2 •. Spesimen yang memberi hasil negatif pada masa pengeraman 6 jam dieramkan semula semalaman kerana terdapat strain S. 3. aureus yang kadar penghasilan koagulasenya adalah rendah maka masa yang panjang diperlukan untuk koagulase mencapai aras yang memberi hasil yang positif (hasil positif yang lewat) Ujian Katalase Katalase adalah enzim dengan bahagian (moieti) yang mengandungi besi.

Slaid mikroskop 3. 2. Penghasilan segelintir gelembung kecil selepas 20-30 saat tidak dianggap positif. Kayu aplikator 4. Amatilah kehadiran gelembung-gelembung gas yang dihasilkan dengan cepat. Kultur bakteria 2. NOTA 1. Jangan gunakan dawai gelung kerana positif palsu boleh berlaku. Sentuhkan penghujung kayu aplikator kepada koloni bakteria.BAHAN 1. Letakkan setitis larutan hidrogen peroksida di atas sebuah slaid kaca bersih dan kering. Masukkan organisma ke dalam titisan reagen di atas slaid. 4. rancak dan berterusan. Jangan gunakan kultur yang berusia lebih daripada 24 jam untuk mengelak daripada . 3. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Penghasilan dan pembebasan gas dengan cepat dicirikan dengan gelembunggelembung gas yang dibebaskan dengan rancak. 87 Ujian negatif: Tiada sebarang tindak balas. 2. Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim katalase. Hidrogen peroksida 3% TATACARA 1.

Pada kultur anaerobik. 3. sekiranya hal ini tidak dapat dielakkan. 4. Seboleh-bolehnya elakkan daripada mengambil koloni yang tumbuh pada permukaan media agar darah. Perlu ditekankan di sini bahawa . Ini untuk mengelakkan daripada terambil bersama sel darah dan mendapatkan hasil yang positif palsu seperti di atas. 6. Larutan H 2 O 2 disimpan di dalam botol gelap di dalam peti beku. Ujian katalase plat: Ujian ini boleh dilakukan ke atas koloni di atas plat kultur dengan me-nuangkan reagen ke atas koloni berkenaan KECUALI jika media kultur tersebut adalah agar darah kerana ia boleh memberikan hasil positif palsu. berhati-hatilah dalam pengambilan tersebut untuk mempastikan hasil yang tepat dan betul. 5.memperolehi hasil negatif palsu kerana enzim ini hanya dapat dikesan pada kultur hidup yang masih segar dan mungkin tiada lagi pada kultur tua. dedahkan kultur kepada udara selama setengah jam sebelum ujian dilakukan untuk membolehkan oksidasi aerobik ke atas katalase yang tereduksi berlaku. Gunakan H 2 O 2 pada kepekatan 3% untuk mendapatkan hasil ujian yang terbaik atau optimum. Tetapi.

Oleh yang demikian. Penghasilan H 2 S oleh sesejenis bakteria menandakan keupayaan bakteria tersebut untuk mereduksi sulfur kepada sulfida. Ujikan juga se-bahagian daripada plat agar yang belum diinokulasi dengan bakteria dengan menuangkan sedikit reagen di atasnya sebelum meneruskan dengan ujian katalase plat ini untuk mengelak-kan hasil positif palsu. Sesetengah bakteria yang menghasilkan H 2 S tidak dapat tumbuh pada media yang mengandungi terbitan ferum (besi). H 2 S yang dihasilkan oleh bakteria . Penghasilan Hidrogen Sulfida Bakteria boleh menghasilkan H 2 S daripada terbitan sulfur organik yang didapati di dalam pepton yang digunakan atau daripada terbitan sulfur tak organik yang dicampurkan dengan media kultur.darah juga mengandungi enzim katalase yang dapat bertindak balas dengan reagen. Ini adalah kerana sesetengah media mungkin mengandungi sedikit katalase yang boleh memberikan tindak balas yang lemah dan lambat serta boleh menyulitkan pembacaan hasil.

Kertas ini hanya diletakkan pada sisi mulut tabung di atas kultur bakteria pada agar condong. Cerun agar nutrien di dalam tabung 3. Dawai lurus 4. 88 3. Serapkan sekeping kertas turas dengan plumbum asetat 5% dan biarkan sehingga kering. 2.golongan ini dikesan dengan kertas yang diserapkan dengan larutan plumbum asetat 5%. Kultur bakteria 2. Kertas turas 5. Tatacara Ujian Penghasilan Hidrogen Sulfida BAHAN 1. Gariskan bakteria ke atas cerun agar di dalam tabung uji. Plumbum asetat 5% TATACARA 1. Gas H 2 S yang dibebaskan akan dikesan melalui perubahan warna kertas putih kepada warna hitam akibat pembentukan plumbum sulfida. Gantung kertas ini pada sisi mulut tabung uji dan pastikan kertas ini tidak menyentuh permukaan agar. tanpa menyentuh permukaan agar tersebut kerana plumbum asetat boleh menghalang pertumbuhan sesetengah bakteria. .

Enzim ini juga bertindak ke atas fosfolipid lainnya. Ujian hasil negatif: Tiada perubahan warna pada kertas. dan lesitinase A. Ujian Nagler pada mulanya dilakukan dengan menumbuhkan bakteria pada media agar kuning telur. Ujian Nagler Penentuan penghasilan enzim lesitinase oleh bakteria adalah berfaedah dalam pengenalpastian bakteria genus Clostridium khususnya Clostridium perfringens ( Clost. hasilnya menunjukkan kehadiran suatu zon opalesens (antibodi anti-lesitinase) di sekeliling koloni yang menandakan penghasilan lesitinase oleh bakteria.4. welchii ) sungguhpun terdapat laporan yang menyatakan bahawa bakteria lain seperti Pseudomonas aeruginosa juga boleh menghasilkan enzim ini. B dan D juga bertindak ke atas lesitin tetapi terhadap terbitan-terbitan lain yang dihasilkan. Selepas pengeraman. Enzim lesitinase C menghidrolisis lesitin (lecithin-phosphatidyl choline) kepada fosforilkolin dan sejenis digliserid. Pentafsiran hasil positif: Bakteria boleh menghasilkan H 2 S daripada sulfur. Fenomena ini kali pertama dilaporkan oleh Nagler yang pada waktu itu menggunakan serum . Eramkan pada 37°C semalaman. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian hasil positif: Kertas menjadi hitam.

. Ekstrak Fildes 5. 2. Agar nutrien 3. Penganggas air pada 50°C 4. vitellenin) daripada kuning telur yang mempresipitasikan lemak bebas. Emulsi kuning telur pekat 6. Antitoksin Clostridium perfringens ( Cl. Turunkan suhu kepada 50°C dengan membiarkan media di dalam penganggas air selama 15 minit. Kultur bakteria 2. Tatacara Ujian Nagler BAHAN 1.sebagai sumber lesitin. Cairkan 20 ml agar nutrien yang steril (Difco: Blood Agar Base CM55). welchii) (antibodi anti-lesitinase) 8. Gelung dawai (Reagen agar Nagler dan kuning telur : Dari sumber komersial) TATACARA 1. lemak bebas daripada kuning telur selepas lesitin dihancurkan dan protein tak larut air (vitellin. Mekanisme penghasilan opalesens dipercayai disebabkan oleh tiga faktor iaitu lemak digliserid yang dihasilkan. 3. Swab (steril) 9. Campurkan 1 ml ekstrak Fildes. Piring Petri 7.

5. 7. Ujian Elek . Eramkan secara anaerobik. Buatkan 1 garisan bakteria melintasi kedua-dua bahagian setengah plat agar ini (bahagian yang disapu antitoksin dan yang tidak). 6. Ujian negatif: Tidak terbentuk zon opalesens di sekeliling koloni pada keseluruhannya (pada kedua-dua kawasan disapu antitoksin dan tidak). Biarkan kering. Titiskan 2 titis antitoksin (antilesitinase) Cl. perfringens pada setengah bahagian daripada media plat. 8. Sebarkan antitoksin ini sama rata ke atas permukaan setengah plat agar dan biarkan ia meresap dan kering. Pentafsiran hasil positif: Bakteria menghasilkan serta merembeskan enzim lesitinase yang dikenal pasti kerana aktivitinya menghasilkan zon opalesens dihalang oleh antibodi anti-lesitinase (antitoksin).4. Campurkan emulsi “kuning telur pekat” (Difco: SR47) untuk mencapai kepekatan 5% dan tuangkan agar campuran ini ke dalam sebuah piring Petri. manakala pada bahagian setengah plat agar yang disapu dengan antitoksin tidak terbentuk zon opalesens. 89 PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Lesitinase dihasilkan jika zon opalesens hanya kelihatan di sekeliling koloni di bahagian setengah plat agar tanpa antitoksin.

Inkubator (Reagen agar dasar jenis Elek: Dari sumber komersial) TATACARA 1. Kultur bakteria kawalan negatif (disahkan tidak menghasilkan toksin difteria) 4. Penganggas air 50°C 6. Kultur bakteria kawalan positif (disahkan menghasilkan toksin difteria) 3. Penghasilan garis presipitasi adalah hasil suatu tindak balas serologi yang melibatkan antigen (toksin) dan antibodi (antitoksin). Kultur bakteria yang diuji 2. Serum lembu 7. . Antitoksin difteria 10. Tatacara Ujian Elek BAHAN 1.Strain melalui Corynebacteria diphtheriae yang menghasilkan toksin dapat dikesan secara in vitro penghasilan presipitasi apabila toksin ini bertindak dengan antitoksin. Cairkan 10 ml agar dasar Elek. Agar dasar Elek 5. secara tradisi ujian ini dimasukkan ke bahagian ujian biokimia. Kertas turas 8. Piring Petri yang steril 9. Walau bagaimanapun.

Titiskan 1 ml antitoksin difteria (1000 unit) ke atas jalur kertas supaya diserap dan biarkan kering. Biarkan agar menjadi kering. kawalan negatif dan yang diuji) secara tegak lurus (90°) melintasi jalur kertas antitoksin. 10. Gunakan inokulum yang tebal. . Inokulasi permukaan agar dengan bakteria (kawalan positif. 2. Campurkan 2 ml serum lembu. 3. Plat harus disediakan pada hari ujian dilakukan. 7. Letakkan sekeping kertas turas ke dalam 1 piring Petri kosong yang steril. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Garis presipitasi kelihatan muncul daripada sudut pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan positif. Eramkan dan amati selepas 24 jam dan 48 jam. Pentafsiran ujian positif: Bakteria menghasilkan toksin difteria.2. 4. Tuangkan agar campur serum ke dalam piring Petri. 6. 8. Ujian negatif: Tiada garis presipitasi. 90 NOTA 1. Turunkan suhu kepada 50°C dengan membiarkan di dalam penganggas air selama 15 minit. Letakkan kertas yang mengandungi antitoksin di tengah piring agar sejurus selepas agar mem-beku. 5. 9.

Kultur bakteria 2.4% atau <) yang mengandungi indikator (garam tetrazolium) di dalam tabung uji 3. kompleks tak larut berwarna merah hasil pereduksian oleh bakteria yang tumbuh. kemungkinan garis presipitin juga dihasilkan oleh strain kawalan negatif (dan juga Corynebacterium akibat antigen yang umum kepada semua korinebakteria). Jika bakteria mempunyai kemampuan untuk bergerak atau bersifat motil ia akan menunjukkan penyebaran yang bermula dari garis inokulasi. Jika plat dieramkan lebih 48 jam.3. Garam tetrazolium adalah tanpa warna dan akan diubah kepada formazan. Ujian Motiliti dengan Menggunakan Agar Separuh Pejal Media pertumbuhan dengan kepekatan agar yang rendah (0. Inkubator . Tatacara Ujian Motiliti (Pergerakan) pada Agar Separuh Pejal BAHAN 1. Bakteria yang tak motil akan tetap pada garis inokulasi dan sama sekali tidak akan tersebar. 4. Garam tetrazolium digunakan dalam ujian motiliti ini kerana ia memudahkan pengesanan pertumbuhan serta penyebaran bakteria secara visual di dalam media. Dawai lurus 4.4% atau <) merupakan suatu media separuh pejal yang membolehkan bakteria bergerak dan menyebar ke pelbagai arah di dalamnya. Pastikan strain kawalan negatif dan strain kawalan positif diikut sertakan. Agar nutrien (0.

Pertumbuhan beberapa jenis bakteria tertentu mungkin dihalang oleh garam tetrazolium. Ujian negatif: Pertumbuhan bakteria terhad kepada garis tusukan. 5. Tusukkan hujung dawai ke dalam agar separuh pejal sehingga ke dasar tabung. NOTA 1. 3. 2. 4. Elakkan daripada menggerakkan dawai ke kiri atau ke kanan semasa dikeluarkan (dan juga semasa dawai ditusuk) kerana ini akan menyebabkan pertumbuhan yang kelihatan tersebar dan memberi tafsiran positif palsu mengenai mobiliti. 3. ujian negatif – bakteria tak motil. 2. Dawai yang ditusuk ke dalam media dikeluarkan seboleh-bolehnya bertepatan dengan garis kemasukannya. Sterilkan keseluruhan dawai lurus. Pentafsiran ujian: Ujian positif – bakteria motif. Sentuh koloni bakteria dengan penghujung dawai. 4. Amati pola pertumbuhan bakteria. PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN Ujian positif: Pertumbuhan bakteria (merah) tersebar daripada garis tusukan dawai lurus. Oleh kerana keseluruhan dawai lurus akan ditusuk ke dalam agar maka pastikan keseluruhan dawai ini dibakar untuk mensterilkannya. 91 .TATACARA 1. Eramkan semalaman. Beberapa bakteria seperti Pseudomonas adalah aerobik dan akan hanya menunjukkan motiliti pada bahagian atas media ini.

6. UJIAN RESAPAN DISK Dalam ujian resapan disk. Seseorang doktor haruslah mengetahui mengenai tahap kerentanan (susceptibility) sesuatu mikroorganisma terhadap antibiotik tertentu supaya memudahkannya membuat keputusan yang sesuai dalam rawatan serta pengurusan seseorang pesakit. Senarai antibiotik yang dipencilkan dan dikenal pasti sememangnya cukup panjang. Cara lain ialah organisma dicampurkan dengan media agar yang masih cecair dan kemudian dituangkan ke dalam piring. Kemudian disk diletakkan di atas inokulum yang telah disebarkan pada permukaan agar atau pada permukaan . Agen kemoterapi yang dihasilkan berikutan aktiviti metabolik bakteria atau fungus disebut antibiotik.1. Maklumat ini boleh diperolehi di makmal umumnya melalui dua teknik atau pendekatan iaitu ujian resapan disk dan asai pencairan tiub. Pada masa ini kebanyakan antibiotik dan terbitannya yang digunakan dalam rawatan dihasilkan secara sintetik atau buatan. namun demikian kebanyakannya tidak mempunyai nilai perubatan kerana sesetengahnya mungkin terlalu toksik terhadap pengguna atau sukar diperolehi. tetapi terlebih dahulu diserapkan ke dalam disk-disk kertas (satu disk satu jenis antibiotik dengan satu unit pencairan). 6. UJIAN SENSITIVITI ANTIBIOTIK IN VITRO Rawatan penyakit dengan sesuatu bahan atau sebatian kimia dinamakan kemoterapi. Biasanya larutan antibiotik ini tidak terus diletakkan ke atas agar. organisma yang diuji digariskan (atau diinokulasi dan kemudian disebarkan) memenuhi permukaan media agar di dalam piring Petri.

Jika kultur bakteria sensitif terhadap sesuatu antibiotik. suatu zon rencatan pertumbuhan akan terbentuk di sekeliling disk yang mengandungi antibiotik tersebut. Sapukan swab sambil memutarkannya pada permukaan media agar untuk penginokulasian mengikut corak seperti diterangkan di bawah: . bahkan kadangkala boleh tumbuh di bawah disk. Dalam ujian resapan disk. Tatacara Membuat Inokulasi Bakteria pada Keseluruhan Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. Celupkan swab steril ke dalam suspensi bakteria yang berada di dalam tabung uji. pada keseluruhan permukaan media plat agar. prosedur pertama (awal) adalah penginokulasian hanya bakteria yang diuji. atau bersama bakteria kawalan. Antibiotik tersebut akan merembes keluar daripada disk dan meresap ke dalam media. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton 2. Sebaliknya.media agar yang telah dicampur organisma sebelum pengeraman. pertumbuhan akan berlaku sehinggalah mencapai ke pinggir disk. 3. Pendekatan ini disebut sebagai ujian resapan disk dan terdapat dua tatacara yang umum. Plat agar darah Mueller-Hinton TATACARA 1. jika ia resistan. 2. Swab (steril) 3. iaitu tatacara Stoke dan tatacara perbandingan.

Kaedah ini dilaksanakan sejajar dengan pergerakan alat pemutar plat. Letakkan plat agar di atas pentas pemutar plat Petri. Buangkan swab ke dalam bekas khas yang mengandungi disinfektan. Alat pemutar plat Petri TATACARA 1.Sapukan swab mula-mula ke satu arah sehingga memenuhi keseluruhan permukaan media dan kemudian sapukan pula menurut arah kira-kira 90 darjah daripada arah sapuan semula. Putarkan swab pada dinding sebelah dalam tabung uji berkenaan untuk menyingkirkan suspensi yang berlebihan. 2. 92 Tatacara Membuat Inokulasi 2 Jenis Bakteria di Bahagian yang Berasingan pada Permukaan Media Plat Agar BAHAN 1. 3. 4. Suspensi bakteria yang diuji di dalam air pepton 2. Plat agar darah Mueller-Hinton 5. 4. Suspensi bakteria kawalan 3. . Swab (steril) 4. Celupkan swab yang steril ke dalam suspensi bakteria kawalan. Buka penutup plat Petri dan inokulasi media dengan mula-mula menyentuh bahagian tengah plat dengan swab yang mengandungi bakteria kawalan sehinggalah penginokulasian ini memenuhi suatu kawasan bulatan kira-kira 5 cm garis pusat.

Suatu garis perbatasan antara kedua-dua jenis bakteria kawalan dan ujian akan diperolehi di mana disk-disk antibiotik akan diletakkan nanti. 6. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) 2.5. Jarum atau forseps (steril) 7. Swab (steril) 6. Tabung air pepton 5. Disk antibiotik 8. Gelung dawai 3. Lakukan kaedah 2 dan 3 untuk bakteria yang akan diuji. Penunu Bunsen 4. Ujian Resapan Disk: Tatacara Perbandingan BAHAN 1. NOTA Pastikan swab tidak terlalu basah atau meninggalkan kesan yang tidak diingini pada permukaan agar. Sentuhkan dengan swab yang mengandungi bakteria yang diuji bahagian tepi plat dan liputi kawasan permukaan agar ini dengan inokulum ini sehingga hampir menyentuh pinggir kawasan inokulum pertama. Inkubator 9. Pembaris TATACARA Hari pertama .

10. Pastikan terdapat jarak yang sekurang-kurangnya 1. 3. Eramkan plat pada 37°C semalaman. 93 5. 9. Pindahkan 3 koloni bakteria (garis pusat 1-2 mm) ke dalam 1 tabung air pepton. 4. Jika suatu carta rujukan piawai diperolehi atau sudah tersedia. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan bakteria kawalan adalah secara kuantitatif hampir sama. separuh sensitif (intermediate) atau resistan. 7. 93). Sterilkan gelung dawai. NOTA 1.5 cm antara 1 dengan lain mahupun antara disk dengan dinding plat. 6. 2. Goncangkan untuk mendapatkan suspensi yang homogenus. Bandingkan hasil sensitiviti kedua-dua strain terhadap antibiotik dan tentukan sama ada strain yang diuji sensitif.1. ujian ke atas strain kawalan . Hari kedua 8. Balikkan plat dan ukurlah garis pusat zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan). Inokulasi strain bakteria ini pada keseluruhan permukaan media agar dengan swab steril (rujuk kepada tatacara di ms. Biarkan supaya permukaan media menjadi kering dan kemudian letakkan disk-disk antibiotik di atas media dengan menggunakan jarum atau forseps steril dan tekan disk ke atas permukaan agar. Ulangi kaedah 1 hingga 5 untuk strain kawalan pada plat lain yang mengandungi media yang sama.

Alat pemutar plat Petri 7. Seseorang hanya perlu merujuk kepada carta tersebut untuk menentukan pola sensitiviti strain bakteria yang diuji menurut senarai yang ditetapkan di dalam carta berkenaan. Penunu Bunsen 4. Ujian Resapan Disk: Tatacara Stoke BAHAN 1. Pembaris TATACARA Hari pertama 1. Jarum atau forseps (steril) 8. 2. separuh sensitif. Inkubator 10. Inokulasi bakteria yang diuji dan bakteria kawalan di atas plat yang sama di bahagian yang . Disk antibiotik 9. atau resistan. Tatacara perbandingan berdasarkan carta atau suatu piawai yang tersedia dikenali sebagai Tatacara Kirby-Bauer. Swab (steril) 6. Tabung air pepton 5.tidak perlu dijalankan. Kultur bakteria (masing-masing untuk ujian dan kawalan) 2. Gelung dawai 3. Ini bagi menyatakan sama ada bakteria tersebut sensitif.

2. bermula daripada titik pusat disk). Pastikan terdapat jarak sekurang-kurangnya 1. Letak dan tekan disk antibiotik tepat di atas garis perbatasan antara kedua-dua kultur supaya sebelah disk berada di kawasan kultur kawalan dan sebelah lagi di kawasan kultur yang diuji. 3.s. Buat perbandingan antara zon tanpa pertumbuhan yang dihasilkan terhadap strain ujian dengan zon yang dihasilkan terhadap strain kawalan untuk menentukan keresistanan bakteria kepada sesuatu antibiotik. 94). Agar Mueller-Hinton merupakan media yang paling sesuai untuk ujian sensitiviti resapan disk. Bagi bakteria yang sukar tumbuh pada media ini bolehlah dicampurkan darah 5% sebagai nutrien tambahan. 3. Eramkan plat pada 37°C semalaman. Kelewatan meletakkan disk menyebabkan bakteria tumbuh sebelum antibiotik dapat meresap ke dalam media dan bertindak ke atas bakteria. Ini menghasilkan pembacaan yang kurang tepat. 94 Hari kedua 4.5 cm antara satu disk dengan yang lain dan juga disk dengan dinding plat. Gunakan isipadu agar yang sama setiap kali supaya ketebalan agar dalam piring Petri .berasingan (rujuk kepada bahagian tatacara di m. Balikkan plat dan ukurlah jejari zon tanpa pertumbuhan bakteria (zon rencatan. 2. 5. Disk antibiotik harus diletakkan sejurus selepas inokulasi dilakukan. NOTA 1.

Kemudian setiap tiub diinokulasi dengan organisma . 6. Pastikan pertumbuhan bakteria yang diuji dan kawalan hampir sama secara kuantitatif untuk memberikan perbandingan yang tepat di antara kedua-duanya. Jangan gunakan disk antibiotik yang telah tamat tempoh penggunaannya atau melebihi tarikh pelupusannya. oleh itu tidak disyorkan sebagai tatacara rutin. Kultur plat harus dieramkan sejurus selepas disk diletakkan. 6. ukuran garis pusat atau jejari yang terkecil yang diambil kira. Dalam keadaan ini. tetapi memperlihatkan juga pertumbuhan bakteria yang berbonjol di sekitar pinggir zon harus dilaporkan sebagai resistan. 5.sentiasa sama. 8. Stafilokokus yang menghasilkan zon rencatan yang jelas. Dalam keadaan ini. antibiotik disediakan dalam pencairan dua kali ganda di dalam suatu siri tabung media pertumbuhan. Jika ini tidak dipatuhi. Zon rencatan yang berbentuk bujur boleh disebabkan oleh disk yang tergeser di atas permukaan media atau disk diletakkan terlalu rapat dengan pinggir piring. kepekatan antibiotik yang meresap ke dalam media agar juga akan sentiasa sama. Dalam prosedur ini. 7. UJIAN PENCAIRAN TABUNG Pendekatan yang lebih kuantitatif untuk menguji sensitiviti bakteria terhadap sesuatu antibiotik adalah tatacara pencairan tabung.2. 4. Fenomena ini mungkin ditemui di kalangan stafilokokus penghasil enzim betalaktamase yang diuji dengan disk antibiotik yang mengandungi penisilin dan terbitannya. Ia memakan masa lebih lama. besar kemungkinan zon rencatan pertumbuhan yang lebih besar akan dihasilkan kerana resapan antibiotik terlebih dahulu berlaku sebelum pertumbuhan bakteria bermula.

Sama ada antibiotik berkenaan bersifat bakterisiadal (membunuh bakteria) atau bakteriostatik (merencat pertumbuhan bakteria) dapat dipastikan dengan melakukan pensubkulturan daripada tiub yang tidak menunjukkan pertumbuhan tersebut ke atas media agar tanpa antibiotik. Antibiotik 6. 95 Tatacara Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) BAHAN 1. Inkubator bersuhu 37°C TATACARA kepekatan bakterisidal . Kultur broth bakteria kawalan 3. Ini dilakukan dengan mengamati tiub berkepekatan antibiotik terendah atau paling minimum dalam siri pencairan yang menghalang pertumbuhan bakteria (tiub yang jernih tepat disebelah tiub yang mula menunjukkan kekeruhan). Tabung-tabung uji (steril) 4.berkenaan dan kepekatan perencatan minimum (minimum inhibitory concentration: MIC ) ditentukan. Kepekatan terendah untuk antibiotik yang menunjukkan hasil “tiada pertumbuhan bakteria” pada subkultur dianggap sebagai kepekatan antibiotik terendah yang berupaya membunuh bakteria tersebut – minimum (minimum bactericidal concentration: MBC). Pipet bersukat 5. Kultur broth bakteria yang diuji 2.

3. NOTA 1. Kultur tabung harus dieramkan sejurus selepas bakteria dicampurkan. 5. Pastikan terdapat juga 1 tabung yang mengandungi antibiotik dengan broth yang tidak mengandungi bakteria (tabung kawalan negatif). cara yang mudahnya adalah dengan merujuk kepada tabung kawalan positif yang mengandungi bakteria tanpa antibiotik (keruh). Goncang dan amatilah setiap tabung daripada kedua-dua siri tabung ini untuk menentukan pertumbuhan bakteria (positif . Bakteria kawalan adalah bakteria yang sensitif terhadap antibiotik yang digunakan dalam . dan tabung kawalan negatif yang mengandungi antibiotik sahaja (jernih).5 ml). Eramkan pada 37°C semalaman. 2. 4. negatif . isipadu larutan 0. Sediakan 2 siri tabung yang mengandungi siri pencairan 2 kali ganda antibiotik yang diuji di dalam broth dengan kepekatan tertinggi antibiotik 200 µg atau 200 unit setiap ml (tabung bersaiz 13 mm x 100 mm.jernih). 2.keruh. Masukkan 0. 3. Pastikan tabung yang steril digunakan dan pencairan dibuat secara teknik aseptik. Lakukan pencairan kultur broth semalaman bakteria yang diuji dan bakteria kawalan sebanyak 1:1000 di dalam broth baru untuk memperoleh ~ 10 5 bakteria hidup setiap ml. termasuk satu tabung yang mengandungi broth tanpa antibiotik (tabung kawalan positif).1. 4. Untuk memastikan sama ada berlaku pertumbuhan atau tidak.5 ml ke dalam setiap tabung.

ujian ini dan mesti beri hasil yang positif sebelum hasil bakteria yang diuji boleh diterima. Ini merupakan kepekatan bakterisidal minimum. titiskan (secara terpisah) 3 titis kandungan setiap tabung yang didapati jernih sahaja dalam siri tabung ujian MIC ke atas separuh plat. Dengan menggunakan pipet yang sama. Biarkan titisan larutan mengering sebelum mengeramkan plat pada 37°C semalaman. Tuliskan nombor siri tabung (atau kepekatan antibiotik) pada setiap separuh plat. Tatacara Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum) BAHAN 1. Gunakan pena penanda untuk membahagikan permukaan dasar setiap plat media kepada 2 bahagian sama besar untuk mendapatkan 2 „separuh plat‟ bagi setiap plat media. Pipet Pasteur TATACARA 1. Tentu dan pastikan pencairan yang terendah di mana tidak terdapat pertumbuhan bakteria lagi. Siri tabung ujian MIC 2. 5. Mulakan penitisan dari separuh tabung dengan kepekatan antibiotik yang tertinggi hinggalah kepada tabung dengan kepekatan yang paling rendah. 4. Pastikan permukaan agar betul-betul kering. 2. 96 6. 97 . Plat-plat agar 3. 3. Amati pertumbuhan koloni di atas plat bagi setiap pencairan. 7.

pengesanan identiti sesejenis mikrob adalah sukar kerana ia mempunyai saiz yang amat kecil dan tidak dapat dilihat dengan mata kasar. mikrob berkemampuan menghasilkan antibodi yang bertindak secara spesifik dengannya. maka adalah sukar untuk menentukan identiti kebanyakan mikrob berdasarkan pengamatan secara langsung. Percantuman antibodi dengan enzim membolehkan antibodi yang melekat kepada antigen dikesan apabila tindakan enzim menukar warna substratnya. terdapat banyak ujian serologi dan banyak variasi sesuatu ujian. Ada juga . UJIAN SEROLOGI DALAM MIKROBIOLOGI Suatu aspek yang penting dalam bidang mikrobiologi adalah pengesanan jenis mikrob yang merupakan agen etiologi sesuatu penyakit. Jika percantuman adalah dengan fluorokrom. tindakan sesuatu mikrob dengan antibodi yang spesifik terhadapnya adalah suatu pendekatan yang digunakan dalam pengenalan identiti sesuatu mikrob. Di bidang mikrobiologi. Tindakan antigen mikrob dengan antibodi dapat dikenal pasti dengan beberapa cara seperti mewujudkan presipitasi atau aglutinasi. Sungguhpun mikroskop boleh digunakan. pancaran cahaya berwarna tertentu – seperti warna hijau-kuning oleh fluorokrom FITC adalah tanda kehadiran kompleks antigenantibodi. Oleh kerana mikrob merupakan antigen yang baik. Oleh yang demikian.7. Dalam hal ini. kebanyakan mikrob seperti bakteria memiliki morfologi kasar yang sama.

aglutinasi lateks dan imunopendafluor. tatacara dwilapisan antibodi yang diubahsuai. tatacara dwilapisan antibodi. aspek umum kedua-dua ujian berkenaan akan dibentangkan. Walau bagaimanapun. Asai ini merupakan imunoasai heterogenus kerana ia mempunyai suatu peringkat di mana komponen yang dilabelkan (gabungkan) enzim yang telah bertindak dengan ligannya dipisahkan daripada komponen yang sama yang tidak bertindak. diterangkan kerana ketiga-tiga ujian berkenaan mempunyai aplikasi dalam bidang bakteriologi. ELISA komersial. tatacara perencatan. 1 ELISA Asai imunosorben bergabung enzim (enzyme-linked immunosorbent assay) atau lebih terkenal dengan singkatan ELISA adalah sejenis imunoasai yang antigen atau antibodi larut dilekatkan kepada suatu permukaan pepejal seperti permukaan manik atau telaga tanpa menghilangkan reaktiviti komponen imunologiknya. iaitu ELISA . ELISA terdiri daripada beberapa jenis asai: tatacara persaingan. fasa pepejal anti-IgM dan dan aglutinasi lateks biasanya dilakukan dengan reagen . mikologi dan virologi. 7 .ujian yang merupakan ujian rekaan makmal sendiri (in-house) di samping ujian komersial. Dalam bahagian ini hanya tiga ujian mikrobiologi. rasanya tidaklah sesuai untuk dibahaskan tentang tatacara masing-masing. maka kit daripada pengeluar yang berbeza mempunyai tatacara tersendiri. Pemisahan ini dilakukan melalui pencucian. Oleh yang demikian.

Reagen komersial biasanya mempunyai sensitiviti yang amat tinggi dan ini boleh menimbulkan hasil positif palsu jika pencucian antara peringkat pengeraman dengan reagen tidak dilakukan dengan sempurna. umpamanya semalaman sungguhpun pada suhu peti beku. Rancangkan kekerapan ujian yang akan dijalankan untuk mengoptimumkan penggunaan sesuatu kit kerana reagen dan fasa pepejal (telaga. khususnya. jika ia dilakukan dengan menggunakan alat pembaca ELISA . penyimpanan lama. 3. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan bagi mengelakkan kemungkinan hasil negatif palsu. . 98 4. 2. NOTA 1. manik) yang disaluti antigen atau antibodi juga digunakan kerana sampel kawalan positif dan negatif turut diasaikan dengan sampel ujian setiap kali ujian dijalankan. akan menukar warna hasil ujian daripada apa yang didapati sejurus selepas asai tamat. Dalam sesetengah sistem enzim-indikator. sungguhpun kebanyakan ELISA untuk kegunaan dalam mikrobiologi adalah termasuk dalam golongan kedua ini. sungguhpun tindak balas enzim ke atas substratnya telah dihentikan dengan bahan kimia yang sesuai.tatacara secara tidak langsung (asai untuk pengesanan antibodi). Ikuti arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. ELISA boleh merupakan asai kuantitatif atau kualitatif. 5. sama ada daripada segi masa cucian mahupun bilangan cucian yang dilakukan. Jangan tunggu terlalu lama selepas hasil asai dibaca.

terdapat berbagai-bagai jenama ujian aglutinasi lateks untuk pengesanan berbagaibagai antigen/antibodi. Di pasaran. Sungguhpun ujian aglutinasi lateks slaid mudah dilakukan. Para pengguna harus mempastikan sesuatu ujian itu bermutu tinggi dan sesuai untuk tujuan mereka. Ujian Aglutinasi Lateks Slaid Antibodi atau antigen boleh digabungkan dengan partikel polistirin (digelarkan „lateks‟ kerana warna putihnya menyerupai lateks tumbuhan) bagi mengesan antigen atau antibodi masingmasing. NOTA . 7. Ujian ini adalah cepat serta mudah dilakukan dan tidak memerlukan alat radas yang mahal atau canggih. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. Pastikan sisa asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal. beberapa peraturan harus dipatuhi supaya hasil yang didapati boleh diyakini. Tambahan pula.6. Pergabungan antigen dengan antibodi akan menyebabkan kelompok-kelompok besar partikel lateks yang dapat diamati dengan mata kasar. Tidak semuanya boleh dianggap memuaskan dari segi spesifisiti dan sensitiviti. ujian ini tidak membazirkan reagen jika dilakukan ke atas sebilangan sampel yang kecil.

Titisan dengan isipadu yang sama boleh dicapai dengan menggunakan mikropipet. Titisan besar reagen daripada botol reagen mungkin menggalakkan para pengguna berusaha untuk mengurangkan isipadu reagen bagi mengurangkan kos. 3. Ikut arahan dengan tepat mengenai tatacara yang dinyatakan oleh pengeluar ujian. Oleh kerana ujian direka dengan sensitiviti yang tinggi. 4. 9. 7. Jangan lakukan ujian dengan menggunakan reagen daripada beberapa kit yang mempunyai nombor pengeluaran yang berbeza. Baca hasil ujian pada masa yang ditetapkan selepas ujian dimulakan. 2. 8. ada kemungkinan hasil negatif palsu didapati jika sampel diuji lebih daripada masa yang ditetapkan. 5. 6. 99 . Biarkan reagen mencapai suhu bilik sebelum ujian dilakukan kerana penggunaan kit sejurus selepas dikeluarkan dari peti beku mungkin memberikan hasil yang kurang memuaskan. atau pun hasil negatif palsu. Jangan gunakan reagen selepas tarikh pelupusan supaya mengelakkan kemungkinan hasil positif palsu. Titisan reagen lateks yang dititiskan daripada botol reagen adalah berbeza-beza.1. Amalan ini seharusnya jangan dilakukan kerana mengurangkan isipadu reagen boleh menimbulkan hasil negatif palsu. Goncang botol-botol reagen supaya memperolehi suspensi reagen lateks yang sama rata sebelum reagen lateks digunakan. Pastikan sisa daripada asai seperti cucian dimasukkan di dalam bekas disinfektan yang sesuai untuk mengelakkan berlakunya infeksi ke atas pengguna makmal.

Nisbah amaun tenaga yang dikeluarkan kepada tenaga yang diserap adalah amat tinggi (~85%) maka ia memberi sensitiviti yang baik. Dalam lain perkataan. Jenis warna (gelombang cahaya) yang dikeluarkan adalah khas untuk sejenis fluorokrom. Sungguhpun terdapat berbagai jenis fluorokrom seperti rodamin dan Texas Red. Pancaran cahayanya pada gelombang 520 mµ adalah di kawasan sensitiviti pengamatan yang paling baik maka ia memberi sensitiviti yang baik. maka ia meningkatkan spesifisiti. . Dalam pendekatan lain. gabungan secara spesifik antibodi dengan sesuatu antigen dikenal pasti melalui gabungan antibodi berkenaan dengan antibodi terhadapnya yang tercantum fluorkrom ( ujian tak langsung ). cahaya suatu warna diserap dan cahaya warna lain dikeluarkan oleh fluorokrom. 2. komponen mikrob) dapat dikenal pasti secara tidak langsung melalui pengamatan mikroskop apabila antigen berkenaan digabung secara spesifik dengan antibodi yang secara langsung tercantum fluorokrom ( ujian langsung ).Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung Kehadiran sejenis antigen (misalnya. Fluorokrom adalah sebatian semula jadi atau sintetik yang boleh menyerap cahaya gelombang tertentu dan sejurus selepas itu mengeluarkan tenaga sebagai cahaya dengan gelombang yang lebih panjang. Autopendafluor berwarna hijau-kuning jarang berlaku. fluoresein adalah fluorokrom yang paling umum digunakan kerana ia mempunyai beberapa kelebihan: 1. 3.

Air suling 11. Antiserum 7. Kertas turas 4. Konjugat antibodi terhadap antiserum dan FITC („konjugat‟) 8.4. Varnis kuku 6. Kayu aplikator 5. Titiskan suspensi sampel (sel diinfeksi mikrob dan ditanggalkan dari permukaan bekas . Mikroskop imunopendafluor TATACARA Penyediaan spesimen sel yang diuji ke atas slaid mikroskop 1. Slaid mikroskop atau slaid khas untuk ujian imunopendafluor 2. Inkubator bersuhu 37°C 13. Metanol 10. Larutan salin yang ditampankan fosfat ( PBS ) 9. Tatacara Ujian Imunopendafluor Tidak Langsung BAHAN 1. Larutan PBS 90% dan gliserol 10% 12. Fluoresein digunakan dalam bentuk fluorescein isothiocyanate ( FITC) kerana kehadiran kumpulan sianat yang mempunyai afiniti untuk protein membolehkan antibodi dicantum dengannya. Piring Petri 3.

10. atau sel dari spesimen klinikal) ke atas sekeping slaid mikroskop atau di dalam telaga cetak slaid mikroskop khas untuk ujian imunopendafluor. Fiksasi spesimen (spesimen yang dititiskan kepada slaid mikroskop atau sel yang ditumbuhkan di atas slaid penutup dan diinfeksi dengan virus) 100 4. Letakkan spesimen yang berada pada penutup slaid di atas slaid yang diletakkan di atas kayu aplikator. Biarkan kering. Titiskan persediaan antiserum (sumber antibodi terhadap virus) ke atas spesimen dan . Alas satu piring Petri dengan sekeping kertas turas dan basahkan dengan air. 6. 11. Tindak balas dengan reagen antibodi 7. Keluarkan dan biarkan kering.kultur. Celup di dalam metanol pada suhu 4°C selama 2 minit. Letakkan slaid di atas kayu aplikator supaya slaid berada lebih tinggi daripada aras kertas turas. 9. 3. Patahkan sebatang kayu aplikator di bahagian tengahnya dan letakkan dalam bentuk „V‟ di atas kertas turas di dalam piring Petri (Ini merupakan bekas lembap). 2. Kelilingi spesimen dengan 1 bulatan varnis kuku. 5. 8. Sebarkan sehingga meliputi kawasan bulat seluas 1 cm garis pusat slaid mikroskop atau memenuhi seluruh telaga.

. 2. 23. 20. Cuci 3 kali dengan PBS . Fiksasi spesimen yang terlalu lama mungkin menimbulkan pendafluor yang tak spesifik. 14. Amati dengan mikroskop pendafluor. 17. Biarkan kering di dalam tempat gelap seperti laci yang tertutup. 12. Tutup piring Petri dan eramkan di dalam inkubator bersuhu 37°C selama 30-60 minit.sebarkan supaya meliputi seluruh spesimen. 16. 13. Tutup piring Petri dan eramkan dalam alat inkubator bersuhu 37°C selama 30-60 minit. penutup slaid berkenaan ditekan. 21. 24. Titiskan persediaan konjugat ke atas spesimen dan sebarkan supaya meliputi ke seluruh spesimen. Bilas spesimen ke atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS . Masukkan di dalam bekas lembap. Cuci semula 2 kali. 18. Spesimen di atas penutup slaid dilekapkan di atas setitis kecil larutan PBS gliserol. Bilas dengan air suling. 15. 19. NOTA 1. Pencucian yang dilakukan selepas pengeraman boleh dipendekkan serta lebih berkesan jika PBS dalam bekas yang mengandungi slaid spesimen dikacau dengan alat magnet yang berputar. Bilas spesimen yang ada di atas slaid (atau penutup slaid) dengan PBS . Rendam dalam PBS selama 3 minit di dalam piring Petri (cuci). 22.

8. Spesimen harus dibaca (diamati dengan mikroskop pendafluor) secepat mungkin kerana intensiti cahaya pendafluor akan berkurang. Reagen konjugat antibodi-fluorokrom biasanya diperolehi daripada sumber komersial. Biarkan lampu raksa mikroskop bernyala kira-kira 15 minit bagi menstabilkan pancaran cahayanya sebelum spesimen diamati. spesimen masih boleh dibaca selepas disimpan semalaman. 4. Sinaran pendafluor latar belakang boleh ditindaskan dengan spesimen dieramkan dengan metilin biru selepas tindakan dengan konjugat antibodi-fluorokrom. Jika reagen bermutu tinggi dan ujian dilakukan dengan sempurna. Penyimpanan spesimen di dalam tempat yang gelap akan melambatkan proses ini. pastikan ia berfungsi dengan baik sebelum amaun yang lebih besar dibeli. Oleh yang demikian. Reagen konjugat. Untuk mengelakkan kehilangan aktiviti biologinya akibat reagen selalu dicairkan dan dibeku. 13 Balang anaerobik-penggunaan. reagen berkenaan boleh disimpan pada suhu – 20°C tanpa dibeku jika ia dicampurkan dengan isipadu sama gliserol. dan lebih-lebih lagi antiserum.3. 20-21 Asepsis-pemindahan benda dari botol yang tertutup. 6. biasanya digunakan dalam pencairan yang amat tinggi. 7. Oleh yang demikian. 52 . 5. amaun yang kecil digunakan setiap kali. Pastikan mikroskop imunopendafluor dinyalakan sekurang-kurangnya 20 minit sebelum ia dipadamkan supaya jangka hayat lampu raksa dapat dikekalkan lama. 101 Apusan bakteria-membuat.

64 Kultur sel-pengkulturan semula sel yang dikrioawetkan.Balang lilin-mewujudkan atmosfera karbon dioksida. 53-54 Kultur sel-inokulasi dengan virus. 66 Kultur sel-persediaan media. 10 Fiksasi bakteria dengan haba-membuat. 47-49 Inokulasi plat agar dengan 1 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik. 67 Kultur sel-kriopengawetan kultur sel yang hidup.penggunaan. 22 GasPak-mewujudkan keadaan anaerobik. 92 Inkubator CO 2 . 64-65 Kultur sel-penghitungan dengan menggunakan hemosi-ometer. 60-61 Kultur sel-tripsinisasi seluruh tisu. 61-62 Kultur sel-tripsinisasi sel selapisan dan pengermaan . 91 Inokulasi plat agar dengan 2 jenis bakteria untuk ujian sensitiviti antibiotik. 53 Bantuan pemula-rawatan. 52 Inokulasi plat agar dengan kultur yis. 10 Disinfektan-penggunaan.

23 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen virus. 40 Mikroskop cahaya-mengelakkan pertumbuhan fungus. 55-56 Kultur yis-merangsang penghasilan tiub germa. 44-45 Mikroskop elektron-menyaluti grid dengan Formvar.kultur sel. 47 Media bakteria-jenis. 26 . 39-40 Mikroskop elektron-tatacara imun. 41 Mikroskop elektron-pewarnaan negatif. 12-13 Pewarnaan Albert (pewarnaan granul metakromatik). 11 Pensterilan menggunakan alkohol yang membakar. 16 Mikroskop cahaya-penggunaan. 46 Media agar-menyediakan sebagai cerun. 38-39 Mikroskop elektron-pengamatan spesimen bakteria. 14-15 Pensterilan gelung dawai dengan api. 62-63 Kultur slaid fungus-membuat. 16 Mikroskop cahaya-pembersihan kanta. 56-57 Media agar-menyediakan di dalam plat Petri.

33 Pewarnaan metenamina-argentum Gomori. 30 Pelekapan titisan tergantung untuk bakteria. 33 Pewarnaan kapsul (rujuk kepada pewarnaan negatif dengan dakwat India). 47-49 . 17 Pelekapan basah KOH untuk fungus. 34-35 INDEKS Pewarnaan negatif dengan dakwat India. 27 Pewarnaan Kinyoun (terubahsuai) untuk fungus.Pewarnaan asid periodik-Schiff. 26-27 Pewarnaan spora (rujuk kepada pewarnaan Schaeffer Fulton). 31 Pelekapan basah lactophenol coton blue untuk fungus. 25 Pewarnaan Ziehl-Neelsen. 25 Pelekapan basah bakteria. 23 Pewarnaan Gram untuk fungus. 27 Pewarnaan tahan asid (rujuk kepada pewarnaan Ziehl-Neelsen). 17-19 Plat garisan-teknik. 32 Pelekapan basah salin untuk fungus. 36 Pewarnaan Schaeffer-Fulton. 34 Pewarnaan Gram untuk bakteria.

Prosedur umum makmal mikrobiologi. 68 Telur-membuat inokulasi membran korioalantoik. 71 Telur-mengambil membran korioalantoik. 84-86 Ujian Oksidase. 76-77 Ujian Imunopendafluor. 98 Ujian ELISA . 71-72 Ujian aglutinasi lateks slaid. 86-87 Ujian keperluan faktor pertumbuhan X dan V. 69 Telur-mengumpulkan cecair alantoik. 20 Telur-melakukan penyuluhan. . 80-81 Ujian Koagulase. 77-78 Ujian MIC (Kepekatan Perencatan Minimum) tabung. 83-84 Ujian Metil-merah. 97-98 Ujian Elek. 73-74 Ujian Indol. 69 Telur-membuat inokulasi ruang alantoik. 70-71 Telur-mengumpulkan cecair amniotik. 99-100 Ujian Katalase. 9 Slaid mikroskop-membersihkan dan simpanan. 70 Telur-membuat inokulasi ruang amniotik. 89 Ujian Fermentasi gula dan penghasilan gas.

90 Ujian Resapan disk: Tatacara perbandingan. 79 Ujian Tiga gula besi. 79 Ujian Sensitiviti: Optochin. 95 Ujian Motiliti bakteria di dalam agar separuh pepejal. 92-93 Ujian Resapan disk: Tatacara Stokes. 82-83 Ujian Voges-Proskauer. 74-76 Ujian Urease. 78 .95 Ujian MBC (Kepekatan Bakterisidal Minimum). 93-94 Ujian Sensitiviti: Bacitracin.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful