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Estudio de respuestas celulares in vitro e in vivo

Funcionalidad de las clulas Activacin Proliferacin Funcin efectora Sntesis de sustancias inmunoreguladoras (citoquinas) Expresin de Receptores Apoptosis Deteccin de tipos celulares Caracterizacin fenotpica Evaluacin nmero total de linfocitos Relaciones LT/LB, LT CD4+/ CD8+

In vitro
Activacin de Linfocitos por Mitgenos o Ag Cultivo Mixto Linfocitario (CML) Citotoxicidad Mediada por Clulas (CMC) Produccin de citoquinas, Acs (para LB) Muerte celular - Apoptosis

In vivo
Proliferacin Apoptosis Citotoxicidad

Activacin celular:
Medicin de citoquinas: ELISA, RIA ELISPOT Inmunofluorescencia Citometra de flujo
(Clulas en suspensin)

Marcacin intracitoplasmtica Beads

Microscopa
(cortes de tejidos, clulas adheridas a un soporte)

RT PCR (cualitativa-semicuantitativa) PCR RT - Real-time PCR (RT-qPCR) Cuantitativa

Western Blot Mtodos biolgicos

Proliferacin celular:
In vitro
Incorporacin de 3H-Timidina Incorporacin de Bromo-deoxiuridina CFDA-SE

In vivo

Incorporacin de Bromo-deoxiuridina CFDA-SE

Apoptosis:
Anexina-V / PI
Tunel Hipodiploida Fragmentacin de ADN Tincin con Bromuro de etidio y Naranja de acridina dosaje biolgico de TNF- Vas de activacin de caspasas

Estudio de la funcin efectora:


51Cr In vitro Citotoxicidad mediada por clulas In vivo colorantes enzimas

CFDA-SE

Reaccin mixta linfocitaria Ensayos de presentacin y procesamiento

Separacin de las clulas


Mtodos
Gradiente de Ficoll-Hypaque Gradiente de Percoll Pasaje a travs de columnas de lana de nylon Adherencia Citotoxicidad mediada por Ac Tcnicas inmunomagnticas Citometra de Flujo Separacin de clulas

enriquecimiento

purificacin

clulas mononucleares

Sangre perifrica
LT (80%) LB (10%) NK (10%)

Bazo
LT (50%) LB (40%) NK (10%)

Ganglios
LT (70%) LB (30%)

Separacin de clulas

Gradiente de Ficoll-Hypaque
A partir de stas fracciones se puede: Plasma
Desplaquetizar Separar clulas por adherencia (y diferenciar los monocitos a macrfagos) Separar clulas por gradiente de Percoll

Sedimentacin con Dextran: Para enriquecer en PMN

Separacin de clulas

Gradiente de Percoll
Centrifugacin

plasma blastos, monocitos, NK linfocitos granulocitos eritrocitos

Permite separar los linfocitos de los monocitos del halo del Ficoll (doble purificacin) pellet: linfocitos Halo de monocitos Accesibles en costo Simples

Separacin de clulas

Pasaje a travs de columnas de lana de nylon


Enriquecimiento de clulas T por no adherencia al nylon

LB

Adhesin de LB y macrfagos

MO MO
LT eluyen
LT LT

Ventaja: No se necesitan Ac o complemento Desventaja: Enriquecimiento, no quedan las poblaciones puras

Separacin de clulas

Separacin de las poblaciones linfocitarias


Seleccin Positiva Utilizando anticuerpos especficos Seleccin Negativa citometria de Flujo (sorting) Perlas inmunomagnticas Citotoxicidad mediada por anticuerpos

TIPO CELULAR LT LT helper LT citotxico LB NK monocitos Separacin de clulas

MARCADOR
CD3 CD3 CD4 CD3 CD8 IgM de superficie CD19 CD21 CD16 CD14

Citotoxicidad mediada por Ac

Complemento

Y Y

Deplecin de la poblacin

Separacin de clulas

Y Y

Y Y Y

Tcnicas inmunomagnticas

Ac con microesferas magnticas

SELECCIN NEGATIVA

SELECCIN POSITIVA

Separacin de clulas

Pruebas Funcionales in vitro

Activacin de Linfocitos (LT y/o LB)


Estimulacin con Mitgenos Estimulacin Antignica Cultivo Mixto Linfocitario (CML)

Evaluacin de la Proliferacin Celular


Incorporacin de 3H-Timidina Incorporacin de Bromo-deoxiuridina CFDA-SE IL-2 (mtodo indirecto)

Proliferacin celular

Proliferacin in vitro de celulas mononucleares


Activacin Policlonal Fitohemaglutinina (PHA) Concanavalina A (Con A) Mitgeno de Fitolaca (PWM) steres de forbol (PMA) Protena A S. aureus ionomicina antiCD3 + antiCD28 Clulas respondedoras LT LT LT y LB LT y LB LB LT + LB LT Previa sensibilizacin con el Ag (presencia de clulas especficas) Cultivos ms prolongados (5 a 6 das) Necesitan las CPA

Activacin antgeno especfica: se utilizan antgenos o mezclas de antgenos respecto a los cuales se quiere ver la proliferacin.

Proliferacin celular

Ensayo y controles
Estimulacin con mitgeno para evaluar proliferacin de LT y LB. Clulas sin estimular Clulas estimuladas con mitgeno Proliferacin linfocitaria antgeno especfica. Clulas sin estimular Clulas estimuladas con antgeno. Clulas estimuladas con mitgeno.

Hubo proliferacin?

Proliferacin celular

Incorporacin de 3H-Timidina
3H-timidina
El ADN se transfiere a una membrana

Cultivo en presencia de antgeno o Los linfocitos mitgeno proliferan

la timidina se incorpora al ADN celular

Se miden las cuentas por minuto (3H) en cada muestra en un contador de centelleo

Proliferacin celular

Incorporacin de 3H-Timidina
70 60 50 40 30 20 10 0 0 2 4

Cintica de proliferacin

cpm x 10-3

Clulas estimuladas Clulas sin estimular: basal

Dias despus del Inicio del Cultivo

Curva dosis respuesta


75

CPM (x10-3)

Curvas dosis respuesta

50

clulas de dador inmunizado clulas de dador control (no inmunizado)

25

0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

Proliferacin celular

Dosis de antgeno (g/ml)

Incorporacin de 5-Bromodesoxiuridina (BrdU)


5-bromo-2-deoxyuridina Brdu es un homologo sinttico de la timidina
BrdU es incorporado en el ADN de aquellas clulas que se encuentran en la fase S del ciclo celular. (cllulas proximas a dividirse)

La incorporacin de BrdU a las clulas se puede detectar utilizando un anticuerpo monoclonal anti-BrdU marcado con: - Una enzima (ej peroxidasa) - Un Fluorocromo (FITC) ELISA Citometra de Flujo

Proliferacin celular

Cultivo en presencia de antgeno

Los linfocitos especficos proliferan Anti-BrdU-HRP

La BrdU se incorpora al ADN celular Revelado

Lisis y desnaturalizacin

Fijacin del DNA a la placa

Proliferacin celular

Proliferacin celular

Marcacin de clulas con CFSE:


El 5,6 ester succinimidil diacetato carboxifluoresceina

Atraviesa fcilmente las membranas celulares. No Fluorescente

Reacciona con las protenas formando uniones covalentes estables Atraviesa las membranas celulares con ms dificultad. Fluorescente

Proliferacin celular

Clulas marcadas con CFSE

Inyeccin a un animal: - Proliferacin in vivo - Citotoxicidad in vivo - Homing

- Proliferacin in vitro - Estudio de variaciones en la poblacin segn el nmero de divisiones experimentadas: Expresin de citoquinas Diferenciacin celular (ej: marcadores de clulas de memoria)

Proliferacin celular

CFDA-SE

Proliferacin

Linfocitos

Linfocitos inyeccin endovenosa a un animal o Estimulacin in vitro A medida que proliferan el CFSE se va diluyendo, generacin a generacin. Disminuye la intensidad de Fluoresencia detectada

Proliferacin celular

Clulas marcadas antes de estimular

Aumenta el nmero de divisiones celulares Disminuye la intensidad de fluorescencia Proliferacin celular

autofluorescencia

Clulas marcadas antes de estimular

Clulas proliferando
Aumenta el nmero de divisiones celulares Proliferacin celular Disminuye la intensidad de fluorescencia

Cultivo Mixto Linfocitario (CML)


Clula respondedora

Clulas estimuladoras

5 a 7 das Ag: CMH alogeneico de CPA y LB Proliferacin por reconocimiento principalmente del CMH II UNIDIRECCIONAL: clulas estimuladoras tratadas con mitomicina C o irradiadas BIDIRECCIONAL Proliferacin celular

Activacin celular: produccin de citoquinas Medicin de citoquinas:


ELISA ELISPOT Inmunofluorescencia Citometra de flujo
(Clulas en suspensin)

Marcacin intracitoplasmtica Beads

Microscopa
(cortes de tejidos, clulas adheridas a un soporte)

PCR

RT PCR (cualitativa-semicuantitativa) RT - Real-time PCR (RT-qPCR) Cuantitativa

Western Blot Mtodos biolgicos

Medicin de citoquinas por ELISA ELISA de captura

En sobrenadantes de cultivo Suero Diferentes fludos biolgicos

Curva de calibracin (citoquina estndar) muestras

Medicin de citoquinas por ELISPOT


Se detecta la produccin de citoquinas a nivel de uan clula individual Se requiere al igual que en el ELISA de captura dos anticuerpos diferentes que reconozcan epitopes diferentes en la citoquina. Los spots formados son permanentes y pueden ser contados visualmente, microscpicamente o electrnicamente Es 20-200 veces ms sensible que un ELISA de captura: la concentracin de citoquina secretada en el microentorno de la clula es mucho mayor que en un sobrenadante de cultivo. Si se usa en paralelo con un ELISA se puede determinar la cantidad promedio de citoquina producida por clula. Acoplado a mtodos de pruificacin de poblaciones celulares, se puede determinar la frecuencia de clulas productoras de citoquinas en las diferentes subpoblaciones

Medicin de citoquinas por ELISPOT

Se sensibilizan placas de microtitulacin con fondo de nitrocelulosa horneada con el anticuerpo anti-citoquina de inters Se cultivan las clulas productoras de citoquinas en presencia de estmulos. Las citoquinas secretadas se unen a los anticuerpos unidos a la placa. Se lisan las clulas. Se incuba con otro anticuerpo anti-citoquina de inters biotinilado. Se incuba con la enzima unida a avidina Se revela con el sustrato de la enzima que genera un precipitado (spot), cada spot indicara el sitio que ubicaba una clula productora de citoquinas (Unidad productora de citoquinas)

ELISPOT

Determinacin de la produccin de citoquinas por PCR


Se determina la presencia o cantidad del mRNA de la citoquina estudiada Tipo de muestras: clulas en cultivo tejido (biopsias, etc.) clulas mononucleares de SP (PBMCs) Tcnica experimental: - Aislamiento de RNA celular - Obtencin de cDNA - PCR: clsica o cuantitativa - Anlisis de resultados - electroforesis en gel de agarosa - anlisis cuantitativo

Aislamiento de RNA celular


Extraccin de RNA por el mtodo de trizol (isotiocianato de guanidinio y fenol) 1- Homogeinizacin en trizol 2- Agregado de cloroformo, centrifugacin 3- separacin de fase acuosa 4- agregado de isopropanol, centrifugacin 5- lavado con etanol, secado 6- suspensin en agua lobre de RNAsas (5560C, 15 min)

Disociacin total de complejos nucleoprotena cloroformo

Mtodo rpido Mantiene integridad del RNA Prevenir contaminacin con RNAsas

Determinacin de citoquinas por RT-PCR semicuantitativa

Transcriptasa reversa

Transcripcin reversa

Primers (oligo-dT, primers diseados al azar, primers especficos para un gen) dNTPs

cDNA
citoquina

Expresin relativa
(densitometra)

dNTPs, TAQpol, primers, MgCl2

citoquina

Determinacin de citoquinas por RT-PCR cuantitativa (real time PCR)


SYBR Green es un
fluorocromo que se intercala en el DNA doble cadena Permite monitoreo contnuo de la fluorescencia durante la PCR Estimamos el nmero de copias iniciales del cDNA Al final de la PCR se hace un ciclo de aumento contnuo de la temperatura y determinacin constante de fluorescencia
Informacin cualitativa del producto de PCR

curva de melting

Anlisis de resultados RT-qPCR

Comparacin entre deteccin contnua de DNA y PCR convencional

Anlisis de resultados: puesta a punto y problemas Cuantificacin


Fluorescencia

Real time PCR usando sondas TaqMan Sondas de hidrlisis Emiten fluorescencia cuando la actividad exonucleasa 5-3 de la TaqPol hidroliza la sonda El reporter se separa del quencher La sonda est fosforilada en 3, no puede ser extendida por TaqPol Se mide fluorescencia al final de la extensin Las sondas se van consumiendo, y la fluorescencia aumentando No hay curva de melting

No se distingue entre cDNA y DNA genmico hay que correr un gel de agarosa

Anlisis de resultados: Cuantificacin


El nmero de ciclos necesarios para alcanzar un nivel de fluorescencia es proporcional a la cantidad de cDNA de inicial

Se grafica, nmero de ciclos versis log de la cantidad de DNA inicial y se obtiene una linea recta. Puede obtenerse una curva de calibracin utilizando cantidades conocidas de cDNA.