INTRODUCERE

Acidul folic şi derivaţii săi prezintă un larg interes în biologie şi medicină datorită funcţiilor coenzimatice îndeplinite în organism într-o serie de reacţii de importanţă vitală. Acidul folic participă la formarea timinei şi a bazelor purinice din ADN, deci deţine un rol fundamental în creşterea şi reproducerea celulară. Folat-coenzimele sunt derivaţi ai acidului tetrahidrofolic, acestea reprezentând forme biologic active ale acidului folic. De aici derivă importanţa specială a reducerii acidului folic şi mai ales aceea a transformării acidului dihidrofolic în acid tetrahidrofolic, proces ce se desfăşoară în organism sub acţiunea enzimei dihidrofolatreductază. Această enzimă “cheie” a metabolismului folaţilor a constituit obiectul unor numeroase studii biochimice şi histoenzimologice. Ea reprezintă cu cea mai mare probabilitate, receptorul molecular al analogilor acidului folic, explicând marea eficacitate a unora dintre aceste substanţe ca agenţi citotoxici şi în consecinţă, aplicabilitatea lor în terapia cancerului. Dat fiind rolul derivaţilor acidului folic în biosinteza acizilor nucleici şi a proteinelor, de un interes deosebit a beneficiat în această lucrare studiul implicaţiior acidului folic în diferite situaţii fiziologice (sarcină, copil în creştere) sau patologice (neoplasme, în particular leucemii, anemie megaloblastică, boli cronice exfoliative ale pielii). De asemenea, în lucrarea de faţă s-a urmărit o reactualizare privind noile date apărute în literatura de specialitate în legătură cu această temă: noutăţi referitoare la mecanismul absorbţiei, transportului şi utilizării folaţilor, la carenţa de folaţi şi malformaţiile congenitale, la mecanismul de acţiune al medicamentelor antiinflamatoare nesteroidiene (AINS).

2

De-a lungul ultimilor ani s-au făcut multe studii în ceea ce priveşte incidenţa malnutriţiei la bătrâni (în special la pacienţii vârstnici spitalizaţi pe perioade mai mari, cât şi la persoane care se hrănesc cu conserve). Câteva studii au indicat o incidenţă crescută a malnutriţiei la persoanele trecute de 65 de ani. Malnutriţia a fost evaluată atât prin parametrii antropometrici cât şi biochimici (incluzând nivelul seric de acid folic). De asemenea a fost observată o incidenţă crescută a anemiei la aceşti pacienţi, anemie datorată unui deficit de folaţi. Mai mult, în ultimii ani hiperhomocisteinemia a fost propusă ca factor independent de risc pentru boala arterială coronariană. De vreme ce deficitul de acid folic este o cauză importantă de hiperhomocisteinemie în populaţia generală, scăderea hiperhomocisteinemiei printr-un tratament simplu şi eficace cu acid folic poate scădea incidenţa bolii arteriale coronariene. Ţinând cont de informaţiile menţionate anterior am ales să studiez în partea experimentală variaţia concentraţiei de acid folic din omogenate tisulare, în funcţie de vârstă şi organ (ca factori independenţi). Determinările le-am făcut pe şobolani împărţiţi în trei grupe de vârstă: tineri, adulţi şi vârstnici şi concentraţiile de acid folic au fost măsurate din omogenatele tisulare din ficat, creier, rinichi, splină. Problema variaţiei acidului folic cu vârsta este de importanţă nu atât individuală, cât socială, indicând oportunitatea unei suplimentări sistematice puţin costisitoare şi lipsită de riscuri (cel puţin la cei ce prezintă manifestări clinice). Abordarea acestei teme se impunea cu atât mai mult cu cât la noi în ţară există puţine studii referitoare la acest subiect, iar în articolele de specialitate din întreaga lume este menţionată tot mai frecvent.

3

1.
1.1. Scurt istoric

ACIDUL FOLIC ŞI DERIVAŢII SĂI

Primele observaţii cu privire la existenţa unui nou factor alimentar, cu acţiune vitaminică, s-au semnalat în perioada anilor 1931-1932, când s-a constatat că leucopenia şi granulocitopenia maimuţelor poate fi vindecată cu ajutorul unui extract obţinut din drojdia de bere. În 1931, L.Wills şi B.S.Lond extrag din drojdia de bere un factor antianemic activ pe maimuţă, numit vitamina M (M=monky). Tot în 1931, L.Wills, aflat în India, remarcă efectul favorabil al unui extract din ficat şi drojdii asupra anemiei macrocitare tropicale, concluzionând că această afecţiune trebuie să fie cauzată de lipsa unui factor nutritiv, a unei deficienţe alimentare. În 1938, P.Day, W.C.Langeston, W.Y.Darby constată că extractul din drojdia de bere este activ şi asupra puilor de găină, stimulând creşterea acestora. A fost numit factor de creştere pentru pui sau “Factor U”. A.G.Hogan şi E.M.Parrott reuşesc să descopere în extractele din ficat un factor antianemic pentru puii de găină, căruia îi dau numele de “Vitamina Bc”(c=chick, pui de găină). În perioada 1939-1940, E.E.Snell şi W.H.Peterson obţin din ficat un factor de creştere pentru Lactobacillus casei, izolat prin adsorbţie pe cărbune activ (norit) şi eluare cu alcool amoniacal şi îl denumesc “factor L.Casei”sau “norit-eluat-factor”. În 1941, H.K.Mitchell, E.E.Snell, R.J.Williams reuşesc să izoleze din frunzele de spanac acidul folic (folium=frunză), care stimulează creşterea la Streptococcus lactis şi manifestă proprietăţi vitaminice la animale. Ulterior s-a constatat că factorii nutritivi obtinuţi de diferiţi cercetători din drojdie, ficat, spanac, microorganisme, fac parte din aceeaşi grupă şi s-a propus denumirea lor generică de acizi folici.

4

care din punct de vedere chimic sunt corelate cu acidul pteroilglutamic.Wald stabileşte efectul favorabil al acidului folic în tratarea unor afecţiuni neuropsihice. în 1945. în 1973. Ulterior au fost identificaţi. G.L. C.Osborne-White şi R. Stabilirea structurii chimice a acidului folic a fost efectuată de E. Butterworth raportează că dozele mari de acid folic ajunse în sânge reduc riscul apariţiei cancerului cervical la femeile infectate cu “papilloma virusul” uman.S.4 miligrame de folaţi pentru a reduce riscul apariţiei unor malformaţii şi afecţiuni cancerigene. dintre care o importanţă deosebită o prezintă acizii folinici în reacţiile de transformilare.E. hotărăşte ca toate femeile să consume zilnic 0.J. de către W.B.Termenul de folaţi este utilizat să desemneze toţi membrii familiei acizilor folici şi a derivaţilor acestora.Herbert consumă mai multe luni o dietă deficitară în folaţi şi stabileşte simptomele care apar în starea carenţială. confirmată în acelaşi an prin sinteza de R.Vandenbelt. B. care menţionează că în componenţa acidului folic intră şi unii pigmenţi pteridinici izolaţi anterior din aripile fluturilor precum şi acidul p-aminobenzoic. au acţiune 5 . inclusiv compuşii în care acidul folic este legat de unul sau mai multe resturi de molecule de acid L-glutamic. 1. J.Smith numeroşi factori nutritivi înrudiţi (aproximativ 28) din ficatul de oaie şi şobolan. În 1992. În 1962. În 1991.L.Angir şi colab..Wittle.2.A. J. Totodată stabileşte necesităţile de folaţi pentru oamenii adulţi.U.O’Dell.Pfiffner.M. În 1993 Serviciul de Sănătate Publică din S. Grupul acizilor folici Grupul generic al “acizilor folici” este constituit dintr-un complex de vitamine B.

1. acidul dihidrofolic.. R etc. Vitamina M este un factor nutritiv care vindecă anemia nutriţională la maimuţă. Lactobacillus factor. în metabolismul unor aminoacizi etc. Prin metode fizice şi chimice compuşii din complex pot fi separaţi. Este identic cu vitaminele Bc. ficat etc. denumire ce provine din structura sa chimică.hematopoetică şi leucopoetică. 6 . U. frunze de spanac. sunt factori de creştere pentru numeroase organisme. -C=O. a acizilor nucleici şi a proteinelor. vitaminele M. Acizii folici au un rol însemnat în formarea globulelor roşii şi albe din sânge. Toţi aceşti factori se pot obţine prin extracte apoase din drojdii. B4. acidul tetrahidrofolic. de unde îi derivă şi numele. în biosinteza bazelor azotate.. şi Streptococcus faecalis R. Vitamina Bc-conjugată vindecă anemia macrocitară a puilor de găină şi este esenţială pentru creşterea microorganismelor Lactobacillus casei L. Se mai numeşte şi acid pteroilglutamic. factori necesari creşterii unor microorganisme sau vindecării unor forme diferite de anemie la animale. factorul S. vitamina Bc-conjugată. Acidul folinic se mai numeşte şi “citrovorum factor” deoarece este indispensabil culturilor de Leuconostoc citrovorum. dar se deosebesc între ele prin acţiunea specifică pe care o au asupra diferitelor microorganisme şi specii de animale.). Structura acidului folic Acidul folic se numeşte astfel deoarece a fost izolat prima dată din frunzele plantelor (folium-frunza). deasemenea au un rol fundamental şi în activarea şi transportul unităţilor C1 active (-CH3. -CH2OH. factorul R.3. -CH=NH etc. M. pentru că la izolarea sa din produsele naturale se foloseşte adsorbţia pe cărbune Norit (cărbune activ) şi eluare cu soluţii amoniacale. acidul folinic. în prevenirea şi tratarea anemiilor. vitaminele B10 si B11 etc. precum şi cu cea de Norit eluat factor. U. HCOO-. prin adsorbţie pe cărbune activ (norit) şi apoi eluate de pe adsorbant cu diferiţi compuşi. identificaţi şi dozaţi. Dintre alţi factori nutriţionali corelaţi cu grupa acidului folic menţionaţi de diferiţi cercetători fac parte factorul U. Aparţin acestui grup: acidul folic. R.

În aceste condiţii din acidul folic s-a obţinut o fracţiune cu funcţie aminică aromatică primară. OH 4 3 5 9 6 7 10 N 2 N B CH2 NH A H2N N1 N8 Pteridina Acid pteroic CO N CH CH2 CH2 H COOH Acid p-aminoAcid glutamic benzoic COOH Acid folic ( pteroilglutamic ) Structura moleculara a acidului folic Structura chimică a acidului folic s-a stabilit iniţial prin identificarea compuşilor ce rezultă din degradarea sa hidrolitică.Acidul folic are o structură complexă. era fluorescentă şi prezenta caracter acid. se obţine acidul pteroil-monoglutamic (Pte-Glu). A doua fracţiune avea structură pteridinică. acesta are o conformaţie extinsă cu nucleu pteridinic în poziţia 7 . -un radical al acidului para-amino-benzoic (PABA). -un rest peptidic rezultat din una sau mai multe (până la 7) molecule de acid glutamic. Prin adăugarea la acesta a celui de-al treilea component (un rest de acid glutamic). în mediul alcalin aerob. din care prin hidroliza ulterioară se eliberează acidul paraaminobenzoic şi acidul glutamic. Utilizarea difracţiei cu raze X a facilitat stabilirea structurii cristaline a moleculei de acid folic dihidratat. având molecula compusă din trei fragmente: -un inel pteridinic pe care se găseşte grefată o grupare amino în pozitia 2 şi o grupare hidroxil în pozitia 4 (2-amino-4-hidroxipteridina). Primele două componente constituie acidul pteroic. derivat la care ne referim atunci când folosim denumirea de acid folic.

1889-1893) şi ulterior au fost izolate o serie de pteridine (xantopterina.4.V. -natura substituienţilor de la carbonul din pozitiile N5 si N10. leucopterina. structura de bază a grupului. legându-se de restul moleculei prin legături de hidrogen. aranjarea intramoleculara a nucleului pteridinic 1. -numărul resturilor de acid glutamic din moleculă. izoxantopterina). pe baza fluorescenţei intense în U. Oxigenul de la carbonul 4 şi atomul de azot 10 sunt de aceeaşi parte a moleculei. Ele sunt prezente şi la microorganisme şi la animale şi au fost supuse unor ample cercetări care au dus la 8 . Derivaţii naturali ai acidului folic diferă între ei prin: -starea de oxidare a ciclului pteridinic. Caracterizarea compuşilor din categoria folaţilor Folaţii reprezintă o mare familie de molecule naturale formate prin modificări a moleculei de acid folic. Pteridinele au fost identificate în pigmenţii aripilor fluturilor. (Hopkins.ceto.

vitamina Bc conjugată (PteGlu7). respectiv acidul folic. Prin ataşarea la acidul pteroic a unui rest de acid glutamic (Glu) se obţine acidul pteroilmonoglutamic (Pte-Glu). teropterina (Pte-Glu3). la sinteza şi la elucidarea rolului lor biologic.Wieland. 1925). 4 3 5 OH 6 7 N N A N 1 B N 8 N H2N N N N CH3 2 Pteridina Pterina (2 -amino-4-hidroxi-6-metilpteridina) Structura pteridinei si a pterinei 9 . Pteridina contribuie la formarea pterinei (2-amino-4-hidroxi-6-metil-pteridina). Prin adăugarea unor noi resturi de acid glutamic la acidul folic prin legături γ. în biosinteza şi/sau ca elemente structurale a acizilor folici şi folinici.stabilirea structurii (H. Pterina împreună cu acidul para-amino-benzoic formează acidul pteroic (Pte). se pot obţine diopterina (Pte-Glu2). Pteridina are o structură biciclică fiind formată dintr-un nucleu pirimidinic (A) şi unul piramizinic (B). de exemplu: cofactori şi hidrolaze ca precursori ai vitaminei B12.

conjugata (Pte-Glu7) Structura unor compusi pteroidici si folici 10 .COOH CO NH CH (CH2)2 COOH OH 4 3N 5 9 6 7 (CH2)2 10 N CH2 NH A B N8 CO N CH H COOH H2N 2 N 1 Diopterina(Pte-Glu 2) COOH CO NH CH (CH2)2 CO NH COOH CH (CH2)2 COOH OH 4 3N 5 9 6 7 (CH2)2 10 N CH2 NH A B N8 CO N CH H COOH H2N 2 N 1 Teropterina(Pte-Glu3) COOH CO NH CH (CH2)2 COOH 6 OH 4 3N N 5 9 6 7 (CH2)2 10 CH2 NH CO A B N8 N CH H COOH H2N 2 N1 Vitamina Bc .

OH N H2N N CH2 N 10 A N B N CH3 (CH2)2 CO N CH H COOH COOH Acidul-N10-metil-folic OH N H2N N CH2 N C H 10 A N B N (CH2)2 CO N CH H COOH COOH O Acidul-N10-formil-folic 10 OH N H2N N CH2 NH COOH A N B N Acidul pteroic (Pte) OH N H2N N CH2 N 10 COOH A N B N CH3 Acid-N 10-metil-pteroic (Rhizopterina) OH N H2N N CH2 N H 10 COOH O A N B N C Acid-N 10-formil-pteroic (Factor SLR) Structura unor compusi pteroidici si folici 11 .

casei şi Str. Este de zece ori mai activ decât acidul folic asupra creşterii microorganismelor L.casei şi nici antianemică. Primul acid este eficace în tratarea anemiei macrocitare la om şi atenuează la canceroşi simptomele dureroase. dar. Are substituit un radical formil la N10 al acidului folic. dar nu are acţiune asupra Lactobacillus casei şi nici asupra anemiei puilor de găină. Reprezintă forma predominantă sub care se găseşte acidul folic în ţesuturi. Teropterina sau acidul pteroilglutamic se mai numeşte şi factor de creştere. Prezintă acţiune curativă în anemia puilor de găină.OH N N N N OH OH N H2N N N N CH OH CH OH CH3 H2N Xantopterina Biopterina Structura xantopterinei si a biopterinei Acidul pteroic nu prezintă activitate de creştere asupra L. Rizopterina este un factor de creştere pentru Streptococcus faecalis R (SLR). S-a obţinut prin sinteză din acid pteroic şi acid folic. Vitamina Bc conjugată nu are o acţiune directă asupra anemiei macrocitare la om şi nici nu stimulează creşterea la L. Este utilizat în tratamentul tumorilor maligne. Acidul N10-formil-pteroic (Rhizopterina-izolat din Risopus nigrigans) are activitate limitată de creştere asupra microorganismelor.faecalis R. S-a izolat din lichidul de fermentare de la Rhizopus nigricans. prezintă proprietăţi antianemice. Diopterina se găseşte sub formă de acid pteroil-L-glutamil-α-glutamic şi sub formă de acid pteroil-γ-glutamil-glutamic. Este un derivat al acidului pteroic. Vitamina Bc conjugată sau acidul pteroilhexaglutamic are 7 resturi de acid glutamic substituite la acidul pteroic. A fost obţinut din diferite produse biologice. Sub acţiunea unei enzime hepatice 12 .casei şi Streptococcus lactis R.

în schimb. 7. Enzima vitamin – Bc conjugaza are acţiune carboxipeptidazică a fost iniţial izolată din ficat. 6. vitamina Bc conjugată eliberează acidul pteroil glutamic activ. Ea este eficientă în tratarea anemiei macrocitare şi la maimuţă. Reducerea acidului folic în acid tetrahidrofolic se realizează în două etape succesive. sub acţiunea enzimei dihidrofolatreductaza. 13 . Microorganismele nu conţin această enzimă şi de aceea nu pot utiliza vitamina Bc conjugată. Vitamina Bc conjugată este forma cea mai răspândită sub care se găseşte acidul folic în alimentele naturale.5.numită vitamina-Bc – conjugaza. 8 rezultând acid dihidrofolic şi acid tetrahidrofolic. iar ulterior şi din rinichi de porc. Carbonul asimetric din poziţia 6 conferă moleculei FH4 stereospecificitate pentru diferite funcţii metabolice şi mai ales permite trecerea în formele dihidro. întâi se obţine acidul dihidrofolic (FH2) şi apoi acidul tetrahidrofolic (FH4). Derivaţii metabolic activi Acidul folic este inactiv ca atare în cadrul metabolismului celular. de la gâşte şi din materiale vegetale (cartofi. 1. Reducerea acidului folic în poziţiile 5. formele metabolic active fiind constituite din compuşii rezultaţi din: A. migdale). se pare că gruparea NH2 din poziţia 2 a nucleului pteridinic deţine rolul fundamental în coordonarea moleculei de folat cu funcţie de coenzimă. pancreas (pui de găină).

dintre care numai acidul 7. Glu. 14 . . în prezenţa acidului ascorbic. 8 H2 Pt. 8 H2 Pt. 8 dihidrofolic (acid dihidrofolic “standard”) s-a izolat şi este stabil. . Glu.OH N H2N N N N CH2 NH CO N CH CH2 H COOH Acid folic DHFR CH2 COOH OH N H2N N H N CH2 NH CO N CH CH2 H COOH Acid dihidrofolic DHFR CH2 COOH N OH N H2N N H N N H CH2 NH CO N CH CH2 H COOH CH2 COOH Acid tetrahidrofolic Reducerea acidului folic sub actiunea dihidrofolatreductazei Acidul dihidrofolic se poate prepara prin reducerea catalitică cu oxid de platină sau paladiu în mediu alcalin sau prin reducerea cu hidrosulfit de sodiu la pH=6. 7. 5. . 6 H2 Pt. Sunt posibili trei izomeri ai acidului dihidrofolic: 5. Glu.

Oxidarea cu aer produce o amină diazotabilă (acid para aminobenzoilglutamic). derivaţii săi în forma redusă posedă spectre de absorbţie carecteristice în UV. N10 – metenil FH4 N10 – formimino FH4 15 Maximul de absorbţie la diferite pH-uri (în Acid 292 282 272 348 xx Neutru 280 282. Spectrul de absorbţie al acidului tetrahidrofolic prezintă două maxime.5% sau cu compuşi ce conţin grupări tiolice cum ar fi mercaptoetanolul în soluţie 0. precum şi la 310 nm. Spre deosebire de acidul folic care nu este fluorescent. Poate fi stabilizat în mediul acid (de exemplu în acid ascorbic 0.2-1 M). la lungimea de undă de 298 nm. 8. 310 270. Acidul tetrahidrofolic (FH4) este acidul folic redus în poziţiile 5. Spectrul de absorbţie al derivaţilor acidului folic la diferite pH-uri Compusul nm) Folat Dihidrofolat Tetrahidrofolat N5 – formil FH4 N5. 7. Spectrul de absorbţie al acidului dihidrofolic la pH neutru prezintă două maxime la lungimea de undă de 282 nm. 298 x 258 Bazic 257 283 282 x 255 . Degradarea sa este favorizată de EDTA în timp ce acidul ascorbic şi tiolic îl protejează. iar în absenţa agenţilor reducători maximul de absorbţie variază între limitele 270-298 nm.2-0.Acidul dihidrofolic este uşor degradat prin expunerea la aer sau sub acţiunea bazelor. 6.

N10 – metilenil – FH4. N10 – metilen – FH4. N10 sau N10. Structura generală a derivaţilor N5–substituiţi în care R poate fi:    -CH3 în N5 – metil – FH4. Substituirea de grupări monocarbonate în poziţiile N5 sau N5. Resturile de acid glutamic sunt condensate între ele într–un mod special (gruparea – COOH din poziţia γ a unui rest se leagă de gruparea – NH 2 a altui rest de acid 16 . N5.N5. metabolic activi: N5 – metil FH4: N5 formil – FH4. 292 - 293 290 297 - x compusul se transformă în N10 – formil FH4 în soluţie neutră sau bazică.substituiti COOH 10 OH 5 CH2 N 9 N N H2N N CH2 CO N CH H CH2 CH2 COOH NH Acidul N5N10 metilen tetrahidrofolic C. N5. Modificarea numărului reziduurilor de acid glutamic din moleculă. N10 – metenil FH4 în soluţie acidă. xx compusul se transformă în N5. N10 – metilen FH4 N5 – metil FH4 Valoarea nu este cunoscută. -CH = NH în N5 formimino – FH4 este prezentată mai jos Structura generala a derivatilor acidului folic N5 . B. -CHO în N5 – formil – FH4. Mai jos sunt reprezentate structurile celor mai importanţi derivaţi ai acidului folic.

cristalină de culoare galbenă.16mg/100ml). birefringente. Prin autoclavare 17 . Proprietăţi fizice şi chimice ale acidului folic 1.glutamic. Ca sare de sodiu este solubil în apă. Acidul folic se prezintă sub formă de plăcuţe galbene. Co2+ galben). în fenol. cu punct de topire la 250˚C. Este optic activ dextrogir (+) 16˚. cu ionii metalelor grele formează compuşi complecşi (cu Fe 3+ roşu. subţiri. OH N H2N N H N CH2 NH CO NH CH CH2 CH2 COOH n COOH N acid p-aminobenzoic 2-amino. 4-hidroxi 6-metil pteridina poliglutamic Structura pteroilpoliglutamatilor 1. în metanol. Cu2+ verde. lenticulare. 1. greu solubil în apă (0. 6. Spectrul său de absorbţie în ultraviolet este asemănător cu cel al xantopterinei. Mai des întâlnite sunt formele în care n = 3 (acid pteroiltriglutamic) şi n = 5 (acid pteroilpentaglutamic) în celule animale şi n = 7 (acid pteroilheptaglutamic) la plante. 6. benzen. iar în mediul acid la pH 4 – 12 este stabil. Proprietăţi fizice Acidul folic este o substanţă solidă. iar în mediul bazic formează săruri cu metalele alcalinopământoase. eter şi acetonă. Acidul folic se descompune sub influenţa luminii şi a razelor UV. în acid acetic glacial şi insolubil în cloroform. piridină. rezultând acid pteridoxamin – 6 – carboxilic şi alţi compuşi proveniţi din catena laterală.

preparate acide. 1. La 100˚C. Proprietăţi chimice Dintre proprietăţiile chimice ale acidului folic menţionăm posibilitatea reducerii ciclului pteridinic în derivaţi di – şi tetrahidrofolici. FeSO4. 6. iar cele alcaline se oxidează cu uşurinţă. atomul de carbon din poziţia 6 conferă stereospecificitate moleculei. Răspândire în natură 18 . 2. transportul de unităţi monocarbonate în poziţiile N5.FOLAŢII ÎN NATURĂ ŞI ÎN ORGANISM 2. vitaminele B1. N10.1. Este incompatibil cu substanţe oxidante sau reducătoare deoarece se degradează. pierde 70% din activitate la pH = 1. sulfamide. acidul nicotinic. etc.30min. Soluţiile neutre sunt mai stabile. gume şi mucilagii vegetale. sub acţiunea acizilor se descompune în acid p – aminobenzoil – glutamic şi partea pteridinică modificată. Este inactivat de acidul ascorbic. Solubilitatea acidului folic în apă poate fi măsurată prin încălzire la 75˚C sau prin adăugare de glicocol. siropuri acide. 2. B2. ataşarea la o serie de enzime prin intermediul grupării – NH2 din poziţia 2 (legături peptidice). Cu Ca2+ formează o sare insolubilă. iar în soluţie alcoolică este incompatibilă cu clorhidraţi.

19 . În ficatul de bou se găsesc 290 μg%. Cele mai multe forme de folaţi nu au stabilitate mare în alimente. Frunzele proaspete pot pierde prin uscare la temperatura camerii până la 70% din activitatea folaţilor în decurs de 3 zile. Laptele de vacă conţine cantităţi mici de acid folic. la prepararea hranei în soluţii apoase şi prin fierbere. drojdii. fiind cuprins între 8 şi 25 μg%. Legumele au un conţinut mai redus. bananele 30 μg%.Acidul folic şi derivaţii săi au o largă răspândire în alimente. în special în spanac. O bună parte din acidul folic este sintetizat de flora intestinală fapt ce îngreunează stabilirea necesităţilor pentru om şi animale. dar şi sursele vegetale constituie un aport însemnat. Acidul folic se găseşte în cantităţi variabile în toate alimentele uzuale.90%. În timpul preparării alimentelor o parte din folaţi se distrug. lămâi şi în unele microorganisme. în ficatul de pui se găsesc 370 μg%. conţinutul acidului folic variază între 3-7. în mazăre. în frunzele plantelor superioare.5 μg/g. Necesarul de folaţi al organismului uman Cantitatea de acid folic total dintr-o dietă normală variază între 50 – 2000 mg zilnic. Cerealele conţin în medie 35 μg%. Se găsesc în cantitate mare în ficatul animalelor. În ierburi. 2. Cele mai mari cantităţi de acid folic şi de folaţi se găsesc în regnul animal. dar în acelaşi timp se eliberează cele aflate în complexe inactive sau sub formă conjugată. Ficatul şi muşchii mamiferelor sunt sursele cele mai bogate. sfeclă. iar dintre fructe lămâile 80 μg%. Conţinutul substanţelor pteroilglutamice din plantule de porumb este de 11.5μg/g. 2. portocalele 33 μg%. iar în cel de porc 220 μg%. iar în frunzele mature de 6-7 μg/g. germeni de grâu. Cantităţi mari de folaţi se pierd în timpul extragerii. Uneori pierderile totale se ridică până la 85 .

Pentru a fi absorbiţi.şi tetrahidrofolaţi sub acţiunea dihidrofolatreductazei. la nivelul cărora predomină pteroilglutamotetrahidrofolaţii. cea mai mare parte (90%) aflându-se în eritrocite. După aceea monoglutamaţii rezultaţi vor fi absorbiţi printr-un mecanism activ facilitat de glucoză. sub acţiunea unei conjugaze (cel mai probabil intraenterocitară) pH-dependentă şi zinc-dependentă.O. la doze mai mari. Odată ajuns în celulă. până la 80% pentru 15mg/zi. Această hidroliză are loc la nivelul jejunului proximal.. pubertate) sau patologice (neoplazii. dermatoze cronice. Există proteine ce leagă folaţii în plasmă. indiferent de doza administrată. Folaţii plasmatici se află sub formă de monoglutamat (N5-metil-tetrahidrofolat) şi sunt transportaţi în celule printr-un “carrier” care este specific pentru formele reduse (FH4). etc. împiedică absorbţia vitaminei ca atare. dar rolul lor este încă neclar. poliglutamaţii alimentari trebuie să fie hidrolizaţi la monoglutamaţi. O. 200 μg/zi între 13 – 19 ani şi peste 200 μg/zi pentru adult. aceasta poate deveni considerabilă. La o doză mai mică de 200μg /zi. dar această valoare poate creşte în anumite stări fiziologice (sarcină. aproximativ 80% din acidul folic administrat oral este absorbit. 100 μg/zi de la 1 –12 ani. S. şi anume: 6% pentru 1mg/zi.Necesarul minim de acid folic este de 50 μg /zi. A. Această absorbţie poate fi însă pasivă pentru doze crescute de folaţi. excreţia urinară este minoră sau absentă. lanţul acid poliglutamic fiind încărcat cu o sarcină electrică negativă. 10% pentru 2mg/zi. În cursul transportului lor intraenterocitar monoglutamaţii sunt metilaţi şi apoi reduşi la dihidro. În schimb. acidul pteroilmonoglutamic negăsindu-se ca atare în vreo sursă naturală. Sângele conţine aproximativ 1mg% folaţi. La individul normal. 50% pentru 50mg/zi. Folaţii existenţi în natură sunt conjugaţi cu mai multe molecule de acid glutamic.) Comisia F. recomandă următoarele valori pentru aportul zilnic de acid folic: 60 μg/zi pentru sugari. M. folatul trece în forma poliglutamată după pierderea grupării 20 .

şi mai ales sângele şi mucoasa intestinală. absorbţie sau utilizare. Pierderea folaţilor se produce prin descuamarea zilnică a celulelor epiteliale din piele şi tractul intestinal. Totuşi. În organism folaţii sunt depozitaţi în toate ţesuturile. transpiraţie şi salivă. Forma poliglutamată pare a fi forma în care celulele reţin şi depozitează folaţii. Rezervele normale de folaţi sunt estimate între 5-20mg. Manifestările neurologice ce apar în cadrul deficitului de vitamina B12 (deosebit de grave prin potenţialul lor de ireversibilitate) sunt mai puţin frecvente. cromatina nucleară este dispersată).N5-CH3 într-o reacţie de transfer a grupării metil. Deficitul va fi totuşi aparent doar după câteva luni de la apariţia tulburării primare de aport. reiese faptul că rezervele organismului permit menţinerea unei hematopoeze normale timp de 2-4 luni. iar turn-over-ul folaţilor este mult mai mare. 2. urină. în caz de creştere importantă a necesităţilor (stări septice.3. simptomele deficienţei de folaţi se dezvoltă mult mai rapid decât cele ale vitaminei B12. dar cu precădere la nivelul rinichilor. ţinând seama de necesarul zilnic minim de folaţi (50μg). Sinteza de ADN anormal (prin încorporarea de d-UTP în locul d-TTP) duce la hematopoeză de tip megaloblastic. timpul scurs până la apariţia manifestărilor hematologice şi mai ales a trombopeniei. pancreasului şi mai ales ficatului. din care jumătate în ficat. Rata pierderii este de doar 1-2% din totalul rezervelor hepatice. datorată unei eritropoeze ineficiente. dar valoarea ei este de 10 ori mai mare decât a vitaminei B12 deoarece cantitatea minimă de folaţi necesară a fi absorbită zilnic este de 100 de ori mai mare decât cea a vitaminei B12. 21 .Manifestările clinice ale deficitului de folaţi în organism Manifestările clinice ale deficitului de folaţi implică celulele din ţesuturile cu rată de multiplicare rapidă. traumatisme grave). asincronism de maturaţie nucleo-citoplasmatic (nucleii sunt mai puţin maturi decât era de aşteptat. ca şi prin bilă. Manifestările hematologice constau în primul rând în anemie megaloblastică. poate fi mai scurt (15 zile sau mai puţin).

Culoarea tegumentelor este palidă. depapilată. Valorile plasmatice ale folaţilor sunt scăzute (normal 6-20ng/ml). angor. bilirubină indirectă crescută şi hemosiderină normală sau crescută. hipercelularitate. lucioasă. În ceea ce priveşte celelalte serii celulare sanguine. Precursorii anormali sunt distruşi prematur în măduva osoasă. Pe frotiul de măduvă osoasă se observă. dar şi mai precoce: numărul leucocitelor şi al plachetelor poate fi scăzut. insuficienţă cardiacă. diaree. precursori anormali ca mărime şi morfologie şi pentru seria granulocitară. Clinic. cu nuanţă subicterică. modificările sunt mai rare. hemoglobină scăzută sau chiar normală faţă de numărul de eritrocite scăzut (datorită VEM crescut. Pacienţii prezintă o limbă zmeurie (roşie. poikilocitoză şi macrocitoză. anemia se manifestă prin slăbiciune. acesta fiind şi motivul pentru care valori mici ale hemoglobinei sunt bine suportate de către aceşti pacienţi). iar uneori splina şi ficatul pot fi uşor mărite. metamielocite gigante şi scăderea raportului mieloido/eritrocitar. tahicardie. dureroasă). dar aceste valori pot reflecta variaţii recente în aportul dietetic. deasemenea. frotiul sanguin arată o marcată anizocitoză. Frecvent deficitul de folaţi este asociat cu deficitul de B12 (evidenţiat prin testul Schilling). palpitaţii. rareori apare purpura (datorită trombocitopeniei). anorexie (cu uşoară scădere în greutate). nefiind supusă acestor fluctuaţii. A doua mare categorie de simptome sunt cele digestive. iar apariţia PMN hipersegmentate (mai mult de 6 lobuli) în periferie este cvasipatognomonică pentru anemie megaloblastică. iar clinic se poate constata un sindrom hemoragipar sau o scădere a imunităţii celulare. rezultând anemie prin eritropoeză ineficientă. În sângele periferic se identifică hematii macrocitare (VEM > de 100μ 3). ameţeli. reflectând afectarea proliferării epiteliului intestinal (ce are un turn-over rapid) în cadrul deficitului de folaţi. 22 .În măduva osoasă apar mitoze anormale. Măsurarea folaţilor eritrocitari este în acest sens o măsurătoare cu grad crescut de precizie. steatoree. etc.

Manifestările neurologice şi psihice includ cel mai frecvent un tablou de polinevrită senzitivo-motorie (mai rar sindrom piramidal). Această doză. dar la fel de eficace şi pe cale orală. anxietate. Folaţii sunt utilizaţi în scop terapeutic sub formă de: - acid pteroilglutamic (acid folic) administrat oral (1cp = 5mg) acid N5-formil-tetrahidrofolic (acid folinic) sub formă de soluţie pentru injectare parenterală. anemie macrocitară normocromă aregenerativă). O doză de 50-100μg/zi permite obţinerea unui răspuns hematologic. este suficientă chiar şi în caz de malabsorbţie. demenţă sau psihoză.4. dar doze mai importante. Diagnosticul impune cercetarea frotiului periferic (PMN hipersegmentate. 23 . excreţia urinară de formiminoglutamat în exces) şi excluderea unui deficit de B12 (test Schilling normal). 2. a frotiului de măduvă osoasă (hematopoeză megaloblastică). pe toată durata vieţii (sau până la excluderea cauzei primare). de ordinul a 1mg/zi timp de 2-3 săptămâni sunt necesare pentru a corecta rezervele organismului. Diagnosticul etiologic presupune o anamneză amănunţită cu privire la dietă şi explorarea funcţiei intestinului subţire. administrată pe cale orală. Tratamentul deficitului de folaţi Tratamentul deficitului de folaţi este un tratament de substituţie. se mai poate observa un sindrom depresiv. a nivelului de folaţi plasmatic (mai puţin concludent) sau eritrocitar (se mai pot folosi testul de supresie prin deoxiuridină.

eluare cu anilină şi precipitare cu acetat de plumb. sinteza şi biosinteza folaţilor Acidul folic se poate obţine în stare cristalină din diferite surse naturale (ficat. drojdii. etc.etc) prin extracţie cu apă la pH 3. purificat prin readsorbţie pe cărbune. AgNO3. Extragere.3. adsorbţie pe cărbune activ (norit). spanac. În 24 . acid picric. baritină. cojile cerealelor. METABOLISMUL FOLAŢILOR 3.1.8%. eluţie cu soluţie amoniacală 2.

2HCl NH2 + 4 NaOH 1/2 O2 Acid folic + 2 NaCl + 2NaBr + H 2O Schema sintezei acidului folic În produsele naturale acidul folic se găseşte în stare liberă în cantitate relativ redusă.4. care au însă aceeaşi importanţă nutritivă pentru organismele vii.5-triamin dibromoproprionica pirimidin clorhidrat NH2 . Cromatografierea extractului se face pe coloane cu schimbători de ioni şi separare prin eluare în gradient de concentraţie cu soluţii amoniacale sau de anilină.4. Acidul folinic obţinut prin sinteză este de două ori mai puţin activ decât cel natural.5-triamino-6hidroxipiridinclorhidrat în prezenţă de NaOH.36-hidroxi-2. se obţine acidul folinic. care distrug cofactorii naturali prin încălzirea rapidă a materialului la 95˚C. 25 . O2 şi acetal. cu aldehida 2. deoarece prin sinteză se obţin 2 stereoizomeri din care numai unul este activ. Prin sinteză acidul folic se obţine prin condensarea acidului p-aminobenzoil-L (-)glutamic. în prezenţa acidului ascorbic. Br HOOC (CH2)2 CH NHCO NH2 + CH2 CH C O H H2N Br + N N OH COOH Acid p-aminobenzoil-L(-)-glutamic Aldehida 2. unii cu mai multe resturi de acid glutamic. în prezenţă de tampon ascorbat sau amestec cu uree 6M si cloroform. care este un derivat formilat al acidului formic. deoarece se găseşte în cantitate mai mare sub formă de compuşi chimici diferiţi.3-dibrompropionică şi cu compusul 2.prezent se realizează iniţial inactivarea enzimelor. Prin experienţe “in vitro” s-a observat că prin adăugarea de acid folic pe secţiunile hepatice din mediul de reacţie.

Acidul folinic (N-5-COH-FH4) se obţine “in vitro” prin formilarea şi hidrogenarea sa la temperatură ridicată. sub acţiunea unor enzime. Mecanismul biosintezei acidului folic la om nu este destul de bine cunoscut. coli.SCoA COOH Acid glutamic Acid p-aminobenzoilglutamic OH + H2N N N N CH3 26N Acid folic Pterina . extractele celulare de E.HSCoA H2N CONH CH COOH Acid p-aminobenzoil . HS-CoA şi acidului p-aminobenzoic se formează un derivat adenilic monofosforic O H2N COOH + ATP . care prin hidrogenare trece în acidul folinic. Acidul folinic este sintetizat de majoritatea bacteriilor intestinale. Biosinteza acidului folic se realizează mai repede dacă compusii pteridinici conţin acidul pirofosforic la C-9. Biosinteza acidului folic este stimulată de acidul ascorbic. acid p-aminobenzoic şi 2-amino-4-hidroxipteridin-6-carboxialdehida.P-P H2N C AMP + HSCoA . cu ajutorul unor inhibitori. iar extractele de Lactobacillus arabinosus sunt capabile să utilizeze ca şi compuşi pteridinici 2-amino-4-hidroxi-6 hidroximetilpteridina şi 2-amino-4-hidroxi-6carboxildehidropteridina în prezenţa ATP şi a ionilor de Mg2+.AMP Acid p-aminobenzoic COOH O H2N Acid p-aminobenzoiladenilmonofosforic COOH (CH2)2 (CH2 )2 C SCoA + NH2 CH . În experienţele efectuate cu Mycobacterium avium s-a observat că în prezenţa ATP. prin reacţii de condensare. Experimental s-a dovedit că unele microorganisme sunt capabile să biosintetizeze acidul folic din precursori mai simpli. se formează iniţial acidul dihidrofolic (FH2). în prezenţa acidului ascorbic. Până în prezent s-au efectuat cercetări în acest domeniu pe microorganisme şi pe animale. realizează biosinteza acidului folic din acid glutamic. Astfel. iar “in vivo” sub acţiunea piridinnucleotidreductazei şi a vitaminei C.

acid ascorbic şi a unor enzime specifice. Mg2+. excreţie şi necesităţi 27 . OH N H2N N N N NADP+ OH N N R NADP+ OH NADPH +H + N R CH2 NADPH +H + N N H N N H R H CH2 H2N Acidul folic Acidul dihidrofolic N H H2N Acidul tetrahidrofolic Transformarea acidului folic in acizii dihidrofolic si tetrahidrofolic Transformarea acidului folic în acid folinic s-a pus in evidenţă atât la animale. Prin unirea acestui produs cu pterina se formează acidul folic. care reacţionează cu acidul glutamic şi formează compusul p-aminobenzoilglutamic. FAD. iar din ficatul puilor de găină s-a izolat un sistem enzimatic capabil să transforme acidul dihidrofolic în acid tetrahidrofolic.al acidului p-aminobenzoic. Schema biosintezei acidului folic la Mycobacterium avium Extractele de Clostridium striklandii au transformat acidul folic în acid dihidrofolic. Acid N-5-tetrahidrofolic ATP Mg2+ Acid N-10-tetrahidrofolic + ADP + P 3. cât şi la microorganisme în prezenţa ATP.2. Absorbţie. În ficatul puilor de găină s-a identificat o enzimă care în prezenţa ATP si Mg2+ realizează transformarea acidului N-5-tetrahidrofolic în acid N-10-tetrahidrofolic.

forme sub care trec în sângele venei porte şi apoi la ficat. cu implicarea unor procese active (energodependente) pentru cantităţi fiziologice mici. acid N-5-formimino-tetrahidrofolic (fiFH4). acid N-5. Din aceşti derivaţi acidul folic este absorbit numai după o deconjugare prealabilă a acestor compuşi. s-a pus în evidenţă existenţa unor sisteme enzimatice hidrolizante (conjugaze) care scindează complexele acidului folic. 10-metenil-tetrahidrofolic (f5-10FH4). cicloserine. Din totalul de aproximativ 70mg acizi folici şi folinici existenţi la oamenii adulţi. acid N-10-formil-tetrahidrofolic (f10FH4). acidul folic este convertit în diferiţi compuşi metabolici activi cum sunt: acid N-5-formil-tetrahidrofolic (f5FH4). În toţi aceşti derivaţi apare ca structură de bază acidul tetrahidrofolic (FH4). Absorbţia acidului folic poate fi perturbată şi micşorată de diferiţi compuşi cum sunt: difenilhidrantoina. aproximativ 30-40% se găsesc în ficat (5-15μg/g). Imediat după absorbţie şi parţial chiar în timpul absorbţiei. Se consideră că acidul folic. glicocol. În tubul digestiv şi în rinichi. de unde prin circulaţia sanguină se aprovizionează toate organele şi ţesuturile. homocisteina şi metionina. acid N-5-metil-tetrahidrofolic (m5FH4). serina. În multe produse alimentare acidul folic se prezintă predominant sub forme poliglutamate. etanol. Absorbţia are loc mai ales incepând din partea proximală a intestinului subţire şi continuă. Dozele mari sunt absorbite mai ales prin difuzie pasivă. sunt convertiţi în mucoasa intestinală sub acţiunea unor acidfolicreductaze în derivaţi metilici (CH3-FH4). pirimidine. 28 . pe toată lungimea sa. cu un consum de energie.Acidul folic în stare liberă. ca acid pteroilmonoglutamic este uşor şi rapid absorbit de organism în cantităţi de până la 15-20mg/zi. precum şi derivaţii acestora. care joacă rolul unei coenzime de acceptor si transportor al unei unităţi C1.

acizii folici suferă procese de interconversiune şi de catabolizare. corespunzătoare la o ingestie de 600 μg de acid folic pe zi. În ficat. se menţine relativ constant şi reflectă gradul de aprovizionare a întregului organism cu aceşti compuşi. Tot la nivelul ficatului se transformă acidul folic în acid N-10-formil-folinic. Plasma sanguină conţine 5-20ng/l. dar creşte prin administrarea de doze orale. Excreţia prin urină este mică. anemii gravidice. reacţia fiind activată de acidul glutamic şi inhibată de acidul ascorbic. Conţinutul folaţilor din eritrocite. Folaţii se găsesc în cantitate mai mare în eritrocite. sub formă de acid folic sau derivaţi apropiaţi sub aspect structural. Dacă însă se măresc dozele până la 150μg/kg corp. cuprinzând aproximativ 20% din cantitatea ingerată şi partea neabsorbită produsă de flora intestinală. Dacă se administrează intravenos doze mici de acid folic (1μg/kg corp).Acidul folic este transportat în organism sub formă de CH3-FH3 legat de proteine transportoare. Eliminarea folaţilor şi a metaboliţilor acestora se face în cantitate mai mare prin fecale. În eritrocite acidul folic prin metabolizare dă naştere la acid p-aminobenzoilglutamic şi la un derivat aldehidic al pterinei. aproximativ 2-5 μg/zi. în decurs de 6-12 ore. cantitatea acestui acid din organism se apreciază a fi între 6-10mg. La o dietă normală. aproximativ 90% din cantitatea administrată este distribuită din fluxul sanguin în tot corpul în decurs de 3 minute. În sânge şi ţesuturi. iar eritrocitele conţin cantităţi de 30 de ori mai mari de folaţi. Acidul folic se transformă mai ales în derivaţi tetrahidrofolici. după saturarea organismului cu folaţi. cantitate suficientă 29 . Cantitatea de folaţi din sânge scade în bolile de cancer (leucemii). având în sânge o concentraţie de 300ng/ml. iar aproximativ 2% se elimină prin urină. aproximativ 200-500μg/zi la omul adult. până la 90% din cantitatea administrată se elimină prin urină. cu variaţii normale între 160-640ng/ml de eritrocite. carenţa folinică şi anemie pernicioasă. în ciroza alcoolică. Eliminarea folaţilor prin urină reprezintă sub 1% din cantitatea acestora în organism. etc. acidul folinic se degradează în compuşi similari.

reprezintă coenzimele unor sisteme enzimatice. 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5. formimino (CH=NH).pentru trei sau patru luni. 3. Prin transpiraţie se elimină cantităţi destul de însemnate de folaţi. metil (CH3). sunt derivaţi ai acidului tetrahidrofolic (FH4) din care fac parte: acid N-5-formil-tetrahidrofolic (N-5-COH-FH4).3. Formele coenzimatice active. formil (-COH). precum şi prin bilă. acid N-5-metil-tetrahidrofolic (N-5-CH3-FH4). acid N-5. care iau parte la reacţii deosebit de importante pentru organism. 10-metenil-tetrahidrofolic (N-5.N-10=CH-FH4). 30 . acid N-10-formil-tetrahidrofolic (N-10-FH4). care poartă fragmente sau radicali cu un atom de carbon. O altă cale de eliminare a acidului folic este cea cutanată. formiat (HOOC-). sub formă de acizi tetrahidrofolici. acid N-5. dacă este blocată absorbţia.N-10-CH2-FH4). implicate în activarea şi transportul unor fragmente monocarbonice (C1) sub formă de hidroximetil (-CH2OH). Rol şi activitate biochimică Acizii folici.

meteniltetrahidrofolic OH 5 CH2 N 9 COOH 10 N N H2N N CH2 CO N CH H CH2 CH2 COOH NH Acid N5.metilentetrahidrofolic Derivati coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic Derivaţii coenzimatici ai acidului tetrahidrofolic se pot obţine pe două căi principale: -tratarea directă a aldehidei formice sau a acidului formic cu acid tetrahidrofolic (FH4).O H C OH N H2N N CH2 N A N B N (CH2)2 CO N CH H COOH COOH Acidul-N10-formiltetrahidrofolic COOH 10 OH 5 CH N + 9 N N H2N N CH2 CO N CH H CH2 CH2 COOH NH Acid N 5. N10. N10. 31 .

care a fost izolată din ficatul de porumbel şi din diferite microorganisme. nornicotina. care este inert. histidina. Ca acceptori de grupări C1 funcţionează glicocolul.H2O C O OH Formil Formiat NADH + H+ NADPH + H+ NAD+ . Fragmentele monocarbonice sunt. sub aspect NADPH + H+ CH2OH Hidroximetil NADP+ C NADP+ O H 32 NAD+ NADH + H+ +O . Ca substanţe donatoare de unităţi C1. iar acesta cu apa dă acidul N10-formil-terahidrofolic care este cel mai activ metabolit. cele mai active sunt serina. xantina.N CH2 FH4 Mg2+ Acid N5. Existenţa acidului N-5-formil-tetrahidrofolic. colina. colamina.-transferul direct al acestor unităţi pe FH4. sub aspect H C O OH H C O H Acid N-5-tetrahidrofolic + FH4 + ATP N 10 CHO FH4 + FH4 ADP+P +ATP N 5. metionina. homocisteina. nicotina. N10 -metenil-tetrahidrofolic +H2 O Acid N-10-formil-tetrahidrofolic coenzimatic nu constituie un balast pentru organism deoarece poate fi uşor transformat pe cale enzimatică în acid N-10-metenil-tetrahidrofolic. Acidul N-10-formil-tetrahidrofolic se poate forma şi prin reacţia directă dintre aldehida formică şi FH4: FH + H O C + ATP 4 H Acid N-10-formil-FH4 Reacţia este catalizată de formiltetrafolatsintetaza. uracilul. timina. acidul folic etc. gliconamidoribozida. betaine. acidul glutamic etc.

Transportul fragmentelor C1 de la o substanţă la alta se realizează de acidul tetrahidrofolic şi derivaţii săi menţionaţi anterior. se obţine ca produs intermediar acidul formiminoglutamic care transferă radicalul formimino pe FH4 cu formare de acid N-5-formimino-tetrahidrofolic. N10 -metilen-tetrahidrofolic COOH Serina Din histidină. sub acţiunea unor sisteme enzimatice de tipul hidroximetildehidrogenazei în prezenţă de NADP+şi NAD+. COOH Histidina Catabolizare incompleta COOH CH NH + FH 4 HC NH (CH2)2 H2N CH COOH Acid glutamic (CH2)2 COOH Acid formiminoglutamic + Acid N5-formimino-tetrahidrofolic 33 . face parte şi transformarea serinei în glicocol în prezenţa piridoxalfosfatului (PALP): CH2 H2N CH OH + FH4 CH2 NH2 COOH Glicocol + Acid N5 . Dintre reacţiile chimice la care iau parte coenzimele tetrahidrofolice. interconvertibile.metabolic. deoarece pot trece reciproc una în alta.

COOH (CH2)2 CH NH C O H COOH + FH4 H2N (CH2)2 C COOH + Acid N-formil-tetrahidrofolic COOH Acid formilglutamic Acid glutamic ATP Mg2+ Acid N-10-formil-tetrahidrofolic 34 . formează acidul N-5. sub acţiunea unei ciclodezaminaze.N-10=CHFH4). în prezenţă de NAD+ cu formare de acid Nformil-glutamic. formează acid glicoxalic. printr-o reacţie de transaminare. Glicocolul. Acesta în prezenţa ATP se transformă în acidul N-10formil-tetrahidrofolic. care este mai puţin activ. care cedează gruparea formil acidului glutamic. Acelaşi mecanism de reacţie se produce şi la transformarea xantinei în formiminoglicocol.N-10-metilenil-tetrahidrofolic (N-5. COOH C O COOH H COOH + H2N (CH2)2 C COOH + NAD+ (CH2)2 CH NH C + O + CO 2 + NADPH + H H Acid glioxalic COOH Acid formilglutamic Acid glutamic Acidul formilglutamic cedează radicalul formil acidului FH4 şi se formează acidul folinic.Acidul N-5-formimino-tetrahidrofolic (N-5-fi-FH4).

nicotinei. N10-CH2-FH4. în biosinteza colinei. care au fixate unităţi C1.N-10-CH2-FH4. Ea donează un radical metil la 2’-deoxiuridin-nucleotide (sau nucleozide) şi acestea se transformă în 2’-deoxitimidin-nucleotide. -CHO. se comportă ca donori în reacţiile care necesită acceptarea fragmentelor –CH2OH. deoarece se comportă ca o coenzimă în reacţia de transformare a uracilului în nucleozide şi nucleotide în timină. N-10=CH-FH4. ce iau parte la formarea acizilor nucleici.N-10-metilen-FH4 are un rol însemnat în biosinteza ADN. 35 .Coenzimele folinice. Ca donori de grupări –CH2-OH este mai activ acidul N-5. Transformarea uracilului în timină se face în molecula nucleotidelor (nucleozidelor). Acidul N-5. etc. În funcţie de felul compuşilor care se sintetizează în urma transferului de unităţi C1. rezultă rolul important pe care îl au acizii folici în procesele de creştere şi reproducere celulară. Dintre compuşii intermediari care se formează în procesul de biosinteză a bazelor purinice. În procesul de biosinteză a bazelor purinice sunt cedate două grupări formil. -CH=NH. localizate la C-2 si C-8 al nucleului purinic. HCOO-. În reacţiile cu cedare de radicali formil vor funcţiona ca donori acizii N-10-formilFH4 şi N-5. participă la reacţie una sau alta din formele active. -CH3. iar ca donori de radicali CH3 funcţionează acidul N-5-CH2-FH4 şi uneori acidul N-5. Acceptorii de grupări C1 active sunt mai numeroşi în procesul de biosinteză a bazelor şi a nucleotidelor purinice. care reprezintă cărămizile de bază în biosinteza acidului deoxiribonucleic. în urma primirii unor unitaţi C1 active fac parte : -formilglicinamidoribozida(FGAR) -formilaminoimidazolcarboxiamidribozida(FAICAR) Datorită participării coenzimelor folinice în biosinteza nucleotidelor purinice. respectiv nucleozide. betainei.

În cazul biosintezei metioninei se realizează transferul grupării metil de la N-5CH3-FH4 la homocisteină.CH3 COOH CH2 N CH3 CH3 + [O] COOH CH2 N CH3 CH2OH CH2 N Betaina (CH3)3 Dimetilglicina Hidroximetilsarcozina FH4CH2OH FH4 COOH CH2 NH Sarcozina COOH CH3 + [O] CH2 NH CH2OH Hidroximetilglicocol FH4-CH2OH FH4 COOH CH2 NH2 FH4-CH2OH FH4 CH2 H2N CH COOH Serina OH Glicocol FH4 FH4-CH2OH 36 . Dintre reacţiile la care participă N-10-formil-FH4 si N-10-CH2OH-FH4.e importantă trasformarea betainei în serină. Metionina are rol însemnat în formarea colinfosfolipidelor deoarece grupele metil din colină provin din metionina activată (Sadenozilmetionina). CH2 CH2 H2N CH COOH Homocisteina SH + N-5-CH3 FH4 H2N CH2 CH2 CH COOH S CH3 + FH4 Metionina În procesul de biosinteză a metioninei se produce neogeneza grupei metil şi nu transferul acesteia de la alţi donori. COOH + .

contribuie activ la transformarea uracilului în timină şi a metioninei în creatină precum şi la biosinteza inelelor porfirinice. nu şi la cele aflate în carenţă de folaţi. Este utilizat tot mai mult în lupta împotriva cancerului. Acidul folic stimulează activitatea colinesterazei. Unele microorganisme transformă uşor uracilul în timină sau citozină.Ultima reacţie este reversibilă fapt important deoarece serina se poate transforma în glicocol. În prezenţa formiatului marcat cu 14C. şi a homocisteinei în timină. dar inhibă activitatea tirozinazei şi a xantinoxidazei. a cărei diminuare ar duce la o creştere a acetilcolinei. Acidul N-5-formil-tetrahidrofolic. pe lângă transformarea glicocolului în serină. iar efectul optim al acidului folic asupra acestor microorganisme se obţine când se administrează împreună cu vitamina B12. Asigură funcţionarea optimă a sistemului nervos. numai la animalele tratate cu acid folic. Există date experimentale care dovedesc că timina poate substitui acidul folic în stimularea creşterii unor microorganisme (Str. 37 . iar situaţia se redresează prin administrare de acid folic. dar pentru biosinteza timinei au nevoie de acid folic. A manifestat efecte antiteratogene la animalele tratate cu pirimetamină. faecalis). conţinutul nucleoproteidelor scade în mod accentuat. Datorită acestor corelaţii se consideră că acidul folic funcţionează direct sau indirect ca o coenzimă în biosinteza timinei. Acidul folic este un factor important pentru creşterea animalelor tinere şi pentru microorganisme. constituind o importantă sursă de fragmente –CH2OH. La maimuţe cu deficienţe de acid folic. cu influenţă negativă asupra hematopoezei. Prin administrarea de formiat marcat cu 14C se regăseşte în hem. acesta se regăseşte în atomul de carbon al grupării metil din timină. Acidul tetrahidrofolic stimulează biosinteza nucleelor porfirinice şi a nucleoproteidelor.

în timpul sarcinii necesarul zilnic de acid folic este crescut de câteva ori faţă de normal. barbiturice. malabsorbţia (sprue. implicând aportul de acid folic. etc. vinul) sau practic nul (băuturile distilate). echilibrată. În cazul alcoolicilor sursa lor principală o constituie băuturile alcoolice. măduva osoasă). Pentru un organism sănătos şi o dietă raţională. Astfel. etanol) sau interferarea căilor metabolice (inhibitori DHFR-Metotrexat. Deficitul de aport dietetic de acid folic este mai frecvent întâlnit decât deficitul de vitamină B12.4. anemie cronică hemolitică. regimul “tea and toast”) şi ocazional adolescenţiialcoolicii şi toxicomanii. acestea având conţinut de acid folic scăzut (berea. Anemia ce apare in timpul sarcinii este rezultatul unui consum crescut de acid folic pe fondul unor factori favorizanţi ca: alimentaţie deficitară. Dintre categoriile mai frecvent afectate fac parte bătrânii cu aport alimentar nediversificat (conserve. perioadele de creştere în copilărie şi adolescenţă) precum şi în condiţiile patologice de creştere a ratei de multiplicare a ţesuturilor cu turn-over crescut (mucoasa intestinală. necesităţile suplimentare nu constituie un impediment. existând cazuri în care anemia din perioada iniţială a sarcinii se datorează unor deficienţe alimentare sau menometroragiilor. medicamente-fenitoina. Cauze ce duc la scăderea acidului folic în organism Cauzele ce duc la scăderea acidului folic în organism sunt multiple. Important de reţinut este că anemia poate fi anterioară sarcinii şi o agravează prin necesităţile crescute. necesităţile metabolice crescute (sarcină. ignoranţa. PERTURBAREA METABOLISMULUI FOLAŢILOR LA OM 4. iar deficitul de acid folic este de 3 ori mai frecvent la multipare faţă de primipare.1. neoplasm). 38 . În alcoolismul cronic se cumulează aportul scăzut cu scăderea utilizării acidului folic. etanolul) şi altele. Necesităţile metabolice crescute de folaţi apar atât în condiţii fiziologice (sarcină.

În celulele în care aceşti inhibitori de DHFR se acumulează este împiedicată transformarea deoxiuridinmonofosfat (dUMP) în deoxitimidinmonofosfat (dTMP) şi drept consecinţă are loc fosforilarea dUMP ce va fi inserat în lanţurile de ADN într-o proporţie ce va depăsi cantitativ capacitatea sistemelor ce recunosc. copii în creştere) 1. excizează şi repară eroarea. I I aport inadecvat necesităţi dieta neechilibrată(alcoolici. precum şi cu expansiunea masei eritrocitare a mamei. mergând de la malformaţii ale tubului neural. adolescenţi. reducerea absorbţiei de folaţi şi creşterea necesarului favorizată de infecţiile urinare frecvente. necesar pentru sinteza ADN. barbiturice). Rolul acidului folic în etiologia defectului de tub neural precum şi metodele de profilaxie ale acestor malformaţii prin suplimentarea dietei femeii gravide sunt foarte importante.sarcina 39 . pâna la avort. Malabsorbţia poate duce la un deficit de acid folic în condiţiile unui aport de folaţi normal. necesităţile de acid folic cresc cel mai frecvent datorită unei eritropoeze foarte active (de ex. unor rare deficite enzimatice (DHFR) sau cel mai frecvent inhibitorilor DHFR (Metrotrexat). enteropatia glutenică etc. determinând creşterea de aproximativ 5 ori a posibilităţii de apariţie a deficienţei de acid folic în ultimul trimestru al sarcinii. cu repercursiuni asupra produsului de concepţie. Pot interveni şi alţi factori precum: anorexia.). rezultând astfel false lanţuri de ADN ce explică eritropoeza megaloblastică. În condiţii patologice. Interferarea căilor metabolice ale acidului folic se datorează alcoolului. anemia hemolitică cronică). Gemelaritatea accentuează nevoile de acid folic. placentei şi uterului. ea are drept cauză afecţiuni ale intestinului (sprue tropical. ADN asociată cu dezvoltarea fătului. Lipsa acidului folic. determină tulburări de maturaţie şi multiplicare celulară. alcoolismul cronic sau medicamente ce acţionează probabil pe această cale (fenitoina.Cauza principală a deficienţei de folaţi în sarcină este reprezentată de creşterea sintezei de ARN.

de către Hibbard că deficitul de folaţi.I crescute 2.copilărie 3.enteropatie glutenică 3.eritropoeză crescută(anemie hemolitică cronică) 5. Folaţii şi sarcina.rare deficite enzimatice (DHFR) I II I V malabsorbtia interferarea căilor metabolice Cauzele deficitului de folati 4. interesul cercetătorilor a fost focalizat mai ales spre relaţia deficit de acid folic –malformaţii ale tubului neural (prima asociere în acest sens a fost facută de Hibbard. barbiturice 1.hemodializă 1.neoplasm 4.sprue tropical 2. 40 . 1965. cunoscut deja ca fiind răspunzător de hematopoeza anormală. când 66% dintre mamele cu produs de concepţie afectat au avut concentraţii crescute de acid forminoglutamic în urină). putând (mai ales dacă apare la începutul gestaţiei) da avorturi spontane sau malformaţii. Un studiu prospectiv privind nivelul folaţilor eritrocitari la gravide în primul trimestru de sarcină a arătat o incidenţă semnificativ crescută a malformaţiilor la gravidele cu nivel al folaţilor eritrocitari redus (<130μg/ml).2.etanol 3. ar putea induce modificări şi asupra produsului de concepţie şi a placentei.boli cronice exfoliative ale pielii 6.inhibitori DHFR(Metotrexat) 2. profilaxia malformaţiilor fetale prin administrarea acidului folic Datorită rolului fundamental al folaţilor în replicarea celulară. În ultimul timp. s-a stabilit pentru prima oară în 1964.medicamente:fenitoina.

tulburări metabolice). Din punct de vedere al avizului privind dieta. una din patru femei având în antecedente o sarcină afectată din această cauză a primit 4 mg acid folic timp de minimum 12 săptămâni înaintea concepţiei şi în timpul primelor 3 luni de sarcină. sunt: educaţia generală privind dieta (cu o atenţie specială privind grupurile cu cerinţe crescute: utilizatorii de medicamente citotoxice. Riscul apariţiei malformaţiilor de tub neural la produsul de concepţie a fost semnificativ mai mic la gravidele ce au primit acid folic faţă de lotul martor. spanac. făcând foarte greu o profilaxie ţintită. accentul fiind pus pe alimentele populare şi nici foarte scumpe. lapte (de exemplu o supă de spanac conţine aproximativ 125 μg. Cele trei mari direcţii ale strategiei privind profilaxia deficitului de folaţi şi a consecinţelor acestuia. Orientarea 41 . se combate ipoteza că deficitul de acid folic s-ar datora exclusiv unui statut socio-economic scăzut. Confirmarea efectului protector al suplimentării folaţilor în profilaxia recurenţei malformaţiilor de tub neural susţine utilitatea administrării de folaţi la femeile ce aparţin unei grupe de risc (din punct de vedere al apariţiei malformaţiilor neurale fetale) şi pune problema extinderii administării profilactice a folaţilor la toate femeile gravide. Un mare număr de femei gravide au un aport dietetic de folaţi sub valorile recomandate (300μg de folaţi/zi). fulgi de porumb. oricum până în prezent este imposibilă determinarea certă a apartenenţei gravidei la o grupă de risc crescut din acest punct de vedere.Problema efectului protector al administrării preventive a acidului folic a fost obiectul unui amplu program de cercetare administrat în Marea Britanie în 1983 şi finalizat în 1991 (MRC Vitamin Study Group 1991). Astfel. astfel. sindroame de malabsorbţie. se recomandă consumul crescut de legume proaspete. suplimentare a alimentelor cu acid folic şi administrarea suplimentară de acid folic la toate femeile ce vor deveni gravide în scurt timp. dar numai o mică parte din acestea vor avea un produs de concepţie normal. o porţie de fulgi de porumb cu un pahar de lapte 80 μg).

populaţiei pe baza unui aviz dietetic a specialistului este extrem de deficitară. iar nivelul suplimentării trebuie să fie cel minim protector (pentru a evita aportul excesiv de acid folic). în general concepţia nu este planificată şi numai un număr restrâns de cupluri se vor prezenta la un consult prenatal. Alimentele alese trebuie să fie consumate cu precădere de către populaţia ţintă. suplimentarea trebuie începută cu trei luni înaintea concepţiei şi continuată primele 8-12 săptămâni de sarcină. poate fi obţinut şi dacă suplimentarea este începută mai tarziu. Astfel. deşi nu se cunosc posibilele reacţii adverse ale acidului folic asupra femeilor în perioada de fertilitate. iar fulgii de porumb sunt fortificaţi la 250 μg/100g (75μg/porţie medie). ele pot apărea abia după mulţi ani. În orice caz. cât şi în şcoli şi în rândurile adolescenţilor. aceste evaluări aparţin Expert Advisory Group şi sunt valabile pentru produse alimentare in Marea Britanie. se recomandă doze mici pentru mamele cu risc mic şi doze mari (4mg/zi) pentru femeile cu risc crescut. Un efect protector. dar de intensitate mai mică. aşa cum a fost cazul unor posibile efecte teratogene 42 . dozele sugerate au fost stabilite empiric şi nu se ştie dacă efectul protector al folaţilor împotriva apariţiei malformaţiilor este la fel de cert ca şi cel împotriva recurenţei lor. Problema suplimentării acidului folic la femeile gravide se pune mai ales pentru marea masă a populaţiei. În concluzie. întrucât numărul restrâns al celor cu risc crescut va beneficia probabil de consult şi tratament adecvat.5mg/zi) pentru profilaxia generală antenatală. atât în perioada antenatală. chiar la începutul gestaţiei. Din nefericire. Suplimentarea artificială cu folaţi a alimentelor comerciale disponibile pune problema libertăţii de opţiune şi a posibilelor reacţii adverse. precum neuropatia datorată unui exces de acid folic la vârstnici. Multe studii au recomandat folosirea dozelor farmacologice de acid folic (4mg/zi) în scop profilactic. cele mai frecvente alimente îmbogăţite în folaţi sunt pâinea (există deja pâine suplimentată cu conţinut în folaţi 120μg/100 grame). dar grija unei supradozări a ridicat problema folosirii unor doze “fiziologice” (0. Deşi nu s-au evidenţiat încă reacţiile adverse pentru doze mari.

Punerea la punct a unui protocol de “screening” prenatal privind femeile cu risc crescut ar putea reorienta întreaga strategie profilactică şi poate fi obiectul unor cercetări ulterioare la noi în ţară. implantarea şi creşterea metastazelor. datorită specificităţii de fază şi a faptului că afectează sinteza macromoleculară în puncte multiple. ţinta terapiei anticanceroase Terapia antineoplazică depăşeşte în vechime vârsta de 50 de ani. Antimetaboliţii nu sunt administraţi obişnuit ca medicatie unică. sau cu analogi inactivi ai substraturilor reacţiilor specifice. incluzând agenţi antineoplazici şi stimulatori ai răspunsului biologic. Majoritatea sunt specifici doar în timpul anumitor faze ale ciclului celular. aprofundarea mecanismelor de rezistenţă la terapie.ale vitaminei A (1990). creşterea întrebuinţării terapiei adjuvante (prevenirea recidivelor şi distrugerea micrometastazelor. după radioterapie şi/sau chirurgie) şi neoadjuvante (administrarea înainte de radioterapie sau chimioterapie sau chirurgie pentru scăderea masei tumorale). Acidul folic. Principalul progres al ultimilor ani nu constă în lărgirea numărului de agenţi antineoplazici descoperiţi. 43 . lărgirea cunoştinţelor despre iniţierea tumorală.3. Strategia cea mai corectă ar consta în evitarea administrării dozelor farmacologice dacă nu există o justificare clară. lucru care duce la prevenirea sau micşorarea efectelor toxice. Dacă înainte de 1940 cuvântul cancer apărea în indexul tratatelor de farmacologie doar accidental. înţelegerea mecanismelor de acţiune ale medicamentelor. diseminarea. ci în dezvoltarea conceptuală a terapeuticii. 4. astăzi chimioterapia reprezintă o piatră de temelie în terapia cancerului. Aceasta constă în: stabilirea unor regimuri terapeutice mai eficace prin administrarea simultană a diverse medicamente. Antimetaboliţii sunt substanţe proiectate ca inhibitori competitivi ai reacţiilor enzimatice ale metabolismului intermediar.

MTX este folosit şi în terapia psoriazisului. Într-o altă cale metabolică importantă. Procentajul crescut de remisiuni complete ale coriocarcinomului a impulsionat cercetarea în domeniul chimioterapiei. În ultimii 20 de ani au fost testaţi clinic noi compuşi antifolaţi. aceştia au produs prima remisie temporară a leucemiei (Farber et al. datorită rolului său esenţial în sinteza precursorilor ADN. care scade efectul toxic al metotrexatului. un antifolat chinazolinic lipofil. Folosirea dozelor crescute de MTX a extins utilitatea acestuia la tumori ca sarcomul osteogenic. În plus. factor C). N10-metilen-FH4 asigură o grupare metil şi doi atomi de hidrogen pentru sinteza timidilatului (dTMP) din deoxiuridilat. metotrexatul (MTX). N10-formil-FH4 şi N5. o ipoteză care a fost confirmată de testele iniţiale. ca medicament eficace. coriocarcinomul (Hertz. 1985). care 44 . Formele reduse de acid folic (tetrahidrofolaţi) sunt necesare pentru sinteza purinelor şi a timidilatului. anormală a celulelor epidermoide (McDonald 1981). 1963). Metotrexatul (ametopterina) a fost primul antimetabolit care a primit recunoaştere clinică. cu toxicitate acceptabilă.4 diamino 4 dezoxifolic). au propus că analogii acidului folic pot inhiba proliferarea celulelor maligne. N5. Interesul pentru antifolaţi a crescut semnificativ după introducerea terapiei cu doze mari combinate cu leucovorină (acid folinic. Acest compus a fost înlocuit mai târziu cu derivatul său N10 metilat. Chabner et al. tumori ce nu răspund la doze mici. cum ar fi diaminopirimidinele şi chinazolinele. precursorul adenilatului (AMP) şi guanilatului (GMP). Farber şi colab. antifolaţii sunt inhibitori puternici ai reactivităţii imune mediate celular. în 1948. 1948) şi prima vindecare a unei tumori solide. o boală non-neoplazică caracterizată prin proliferare rapidă. cu aminopterină (acid 2. Antifolaţii ocupă un loc important în terapia antineoplazică.Acidul folic reprezintă o ţintă atractivă pentru chimioterapia antitumorală. N10-metenil-FH4 contribuie cu o grupare monocarbonată la sinteza acidului inozinic. având şi rol de agenţi imunosupresori ce se folosesc în transplantele de organe. Cel mai recent dintre acestea este trimetrexatul. în tratamentul artritei reumatoide şi în granulomatoza Wegener (Jackson 1984.

alături de toţi ceilalţi antimetaboliţi. enzima care repară leziunile produse în ADN de medicamentele antineoplazice. nefiind limitată doar la agenţii antineoplazici. care apare datorită fenomenului de amplificare genică. Această proteină transportoare. Trimetrexatul şi 10-EDAM au demonstrat o activitate antitumorală în tratamentul carcinoamelor de intestin. Trimetrexatul are activitate puternic antiparazitară şi efecte antineoplazice. Acesta este frecvent asociat cu creşterea expresiei genei MDR 1 pentru o glicoproteină membranară (glicoproteina-P). Un alt mecanism de rezistenţă multiplă implică modificări calitative şi cantitative în topoizomeraza II. Experimental. O problemă majoră a chimioterapiei anticanceroase este rezistenţa la drog. 1988). un inhibitor potent al dihidrofolat reductazei.ocoleşte obligativitatea din cazul folaţilor şi a metotrexatului de a folosi transportul activ. 45 inhibitor (Thill et colab. Unele tipuri tumorale. se poate observa apariţia unei rezistenţe specifice pentru un anumit drog. drogurile CCS s-au dovedit eficace împotriva malignităţilor hematologice şi a altor tumori în care proliferează o proporţie relativ crescută de celule. implicând efluxul medicamentului. În general. care are afinitate scăzută pentru creşterea concentraţiei intracelulare a DHFR. producţia de forme de DHFR alterată. Alteori se observă un fenotip cu rezistenţă multiplă. MTX face parte din clasa drogurilor specifice pentru ciclul celular faza S (CCS). foloseşte energia ATP pentru evacuarea multor molecule străine. cum ar fi cancerul colonic sau cancerul pulmonar prezintă o rezistenţă primară. după expunerea la un singur agent. plămân. . adica o lipsă de răspuns la prima expunere la drog. care apare atât în celule normale cât şi în celule tumorale. Rezistenţa dobândită se dezvoltă în diferite tipuri de tumori iniţial sensibile la tratament. testate încă în ambele specialităţi. Principalele mecanisme de rezistenţă cunoscute sunt: transportul deficitar al MTX în celule (Assaraf & Shimke 1987). Un alt folat din ce în ce mai interesant este 10-EDAM (10etil-5-diazo-aminopterina). care posedă transport şi poliglutamare îmbunătăţite faţă de metotrexat.

- scăderea abilităţii de a sintetiza poliglutamaţi de MTX.CH3 COOH NH2 N H2N N N Cl COOH CH2 N CH3 Cl N CO N CH H CH2 CH2 Diclormetotrexat COOH NH2 N H2N N N COOCH2CH3 CH2 N CH3 N CO N CH H CH2 CH2 Dietilesterul metotrexatului COOCH2CH3 46 . scăderea activităţii timidilat-sintetazei (Curt 1985).H Metotrexat R= . NH2 N H2N N N COOH CH2 N R N CO N CH H CH2 CH2 Aminopterina R= .

ceea ce are ca rezultat inhibiţia sintezei purinelor şi timidilatului. care transferă doi atomi de hidrogen de la cofactorul NADPH la DHF pentru a forma FH4. este necesar să se determine rolul determinant al DHFR în metabolismul folaţilor. Mecanisme de acţiune şi rezistenţă Activitatea antitumorală a analogilor de folaţi este rezultatul substituţiei unei grupări amino cu una hidroxil în poziţia 4 a inelului pteridinic. de DHF. inhibiţia DHFR cu MTX sau analogi similari duce la acumularea de cofactori folat în formă inactivă. acidul N5.NH2 N H2N N Cl Cl 2. Astfel. schimbare care transformă molecula de folat din substrat. iar importanţa relativă a fiecărui efect variază la 47 .DDMP Analogi ai folatilor de interes clinic Structura chimica a unor analogi structurali ai folatilor 4. N10 metilen FH4 este convertit la DHF.4-Diamino 5(3'. Acest cofactor inactiv devine apoi substrat pentru DHFR. În reacţia timidilat sintetazei (TS). În celulele cu ritm crescut a sintezei de timidilat.4' diclorfenil) 6 metilpirimidina . Pentru a întelege acţiunea metotrexatului şi a altor antifolaţi.4. citotoxicitatea MTX-ului este determinată de perturbarea sintezei de novo a purinelor şi a sintezei timidilatului. dihidrofolatreductaza (DHFR). într-un inhibitor ce se leagă strâns de enzima cheie a metabolismului folic intracelular. Derivaţii acidului folic sunt coenzime active doar în forma complet redusă de tetrahidrofolaţi.

deleţia folaţilor reduşi intracelulari şi inhibiţia sintezei ADN constituie paşi importanţi în determinarea răspunsului la tratament şi a toxicităţii acestui medicament. MTX a avut un efect antipurinic letal. activitatea timidilat sintazei modulează citotoxicitatea MTX. la celulele normale şi maligne in vivo. Deoarece legarea strânsă de DHFR şi depleţia consecutivă a folaţilor reduşi sunt esenţiale pentru mecanismul de acţiune a MTX. Inhibiţia timidilat sintazei (prin administrarea F-pirimidinelor şi reducerea rezervelor de dUMP) scade turnover-ul folaţilor reduşi şi reduce citotoxicitatea MTX. MTX-ul poliglutamat are un efect inhibitor puternic şi direct asupra timidilat sintazei şi a enzimelor sintezei purinelor.diferitele tipuri de celule cultivate in vitro şi. legarea de DHFR. Când a fost administrată cu două ore înaintea MTX. începând cu transformarea membranelor celulare. în modelele de limfom L5178. normale şi maligne. Borsa şi Whitmore au demonstrat că citotoxicitatea MTX-ului faţă de limfocite de şoarece poate fi crescută prin administrarea de purine. probabil. În general. timidina a protejat ambele linii celulare. 48 . probabil datorită creşterii efectului antitimidilat al MTX. prin aceste efecte inhibitorii pot contribui direct la citotoxicitatea drogului. Măsurarea rezervelor intracelulare de nucleotide a demonstrat că timidina realizează o depleţie a rezervei de dUMP (prin inhibiţia cu TTP a dCMP deaminazei) şi încetineşte reacţia timidilat sintazei. Evenimentele care conduc la acţiunea citotoxică a MTX. transformarea în derivaţi poliglutamaţi. întreruperea sintezei de novo a purinelor apare în prezenţa unor nivele crescute de timidilat sintază şi se produce prin consumarea rezervelor de folaţi reduşi necesare sintezei acestora. Totuşi. care au investigat capacitatea timidinei de a proteja culturi de celule mamare împotriva unei doze letale de MTX. Importanţa activităţii timidilat sintazei în determinarea citotoxicităţii MTX a fost confirmată recent de Tattetersall şi colaboratorii. conservând astfel folaţii reduşi şi păstrând sinteza de novo a purinelor.

În plus. FBP leagă folaţii cu afinitate crescută (Kd de ordinul nM) şi apoi îi eliberează în citoplasmă printr-un proces de endocitoză mediată de receptori.Transportul transmembranar Traversarea de către antifolaţi a membranelor celulare a fost studiată cu multă atenţie datorită legăturii dintre anomaliile de transport şi rezistenţă. MTX intracelular liber este forţat să iasă din celule atunci când intră în celule cantităţi crescute FH4 extracelular. Acestă afinitate mai mare a carrier-ului celulelor tumorale este considerată ca fiind explicaţia persistenţei mai îndelungate a MTX liber intracelular şi poate contribui la selectivitatea acţiunii antifolaţilor împotriva tumorilor. au stabilit că MTX intră în celule pe baza unui proces activ sensibil la temperatură. deci. printr-un proces cunoscut sub numele de heteroschimb. Se pare că FBP acţionează la concentraţii scăzute de folaţi (<50 nM) iar carrierul la concentraţii normale sau crescute. Macromoleculele care leagă folaţii au fost izolate din membranele unor celule de mamifere. pe braţul lung al cromozomului 21. incluzând agentul de salvare 5-formil-FH4 (leucovorina). în timp ce afinitatea celulelor epiteliale intestinale este oarecum mai scăzută Km=87 μM. MTX şi folaţii reduşi concurează. dar nu li s-a dovedit vreun rol în transport.4.5. Aportul celular de folaţi se produce prin cel puţin două mecanisme independente: folaţii reduşi sunt internalizaţi printr-un sistem “carrier” (RFC-reduced folate carrier) cu afinitate redusă (Km=1-5μM) prin transport anionic. pentru a intra în celulă. Influxul poate fi observat şi în vezicule membranare izolate. întâlnit în majoritatea celulelor. 49 . iar acidul folic şi 5-metil-FH4 intră în celulă în complex cu o proteină membranară care leagă folatul (FBP folate binding protein). dependent probabil de o proteină transmembranară. Studiile clasice ale lui Goldman şi colab. Afinitatea “carrier”-ului pentru MTX se situează între 1μM-6μM pentru diverse linii de celule tumorale (murine şi umane). Mecanismul transportor al MTX în celulele leucemice murinice şi umane este deasemenea utilizat de folaţii reduşi naturali. Gena RFC e localizată distal.

Nici una dintre aceste interacţii nu a dovedit că afectează chimio terapia clinică.faţă de celulele normale. descris mai sus. Aceste modificări cresc nivelele MTX intracelular de 5-6 ori. Acumularea MTX în celulele tumorale poate fi influenţată de alţi agenţi antitumorali. sau un proces realizat pentru un “carrier” specific. A doua cale a fost caracterizată prin sensibilitatea la bromosulfonftaleină. incluzând medicamente frecvent utilizate ca antifolaţi în terapiile combinate. dar trei sisteme de eflux pentru MTX. prin inhibarea efluxului. dar şi mărirea necesarului de folaţi reduşi în fazele de creştere rapidă pentru a contribui la aceasta. Cel mai important dintre acestea pare să fie acelaşi care mediază şi influxul de MTX. precum şi absenţa heteroschimbului dintre MTX si FH4. Dependenţa transportului de ritmul de creştere poate contribui la creşterea citotoxicităţii MTX pentru celulele care se divid rapid. Alte aspecte ale acestui proces de transport sunt lipsa competiţiei dintre MTX şi FH4 pentru intrare. Acest al doilea proces poate fi difuzie pasivă. un al doilea mecanism de intrare apare la concentraţii crescute ale drogului (peste 20μM). Un studiu recent a lui Henderson şi Zeveny a evidenţiat doar o singură cale de influx cu afinitate crescută pentru concentraţii de până la 50μM.1μM. În continuare la procesul de transport activ cu afinitate crescută. Mecanismul de intrare explică abilitatea celulelor rezistente la transport de a prelua drogul la concentraţii extracelulare crescute şi reprezintă o motivaţie raţională a utilizării dozelor crescute de MTX în chimioterapie. Celulele leucemice murinice rapid proliferative au o viteză de preluare a MTX de 3 ori mai mare şi o viteză de eflux a drogului cu 50% mai mică decât o au celulele în faza staţionară de creştere. inhibând efectul medicamentului. Influxul MTX este inhibat de ouabaină. în timp ce a treia a fost insensibilă la această substanţă şi la 50 . Faza proliferativă sau cinetică a celulelor influenţează puternic procesul de transport. Vincristina creşte MTX intracelular. Concentraţia vincristinei necesară pentru a produce acest efect (10μM) nu este uşor obţinută în timpul chimioterapiei clinice. care produce frecvent niveluri sanguine maxime ale vincristinei mai mici de 0. glucocorticoizi şi cefalotin. în timp ce acumularea este crescută de probenecid.

Au fost propuse noi investigaţii. după doze echimolare în vivo. Acumularea şi persistenţa drogului în tumori faţă de ţesutul normal determină în mod clar durata sa de acţiune în teritorii specifice. au fost observate în tumori umane şi murinice expuse la creşteri treptate ale concentraţiei drogului in vitro care poate fi un mecanism la fel de important şi în practica clinică. Diesterii MTX sunt rapid hidrolizaţi la compusul de bază în plasma de şoarece. câinelui şi omului. faţă de epiteliul intestinal. Analiza specifică in vitro a ratelor de preluare a medicamentului de către celulele leucemice a evidenţiat o relaţie pozitivă similară între răspunsul la medicament şi transport. când sunt inhibate în aceste plasme dibutilesterii sunt convertiţi la 51 . cu scopul de a ocoli rezistenţa cauzată de deficienţa de transport. triazinaţii şi trimetrexatul au o excelentă activitate antitumorală în culturile de celule în tratamentul experimental al tumorilor la rozătoare şi ar trebui să penetreze celulele deficiente în transport. sensibile la MTX. Contribuţia acestor componente la eflux poate fi modificată în funcţie de prezenţa extracelulară a anionilor glucozei. sau a inhibitorilor metabolici. aparent datorită inhibiţiei transportului nucleozidelor. a avut perioade mai scurte ale inhibiţiei sintezei ADN şi a fost neafectată în experimentele chimioterapice. Alte mecanisme de rezistenţă. Antifolaţii liposolubili. cum sunt esterii de MTX. în special creşterea concentraţiei de DHFR ca urmare a amplificaţiei genice. Importanţa transportului MTX în determinarea răspunsului clinic este nesigură. Înţelegerea rezistenţei la antifolaţi la nivel clinic rămâne incompletă. Dibutilester-MTX are deasemenea proprietatea neobişnuită de a inhiba încorporarea timidinei în ADN. Au fost observate nivele maxime intracelulare mai mari şi o persistenţă mai îndelungată a drogului în celulele leucemice ale murinelor. dar sunt mai stabili în plasma maimuţei. în timp ce linia celulară sarcomatoasă 180 rezistentă. Aceste diferenţe se corelează cu acumularea intracelulară mai mare a chinazolinelor şi aminopterinei faţă de MTX. diaminopirimidinele. Antifolaţii chinazolinici au o rată de eflux mai crescută.inhibitori competitivi ai MTX. a acumulat concentraţii mai scăzute de drog. Există diferenţe semnificative ale caracteristicelor de transport între diverşi antifolaţi.

derivaţi α şi γ monobutilici. Proprietăţile de transport ale monobutilesterilor nu au fost încă definite. au reuşit să îndrepte lipozomi cu purtători de haptene. Deşi acidul folic este capabil să salveze celulele hepatom Reuber H35 de citotoxicitatea MTX. Astfel. O altă încercare de a depăşi rezistenţa la transport este încapsularea MTX în vezicule fosfolipidice bistrat. probabil deoarece. Shen şi colab. cu eliberarea antifolatului. ca şi MTX. numite lizozomi. Tiamin pirofosfatul. sau prin contopirea membranelor celulare şi lipozomice. fiind inhibitori stabili şi eficace ai DHFR. Deşi lipozomii localizau celule ţintă mielomatoase cu acurateţe nu a fost observată nici o inhibiţie a încorporării deoxiuridinei. Deoarece conjugatul polilizinMTX nu inhibă direct DHFR şi toxicitatea sa poate fi anulată prin administrarea simultană de leucovorină. protejează fibroblaştii de şoarece de toxicitatea MTX. conjugatul polilizină-MTX este transportat printr-un sistem “carrier” independent. conţinând MTX. Conjugaţii de MTX şi polilizină. dar nu de aceea a polilizinMTX. este incapabil să salveze o murină rezistentă la transport de efectele polilizin-MTX. teoretic. deoarece conţinutul veziculelor nu a putut intra în celulă. care sunt toxici pentru culturile de celule ovariene de hamsteri cu transport eficient. care inhibă transportul MTX.lui plasmatic şi nu din transportul selectiv al medicamentului la tumora. spre celulele mielomatoase murinice care exprimau pe suprafaţa lor imunoglobuline cu afinitate pentru haptene. unde intrarea poate fi făcută prin pinocitoză. Aceste plachete microscopice ce conţin medicament pot. acidul folic este incapabil să intre în celulele rezistente la transport. este probabil că şi compusul suportă liza intracelulară. transporta MTX la suprafaţa celulară. Deşi rezultate încurajatoare cu lipozomi încărcaţi cu MTX au fost raportate pe modele animale. O excepţie posibilă a acestei concluzii este tehnica de încapsulare a MTX in 52 . majoritatea dovezilor sugerează că îmbunătăţirea supravieţuirii provine de la întârzierea nespecifică a clearence. Lasserman şi colab. au postulat că conjugatul intră în celulă prin pinocitoză şi prin liza enzimatică ce apare în lizozomi. oferă şi posibilitatea de a ocoli rezistenţa la transport.

Dacă tumora este apoi incălzită.lipozomi termolabili. Legarea metotrexatului la dihidrofolatreductază Caracteristicile fizice ale legării NADPH şi a MTX de DHFR au fost stabilite prin studii cristalografice cu raze X şi prin determinarea secvenţelor de aminoacizi ale enzimelor naturale şi ale celor modificate chimic. COOH N NH2 N H2N N CH2 N CH3 N CO N CH H CH2 CH2 O C COOH N CH H CH2 COOH MTX – γ . 4. va fi nevoie de identificarea unor antigene tumorale umane comune în scopul de a face acest experiment util din punct de vedere clinic. În mod ideal.peptidice Un alt experiment a fost folosit de Heath şi colab. folosind MTX-γ aspartat. datorită transportului deficitar. ducând la o activitate terapeutică îmbunătăţită. eliberarea preferenţială a MTX apare la sediul tumorii. Au fost studiate enzime bacteriene şi 53 .aspartat Legarea reziduurilor de aspartat la MTX prin legături γ . Acest analog de MTX are capacitate limitată de a traversa membrana celulară şi este de 200 de ori mai puţin toxic decât MTX.. Citotoxicitatea a apărut doar prrin eliberarea intracelulară a drogului via lipozomi îmbrăcaţi cu anticorpi specifici pentru fibroblaşti murinici L 929.6. conţinut în lipozomi înveliţi în anticorpii specifici antitumorali.

Legarea MTX la reductaza izolată de la Streptococcus faecium generează lent un complex cu un Ki al inhibitorului de 58 pM. supravieţuind electroforezei în gel şi filtrării în gel. 54 . trimetroprimul şi aminopterina urmează acelaşi proces cinetic. în comparaţie cu inhibitorul. hidrofobă. în timp ce pteridinele ce nu au gruparea acid amino benzoic se comportă ca inhibitorii competitivi clasici ai enzimei. formată din izoleucina-7 (sau leucina-7). incluzând diaminopirimidinele. În prezenţa NADPH-ului în exces. MTX este legat printr-o porţiune lungă. atomul N al MTX. alanina-9. În general. NADH nu asigură legarea MTX de DHFR. fenilalanina-34 şi alte reziduuri. Procesul a fost denumit inhibiţie strâns legată şi lentă. leucina31. Alţi analogi de folaţi.de la mamifere. Complexul enzimă-NADPH-inhibitor este extrem de stabil. ceea ce inseamnă că fiecare moleculă de MTX va lega o moleculă de enzimă. de “legare strânsă şi lentă”. Această afinitate este crescută de pH-ul acid. În plus. potenţată de ionii de K+ şi oxidarea grupărilor sulfhidril ale enzimei. a excesului de NADPH şi a unei afinităţi scăzute a inhibitorului faţă de enzimă. afinitatea de legare a MTX de reductază a fost estimată între 1nM şi 1pM. Spre deosebire de NADPH. dar nu şi pe cel al substratului fiziologic (FH4). NADH are deasemenea capacitatea de a acţiona ca şi cosubstrat pentru DHFR în locul NADPH. Importanţa raportului dintre NADH şi NADPH în determinarea răspunsului la MTX rămâne să fie stabilită. secvenţele de aminoacizi posedând similitudini puternice în poziţiile implicate în legarea cofactorilor sau a inhibitorilor. Cinetica a fost evaluată folosind şi modele de simulare . legarea este stoechiometrică. pentru reducerea folatului şi a dihidrofolatului. În condiţiile unui pH scăzut. Două interacţii mai importante participă la potenţarea legării 4-amino-antifolaţilor: a) b) oxigenul carbonilic al izoleucinei-7 realizează o legătură de hidrogen cu gruparea carboxil a aspartatului-30 (sau glutamatului-30) protonează gruparea 4-aminei . substratul fiziologic pare să se lege de enzimă într-o configuraţie răsturnată.

dar reversibil. Motivul acestei diferenţe este încă neclar. nelegat. dar poate fi rezultatul diferenţelor din mediul ionic. În culturile de celule şi în sisteme acelulare. Acestă disociere lentă este considerabil mai rapidă decât cea calculată în experimente cu enzimă pură în prezenţa unui exces de NADPH. pentru a menţine inhibiţia totală a DHFR şi a sista sinteza timidilatului. sinteza timidilatului va reîncepe imediat în ciuda persistenţei MTX intracelular legat de enzimă. De exemplu. În condiţiile unor concentraţii crescute de substrat competitiv şi la un pH normal. Deci este necesar un exces de drog liber. este necesar un exces considerabil de MTX liber pentru realizarea unei inhibiţii complete a enzimei. 55 . de legare prin complexe cu afinitate scăzută a drogului cu DHFR şi NADP+. dacă se incubează celule tumorale cu cantităţi crescute de MTX pentru a permite titrarea totală a enzimei şi apoi se scoate drogul nelegat din soluţie. sau doar cu enzima. dar stabilă a MTX de pe enzimă.În terapeutică. 3H-MTX (MTX marcat cu 3H) legat de enzimă poate fi deplasat de pe aceasta prin expunere la noi doze de drog. fenomen ce indică o disociere lentă. MTX acţionează ca un inhibitor cu legare strânsă.

Material şi metodă Animale şi dietă Pentru studiu s-au folosit trei grupuri de şobolani albi. cu ajutorul acidului Concentraţiile acidului folic în funcţie de vârstă şi de organ le-am estimat prin fosfomolibdenowolframic. descrisă de Lowry (Lowry. astfel: 1)-primul grup: şobolani tineri. REZULTATE EXPERIMENTALE În studiul prezent am folosit o metodă spectrofotometrică pentru a determina concentraţia de acid folic din omogenate tisulare din diferite organe (ficat. de sex masculin.5. 1951). reactivul naftiletilendiamină pentru determinarea acidului folic. splină) la şobolanii albi. cu vârste în jur de un an sau chiar mai mult şi greutate mai mare de 125 grame. 3)-al treilea grup: şobolani bătrâni. fiecare grup constând în cinci şobolani de vârstă şi greutăţi apropiate.1. 56 . organ. cu vârsta mai mică de şase luni şi greutate mai mică de 50 de grame. 2)-al doilea grup: şobolani adulţi. Toţi şobolanii au fost supuşi la aceeaşi dietă. rinichi. acest studiu a fost realizat în scopul aflării variaţiei concentraţiei de acid folic în funcţie de: metoda vârstă. creier. Determinarea concentraţiei de acid folic la şobolani 5. cu vârste cuprinse între şase luni şi un an şi greutate cuprinsă între 100 grame şi 125 grame. Pentru curba de etalonare am folosit: metoda biuretului pentru determinarea proteinelor celulare.

iar apoi s-au presat uşor pe hârtie de filtru.Prepararea omogenatelor tisulare Toate operaţiunile de preparare a omogenatelor tisulare pentru investigaţii biochimice se fac la 0-4˚ C. Sunt sedimentaţi: -nucleii. Ţesuturile uşor poterabile (ficat şi creier) au fost omogenizate la 1500rpm. Pentru omogenizare 5 ml de soluţie de NaCl 0. Apoi. timp de 2 minute. soluţiile de spălare şi mediile de omogenizare au fost păstrate la gheaţă şi au fost reci în momentul întrebuinţării.15M până ce lichidul de spălare a rămas limpede. -hematiile. pâna ce soluţia de spălare a rămas limpede. într-un omogenizator de sticlă tip Potter-Elvehjem. Omogenatele obţinute s-au centrifugat la 700 g timp de 10 minute (după o prealabilă echilibrare). Animalele de laborator au fost decapitate şi apoi supuse exsanguinării. S-au cântărit foarte repede. pentru a îndepărta sângele. -debriurile celulare. creier şi splină. Supernatantul se decantează şi se păstreaza în gheaţă pentru alte determinări biochimice. S-au izolat organele necesare experimentului: ficat. eprubetele şi cupele de centrifugă. 57 . rinichi.15M.15M au fost adăugaţi pe gramul de ţesut (cu scopul de a obţine un omogenat de concentraţie 10%). cu o foarfecă s-a mărunţit bine organul şi s-a spălat cu NaCl 0. Sticlăria de lucru. -celulele întregi. Ţesuturile mai dure (rinichi şi splină) au necesitat o omogenizare cu o durată mai crescută. Fiecare organ a fost spălat de câteva ori (într-un pahar Berzelius menţinut în gheaţă) cu soluţie rece de NaCl 0.

Pentru a putea compara şi interpreta rezultatele determinărilor biochimice pe omogenate. În funcţie de greutatea sa se realizează omogenate de 10-20%. 58 . a cărei intesitate este direct proportională cu concentraţia proteinelor din probă. Metoda de determinare a proteinelor celulare folosită pentru standardizare (metoda biuretului) -sensibilitate de 0. Standardizarea se obţine preparând totdeauna omogenate de aceeaşi concentraţie. 2. Raportarea la conţinutul proteic Este metoda de standardizare cea mai utilizată.NaOH 10%. -prin raportare la conţinutul proteic al omogenatului. materialul biologic s-a standardizat în două moduri: -prin raportare la greutatea produsului la începutul determinării (standard de preparare). diverse soluţii de omogenizare.reactivul biuret. Reactivi: 1. Standard de preparare Iniţial organul sau fragmentul de organ se cântăreşte.25-10mg/ml omogenat Principiu: Proteinele celulare dau cu reactivul biuret un derivat de culoare albastră caracteristică.

2N.8 ml apa distilată 0. Se face pentru fiecare determinare şi un martor de turbiditate. 59 . Dacă reactivul este contaminat cu alte substanţe apare un precipitat roşcat şi nu se mai foloseşte. -KI-5g. după care se citeşte extincţia la lungimea de undă de 540 nm. Se citeşte extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare .2 ml omogenat 1 ml NaOH-10% 3 ml reactiv biuret culoare 2 ml apa distilată 1 ml NaOH-10% 3 ml reactiv biuret turbiditate 1. Martor de Martor de Proba 1. Se lasă în repaus 30 de minute la temperatura camerei.2 ml omogenat 1 ml NaOH-10% 3 ml apa distilată Se agită bine. ele prezintă o anumită turbiditate. cu grosimea stratului de 10 nm. Tehnica Deoarece omogenatele tisulare nu sunt soluţii limpezi. Reactivul preparat corect este de culoare albastră. dând cu reactivul biuret un efect secundar ce interferă cu reacţia de culoare. Calculul cantităţii de proteine se face prin raportarea valorii corespunzătoare diferenţei dintre cele două mărimi la o curbă etalon.8 ml apa distilată 0. iar extincţia martorului de turbiditate faţă de cea a apei distilate. -CuSO4·5H2O –3g.Reactivul biuret se prepară astfel: -tartrat de sodiu şi potasiu –9g. Se dizolvă şi se aduce la 1000ml cu NaOH 0. Se păstrează timp nelimitat.

006 0.9375 0.75 0.003 *)-extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare minus extincţia martorului de turbiditate faţă de cea a apei distilate 5.46875 0. -se reprezintă grafic modul de variaţie a extincţiei în funcţie de concentraţia soluţiei de proteine Concentraţie (mg/ml) Extincţie (p/c-t/H2O)* 60 0.25-60 mg/ml .042 1.875 0. -se pregăteşte o scară de diluţii de concentraţii cunoscute cuprinse între 0.320 15 0.234375 0.012 0.617 30 0.024 0.090 3.2.Curba etalon -se prepară o soluţie standard de albumină serică de bou. -se respectă pentru fiecare diluţie protocolul prezentat în tabelul anterior .166 7.5 0.Determinarea conţinutului în acid folic Reactivi 60 .

-acid clorhidric soluţie 5N.5 ml NaNO2 0.5 ml KMnO4 0.5 ml omogenat 2.5 ml apă Se lasă 2-3 minute 0.5 ml KmnO4 0.5 ml NaNO2 0.5 sulfamic 0.5 ml HCl Se agită puternic şi se lasă 2 minute O.4%.1%. -azotit de sodiu soluţie 2%.-fosfat dibazic de potasiu soluţie 3%.5 ml NED ml acid de Se citeşte extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare şi a martorului de turbiditate faţă de cea a apei distilate după 10 minute la lungimea de undă 530 nm în cuvă de 10 mm.5 ml acid O.5 ml NED de Martor culoare 2. -acid sulfamic soluţie 5%.5 ml HCl 0.5 ml NED 0. Calculul cantităţii de acid folic se face prin raportarea valorii corespunzătoare diferenţei dintre cele două mărimi la o curbă etalon.5 ml NaNO2 0. -permanganat de sodiu 0. 61 . -diclorhidrat de N (1-naftil) etilendiamina NED soluţie 0.5 ml HCls O.5 ml KMnO4 0.5 ml omogenat 0. Tehnica Proba Martor turbiditate 2.5 ml acid sulfamic sulfamic Se agită puternic până la îndepărtarea NO2 0.

0728 86.Curba etalon: -se prepară o soluţie standard de acid folic.22 0.66 0.1394 0.2905 21.8756 0.226 1.8555 65 0.1180 0. o metodă de bază.2758 0.0718 7. Această metodă se foloseşte ca tehnică de dozare în industria farmaceutică (Atanasiu şi colab.83 0.1555 0.0303 *)extincţia probei faţă de cea a martorului de turbiditate **)-extincţia probei faţă de cea a martorului de culoare minus extincţia martorului de turbiditate faţă de a apei distilate. -se reprezintă grafic modul de variaţie al extincţiei în funcţie de concentraţia soluţiei de acid folic.0508 1.61 0.1766 10.2648 108. spectrofotometrică.0431 3.565 43. -se pregăteşte o scară de diluţii cu concentraţii cunoscute cuprinse între 1. -se respectă pentru fiecare diluţie protocolul prezentat în tabelul anterior. 1989) .66 0..6198 0.2023-130 μg/ml. Măsurarea cantităţilor de acid folic din omogenatele tisulare Concentraţiile de acid folic au fost estimate prin metoda NED (N-1-naftiletilen diamina).3585 0.33 1. Concentraţie Extincţie Extincţie μg/ml p/t* p/c –t/H2O 130 1. 62 .33 0.

NaNO2 -2% acid hidrocloric – 5%.1% - Tehnica 63 . acid sulfamic –5% NED-0.Reactivi -_monofosfat de potasiu –3%.4% . - permanganat de potasiu –0.

Proba 2.5 ml HCl 0.5 ml NaNO2 Se agită şi se lasă 2 min 0.5 ml HCl 0. Măsurarea concentraţiei de proteine din omogenat Concentraţia de proteine a fost calculată prin metoda descrisă de Lowry (Lowry.5 ml NED Se lasă 10 minute 0. Rezultatele obţinute s-au exprimat atât în funcţie de greutatea iniţială a organului (μg de acid folic/g de ţesut).5 ml NED Se citeşte extincţia faţă de martorul de culoare la lungimea de undă de 530 de nm.5 ml KMnO4 Se lasă 2-3 minute 0±.5 ml NaNO2 0.5 ml omogenat 0. metodă bazată pe acidul fosfomolibdenowolframic (reactivul “Folin-Ciocalteu”). 64 .5 ml KMnO4 0. cât şi în funcţie de concentraţia de proteine din omogenat (μg de acid folic/mg de proteine). concentraţia de acid folic corespunzătoare acestei extincţii s-a calculat prin raportarea la curba standard (prin metoda expusă anterior).5 ml acid sulfamic Martor de culoare 2.5 ml acid sulfamic Se agită până când N2 este complet înlăturat 0.5 ml K2HPO4 0. 1951).

curbă construită pe baza unor concentraţii proteice cunoscute (prin metoda descrisă anterior).Reactivi Reactivul A: .4g NaOH. Rezultatele au fost deasemenea raportate la o curbă etalon.5ml reactiv Folin-Ciocâlteu. Reactivul D: -acid fosfomolibdenowolframic. întregul amestec a fost agitat şi după aceea lăsat timp de 30 de minute. -apă distilată până la 1000 ml. faţă de un martor ce conţinea 20μl de apă distilată în loc de 20μl de omogenat. Reactivul C: -25 ml reactiv A + 0. -10g sare Seignette. 65 . -apă distilată până la 1000ml. Tehnica Peste 20 μl de omogenat se adaugă 180 μl de apă distilată. Extincţia s-a citit la o lungime de undă de 660 nm. Reactivul B: -5g CuSO4·5 H2O. iar apoi se adaugă 5ml reactiv C şi 0.5 ml reactiv B.

OH N H2N N N N CH2 NH CO N CH CH2 H COOH CH2 COOH

KMnO4
OH N N N N COOH

+

PRODUSI

H2N

2-amino-4-hidroxi-6-carboxipteridina U.V.
OH N H2N N N N

- CO2

2-amino-4-hidroxipteridina 1/2 O2
OH N H2N N N

Isoxanthopterina
N OH

HCl 5N HNO2
OH N HO N N N OH

2,4,7-trihidroxipteridina

66

OH N HO N N N OH

2,4,7-trihidroxipteridina H3NO3S

CHO COOH Acid glioxilic

HO +

N

NH2 NH2

OH 2,4-dihidroxi-5,6-diaminopirimidina Naftiletilendiamina Compus violet

5.3.Rezultate şi discuţii Variaţia concentraţiei de acid folic: în funcţie de vârstă şi organ

Acid folic Concentraţie (valoare ±eroare) are) Organ

Proteine Concentraţie (valoare±ero de

Grup μg de μg de mg a de acid folic/g acid proteină/ml vârstă de ţesut folic/mg de omogenat
67

proteine

68

99 69 .74± 2.80±0.tânăr .76 431.76 25.48±4 1.

71±0.12 30.07±3 1.Ficat adult .12± 2.36 322.43 70 .

55 18.33 71 .bătrâ n .54± 2.52±2 2.11±0.83 195.

93± 2.54 27.tânăr .13±0.41 72 .08 333.13±8 6.

54 208.13 73 .57±4 3.88 20.Rinichi adult .25±0.37± 1.

73± 1.07 46.bătrâ n .31±2 9.13 74 .13±0.03 227.

81± 2.36±9 1.04± 27.43 110.61±0.33 75 .72 1.17 .87 29.23 336.06±0.tânăr Creier adult .48±3 2.

68 31 27.17 1.27 1.13 208.08±2.13±0.44±2 20.08 Splina 120.23±0.8 322.74 76 7.52 Rinichi 333. .53 bătrâ n tânăr Splină adult .57 227.31 Creier 336.77 120.07±0.74 bătrâ n 83 .450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Tineri Adulti Batrani Ficat 431.03± 17.53±3.28 .03 91.41±1 1. .48 27.07 195.73±1 3.73 109.04 1.08± 6.25±0.36 110.88 109.03±9 2.53 91.

57 110.36 120.37 46.08 6.93 20.81 7.54 Rinichi 27.48 333.74 30.03 Batrani 195.41 Variaţia concentaţiei de acid folic pe grupe de vârstă exprimată în μgAF/mg prot.13 333.08 Variatia concentratiei de acid folic pe grupe de varsta exprimata in μg AF/g de tesut 77 . 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Ficat Rinichi Creier Splina Tineri 431.Variaţia concentaţiei de acid folic pe grupe de vârstă exprimată în μgAF/g de ţesut 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Tineri Adulti Batrani Ficat 25.73 Creier 29.53 27.31 91.52 227.12 18.73 Adulti 322.44 Splina 20.03 17.48 109.07 208.04 27.

ca apoi să crească paradoxal la şobolanii bătrâni. Această ipoteză s-a justificat prin corelarea cu valorile calculate a concentraţiilor proteinelor din omogenatul de rinichi de la tineri şi de la adulţi. 2) prezenţa unei concentraţii scăzute de proteine în acest omogenat. prezenţa unei concentraţii crescute de folaţi în omogenatul de rinichi la 78 . În ceea ce priveşte concentraţiile de acid folic din creier nu are valoare faptul că s-a obţinut o scădere a concentraţiilor de acid folic (de aproximativ trei ordine de mărime) de la tineri spre adulţi. Variaţiile concentraţiilor de acid folic în funcţie de organ: Din toate tipurile de reprezentări grafice. Sunt două posibile explicaţii prentru aceste variaţii neaşteptate.. 1979) şi cu nivelul activităţii metabolice din ficat (implicând metabolismul hepatic a unei singure unităţi carbonice). aceste rezultate sunt în concordanţă cu studiile histologice făcute anterior (Onicescu şi colab. cu excepţia concentraţiilor de acid folic din omogenatul din rinichi. pe grupe de vârstă.Variaţia concentraţiei de acid folic pe grupe de vârstă Din studiul grafic al variaţiei concentraţiei de acid folic pe grupe de vârstă (exprimată în μg de AF/g de ţesut) s-a observat o scădere gradată de la tineri spre adulţi şi spre bătrâni. Dintre aceste două ipoteze ultima este mai plauzibila. 1) tineri. rezultă faptul că indiferent de modalitatea de exprimare a acidului folic (μg acid folic/g de ţesut sau μg acid folic/ mg de proteine) nivelul cel mai crescut de folaţi s-a obţinut în omogenatul de ficat. În acest caz particular concentraţia de acid folic scade de la tineri la adulţi.

12 20.44 6.03 Adulti 30.41 Variaţiile concetraţiilor de acid folic în funcţie de organ (exprimate în μg AF/mg de proteine) Concluzii În acest studiu s-a dovedit o incidenţă crescută a deficitului de acid folic la bătrâni. Tabloul clinic nespecific al malnutriţiei la bătrâni (care este adesea greşit diagnosticată) însoţit de deficienţă de folaţi induc homocisteinemia şi se asociază cu un risc crescut cardiovascular. la pacienţi instituţionalizaţi la geriatrie.54 46.S – au obţinut cantităţi mult mai mari de acid folic în ficat şi rinichi. Este necesară o evaluare ulterioară pentru a demonstra rolul patogenic a deficitului de acid folic în diferite sindroame clinice la bătrâni (ca de exemplu deficite imunologice şi neuropsihiatrice).37 27.04 20.08 Batrani 18.81 17.93 29. la 79 .74 27. Aceste observaţii sunt argumente în favoarea următoarelor concluzii: 1) 2) stării nutriţionale a bătrânilor trebuie să i se acorde o mai mare importanţă soluţia este suplimentarea de acid folic la bătrâni (măcar la pacienţii cu risc decât unui diagnostic de rutină de a dezvolta o deficienţă de acid folic. deficit cauzat în principal de malnutriţie. 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Ficat Rinichi Creier Splina Tineri 25.73 7. faţă de valorile corespunzătoare din splină şi creier.

pacienţii ce consumă mâncare conservată etc. această soluţie este atât sigură cât şi ieftină (singura reacţie adversă a fost observată la epileptici).). 80 .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful