PEMERIKSAAN STATUS BESI TUBUH

PENDAHULUAN
Besi mempunyai banyak fungsi penting dalam tubuh, terutama perannya dalam hemoglobin sebagai alat transport oksigen. Kandungan besi dalam tubuh orang normal berkisar antara 3-5 gram atau pada pria sekitar 50 mg/kg BB dan pada wanita sekitar 35 mg/kg BB. Dalam tubuh besi terdapat dalam dua bentuk, yaitu ferro (Fe
2+

) dan ferri (Fe3+). Pada suasana netral atau

alkali besi berbentuk Fe3+ dan dalam suasana asam besi berbentuk Fe2+. Dalam tubuh besi tidak pernah dalam bentuk bebas (free iron), tetapi selalu berikatan dengan protein tertentu. Besi bebas akan merusak jaringan karena memiliki sifat sebagai radikal bebas. Metabolisme besi dimulai sejak dari penyediaan besi dalam diet, absorpsi, transportasi serta distribusinya dalam tubuh.

ABSORBSI BESI
Absorbsi besi tergantung dari jumlah besi dalam diet dan kebutuhan tubuh. Pada makanan sehari-hari umumnya mengandung kira-kira 15 mg besi dan hanya sekitar 1 mg besi (5-10%) akan ditransfer masuk dalam darah. Besi diserap di duodenum proximal, dan sebagian kecil di jejunum. Umumnya besi dalam makanan terdapat dalam bentuk non heme (dalam bentuk Fe3+). Ferri ini harus diubah menjadi bentuk ferro supaya bisa diabsorbsi dalam usus. Besi dalam bentuk ferri (Fe3+) direduksi menjadi bentuk ferro (Fe2+). Kemudian besi Fe2+ diangkut kedalam enterosit. Besi dalam enterosit, kemudian sebagian disimpan dalam bentuk feritin dan sisanya dibawa menembus membran basolateral. Didalam plasma, bentuk Fe2+ diubah menjadi Fe3+ yang kemudian berikatan dengan transferin yang merupakan protein pengangkut besi dalam plasma darah. Cairan lambung meningkatkan absorbsi besi, sedangkan cairan pankreas menurunkan absorbsi besi. Beberapa bahan dapat mempengaruhi absorbsi besi. Vitamin C dan daging dapat meningkatkan absorbsi besi, sedangkan phytate dan tannin menghambat absorbsi besi.

SIKLUS BESI
Sebanyak 75% dari kompleks transferrin-besi diangkut ke prekursor eritrosit di sumsum tulang yang memiliki banyak reseptor untuk transferin. Sebanyak 80–90% molekul besi yang masuk ke dalam prekursor eritrosit akan dibebaskan, sedangkan transferin akan kembali ke dalam sirkulasi. Besi yang telah dibebaskan akan masuk ke dalam mitokondria untuk
1

diproses bergabung dengan protoporfirin menjadi heme, sisanya tersimpan dalam bentuk feritin. Eritrosit yang matang akan masuk ke sirkulasi darah dan sesudah 120 hari eritrosit ditelan oleh makrofag dalam RES. Metabolisme besi terutama bersumber dari hemoglobin eritrosit tua yang dihancurkan oleh makrofag sistem RES. Pada RES besi dikeluarkan dari hemoglobin dan kembali ke plasma, kemudian diikat oleh transferrin. Kecepatan pelepasan besi ke dalam sirkulasi oleh makrofag lebih cepat terjadi pada pagi hari, sehingga kadar besi plasma menunjukkan variasi diurnal. Pada keadaan normal tubuh akan kehilangan 1 mg besi perhari dan akan digantikan melalui absorpsi. Besi dari sumber makanan yang diserap duodenum berkisar 1–2 mg, sebanyak itu pula yang dapat hilang karena deskuamasi kulit, keringat, urin dan tinja.

PENGUKURAN KANDUNGAN BESI PADA TUBUH Pemeriksaan kadar besi dalam serum meliputi pemeriksaan serum iron (SI), Total Iron Binding Capacity (TIBC), saturasi transferrin, ferritin serum, transferrin serum dan hemosiderin dari hapusan sumsum tulang. Persiapan untuk tes SI dan TIBC : 1. Sampel tes   Pasien disarankan untuk menghentikan obat oral yang mengandung besi minimal 12 jam sebelum pengambilan sampel Sampel yang bisa dipakai dalam pengambilan sampel adalah serum atau plasma heparin. EDTA, oksalat dan sitrat bisa mengganggu uji ini. 2. Peralatan Glassware Untuk menghindari kontaminasi dengan besi, sebaiknya digunakan tabung plastik disposable , ukuran 12x75 mm. Jika menggunakan glassware, maka harus dicuci dengan detergent, kemudian rendam dalam HCl 2 mol/L selama 6-12 jam, selanjutnya bilas dengan iron-free water.
2

3. Iron-free water. Biasanya memakai deionized water. Dikatakan bebas besi dimana air harus mengandung minimal 0,2 µmol besi/liter.

SERUM IRON I. Pemeriksaan Serum Iron yang direkomendasikan ICSH (International Council for Standardization in Haematology) Prinsip : Besi dilepaskan dari ikatannya dengan transferrin, direduksi dari bentuk Fe3+ menjadi Fe2+ dan serum protein dipresipitasi dengan menggunakan reagen asam campuran (mixed acid reagent). Besi ferro dalam supernatan direaksikan dengan larutan kromogen akan membentuk komplek warna (pink solution) dan dibaca dengan fotometer pada panjang gelombang 562 nm. Reagen : 1. Protein precipitant 100 g/L trichloracetic acid (0,61 M) dan 30 ml/L thioglycollic acid dalam 1 mol/L HCl. Larutan ini stabil selama 2 bulan dalam gelap. Karena pertimbangan masalah kesehatan dan keamanan pada penggunaan thioglycollic acid, maka ascorbic acid digunakan sebagai alternatif agen reduktor, meskipun mungkin lebih dipengaruhi oleh adanya copper. Dalam 45 ml HCl 1 mol/L ditambahkan 5 ml larutan trichloracetic acid 6,1 mol/L, kemudian ditambahkan lagi dengan 200 mg ascorbic acid kemudian dicampur. 2. Larutan kromogen 25 mg ferrozine dilarutkan dalam 100 ml sodium acetate 1,5 mol/L Larutan ini dapat stabil hingga 4 minggu bila disimpan dalam gelap. 3. Larutan standar besi (80 μmol/l) a. Tambahkan 200 μL HCl 2 mol/L dalam 22,1 ml deionized water, dan campur. b. Tambahkan 100 μL larutan standar besi (1000 μg Fe/mL dalam 1 % HCl) dan campur. c. Stabil hingga 2 bulan pada suhu ruangan

3

Cara kerja : 1. Masukkan ke dalam tabung, masing-masing 0,5 ml serum, 0,5 ml larutan kerja standar besi, dan 0,5 ml iron-free water sebagai blanko. 2. Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 0,5 ml protein precipitant, kemudian campur, selanjutnya diamkan selama 5 menit 3. Sentrifugasi tabung yang berisi serum dengan microfuge pada 13.000 rpm selama 4 menit. untuk mengendapkan protein dan mendapatkan supernatan. Ambil 0,5 ml supernatan dan 0,5 ml campuran pada tabung lainnya. Kemudian pada masing-masing tabung ditambahkan 0,5 ml larutan kromogen dan campur dengan baik. 4. Tunggu selama 10 menit 5. Ukur absorbans pada panjang gelombang 562 nm. 6. Penghitungan : Serum iron = Atest-Ablanko Astandar-A blanko Jika tak ada microfuge, gunakan volume dobel untuk reagen dan serum dalam tabung 3 ml dan sentrifus pada 1500 g selama 15 menit Terbentuknya komplek warna akan terlambat, bila menggunakan plasma EDTA, dan harus ditunggu selama 15 menit sebelum diukur absorbansnya. Nilai rujukan SI : 10-30 μmol/L II. Pemeriksaan Serum Iron di Laboratorium Patologi Klinik RSU Dr. Soetomo Metode yang digunakan : Colorimetric-Ferrozine Prinsip : Ikatan antara ferri (Fe3+) dan transferin dilepaskan oleh guanidine dalam suasana pH 4,8. Selanjutnya asam askorbat akan mereduksi ion ferri (Fe3+) menjadi ferro (Fe2+), kemudian Fe2+ akan bereaksi dengan ferrozine membentuk komplek berwarna. Reagen :  Reagen 1 : R1 o Acetate buffer, pH 4,8 o Guanidine hydrochloride o Thiourea  Reagen 2 : R2 o Ascorbic acid
4

x 80

100 mmol/L 5 mol/L

52,5 mmol/L

 

Reagen 3 : R3 o Ferrozine Standar : Std o Iron 100 1 μg/dL mg/L 41 mmol/L

17,9 μmol/L Sampel : serum atau plasma heparin Cara kerja : 1. Larutan kerja (Working reagent) : Larutkan 1 sendok takar R2 dalam 50 ml R1. Tunggu hingga tercampur dengan baik. Larutan ini stabil selama 2 minggu pada suhu 2-8o C, dan 3 hari pada suhu 20-25o C. 2. Kemudian lakukan sesuai tabel dibawah ini : Blanko Larutan kerja Akuades Standar Sampel 500 μL 150 μL Standar 500 μL 150 μL Sampel 500 μL 150 μL

3. Campurkan dan baca absorbans (A) pada panjang gelombang 560 nm setelah 50 detik Blanko 4. Kemudian tambahkan : Blanko Reagen 3 (R3) 25 μL Standar 25 μL Sampel 25 μL Standar A1 Sampel A2

5. Campurkan dan baca absorbance (A) pada panjang gelombang 560 nm setelah 325 detik Blanko Standar A3 Sampel A4

6. Penghitungan : A4-A2 A3-A1
X konsentrasi standar

5

Nilai rujukan : a. Bayi baru lahir b. Bayi c. Anak-anak d. Wanita dewasa e. Laki-laki dewasa : 1 - 2,5 mg/L (17,9 – 44,8 μmol/L) : 0,4 – 1 mg/L (7,2 – 17,9 μmol/L) : 0,5 – 1,2 mg/L (9,0 – 21,5 μmol/L) : 0,5 – 1,7 mg/L (9,0 – 30,4 μmol/L) : 0,65 – 1,75 mg/L (11,6 – 31,3 μmol/L)

Metode ini linier sampai dengan konsentrasi 500 μg/L (5 mg/L atau 89,5 μmol/L)

TOTAL IRON BINDING CAPACITY (TIBC) I. Pemeriksaan TIBC yang direkomendasikan ICSH Dalam plasma, besi terikat pada tranferin, dan TIBC adalah mengukur protein tersebut. TIBC = serum iron + UIBC (Unsaturated Iron Binding Capacity) Nilai rujukan : 47- 70 μmol/L Prinsip : Pada serum ditambahkan besi yang berlebih (ferri klorid). Besi yang tidak terikat transferin akan diabsorbsi oleh magnesium carbonate, kemudian kadar besi serum diukur. Reagen : 1. Basic magnesium carbonate 2. Saturating solution (100 μmol Fe/L).  Tambahkan 17,7 ml deionized water, 100 μL HCl 1 mol/L, 100 μL larutan standar. (Saturating iron solution mengandung 5,6 μg Fe/mL) Campur  Cara kerja : 1. Masukkan 0,5 ml serum ke dalam tabung 2. Kemudian tambahkan 0,5 ml saturating iron solution, campur dengan hatihati, dan diamkan selama 15 menit pada suhu ruangan. 3. Tambahkan 100 mg light magnesium carbonate, tutup tabung dan bolak-balik tabung, diamkan selama 30 menit dengan sekali-kali diaduk. 4. Sentrifugasi tabung yang berisi serum dengan microfuge pada 13.000 rpm selama 4 menit. untuk mengendapkan protein dan mendapatkan supernatan. Stabil dalam 2 bulan pada suhu ruangan.

6

5. Periksa supernatan, jika masih sisa magnesium carbonate harus disentrifus ulang. 6. Ambil supernatannya sebanyak 0,5 ml dan perlakukan seperti pada pemeriksaan serum iron. 7. Hasil akhir dikalikan 2 Jika tak ada microfuge, gunakan volume dobel untuk reagen dan serum dalam tabung 3 ml dan sentrifus pada 1500 g selama 15 menit II. Pemeriksaan TIBC di Laboratorium Patologi Klinik RSU Dr. Soetomo Metode yang digunakan : saturasi Prinsip : TIBC dievaluasi setelah saturasi transferin oleh larutan besi, dan kelebihan besi akan diabsorbsi oleh magnesium hydroxide carbonate. Setelah disentrifus, konsentrasi besi dalam supernatan diukur. Reagen :  Reagen 1 : R1 o Iron saturating solution 500 μg/dL 5 mg/L 89,5 μmol/L  Reagen 2 : R2 o Magnesium hydroxide carbonate (1 sendok takar = 100 mg) Sampel : Serum, plasma heparin Cara kerja : 1. Sampel 0,5 ml dicampurkan dengan 1 ml reagen R1, diinkubasi selama 5 menit 2. Kemudian tambahkan 1 sendok takar ( kira-kira 100 mg) reagen R2, dan diinkubasi selama 20 menit, dengan sekali-kali dikocok. 3. Sentrifus selama 10 menit dengan 3000 rpm 4. Ambil supernatannya. 5. Periksa supernatan seperti pada penentuan SI. Dengan 1 bagian supernatan : 3 bagian reagen R1 (pada SI). Nilai rujukan :   Laki-laki dewasa : 2,6 – 3,9 mg/L ( 46,5 – 69,8 μmol/L) Wanita dewasa : 2,1 – 3,4 mg/L (37,6 – 60,9 μmol/L)

7

SATURASI TRANSFERIN Saturasi transferin ditentukan dengan rumus sebagai berikut : SI (μg/dL) TIBC (μg/dL) Harga normal : 20 - 45% FERITIN SERUM Metode ELISA Double Sandwich Prinsip : pemeriksaan feritin serum memakai metode ELISA dengan cara double sandwich. Antibodi dengan high affinity terhadap feritin (antiferitin Ig G) akan berikatan dengan feritin serum dan selanjutnya dilabel dengan enzim horseradish peroxidase dan dibaca absorbannya pada panjang gelombang 492 nm. Reagen : 1. Preparat antiferitin Ig G yang dikonjugasi dengan horseradish peroxidase 2. Larutan standar feritin. Dibuat dengan cara :  Encerkan human ferritin 200 µg/ml ke dalam air. Encerkan larutan feritin 200 µg/ml ke dalam 10 µl/ml dalam 0,05 mol/l larutan sodium barbitone (yang terdiri dari 0,1 mol/l NaCl, 0,02% NaN dan BSA 5 gr/dl), pH disesuaikan sampai pH 8 dengan menambah HCl 5 mol/l.   Bagi dalam 200 tabung kecil, masing-masing berisi 200 µl, tutup rapat dan tahan sampai 1 tahun pada suhu 40C Jika akan dipakai, encerkan dengan buffer B sampai 1000 µg/l dan siapkan larutan dalam range 0,2 – 25 µg/l (bandingkan dengan standar WHO untuk uji serum ferritin 94/572) 3. Buffer A : Phosphate-buffered saline pH 7,2 4. Buffer B : 5 gram BSA (Bovine Serum Albumin) dalam 1 liter buffer A 5. Buffer C : Carbonate buffer pH 9,6 6. Buffer D : Citrate phosphate buffer pH 5. 7. Larutan substrat x 100 %

8

Cara kerja : 1. Lapisi microtitre plate, dengan cara :     Preparat antiferitin Ig G diencerkan dengan 2 µg/ml buffer C, tambahkan 200 µl ke dalam tiap-tiap sumuran. Tutup dan inkubasi semalam pada suhu 40C. Kosongkan sumuran dengan cara dibalik dan di-tapping pada handuk kering. Tambahkan 200 µl 0,05% BSA dalam buffer C, diamkan 30 menit dalam suhu ruangan. Cuci tiap sumuran dengan buffer A sampai 3x. plate dapat disimpan sampai 1 minggu pada tempat kering dan suhu 40C 2. Encerkan 50 µl serum pasien dengan 1 ml buffer B. 3. Tambahkan 200 µl larutan standard dan serum pasien ke dalam tiap sumuran dalam waktu 20 menit. 4. Tutup dan diamkan selama 20 menit pada suhu kamar dan jauhkan dari sinar matahari 5. Kosongkan sumuran dan cuci 3x dengan buffer A. 6. Tambahkan 200 µl preparat konjugasi antiferitin Ig G dengan horseradish peroxidase yang sudah diencerkan, tutup dan diamkan selama 2 jam pada suhu kamar. 7. Cuci 3x dengan buffer A 8. Tambahkan 200 µl larutan substrat pada tiap-tiap sumuran, inkubasi selama 30 menit. 9. Tambahkan 50 µl asam sulfur 4M pada tiap-tiap sumuran untuk menghentikan reaksi 10. Tunggu 30 menit dan baca absorbannya pada 492 nm dengan microtitre plate reader, atau ambil 200 µl larutan dari tiap sumuran dan masukkan dalam 800 µl air, baca dengan fotometer. Metode IRMA (Immunoradiometric Assay) Prinsip : Antibodi yang dilabel dengan radioaktif yang berlebih direaksikan dengan ferritin. Ferritin yang tidak berikatan dengan antibodi akan dihilangkan dengan immunoadsorbent. Nilai rujukan : 35 – 300 µg/l (pria dewasa) 20 – 100 µg/l (wanita dewasa) Perlu pertimbangan yang hati-hati untuk menentukan kadar serum ferritin yang tinggi, primer disebabkan karena kenaikan besi atau karena kerusakan jaringan. Ferritin merupakan suatu protein fase akut dimana ferritin akan dilepaskan oleh hati ke sirkulasi pada keadaan penyakit hepatoseluler, tumor/keganasan hati, alkoholisme dan pemakaian kontrasepsi oral.
9

HEMOSIDERIN Penilaian besi secara langsung dari dua depot besi yaitu sumsum tulang dan hati, lebih disukai dari sumsum tulang. Penilaianhemosiderin dapat memakai metode Prussian Blue (tampak berwarna biru) atau membuat hapusan tebal tanpa pengecatan (tampak berwarna keemasan). Prinsip : reagen Prussian blue akan mewarnai besi menjadi berwarna biru terang atau hijau, sedangkan inti dan eritrosit tercat warna merah atau merah muda oleh neutral red. Bahan dan alat : 1. Gelas obyek dan bahan sampel, dibuat hapusan darah 2. Metanol untuk fiksasi 3. Larutan potassium ferrocyanide 10 g/l dalam 0,1 mol/l HCl 4. Larutan neutral red atau eosin 5. Larutan HCl 3 mol/l Cara kerja : 1. Hapusan darah difiksasi dengan metanol, tunggu 10 – 20 menit 2. Masukkan hapusan dalam larutan potassium ferrocyanide selama 10 menit pada suhu 200C. 3. Cuci dengan air kran selama kira-kira 20 menit, kemudian bilas dengan distilled water. 4. Cat dengan neutral red atau eosin selama 10-15 detik 5. Tuangi dengan HCl 3 mol/l dan cuci dengan air kran.

10

Nilai rujukan : Kriteria gradasi pengecatan besi (Prussian blue) pada aspirasi sumsum tulang GRADASI 0 1 KRITERIA Tak tampak granula besi Granula-granula kecil pada sel retikulum tampak hanya dengan minyak emersi 2 Sedikit granula-granula kecil yang dapat dilihat dengan lensa kekuatan lemah 3 Sejumlah granula-granula kecil dalam semua partikel sumsum tulang 4 5 6 Granula-granula besar dalam kelompok kecil Granula-granula besar dalam kelompok besar Deposit yang sangat besar yang mengaburkan gambaran sumsum tulang secara rinci 762 ± 247 1618 ± 464 3681 ± 1400 406 ± 131 223 ± 75 KANDUNGAN BESI 43 ± 23 130 ± 50±

INTERPRETASI HASIL Konsentrasi serum iron pada kedaan normal memperlihatkan fluktuasi yang lebar dari hari ke hari dan variasi diurnal. Kadar tertinggi pada pagi hari dan terendah pada malam hari. Namun pada keadaan patologis, baik pada defisiensi besi ataupun kelebihan besi, fluktuasi ini cenderung menghilang. Serum iron (SI) dan terutama saturasi transferin, mencerminkan suplai besi ke jaringan pada saat sampling, dan tidak memberikan banyak informasi tentang status besi tubuh. Misalnya pada perjalanan yang progresif defisiensi besi, kadar serum iron tidak terpengaruh hingga pada tahap cadangan besi tubuh habis. Sebaliknya, peningkatan cadangan besi tubuh pada anemia penyakit kronik, biasanya disertai dengan penurunan kadar serum iron.

11

Tabel. Interpretasi SI dan TIBC Measurement Serum Iron (SI) Increased Iron overload Liver disease Chronic alcoholism Hypoplastic anaemia Haemolysis/ineffective Iron deficiency erythropoiesis Pregnancy Oral contraceptive Decreased Iron deficiency Infection/inflamation Anaemia of chronic disorder

Serum TIBC

Iron overload Infection/inflamation Anaemia of chronic disorder

Berbeda dengan anemia defisiensi besi, pada anemia karena penyakit sistemik ditemukan penurunan serum iron dan serum TIBC, disertai persen saturasi transferin sangat menurun dibanding pada anemia defisiensi besi. Peningkatan kadar serum iron dan persen saturasi transferin sebagian besar disebabkan penyakit hati atau kegagalan sumsum tulang menggunakan besi secara efektif. Meskipun demikian, peningkatan persisten dari persen saturasi TIBC kemungkinan merupakan indikasi awal dari peningkatan risiko uptake besi oleh jaringan dan perkembangan dari kelebihan besi. Pada anemia defisiensi besi, SI menurun, TIBC/ transferrin meningkat, saturasi transferrin menurun dan ferritin menurun. Pada anemia karena penyakit kronis, SI menurun, TIBC normal atau menurun, saturasi transferin bisa normalatau menurun dan ferritin normal atau meningkat. Pada keadaan kelebihan besi, SI dan TIBC meningkat, saturasi transferrin meningkat dan ferritin meningkat. Sedangkan untuk pemeriksaan hemosiderin dengan pengecatan Prussian blue jarang dilakukan karena bersifat invasif. Nilai SI normal mempunyai fluktuasi yang lebar dan memperlihatkan variasi diurnal serta tidak terpengaruh sampai cadangan besi habis. Penurunan SI terjadi pada anemia defisiensi besi, penyakit kronis dan selama respon fase akut. Sedangkan TIBC meningkat pada anemia defisiensi besi dan kehamilan dan menurun pada infeksi dan keganasan.

12

DAFTAR PUSTAKA

Bakta IM, Hematologi Klinik Ringkas. EGC. Edisi 1. 2007; 3:26-44 Chanarin, Laboratory Haematology An Account of Laboratory Techniques. Churchill Livingstone. 1989; 4:83-86 Greer John P et al, Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott Williams & Wilkins. 11th edition. 2004 ; 28: 980-987 Joseph J. Mazza, Manual of Clinical Hematology. Lippincott Williams & Wilkins. Third edition. 2002;2: 17-21 Lewis Bain Bates, Dacie and Lewis Pratical Haematology. Churchill Livingstone Elsevier. 2006 ; 7:131-153 Lea and Febiger, Wintrobe Clinical Hematology. 8th edition. 1981 ; 152-160, 605-41, 646-52, 654-9, 667-74. Rolf H. Iron Metabolism, Iron Deficiency and anaemia. J Sysmex Int. 2003;13:65-74

13