DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE ANTIBIOTICO POR DIFUSION EN GEL 1.

OBJETIVO Determinar el efecto del tipo de microorganismo, la concentracin del inculo y la concentracin del activo sobre el dimetro del halo de inhibicin para la evaluacin de una sustancia antimicrobiana por difusin el gel. 2. MATERIALES tubo de ensayo con 4 ml de inculo Tubo de ensayo con 2 ml de solucin estndar del antibitico Tubo de ensayo con 2 ml de solucin problema del antibitico Tubos de ensayo pequeos vacos Recipiente con 25 ml de agar antibitico No.1 Recipiente con 15 ml de buffer fosfatos 0.1 M pH 6.5 Cajas de petri vacas estriles Pipeta de 5 ml estril Pipeta de 1 ml estril 1 1 1 8 3 1 3 2 13

Recipiente con alcohol y dos sacabocados No 4 y dos pinza, uno por mesn. 2. PROCEDIMIENTO 2.1 Inculo: Prepare suspenciones de Micrococcus luteus y Staphylococcus aureus en buffer fosfatos 0.1 M pH 6.5 a una densidad ptica de 25% T. Coseche los microorganismos de cultivos incubados a 37C por 24 horas en agar antibitico No. 1 con 5 ml de buffer fosfatos, y esta suspencin concentrada utilcela para hacer las suspenciones a 25%T, el volumen que requiera para el procedimiento. 2.2 El Activo Solucin 1: Penicilina G potsica (PGK) a 1000 UI/ml de actividad Solucin A: Dilucin 1 en 25 en buffer fosfatos de la Solucin 1 (40 UI/ml) Solucin B: Dilucin 1 en 10 en buffer fosfatos de la Solucin 2 (4 UI/ml) Solucin M: Corresponde a una solucin de PGK de concentracin desconocida 2.3 Diluciones de Trabajo En cuatro tubos de ensayo pequeos marcados del No 2 al 5 coloque 2 ml de buffer fosfatos. De la Solucin 2 o 3 segn se indique en la prctica, tome 1 ml y dispnselo en el tubo marcado No.2, homogeneice y de este tubo tome 1 ml y dispnselo en el No. 3. Repita el procedimiento hasta completar el tubo No.5. Ver Figura No. 1 Las diluciones de la solucin M se preparan de la misma manera que la del patrn 2.4 Desarrollo del Ensayo. Inocule los tres recipiente que contienen 25 ml agar antibitico No. 1 fundido que se mantiene a entre 48 y 50C. Mezcle bien sin hacer burbujas y srvalo en las cajas de petri correspondientes. Deje endurecer el agar, haga seis perforaciones (figura No. 1) con un sacabocados No. 4 y retire los bocados de agar para dejar listos los pozuelos. Dispense en cada pozuelo 0.1 ml de cada una

de las diluciones y 0.1 ml del buffer en el pozuelo central. Incube las cajas a 35C por 24 horas y determine los dimetros de los halos de inhibicin. El volumen de inculo se fijar segn los grupos presentes. Estos pueden ser 0.1, 0.5 o 1 ml por cada 25 ml de agar. Que se le asignar a cada grupo.

1 ml

1 ml

ml

ml

Solucin 2 (3)
Figura No. 1. Preparacin de las diluciones de trabajo

Figura No.2. Distribucin de los pozuelos en el agar.

3. ANLISIS DE LOS RESULTADOS CONCENTRACION UI/ml 40 20 10 5 2.5 CONCENTRACION UI/ml 4 2 1 0.5 0.25 DIAMETRO DEL HALO (mm) LONGITUD DE LA CORONA (mm) DIAMETRO DEL HALO (mm) LONGITUD DE LA CORONA (mm) DIAMETRO DEL HALO (mm) LONGITUD DE LA CORONA (mm)

MUESTRA M1 M2 M3 M4 M5

Realice los siguientes grficos: Figura 2. Log de Concentracin vs. Dimetro del halo y calcule su pendiente Figura 3[Longitud de la corona]2 vs. Log de Concentracin y determine la concentracin crtica. Obtenga los valores de las pendientes y las concentraciones crticas obtenidas por los dems grupos y haga su anlisis de la siguiente manera: Relacione las pendientes con el porcentaje de inculo y determine su efecto sobre la respuesta. Relacione la concentracin crtica con el porcentaje de inculo empleado y determine si hay o no algn efecto del inculo sobre la respuesta. Determine al concentracin de la solucin M y estudie la variacin de la potencia e funcin de los parmetros anteriores (porcentaje de inculo, rango del estndar)