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ANALISIS FISICOQUIMICOS DE LOS ALIMENTOS IBQ. GISELA LOPEZ SAUCEDA DETERMINACION DE PROTEINAS METODO DE KJELDAHL I.

OBJETIVO Al trmino de la prctica el alumno podr cuantificar el contenido de nitrgeno total de una muestra de origen animal o vegetal y relacionar este con el contenido proteico presente en la muestra. II. INTRODUCCION La materia orgnica es digerida por la accin del H2SO4 concentrado, convirtindose en CO2 y H2O; adems reduce el nitrgeno a amonio, el cual pasa a ser fijado por el cido como sulfato de amonio, una sal de gran estabilidad. La reduccin del material nitrogenado hasta amonio, se debe a que parte del H2SO4 es simultneamente reducido a SO2, que se comporta como un fuerte reductor. La digestin de la muestra es la parte mas difcil de la determinacin, esta se acelera mediante la adicin de catalizadores como el mercurio metlico, el xido rojo de mercurio (HgO), el sulfato cprico (CuSO4), el selenio, el permanganato de potasio (KmO4) o una mezcla de estos. El sulfato de sodio o de potasio se adicionan a la mezcla con la finalidad de aumentar el punto de ebullicin y disminuir entonces el tiempo de digestin. Cuando la totalidad de la materia orgnica ha sido digerida, se libera el amonaco por descomposicin del sulfato de amonio con un lcali fuerte (NaOH) y luego se separa por destilacin y recoleccin en un volumen de cido brico, como borato de amonio. El amonio se determina por titulacin con solucin valorada de HCl 0,02 N en presencia de un indicador mixto compuesto por una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno, el cual en medio cido se presenta de color morado y en medio alcalino de color verde. Resumen de las reacciones qumicas en el mtodo Micro-Kjeldahl Digestin: Destilacin: Recoleccin : Titulacin: Materia Orgnica+H2SO4 (NH4) 2SO4 + NaOH NH3 + H3BO3

CO2+H2O+SO2+(NH4)2SO4 Na2SO4 + 2NH3 + 2 H2O

NH4H2BO3

NH4H2BO3 + HCl

NH4Cl + H3BO3

Se acostumbra a hacer determinaciones en blanco para corregir cualquier impureza en los reactivos.

III. METODOLOGIA

ANALISIS FISICOQUIMICOS DE LOS ALIMENTOS IBQ. GISELA LOPEZ SAUCEDA A) MATERIALES - Carne de res, pescado o ave. B) EQUIPOS - Unidad de digestin Kjeldahl - Unidad de destilacin Kjeldahl - Matraz de Kjeldahl de 800 ml - Bulbo Kjeldahl - Matraz Erlenmeyer de 500 ml - Bureta de 50 ml - Agitador magntico con magnetos C) REACTIVOS - Acido sulfrico concentrado, libre de nitrgeno - Catalizador: Mezcle 9 partes de sulfato de potasio, libre de nitrgeno, con 1 parte de sulfato de cobre anhidro, libre de nitrgeno. - Solucin de NaOH (40% w/v). - Acido brico al 4% - Grnulos de antiespumante - Etanol al 95% - Solucin estndar de cido sulfrico 0.1 N (HCl 0.02 N) - Indicador: Mezclar 100 ml de rojo de metilo al 0.1% (en etanol al 95%) con 200 ml de verde de bromocresol al 0.2% Solucin indicadora (2 partes de rojo de metilo al 0,2% + 1 parte de azul de metileno al 0,2%, ambas en solucin alcohlica). D) PROCEDIMIENTO 1.- Pesar 2 g de muestra pipetear una cantidad suficiente de la solucin de la fraccin proteica (20 ml de la fraccin sarcoplsmica o miofibrilar) y colocarlos en el matraz Kjeldahl. Aadir 7 g del catalizador, de 3 a 5 grnulos de antiespumante y 20 ml de acido sulfrico concentrado.Preparar un matraz conteniendo todos los reactivos, excepto la muestra (blanco). Colocar el matraz en la unidad de digestin y encienda el equipo hasta que el lquido quede de un color traslcido (de verde a amarillo claro), primero suave (15 min) y posteriormente a la temperatura ms alta (alrededor de una hora). Quite el matraz con cuidado y espere a que se enfre. Aada con precaucin 200 ml de agua destilada. 2.- Coloque 25 ml de cido brico al 4% en un Matraz Erlenmeyer de 250 ml y adale 5 gotas del indicador y colquelo bajo el condensador de la unidad de destilacin, asegurndose que la lnea del condensador est inmersa en el cido. Agregue 20 ml de NaOH e inmediatamente coloque el matraz al bulbo Kjeldahl, y encienda la unidad de destilacin sin olvidar abrir la corriente de agua de la unidad de destilacin. Recoja aproximadamente 120 ml del destilado (debe observar que en este tiempo cambie el color del cido contenido en el matraz). Apague la unidad de destilacin, quite inmediatamente el matraz donde se colecto el amonio y coloque un vaso de pp conteniendo 500 ml de agua destilada, para lavar el sistema de destilacin.

ANALISIS FISICOQUIMICOS DE LOS ALIMENTOS IBQ. GISELA LOPEZ SAUCEDA 3.- Coloque el matraz conteniendo el amonio destilado sobre un agitador magntico y titule la muestra con la solucin valorada de ac. Sulfrico 0.1 N hasta que la solucin cambie de verde a rosado. Lea el volumen de cido usado en la titulacin. 4.- Realice el mismo proceso para el blanco. 5.- Clculos a) Calcule el nitrgeno total para muestras slidas/semislidas (mgN/100 g de muestra) o lquidas (mgN/100 ml de muestra), como sigue: Nitrgeno total = (b a) x 0.1 x 14.00 x 100 Ws Donde: Ws = peso (g) o volumen (ml) de muestra a = volumen (ml) de 0.1 N H2SO4 usado en la titulacin del blanco b = volumen (ml) de 0.1 N H2SO4 usado en la titulacin de la muestra 14.00 = Peso atmico del nitrgeno b) Calculo del porcentaje de protena: El NT anterior (mgN/100 g o ml de muestra) puede tambin ser presentado como porcentaje de la fraccin de nitrgeno no proteico y es expresado como sigue: % Protena = NT x 6.25 1000 Donde: 1000 = Conversin de mgN/100g a gN/100g mta. 6.25 = Factor de conversin de nitrgeno a protena en carne y sus productos. IV. RESULTADOS Y DISCUSION. Comparar los resultados con los parmetros establecidos en la bibliografa y anotar sus observaciones y conclusiones.

ANALISIS FISICOQUIMICOS DE LOS ALIMENTOS IBQ. GISELA LOPEZ SAUCEDA Se acostumbra a hacer determinaciones en blanco para corregir cualquier impureza en los reactivos. El contenido proteico de la muestra se calcula aplicando la siguiente frmula:

%N =

V N Pe 10 a

Luego de calculado el porcentaje de nitrgeno, es necesario calcular el porcentaje de protenas basndose en este valor y utilizando entonces la siguiente ecuacin;
%P = %N 6,38

Donde: V = mL de HCl gastados en la titulacin. N = normalidad de la solucin de HCl (0,02 N). E = equivalente del nitrgeno (14). a = gramos de muestra. P = protena total. Reactivos H2SO4 libre de nitrgeno HgO libre de nitrgeno Na2SO4 pulverizado Solucin de NaOH-Na2S2O3 (60 g NaOH + 5 g Na2S2O3 * 5H O /100ml) Solucin dev cido brico al 4%. Solucin indicadora (2 partes de rojo de metilo al 0,2% + 1 parte de azul de metileno al 0,2%, ambas en solucin alcohlica). HCl 0,02 N. Procedimiento 1. Medir con pipeta 0,5 mL de la muestra bien homogeneizada, Transferir a un baln de Kjeldahl para microanlisis (30 mL). Agregar 1,9 g de K 2SO4, 40 mg de HgO y 2,5 mL de H2SO4. La tcnica de la A.O.A.C. recomienda no pesar mas de 100 mg de materia orgnica seca y el empleo de 2 mL de H 2SO4 para 15 mg de muestra, si la misma pesa mas de 15 mg, se debe agregar 0,1 mL de H2SO4 por cada exceso de 10 mg de muestra. Adicionar adems, algunas perlas de vidrio.

ANALISIS FISICOQUIMICOS DE LOS ALIMENTOS IBQ. GISELA LOPEZ SAUCEDA 2. Calentar la mezcla en el agitador hasta que el digerido adquiera un aspecto claro y limpio. Enfriar a temperatura ambiente. 3. Disolver el contenido del baln en una pequea cantidad de agua destilada. Colocar una fina pelcula de vaselina alrededor del borde del baln. 4. Para efectuar la destilacin, colocar un vaso de precipitado o erlenmeyer de 100 mL de capacidad, conteniendo 5 mL de solucin de cido brico al 4% y 2-4 gotas del indicador en el aparato, debajo del refrigerante de modo que la punta de este quede sumergida en el lquido. Seguidamente, transferir el digerido, ya diluido, con agua destilada, a la cmara interna de destilacin, haciendo 5 o 6 lavados sucesivos con porciones de 1-2 mL de agua destilada. A continuacin adicionar 8-10 mL de la solucin de NaOH-Na2S2O3, lavar ligeramente el embudo con agua destilada y cerrar las llaves de vidrio del aparato. Finalmente, encender el generador de vapor y destilar hasta recoger unos 15 mL. 5. 6. Retirar el destilado y diluirlo con agua destilada hasta 50 mL. Titular directamente con HCl 0,02 N, colocado en una microbureta automtica. Calcular el porcentaje de nitrgeno y de protenas totales en la muestra de leche aplicando la frmula correspondiente y empleando el factor 6,38.