BIOQUIMICA PRÁCTICA

Dra. LUPE JIBAJA

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

PRACTICAS DE BIOQUIMICA

CARBOHIDRATOS; PROTEINAS Y LIPIDOS.

2007-2008

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BIOQUIMICA PRÁCTICA

Dra. LUPE JIBAJA

INDICE DE CONTENIDOS CAPÍTULO I..................................................................................................................................4 1. CARBOHIDRATOS...................................................................................................................4
1.1 Reacciones de reconocimiento De hidratos de carbono............................................................4
1.1.1 Reacción con α-naftol..............................................................................................................................4 1.1.2 Prueba con naftorresorcina......................................................................................................................5

1.2 Reacciones de reconocimiento de hidratos de carbono reductores.........................................6
1.2.1 Prueba con el hidróxido...........................................................................................................................6 1.2.2 Reacción con el licor de Fehling.............................................................................................................7 1.2.3 Reacción con sales de bismuto Nylander...............................................................................................8 1.2.4 Reacción con Fenilhidrazina....................................................................................................................9 1.2.5 Reconocimiento de la fructosa en una disolución (reacción de A.F. Selivánov)..................................13 1.2.6 Reacción de reconocimiento de las pentosas con orcina......................................................................13 1.2.1 Reacción con floroglucina.....................................................................................................................14 1.2.2 Reacción de reconocimiento de la desoxirribosa...................................................................................15

1.3 Disacáridos.................................................................................................................................15
1.3.1 Reacción de reconocimiento de la sacarosa...........................................................................................15 1.3.2 Reacciones de reconocimiento de la maltosa y lactosa.........................................................................16 1.3.3 Reacciones de reducción de iones metálicos........................................................................................17 1.3.4 Reacción con la fenilhidrazina..............................................................................................................17

1.4 Polisacáridos..............................................................................................................................18
1.4.1 Almidón.................................................................................................................................................18

CAPÍTULO II..............................................................................................................................22 2 LOS LÍPIDOS Y SUS METABOLITOS................................................................................22
2.1 Reacciones de reconocimiento de las grasa.............................................................................22
2.1.1 Reacción de la grasa y el aceite con el Sudán III..................................................................................22 2.1.2 Determinación de la glicerina en las grasas...........................................................................................22 2.1.3 Solubilidad de las grasas........................................................................................................................23 2.1.4 Determinación de las constantes de la grasa..........................................................................................24 2.1.5 Determinación de la temperatura de fusión ..........................................................................................24 2.1.6 Determinación del número acídico........................................................................................................26 2.1.7 Determinación del índice de iodo..........................................................................................................27 2.1.8 Determinación del número (índice) de saponificación..........................................................................28 2.1.9 Emulsificación de las grasas..................................................................................................................30 2.1.10 Hidrólisis de los glicéridos con lipasa.................................................................................................31

2.2 Fosfolípidos................................................................................................................................33
2.2.1 Aislamiento de los fosfolípidos.............................................................................................................33 2.2.2 Aislamiento de las lecitinas de la yema de huevo.................................................................................33 2.2.3 Detección de los ácidosgrasos superiores..............................................................................................33

CAPÍTULO III.............................................................................................................................35 3 PROTEINAS.............................................................................................................................35
3.1 Reacciones De Reconocimiento De Las Proteínas...................................................................35 3.2 Reacciones De Precipitación De Las Proteínas.......................................................................35

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3.2.1 Salificación de las proteínas .................................................................................................................35 3.2.2 Precipitación de las proteínas con sulfato amónico...............................................................................37 3.2.3 Precipitación de las proteínas con cloruro sódico y sulfato de magnesio..............................................38 3.2.4 Purificación de las proteínas de los cristaloides con método de diálisis...............................................39 3.2.5 Precipitación de las proteínas con iones de metales pesados................................................................40 3.2.6 Precipitación de las proteínas con ácidos minerales.............................................................................41 3.2.7 Precipitación de las proteínas con ácidos orgánicos..............................................................................42 3.2.8 Precipitación de las proteínas con alcohol y acetona.............................................................................43

3.3 Reacciones de reconocimiento de las proteínas.......................................................................44
3.3.1 Descubrimiento de los enlaces peptídicos en las moléculas de proteínas (reacción del biuret)............45 3.3.2 Reacción con el ácido pícrico................................................................................................................47

3.4 Reacciones De Reconocimiento De Los Aminoacidos........................................................48
3.4.1 Reacción del triptófano..........................................................................................................................48 3.4.2 Reacción de la arginina..........................................................................................................................49 3.4.3 Reacción de los aminoácidos que contienen azufre..............................................................................50 3.4.4 Reacción de reconocimiento del glutatión.............................................................................................51 3.4.5 Diazorreacción de reconocimiento de la tirosina, el triptófano y la histidina.......................................53 3.4.6 Descubrimiento del componente de hidrato de carbono en las proteínas..............................................54

3.5 Proteínas conjugadas................................................................................................................54
3.5.1 Aislamento de la desoxirribonucleoproteina.........................................................................................54 3.5.2 Obtención de la nucleoproteína a partir de la levadura.........................................................................56 3.5.3 Hidrólisis de la nucleoproteína..............................................................................................................57 3.5.4 Detección de las proteínas sencillas......................................................................................................57 3.5.5 Detección de las pentosas......................................................................................................................58

3.6 Glicoproteínas............................................................................................................................59
3.7.1 Aislamiento de la mucina de la saliva...................................................................................................59

3.8 Métodos de determinación de la cantidad de proteínas en los tejidos y de algunos productos de su metabolismo.........................................................................................................60
3.8.1 Determinación cuantitativa de la proteína mediante la reacción del biuret...........................................61 3.8.2 Determinación cuantitativa de la proteína en los líquidos biológicos con ayuda del ácido nítrico.......61 3.8.3 Determinación cuantitativa de la proteína según el método de Lowry.................................................63

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1 Reacciones de reconocimiento De hidratos de carbono 1.Α-naftol. En el primer tubo de ensayo se añaden de 4 a 6 de disolución  Bibliografía: Chechetklin. El quimismo de la reacción furfural a partir de las pentosas. Ácido sulfúrico.1 Reacción con α-naftol Esta reacción es general para hidratos de carbono y se aplica para detectar la presencia de estos en los materiales biológicos. Timol. LUPE JIBAJA CAPÍTULO I 1.. 5-hidroximetilfurfural a partir de las hexosas. CARBOHIDRATOS 1. A. ∗ se reduce al hecho de que mediante la acción del ácido sulfúrico concentrado se forma C C O C C O C H HO H2 C C C C O C C C H Furfural 5-Hidroximetilfurfural Al combinarse los últimos con α-naftol surge una coloración violeta característica y al combinarse con timol. 4 . disolución al 1%.2% .En dos tubos de ensayo se vierten 2 ml de disolución de sacarosa en cada uno.. Marcha de los trabajos.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra.Soporte con tubos de ensayo Reactivos.V. disolución al 1% en alcohol etílico. Sacarosa. Instrumentos. una coloración roja.1.. “Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral”.. Editorial Mir Moscú. disolución al 0.

1 o 2 ml de ácido sulfúrico concentrado sin mezclarlo con la capa acuosa. Reactivos. disolución alcohólica al 1%.Glucosa. 5 . Acido clorhídrico concentrado. ∗ HO C C 2 C C C C C C C C C O H HO C C C C C C C C C C OH HO C C C C C C C C C OH + OH (CHOH)4 C O OH C (CHOH)4 O C OH C C HO C C C C C C C C C O C C C C C C C C C C OH (CHOH)4 O C OH C Instrumentos. Así. disolución al 5%. forma derivados de dinaftilmetano o xantina. por la pared. Editorial Mir Moscú..Soporte con tubos de ensayo. Benceno. LUPE JIBAJA de α-naftol y en otro. “Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral”. igual cantidad de disolución de timol. Éter. al ácido glucorónico al condensarse con naftorresorcina.V.1.. Naftorresorcina. En ambos tubos de ensayo se vierten con cuidado. En el contacto con las capas aparece una coloración violeta (en el caso de α-naftol) y roja (en el caso de timol). A.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra.2 Prueba con naftorresorcina La reacción se basa en la capacidad de los hidratos de carbono de condensarse con los sistemas aromáticos..  Bibliografía: Chechetklin. formando sustancias coloreadas. 1.

2. La capa etérica (bencénica) se tiñe de color verde azulado.1 Prueba con el hidróxido Cúprico (II). las sales de óxido de bismuto. reacción de Trommer En disolución alcalina los mono y disacáridos reductores reducen el hidróxido cúprico (II) a óxido cuproso (I): Glucosa O H11C5 C H Cu(OH) 2 H11C5 C OH ácido glucónico O 2CuOH H 2O CuO 2 H2 O Instrumentos. se denominan reductores. 6 . La mezcla se calienta con cuidado y se hierve durante 1 min. reduciendo a su vez las sales de óxido cúprico (valencia +2) a sales de óxido cuproso (valencia +1).BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. hasta bismuto metálico. Estos azúcares en medio alcalino tienen la capacidad de oxidarse. En esto se basa una serie de métodos de determinación cualitativa y cuantitativa de los hidratos de carbono. mientras que la xilosa y la arabinosa proporcionan una coloración azul oscura y los ácidos urónicos. ∗ 1.. se añade 1 ml de disolución de naftorresorcina y 1 ml de ácido clorhídrico concentrado. Luego se enfría.2 Reacciones de reconocimiento de hidratos de carbono reductores Los hidratos de carbono cuya molécula contiene un grupo carbonilo libre.   Bibliografía: Chechetklin.En el tubo de ensayo se vierten de 5 a 6 ml de disolución de glucosa. Editorial Mir Moscú. “Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral”.Soporte con tubos de ensayo.V. se añade de 1 a 2 ml de éter o benceno y agita. Las sales de plata.. hasta plata metálica. A. una coloración violeta. LUPE JIBAJA Marcha de los trabajos.. ∗ 1. Igual coloración den la galactosa y la manosa.

Sulfato cúprico.. Hidróxido sódico. Por eso durante el calentamiento. La capa superior del líquido se calienta hasta ebullición. ∗ 1.Glucosa. agitándolo. los que oscurece la reacción principal y constituye un defecto del método: Cu(OH)2 CuO + H2O. Este último se encuentra en estado combinado y forma parte del reactivo de Fehling. ya que la reacción entre el hidrato de carbono reductor y el hidróxido cúprico transcurre cuantitativamente.2 Reacción con el licor de Fehling La reacción con el licor o reactivo de Fehling se basa en el mismo principio que la reacción de Trommer. disolución al 10%. el precipitado de hidróxido cúprico (II) formado se disuelve. la disolución de sulfato cúprico. se añade. En presencia de la glucosa. El exceso del último durante el calentamiento pierde agua y se transforma en óxido cúprico negro. La diferencia consiste en que en las reacciones no se emplea hidróxido cúprico libre. coloreando el líquido de color azul claro. disolución al 1%. Por lo tanto.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. LUPE JIBAJA Reactivos. Al calentar esta disolución. El licor de Fehling representa un compuesto complejo de cobre con tartrato de sodio y potasio de color azul. en la reacción de Trommer debe evitarse el exceso de sulfato cúprico. disolución al 1%. no  7 .En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 ml de disolución de glucosa. gota a gota. Disolución de glucosa no se añade. Marcha de los trabajos.2. En su composición el ion cobre en estado de oxidación «+2» se encuentra en forma de un compuesto complejo con tartratos. Se forma un precipitado de hidróxido cúprico de color azul claro. La aparición de un precipitado amarillo (hidróxido cuproso (I)) y luego rojo (óxido cuproso) indica que la reacción de Trommer es positiva. incluso con exceso de reactivo dado. se forma un precipitado negro de óxido cúprico.. un volumen igual de disolución de hidróxido de sodio y. En otro tubo de ensayo se mezclan de 2 a 3 ml de disolución de hidróxido de sodio con varias gotas de disolución de sulfato cúprico.

A 1 o 2 ml de disolución de glucosa se añaden igual volumen de reactivo de Fehling y se agita.. un precipitado amarillo de hidróxido cuproso CuOH o bien u precipitado rojo de óxido cuproso Cu2O. Antes de utilizar las disoluciones 1 y 2 se mezclan en proporciones iguales). Aparece. el volumen se lleva hasta la raya de enrase. forma hidróxido de bismuto. en prece4ncia de hidróxido de sodio. Reactivos. Al reaccionar con la glucosa. primero en una pequeña cantidad de agua destilada y al disolverse os cristales. 1. se añaden 62. 173 g de sal de Rochelle (tartrato de sodio y potasio) ..2. 5H2O).BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. En un matraz de 500 ml se disuelven. Instrumentos. La capa superior del líquido se calienta hasta la ebullición. En un matraz de 500 ml se disuelven 34. Marcha de los trabajos. en pequeña cantidad de agua destilada.5 g de sosa cáustica disuelta en 100 ml de agua destilada.Soporte con tubos de ensayo. Bi(OH) 2NO 3 NaOH Bi(OH) 3 NaNO 3 8 . el hidróxido de bismuto se reduce a bismuto metálico y el líquido adquiere un color negro.Glucosa. Este último se encuentra en estado combinado con el tartrato de sodio y potacio.65 g de cristales no aireados de vitriolo azul (CuSO4 . Reactivo de Fehling (preparación: disolución 1. En la composición del reactivo de Nylander. Disolución 2. LUPE JIBAJA se forma el precipitado negro CuO y no oscurece la reacción con pequeñas cantidades de glucosa. se mezcla bien y el volumen se lleva hasta la raya de enrase. al igual que en la reacción de Trommer... análogo al de Fehling.3 Reacción con sales de bismuto Nylander Para detectar los azucares reductores se emplean frecuentemente las sales de bismuto. disolución al 1%. entra nitrato dibásico de bismuto que.

A. que producen cristales de color amarillo. de forma característica. lo que reduce a la formación de compuestos poco solubles en agua: osazonas. En la asegunda etapa.Glucosa. 1. Al reaccionar los monosacáridos con fenilhidrazina. La tercera sustitución molécula de entra en reacción de con el grupo carbonilo recién formado. La reacción de formación de osazonas transcurre en tres etapas. Editorial Mir Moscú. con la fenilhidrazona formada reacciona otra molécula de fenilhidrazina y.2.Soporte con tubos de ensayo. La  Bibliografía: Chechetklin. LUPE JIBAJA O H11C5 C H 2Bi(OH) 3 H11C5 C O 2Bi OH 3H2O Instrumentos.. con fenilhidrazonas soluble sen agua (reacción de sustitución).. disolución al 1%. ∗ Marcha de los trabajos.A 2 ml de disolución de glucosa se añade 1 ml de reactivo de Nylander y se hierve durante 2 o 3 min. transforma fenilhidrazina el grupo hidroxilo en grupo carbonilo. Reactivo de Nylander (preparación: 2 g de nitrato dibásico de bismuto y 4 g de tartrato de sodio y potacio (sal de Rochelle) se disuelve en 100ml de la sosa cáustica al 10% y se hierven hasta disolverse la mayor parte de la sal de bismuto. oxadándola. El liquido oscurece debido a la formación de un precipitado negro de bismuto metálico. Reactivos.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. 9 . “Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral”. El precipitado formado se enfría y se separa por filtración). en la primera etapa se forman fenilhidrazonas solubles en agua (reacción de sustitución). En la segunda etapa.4 Reacción con Fenilhidrazina Una particularidad importante de los monosacáridos consiste en su capacidad de entrar en reacción con fenilhidrazina y formar fenilhidrazonas y osazonas..V..

10). de los cuales se forman las osazonas. de la disolución. Luego se coloca el tubo de ensayo en el vaso con hielo. solubilidad y actividad óptica.Glucosa. 10 .. punto de fusión. se añade 0. Portaobjetos y cubreobjetos. de la disolución precipitan cristales de osazona. Mezcla de clorhidrato de fenilhidrazina cristalino y acetato de sodio anhidro (2 : 3) Marcha de los trabajos.5 g de mezcla de clorhidrato de fenilhidrazina y acetato de sodio. Baño de María..En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 ml de disolución de glucosa. Por eso. Estos últimos se observan bajo el microscopio. en el baño de María hirviendo. Las osazonas de diferentes monosacaridos se distinguen por la forma se utilizan para aislar los monosacáridos distinguir unos azúcares de otros (fig. Al enfriarse lentamente. como también de los para cristales. estas propiedades Instrumentos. Microscopio.. LUPE JIBAJA forma de los cristales de osazonas es variable y depende de la estructura de los monosacáridos. Reactivos.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. Vaso con hielo. Pipeta. disolución al 1%.Soporte con tubos de ensayo. se agita y se calienta durante 5 min.

galactosa.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. LUPE JIBAJA Ilustración 1. adquiere una coloración roja intensa y los cristales se desprenden sólo después de diluirlo con agua destilada. xilosa Cuando se forma glucosazona bajo el microscopio se ven finos haces característicos. formados por finos cristales de osazona.lactosa. Si el líquido esta muy concentrado.-Cristales de osazonas de mono y disacáridos: Fila superior-glucosa. maltosa. arabinosa: fila inferior. 11 . como también cristales suelto sen formad e agujas finas. Su punto de fusión es 208º C.

BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. LUPE JIBAJA I O C H HO H H C C C C H OH H + N H2N NH H HO H H C C C C C H OH H OH OH NH OH OH + H2O CH2OH Glucosa Fenilhidrazina CH2OH Fenilhidrazona de la Glucosa II N C H HO H H C C C C H OH H NH C H2N + N NH H O H OH OH NH NH2 + H HO H H C C C C OH OH NH3 + Anilina CH2OH CH2OH III N C H HO H H C C C C H O H OH OH NH C H2N + N H N H NH NH H HO H H C C C C NH + OH OH H2O CH2OH CH2OH Osazona de la Glucosa . 12 .

Reactivos.5 Reconocimiento de la fructosa en una disolución (reacción de A.Soporte con tubos de ensayo.Fructuosa. disolución al 1%.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra.F. 1. Marcha de los trabajos. se añaden 2 ó 3 gotas de disolución.. Baño de María.6 Reacción de reconocimiento de las pentosas con orcina Bajo la acción del ácido clorhídrico concentrado las pertosas.2.En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 ml de reactivo de Selivánov. mediante el calentamiento de la fructosa con un ácido. se deshidratan y se transforman en furfural. de fructosa y se calienta de 1 a 2 min en el baño de María hirviendo. si en la disolución a investigar están presentes dichos hidratos de carbono. La reacción se basa en la formulación del 5hidroximetilfurfural. Este último se condensa con la orcina 13 . esta reacción tiene lugar también con la glucosa. En el proceso de la reacción el precipitado y la coloración deberán aparecer no más tarde que a los 20 ó 30 segundos desde el inicio de la ebullición. Se observa la coloración roja del líquido. El 5hidroximetilfurfural da con la resorcina (meta-dihidroxibenceno) un producto de condensación de color rojo. LUPE JIBAJA 1. la concentración del ácido clorhídrico no deberá sobrepasar el 12%.05 g de resorcina se disuelven en 100 ml de ácido clorhídrico al 20%). En el caso de ebullición prolongada. Instrumentos.. Por eso.2. Las aldohexosas también dan esta reacción. pero transcurre más lentamente y en condiciones especiales (temperatura y acidez del medio).. sobre todo va bien con la fructosa y con aquellos azúcares complejos que por hidrólisis dan fructosa (sacarosa. Selivánov) Esta reacción se aplica especialmente para el reconocimiento de las cetosas. inulina). maltosa y sacarosa. Reactivo de Selivánov (preparación: 0. al calentarse.

Floroglucina cristalina. da color rojo guinda. Espátula..En un tubo de ensayo se vierte 1 ml de disolución de pentosa e igual volumen de reactivo de orcina.1 Reacción con floroglucina Durante el calentamiento de las pentosas con HCl. de floroglucina. el cual al condensarse con la floroglucina (trihidroxibenceno).Pentosa (arabinosa o xilosa). La mezcla se calienta en el baño de María hirviendo durante 20 min. concentrado. pero después de un calentamiento más prolongado. disolución al 1%.2. Disolución al 1%. se añade igual volumen de ácido clorhídrico concentrado y varios cristales una coloración roja.En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 ml de disolución de pentosa o una pequeña cantidad de serrín de madera. 1.Pentosa (arabinosa o xilosa). Pipeta. Durante el calentamiento aparece Acido clorhídrico 14 . Marcha de los trabajos. LUPE JIBAJA (metildihidroxibenceno) en presencia de trazas de cloruro férrico (o + 3 y forma un compuesto que da coloración verde Instrumentos.. Baño de María. Reactivo de orcina que se prepara disolviendo 0..Soporte con tubos de ensayo. Reactivos. Marcha de los trabajos.. El tubo de ensayo se coloca en el baño de María Caliente..1 g de cloruro férrico.2 g de orcina en 100 ml de ácido clorhídrico al 30% y añadiendo 0.. La coloración verde la proporciona también los ácidos urónicos.Soporte con tubos de ensayo. Reactivos. Aparece coloración verde de la disolución.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. Instrumentos. éstas se transforman en furfural.

1 Reacción de reconocimiento de la sacarosa La sacarosa es un disacárido no reductor y durante la hidrólisis (por ácido o enzimática) su molécula se descompone en glucosa y fructosa: 15 .2 Reacción de reconocimiento de la desoxirribosa Las 2-desoxipentosas. Baño de María. aldehído hidroxilevulínico y otros cromógenos afines que se condensan con las aminas aromáticas formando compuestos de color azul. en particular la desoxirriborsa.Soporte con tubos de ensayo.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra.. Marcha de los trabajos. se disuelve en una mezcla de 2.Desoxitribosa. El contenido del tubo de ensayo se hierve en el baño de María durante 10 min. LUPE JIBAJA 1.3 Disacáridos 1. al calentarse con un ácido en condiciones suaves. Pipetas. Reactivos. Se desarrolla una coloración azul estable durante varias horas. Instrumentos.75 ml de ácido sulfúrico concentrado y 100 ml de ácido acético glacial).En un tubo de ensayo se vierte 1 ml de disolución de desoxirribosa y luego 2 ml de disolución de difenilamina. 1.3. forman alcohol furfurílico. Disolución al 1%.. Disolución de difenilamina (preparación: 1 g de difenilamina recristalizada dos veces del alcohol al 70% o éter de petróleo.2.

Reactivos. Sulfato de cobalto.3.glucosa La sacarosa da con el sulfato de cobalto en un medio alcalino un complejo de color violeta.. “Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral”.Sacarosa. disolución al 10%. se añaden varias gotas de disolución de sulfato de cobalto. Instrumentos.-D-glucosido. LUPE JIBAJA β βα α H C H HO H H C OH C C C CH2OH Sacarosa 1.-D-fructósido H OH O O HO H H CH2OH C C C C CH2OH H OH O +HOH H C H HO H H C C C C OH CH2OH OH H OH O + HO HO H H C C C C CH2OH -D-fructosa H OH O CH2OH -D..En un tubo de ensayo se vierten de 2 a 3 ml de disolución de sacarosa.2 Reacciones de reconocimiento de la maltosa y lactosa La maltosa y lactosa son disacáridos reductores: ∗   Bibliografía: Chechetklin A.. Editorial Mir Moscú Pág 103-108 16 . disolución al 1%.2.V. Al añadir exceso de hidróxido sódico (1ml) el líquido adquiere un color violeta.Soporte con tubos de ensayo. 1. disolución al 2%. Hidróxido sódico. ∗ Marcha de los trabajos.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra.

BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. Lactosa. La maltosa también da osazonas características (véase la fig.-D-glucosa) Lactosa (1.3. 95-97) se explica por la presencia en las moléculas de maltosa y lactosa del grupo aldehído libre. disolución al 1%.3 Reacciones de reducción de iones metálicos La reacción positiva con el hidróxido cúprico.-D-glucosa) 1.-D-galactosido. 10) con cristales en forma de placas juntadas en escarapelas. 10).. Las reacciones de reducción de los iones metálicos transcurren con los disacáridos algo más lentamente que con los monosacáridos. 1. con el licor de Fehling y las sales de bismuto (véase la marcha del trabajo en las pág. Lo demás. Los cristales de osazonas de la maltosa y lactosa se disuelven en disolución caliente y precipitan sólo después de enfriarla. cuyos cristales tienen forma de agujas que se unen en aglomeraciones esféricas (véase la fig.  ∗ 17 . LUPE JIBAJA β α H H C H HO H H C OH C C C CH2OH H OH O O H H C C H OH OH C C OH C H O H C H HO H H C C C C CH2OH OH H O O H HO HO H OH C C C C C CH2OH OH H H O H CH2OH Maltosa (1.4.Maltosa.-D-glucosido.4 Reacción con la fenilhidrazina La lactosa forma con la fenilhidrazina osazonas.4. igual que para el análisis de los monosacáridos.3. disolución al 1%. Reactivos.

BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. con todo es un proceso complejo.1.  ∗ Bibliografía: Chechetklin A. La reacción de los polisacáridos.. En la tercera muestra la coloración vuelve a aparecer después del enfriamiento. a la segunda.Almidón. Este proceso es bien expresado de la amilosa. El líquido se colorea de azul.1 Almidón 1.V. LUPE JIBAJA 1. Hidróxido sódico. El contenido del tubo de ensayo se divide en tres partes: a la primera parte se añade 1 ó 2 ml de disolución de hidróxido sódico. Marcha de los trabajos. Se ha demostrado la relación entre la longitud de las cadenas laterales y la coloración resultante de la reacción con iodo (B.Soporte con tubos de ensayo. la amilopectina y el glicógeno. Reactivos. la tercera parte se calienta.4. Stepanenko). Editorial Mir Moscú Pág 108-114 18 .En un tubo de ensayo se vierten 2 ó 3 ml de disolución de almidón y se añade 1 gota de disolución de Lugol. tiene gran importancia también el proceso de adsorción de iodo sobre la superficie de las moléculas ramificadas. “Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral”. disolución al 10%. Para la reacción con el almidón la disolución obtenida se diluye con agua destilada en proporción 1:5%)..4 Polisacáridos 1. Instrumento. N.1 Reacciones Coloreadas del Almidón Una reacción característica para reconocer el almidón es la aparición de una coloración azul al combinarse con la disolución de iodo ioduro potásico. En el caso de polisacáridos de cadenas ramificadas. disolución al 1%.4. por ejemplo. Disolución de lugol (preparación: en 100 ml de agua se disuelven 20 g de yoduro de potasio y 10 g de yodo. 2 ó 3 ml de alcohol etílico. La coloración desaparece siempre. junto con el proceso de formación del complejo. La coloración que aparece depende de la estructura de polisacárido. Alcohol etílico. En el curso de la reacción se forma un complejo de polisacárido con yodo. en particular del almidón..

t = 100 °C 1 ó 2 min Amilodextrinas + I2 → coloración violeta azul ↓ Eritrodextrinas + I2 → coloración rojiparda ↓ Acrodextrinas → no dan coloración ↓ Maltodextrinas → no dan coloración ↓ Maltosa → no dan coloración ↓ Glucosa → no dan coloración Instrumentos. 1. 96). disolución al 1%. disolución al 10%. Hidróxido sódico. 109).. Pipetas. Más abajo se da el esquema de la hidrólisis ácida del almidón: Almidón ↓ HCl diluido.2 Hidrólisis Ácida Escalonada del Almidón En el curso del calentamiento del almidón con ácido clorhídrico diluido. LUPE JIBAJA Esto indica que la prueba con iodo debe realizarse sólo con disolución de almidón fría. Reactivos. Ácido clorhídrico concentrado. Debido a la inestabilidad del complejo de adsorción entre iodo y almidón.Soporte con tubos de ensayo.4. al calentamiento y a la acción de los álcalis con los cuales el iodo forma hipoioditos.Almidón. Papel de tornasol. Éstas se distinguen entre sí en cuanto a la masa molecular y al carácter de la coloración que surge al tratarlas con la disolución de iodo. 19 .1. él se descompone con la formación de los fragmentos de diferente tamaño llamados dextrinas.. esta reacción es sensible a la presencia de alcohol. Disolución de Lugol (véase la preparación en la pág. Licor de Fehling (véase la preparación en la pág.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra.

se añaden 1 ó 2 gotitas de disolución de Lugol. aparece una coloración rojiparda condicionada por la presencia de las eritrodextrinas. produciendo como productos intermedios acrodextrinas. Se hierve nuevamente la disolución y pasada los 2 ó 3 min. más y se repite la misma prueba con yodo. El tubo de ensayo con la disolución de almidón se hierve 1 ó 2 min.4. lo que indica la presencia de la disolución de productos de la hidrólisis que poseen propiedades reductoras. Baño de María con termómetro.En un tubo de ensayo se vierten de 3 a 5 ml de disolución de almidón y se añaden varias gotas de ácido clorhídrico concentrado. La coloración violeta azul aparecida indica la presencia de las amilodextrinas en disolución. Luego de 1 ó 2 min. la maltosa. LUPE JIBAJA Marcha de los trabajos. Para esto se extraen varias gotas de disolución con una pipeta y se vierten en un tubo de ensayo que contenga 5 ó 6 ml de agua destilada. se añade el licor se Fehling y se calienta. Instrumentos. según un papel de tornasol. con disolución de hidróxido sódico. El almidón se desintegra al finas hasta la glucosa. El hidrolizado de almidón se neutraliza. Pipetas. 1. Se mezcla cuidadosamente y se hierve a fuego abierto. Se forma un precipitado amarillo de hidróxido cuproso.. maldodextrinas y maltosa. 20 . iniciada la ebullición se toma una muestra para la reacción con yodo. que luego se descompone por la maltasa hasta la glucosa.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. o rojo.1 Hidrólisis Enzimática del Almidón Bajo la influencia de la enzima amilasa el almidón se desdobla con la formación de un disacárido..Soporte con tubos de ensayo. de oxido cuproso.1. La reacción con iodo será negativa: el líquido adquiere un color amarillo a cuenta de la coloración de la disolución de Lugol. se repiten las pruebas con iodo.

se mezclan cuidadosamente).Preparado de saliva (1 ó 2 ml de saliva se coloca en un vaso y se diluyen 5 veces con agua destilada. Los demás reactivos son los mismos que en el experimento anterior.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. se mezcla cuidadosamente y se pone en el baño de María durante 10 o 15 min. Marcha de los trabajos. 21 ...En un tubo de ensayo se vierten de 3ª 5 ml de disolución de almidón y se añade 0.5 ó 1 ml de saliva. a una temperatura de 37 a 40° C. LUPE JIBAJA Reactivos. La presencia de la glucosa se confirma por la reacción positiva con el color de Fehling. Se hacen repetidamente las pruebas con yodo. la ausencia de la coloración característica demuestra que la hidrólisis ha finalizado.

Marcha de los trabajos.1 Reacciones de reconocimiento de las grasa 2.1 Reacción de la grasa y el aceite con el Sudán III Instrumentos.1.2 Determinación de la glicerina en las grasas En el curso del calentamiento de una grasa en presencia de agentes deshidratantes.. LUPE JIBAJA CAPÍTULO II 2 LOS LÍPIDOS Y SUS METABOLITOS 2.1. se mezcla y se deja en reposo durante 24h por lo menos). 2.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. Aceite vegetal.Sobre el vidrio de reloj se aplica una gota de aceite.2% (preparación: en 200mg de Sudán III se añaden 100ml de alcohol etílico al 70% calentado en un baño de María.. se añade una gota se Sudán III y se mezcla. Se observa la parición de una coloración naranja de la mezcla. que es un aldehído no saturado. Reactivos.Sudán III. 22 . de hidrosulfatos de potasio o sodio se desprenden fácilmente de la glicerina dos moléculas de agua. disolución al 0. y ella se convierte en acroleína. en particular.Vidrio de reloj o placas de vidrio. En el colorante Sudán III se aplica en las investigaciones histológicas para localizar las grasas en los tejidos..

5g de cera. En el otro tubo de ensayo no se forma acroleína. La mezcla en los tubos de ensayo se calienta. 23 . Marcha de trabajos. Hidrosulfato potásico (sódico).Grasa o aceite vegetal.Aceite de girasol. 2. Los lípidos que no contienen glicerina (ceras. La formación de la acroleína en el tubo de ensayo con la grasa se reconoce por la aparición de un olor característico. Alcohol etílico. acre intenso.3 Solubilidad de las grasas El trabajo se realiza con el aceite vegetal y diferentes disolventes.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. En un tubo de ensayo se vierten 8 o 10 gotas de aceite. Reactivos. Mechero de gas o internilla. esterinas.. Instrumentos. inositolfosfolípidos y esfingolípidos) dan reacción de acroleína negativa. cera.. con cuidado pero fuertemente. cristalino. Cloroformo... Benceno. Instrumentos.Soporte con tubos de ensayo.1.El experimento debe realizarse en la campana de humos. En ambos tubos se añade aproximadamente 1g de hidrosulfato potásico..3 a 0. Reactivos.Soporte con tubos de ensayo. LUPE JIBAJA H H C OH C H C OH H H2C CH O C H + 2H2O OH H Glicerina Acroleína La reacción de formación de la acroleína se hace con el propósito de reconocer la glicerina libre o ligada en la molécula de grasa. en el otro se pone de 0.

en consecuencia. En la 24 . en cierta medida. juzgar sobre su asimilamiento. el punto de fusión de la grasa es tanto más bajo. 2.En cuatro tubos de ensayo se vierten de 5 a 7 gotas de aceite de girasol. en el segundo 2ml de alcohol. Como regla. que indica la mala solubilidad del aceite en alcohol.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. en el segundo. Se observan los siguientes cambios: en el primer tubo se forma una emulsión inestable que se separara rápidamente. se asimilan con mayor facilidad. en el tercero y el cuarto tubos de ensayo se forman disoluciones transparentes debido a una buena solubilidad del aceite en benceno y cloroformo.. La mezcla de los tubos de ensayo se agita enérgicamente.5 Determinación de la temperatura de fusión La temperatura de fusión de una grasa es uno de los indicadores que permite. el número o índice de acetilo (índice de éster) y el número o índice de saponificación. en el tercero 2ml de benceno y en el cuarto 2ml de cloroformo. LUPE JIBAJA Marcha de los trabajos. una disolución turbia. el índice de yodo. A la temperatura ambiente las grasas de origen vegetal son líquidos. Las grasas que funden a baja temperatura se emulsifican más fácilmente y. entre las químicas se destacan el número acídico (índice de acidez).1. las constantes físicas de la grasa más importantes son sus temperaturas de fusión y de endurecimiento y la viscosidad. La temperatura de fusión de los glicéridos es condicionada por sus ácidos grasos constituyentes. puesto que en su composición la cantidad de ácidos grasos no saturados alcanza un 95 ó 97%.4 Determinación de las constantes de la grasa Sobre la naturaleza y la calidad de una grasa se puede juzgar a partir de sus constantes físicas y químicas o sus números (índices). 2. cuanto más alto es el contenido de los ácidos de cadena corta o no saturados. En el primer tubo se añaden 2ml de agua.1.

se anota como la temperatura de fusión.. Termómetro. camellos 36 – 48. Tobo de ensayo. El agua se calienta poco a poco. Instrumentos. para evitar errores. El nivel de agua en el vaso debe ser más alto que el término superior del capilar. El termómetro con capilar se mete en el tubo de ensayo donde se ajusta con ayuda de un tapón.5cm de altura.Capilar de vidrio de 1. Terminando el enfriamiento. Entre el inicio y el final de la transición de la grasa desde el estado sólido al líquido transcurre cierto tiempo. La temperatura de fusión de las grasas depende de la especie del animal y oscila dentro de los límites siguientes en º C) ovejas 49 – 54. El capilar se ajusta mediante un anillo de goma en la parte inferior del termómetro de tal manera que su punta llena de grasa sea dirigida hacia arriba y su otro extremo libre de grasa. ácidos grasos libres. conejos 22 – 25.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. vitaminas y otras sustancias. removiéndola frecuentemente. pigmentos. perros 23 – 27. El tubo de ensayo se sumerge en el vaso con agua y se sujeta en la patilla del soporte en posición vertical. Por lo tanto. la parte del capilar llenada de grasa se corta. La indicación del termómetro en el momento cuando la grasa empiece a fluir por el capilar y en la parte superior de este último se forme un espacio libre. sino mezcla de diferentes glicéridos. dejando la columna de grasa de 0. Vaso químico.. hacia abajo. venados 48 – 52. ya que no son sustancias químicas individuales. Reactivos. cabras 46 – 48.El capilar limpio y seco se llena de grasa a una altura de unos 2cm y se mantiene durante 1h sobre hielo o en agua corriente fría. Marcha de los trabajos. Las grasas naturales no poseen un punto de fusión determinado. caballos 28 – 32. Lupa. LUPE JIBAJA composición de las grasas sólidas poco fusibles de origen animal prevalecen los ácidos grasos de cadenas de carbono largas. y a través de la lupa se observa el aumento de la temperatura y el estado de la columna de grasa en los capilares. cerdos 37 – 45.5 ó 2mm en diámetro. la temperatura de fusión de 25 .Grasa de origen animal (fundida y filtrada).. ganado vacuno 48 – 50.

una magnitud de 1. El índice es uno de los indicadores más importantes de la calidad de la grasa. y la disolución se valora rápidamente con al disolución de hidróxido potásico 0. 2. se añaden 10ml de mezcla de alcohol con éter. disolución 0.Matraz Erlenmeyer. El número acídico se expresa en cantidad de miligramos de hidróxido de potasio necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres en un gramo de grasa.1N de hidróxido potásico según la fenolftaleína).1.En el matraz Erlenmeyer se vierte un gramo de aceite de girasol. Hidróxido potásico. LUPE JIBAJA la grasa se determina por lo menos dos veces.1N. comúnmente.6 Determinación del número acídico El número acídico caracteriza la presencia de ácidos grasos libres en la grasa. Bureta.. y el resultado se calcula como promedio.. Instrumentos. El número acídico se calcula según la fórmula x= a . con agitación.6 K . el contenido se agita cuidadosamente. Mezcla neutralizada de alcohol con éter (mezcla de alcohol con éter 1:2 que se neutraliza con disolución 0. Fenolftaleína.2 a 3. disolución 0. c 26 .1N. Se agregan 2 ó 3 gotas de fenolftaleína. El número acídico de la grasa fresca de distintos tipos no sobrepasa. 5. Pipetas de 1 y 10ml.1%.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra.. Reactivos. Una elevada acidez de una grasa indica la pérdida de su calidad.5. Marcha de trabajos. En el curso de almacenaje de la grasa tiene lugar la hidrólisis de los glicéridos y acumulación de los ácidos grasos libres. hasta la aparición de una coloración rosa que persista más de 1 min.Aceite de girasol.

1. El principio del método. Reactivos.Aceite de girasol. 46-66. Cuando mayor es el contenido de ácidos grasos no saturados en la grasa.7 Determinación del índice de iodo Se denomina índice de iodo la cantidad de gramos de iodo que pueden combinarse con 100 g de grasa. aceite de cáñamo. Bureta. Tiosulfato sódico.691 g de iodo recién sublimado se disuelven en 1 l de alcohol etílico al 96%). 175-201. 129-136. 145-162. Pipeta de 10ml. en g. de perro. disolución 0. 31-46. que se verifican cuantitativamente según el esquema: R CH CH R I2 HOH R CH I HC OH R HI El iodo que no ha reaccionado se valora con tiosulfato. de carnero. a es el volumen de disolución de hidróxido potásico de 0. LUPE JIBAJA Donde x es el número acídico. Cloroformo.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. 27 . 27-47. 2. c es la muestra pesada de aceite. El índice de iodo de algunas grasas y aceite oscila dentro de los siguientes límites: deres. en ml. 56-67. en mg. disolución 0. aceite de linaza. para la reducción y otras reacciones..6 es la cantidad de hidróxido potásico (mg) que se contiene en 1ml de disolución de hidróxido potásico. Instrumentos.1N consumido para la valoración de la prueba a investigar. de cerdo. aceite de girasol. disolución al1%.1 N. Iodo. Almidón.1 N en alcohol (la preparación: 12. tanto mayor es su índice de iodo. La determinación del índice del iodo se basa en la reacción de adición del iodo al lugar de ruptura de los dobles enlaces en las moléculas de ácidos grasos. Este número permite evaluar el grado de no saturación de la grasa provocada por la presencia de glicéridos con ácidos grasos de dobles enlaces. 5.. la capacidad de la grasa para la oxidación.Matraces Erlenmeyer de 50 ml con tapones.

1 de aceite de girasol (se pesa en una balanza analítica) .K . K es el coeficiente de corrección del título de la disolución 0. en el otro ( prueba de control) 0.1 N. los matraces se cierran con tapones. 192-198. consumiendo en la valoración de la prueba de control. Cuando la muestra de aceite se disuelta.1 ml de agua. 193-200.g) se calcula según la fórmula. c la muestra pesada de grasa. manteca de cerdo.1 N de tiosulfato sódico. 212-247. Al cabo de 5 min las pruebas se evalúan. g. en ml.8 Determinación del número (índice) de saponificación Número de saponificación se denomina el número de miligramos de hidróxido potásico que se necesitan para neutralizar todos los ácidos grasos (libres y ligados en forma de glicéridos) que se contienen en 1 g de grasa. 2.01269 . 187-195. 0. y los matraces dejan en la oscuridad.1 N de iodo en alcohol. el contenido se remueve agitándolo. con disolución de tiosulfato sódico 0. x = (b − a ). hasta la Fl índice de yodo (x. El número de saponificación de algunos aceites y grasas de buena calidad tiene los valores siguientes: grasa de buey. a es el volumen de la disolución de tiosulfato sódico 0.1. y se añaden de la bureta 5ml de cloroforma en cada uno.01269 es la cantidad de iodo (g) equivalente a 1ml de disolución de tiosulfato sódico 0. 190-200. grasa de carnero. al añadir 1 ml de disolución de almidón al 1%.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. en ml.1 N.0. 28 . manteca de vaca. 100 es el coeficiente de recuento para los 100g de grasa.En una matraz (prueba experimental) se pone 0.1 N.1 N consumido en la valoración de la prueba experimental. primero hasta que la coloración se ponga amarilla clara. aceite de linaza.. en los matraces se añaden con la pipeta 10ml (¡Exactamente!) de disolución 0. agitando permanentemente. LUPE JIBAJA Marcha de los trabajos.100 c Donde b es el volumen de disolución de tiosulfato sódico 0. y luego.

5 N (la preparación: 30g de hidróxido potásico químicamente puro se disuelve en 30ml de agua destilada. y en cada uno se añaden de la bureta 15 ml de disolución alcohólica de hidróxido potásico 0. y su contenido se valora con disolución de ácido clorhídrico 0.. c es la muestra pesada de grasa. Ácido clorhídrico.5 N.5 N.5 N consumido en la valoración de la prueba de control.5 g aceite de girasol. 28. Terminada la saponificación.28. 29 . ml .BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra.En un matraz (prueba experimental) se pone 0. a es el volumen de disolución de ácido clorhídrico 0.. al cabo de 24 h la disolución se filtra). y la mezcla se calienta con agitación gentil en el baño de María hasta la ebullición débil durante 30 ó 40 min.5 N .5 ml de agua. a cada matraz se le añaden 4 gotas de fenolftaleína en cada uno. disolución alcohólica 0.5 N. g.Aceite de girasol. ml. b es el volumen de disolución de ácido clorhídrico 0. Marcha de los trabajos.Baño de María. g.5 N hasta la desaparición de la coloración de rosa. K es el coeficiente de corrección del título de la disolución de ácido clorhídrico 0.5 N consumido en la valoración de la prueba experimental. A los matraces se conectan los refrigerantes de reflujo. El número de saponificación se determina según la fórmula (b − a ) K . Fenolftaleína.05 c x= Donde x es el número de saponificación. LUPE JIBAJA Instrumentos.05 es la cantidad de hidróxido potásico ( mg) que corresponde a 1 ml de disolución de ácido clorhídrico 0. Reactivos. Hidróxido potásico.. Pipetas graduadas de 1ml.1%. disolución al 0. Matraces Erlenmeyer de 50 ml con refrigerantes de reflujo. disolución 0. y el volumen se lleva a 1 l con alcohol etílico al 96%. Bureta. en el otro (prueba de control) 0.

155). Lecitina (véase su preparación en la pag. En el tacto gastrointestinal existen las condiciones para transformar las grasas en emulsión. las proteínas. Reactivos. jabones e hidrocarbonatos de metales alcalinos.. En los dos primeros tubos se vierte 1 ml de agua. En cada tubo de ensayo se añaden 5 gotas de aceite de girasol. los tubos se agotan enérgicamente y se dejan en reposo duramte 5 min.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. LUPE JIBAJA 2. en el quinto 1 ml de disolución de jabón. Cuando ocurre esto. en el cuarto 1 ml de disolución de proteína. en el sexto 1 ml de disolución de hidrocarbonato sódico. favoreciendo a su atomización en gotas menudas. disolución al 1%. y los estabilizadores (emulsionantes) principales de ésta son las sales de ácidos biliares. 30 . los grupos hidrófobos se disuelven en la grasa. los fosfolípidos. esto es. 142) Marcha de trabajos. lo que se traduce en un aumento de la estabilidad de la emulsión.9 Emulsificación de las grasas A la acción de las enzimas del tracto gastrointestinal y de los tejidos son accesibles las grasas que se encuentran en estado emulsificado. Instrumentos.Soporte con tubos de ensayo.1. menos en el primero. en el tercero 1 ml de bilis. se forman emulsiones estables. En el segundo tubo de ensayo se introduce un pedacito de lecitina. En todos los tubos. Las moléculas de los emulsionantes se adsorben en la capa exterior de las gotitas de grasa y disminuyen bruscamente la tensión superficial en el contacto de las fases.Se toma seis tubos de ensayo... a la emulsificación. Hidrocarbonato sódico disolución al 1%. Bilis diluida dos veces.Aceite de girasol. Jabón. Disolución de proteína (véase su preparación en la pag.

La concentración de los ácidos grasos libres se determina mediante la valoración con hidróxido sódico por la fenolftaléina. la lipasa. Pipetas de 1.2 y 10 ml. que se contiene en los jugos gástricos.1.Vasos químicos de 50 ml. Termostato ajustado a 38ºC. Matraces Erlenmeyer de ml. del páncreas y de los intestinos.. Sobre la actividad de la enzima se juzga por el incremento en el medio de incubación de los ácidos grasos libres que se liberan en el curso de la descomposición de la grasa por la lipasa pancreática.10 Hidrólisis de los glicéridos con lipasa En el organismo las grasas se digieren bajo la acción de una enzima. Bureta. sino que también activan la lipasa.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. Instrumentos. El principio del método. La lipasa cataliza el desdoblamiento hidrolítico de las grasas en glicerina y ácidos grasos libres: O O H2 C HC O O O O H2 C O R3 H 2C OH R3 C OH R2 3 HOH HC OH R2 C OH O R1 H 2C OH R1 C OH O En éste proceso desempeñan un papel importante los ácidos biliares que no sólo participan en la emulsificación y adsorción de las grasas. LUPE JIBAJA 2. 31 .

Resultado de las valoraciones pueden anotarse en la tabla. Marcha de trabajos. disolución 0.01 N. Hidróxido sódico.En dos vasos se pone 10 ml de leche y 1 ml de extracto de lipasa en cada uno.. Basándose en los datos obtenidos se traza el gráfico de la acción de la lipasa en el tiempo. Extracto de páncreas (la preparación: 1g de pancreatina comercial se disuelve en 100 ml de disolución de hidrocarbonato sódico al 0.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. con y sin bilis. en el otro 1 ml de bilis ( para activar la lipasa). se añaden 2 gotas de fenolftaleína y se valora con la disolución de hidróxido sódico 0. LUPE JIBAJA Reactivos. La mezcla que se quedó en los vasosa se incuba en el termostato a 38ºC.1%. La cantidad de álcali consumida para la neutralización de los ácidos grasos libres formados en el curso de la hidrólisis de la grasa se determina por la diferencia entre los resultados de la primera y las siguientes valoraciones. En el eje de abscisas del gráfico se pone el tiempo y en el eje de ordenadas el número de mililitros de disolución de hidróxido sódico 0. De cada vaso se toman 2 ml de mezcla y se traslada en matraces para valoración. En uno de ellos se añade 1 ml d agua..Leche hervida y diluida dos veces.01 N consumida en la valoración de los ácidos grasos libres formados mediante un intervalo de tiempo determinado. Bilis diluida dos veces. Tras cada 15 min de los vasos se toman 2 ml de mezcla y se valoran del modo descrito anteriormente.01 N hasta la aparición de una coloración rosada débil. y el líquido se mezcla rápidamente aspirándolo con la pipeta y dejándolo derramarse.4%). 32 . Fenolftaleína. disolución al 0.

"el agua. la disolución de ácido clorhídrico al 10% hasta que se separen los ácidos grasos superiores que suben a la superficie en forma de una capa líquida. Al ser turbio el extracto.Vaso químico. le añaden 20 mi de alcohol caliente y se mezcla con una varilla de vidrio. la leche. al 96%.En el vaso se pone la mitad de una yema. La mezcla se enfría y se filtra en un tubo de ensayo seco.2 Fosfolípidos 2.Yema de huevo. Soporto con tubos do ensayo. Los ácidos grasos liberados se eliminan mediante la filtración. LUPE JIBAJA 2. Acetona. Varilla de vidrio.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. gota a gota.2 Aislamiento de las lecitinas de la yema de huevo Instrumentos.. 2. Marcha de los trabajos. donde ellos se encuentran en considerable cantidad. gota a gota.2. en un tubo de ensayo seco se vierten 5 rnl de acetona y se le añade. el hígado. la filtración se repite.. el filtrado obtenido.1 Aislamiento de los fosfolípidos Unos objetos cómodos para el aislamiento y el estudio de la composición química de los fosfolípidos son el tejido nervioso.3 Detección de los ácidosgrasos superiores Marcha de los trabajos. Alcohol etílico. la yema de huevo.2.2.El hidrolizado alcalino obtenido se diluye con 2 ml de agua y se le añade.. gota a gota. 2. El filtrado que queda se utiliza para otras reacciones de reconocimientos de las lecitinas. Embudos. El filtrado transparente se neutraliza con disolución de hidróxido sódico al 10% hasta una coloración rosada débil de fenolftaleína y se evapora en el baño de María hasta 33 . La aparición de turbidez indica precipitación de lecitina. Reactivos. Para detectar la lecitina en el filtrado. Se forma una emulsión estable. Filtros de papel. En el otro tubo de ensayo seco se vierten 3 mi de filtrado y se añade..

BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. LUPE JIBAJA quedar bien seco. En el residuo seco se detecta la presencia de la glicerina y el ácido fosfórico. 34 .

Las reacciones de precipitación de las proteínas pueden dividirse en dos subgrupos: la precipitación de las proteínas sin su desnaturalización (sales de los metales pesados. Las macromoléculas de las proteínas en este caso. reactivos de reconocimiento de los alcaloides). ácidos minerales y orgánicos.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. y los precipitados de las proteínas obtenidos (gel) pueden ser disueltos de nuevo en el mismo disolvente de partida (transformación en sol). de ciertos enlaces o en las propiedades físicoquímicas.1 PROTEINAS Reacciones De Reconocimiento De Las Proteínas Todas las reacciones de reconocimiento de las proteínas se basan en la presencia en ellas de ciertos grupos químicos. 35 .1 Salificación de las proteínas En el curso de estas reacciones las proteínas precipitadas no se someten a las alteraciones profundas. conservan sus propiedades iniciales (nativas) y no sufren variaciones considerables (desnaturalización).2. 3. Las reacciones de reconocimiento de las proteínas pueden ser divididos en dos grupos independientes: reacciones de precipitación y reacciones coloreadas. temperatura.2 Reacciones De Precipitación De Las Proteínas 3. LUPE JIBAJA CAPÍTULO III 3 3.

BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. A tales sales pertenecen las sustancias siguientes:( NH4)2SO4. NH4 Cl. Como es sabido. al disolverse. Por ejemplo. la precipitación por iones de las sales de metales alcalinos. etc. Las disoluciones concentradas de sulfato amónico salifican casi todas las proteínas. las sales de los metales alcalinos. El mecanismo de acción de estas sales sobre la partícula coloidal se reduce a la adsorción. y esta dispersión de la masa molecular se usa para su separación fraccionada empleando las sales de diferente concentración. la partícula proteínica se vuelve eléctricamente neutra (sucede la anulación de la carga). se denomina salificación. su envoltura de hidratación. Los cloruros de sodio y potasio. enlazan grandes cantidades de agua. es decir. la salificación de las proteínas es un proceso reversible. las proteínas de los tejidos son heterogéneas con respecto a su masa molecular. Además. De esta manera. sobre esta última. precipitan las globulinas en estado de saturación: con acidulación débil ( en punto isoeléctrico) 36 . de las sales neutras de los metales alcalinos o sales amónicas. LUPE JIBAJA La precipitación reversible de las proteínas se logra por adición a las disoluciones acuosas.NaCl. así como el sulfato de magnesio. esto provoca la deshidratación de las partículas coloidales y las priva del segundo factor de la estabilidad del estado de agregación. par concentraciones elevadas. Este método de precipitación de las proteínas. de los iones con carga opuesta. De esta manera. todas las fracciones de globulinas se precipitan anta la semisaturación de la disolución de proteínas con sulfato amónico.Na2SO4. lo que resulta en la disminución de su estabilidad en la disolución. mientras que las albúminas se precipitan con una saturación absoluta. Los precipitados de las proteínas ( gel ) obtenidos por salificación pueden ser disueltos de nuevo al disminuir la concentración de las sales mediante diálisis o por disolución en agua. KCl. Las proteínas se precipitan.

Se precipitan unas proteínas: las globulinas. 3. LUPE JIBAJA estas sales precipitan también las albúminas. y en esta caso se utilizan disoluciones de más baja concentración. Hidróxido sódico. disolución al 1 %.2. se añade igual volumen de disolución saturada de sulfato amónico y se agita. La reacción negativa indica la ausencia de proteínas en el filtrado y la plenitud de la precipitación. 37 . agitando el tubo de ensayo. Luego de 5 ó 7 min. Se precipitan las albúminas que se separan por filtración. Sulfato amónico en forma de cristales desmenuzados finamente. las globulinas. Sulfato amónico ( disolución saturada). hasta que quede un polvo no soluble. Sulfato cúprico. El precipitado de albúminas junto con el filtro se traslada a un tubo de ensayo y se disuelve en 4 ó 5 ml de agua. al filtrado se le añade sulfato amónico cristalino hasta la saturación completa.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. Marcha de los trabajos: En un tubo de ensayo se vierten 2 ó 3 ml de suero de la sangre o de disolución diluida de clara de huevo.2 Precipitación de las proteínas con sulfato amónico. En el filtrado quedan las albúminas y sobre el filtro. disolución al 10 %. el contenido de los tubos de ensayo se filtra. es decir. Reactivos: Suero de sangre o disolución de clara de huevo ( de tres huevos de gallina ) que se prepara mezclando las claras de huevo con 700 ml de agua destilada y 300 ml de disolución saturada de cloruro sódico con posterior filtración a través de varias capas da gasa. Con 2 ó 3 ml de filtrado se hace la reacción de biuret (véase en la pág 167 ). Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. Embudo con filtro. Para precipitar las albúminas.

Al filtrado se le añaden 4 ó 6 gotas de disolución de ácido acético al 1 %.3 Precipitación de las proteínas con cloruro sódico y sulfato de magnesio Instrumentos: Los mismos que en experimento en la precipitación con sulfato amónico (véase la pág. las albúminas se precipitan. Al pasar 5 min.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. El contenido de los tubos de ensayo se filtra. Reactivos: Cloruro sódico cristalino. Acido acético. 155). Entonces se añade igual volumen de agua destilada. con ella se hace la reacción de biuret. el cloruro sódico y en el otro. entonces.  Precipitación reversible de las proteínas con sulfato amónico  Los instrumentos y reactivos son los mismos que en el experimento anterior. Se agregan 2 ó 3 ml de disolución saturada de sulfato amónico y se agita.2. estas se filtran. En uno de los tubos de ensayo se añade. En el filtrado quedan las albúminas que en disoluciones neutras no son precipitadas por dichas sales incluso con saturación completa. Marcha de los trabajos: En dos tubos de ensayo se vierten 2 ó 3 ml de suero de la sangre o clara de huevo diluida en cada uno. Se precipitan proteínas. Sulfato de magnesio cristalino. 3. el sulfato de magnesio. LUPE JIBAJA  La disolución de albúminas se filtra. Marcha de los trabajos: En el tubo de ensayo se vierten 2 ó 3 ml de suero de la sangre o clara de huevo diluida. Al cabo de 2 ó 3 min en ambos tubos aparece el precipitado de globulinas. se mezcla bien y se observa la desaparición paulatina del precipitado de proteínas. disolución al 1 %. hasta la saturación completa. Por medio de la reacción 38 .

del vaso toman 2 ó 3 ml de agua en un tubo de ensayo donde se 39 . disolución al 10 %. Nitrato de plata.4 Purificación de las proteínas de los cristaloides con método de diálisis.Dializador Elemental Instrumentos: Dializador.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. En esta propiedad de las proteínicas se basa el método de purificación de las proteínas de impurezas orgánicas y minerales de bajo peso molecular. impermeables para los coloides. Sulfato cúprico. disolución al 10 %. como sustancias macromoleculares coloidales. LUPE JIBAJA del biuret se comprueba la ausencia de las proteínas en el filtrado (véase la pág. no se difunden a través de los. Al cabo de unos 40 ó 60 min. de tal manera que el borde de la bolsa sobresalga de la superficie del agua. que es una bolsa de colodión sumergida en un vaso con agua destilada Soporte con tubos de ensayo.154). 167) 3. Reactivos: Disolución de proteína que contiene cloruro sódico ( véase su preparación en la pág. disolución al 1 %.2. Las proteínas . Diálisis es un método de separación de los coloides y los cristaloides mediante la difusión de estos últimos a través de membranas especiales. disolución al 1%. Hidróxido sódico.poros de la membrana semipermeable. Ilustración 2.. Acido nítrico. Marcha de los trabajos: Con la disolución de proteína se hace la reacción de biuret Se vierten de 10 a 15 ml de disolución de proteína en la bolsa de colodión sujetándola con ayuda de pinzas de madera dentro del vaso con agua destilada.

a la disolución pasa un complejo de proteínas obtenidos por la acción de las sales de metales pesados son insolubles en disolvente de partida. Si el experimento se ha realizado correctamente. Los iones de las sales de metales pesados forman con las proteínas compuestos complejos estables. El agua del vaso puede cambiarse cada 15 ó 20 min. etc. Además.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. las globulinas se precipitan. LUPE JIBAJA añaden 3 ó 5 gotas de disolución de nitrato de plata con fin de detectar los iones cloruro. plomo. por lo visto. En el otro tubo de ensayo se toman 1 ó 2 ml de líquido del vaso y se hace la reacción de biuret. incluso después de la eliminación de las sales por diálisis o después de la dilución con agua. Bajo la influencia de los iones de las sales de metales pesados ( plomo. La capacidad de las proteínas de enlazar los metales pesados se aprovecha ampliamente en la práctica medicinal y veterinaria: las proteínas sirven de antídotos en caso de envenenamiento con sales de mercurio.5 Precipitación de las proteínas con iones de metales pesados. lo que se explica por la adsorción de un exceso de iones de metal y la recarga del complejo proteínico. etc. hasta aparecer en la disolución el precipitado de globulinas que se forma debido a la disminución de la concentración de cloruro sódico en la bolsa de colodión. en agua o en disoluciones débiles de sales. En presencia de un exceso de acetato de plomo y sulfato cúprico el precipitado formado por ellos se disuelve. en comparación con la precipitación de las proteínas con sales neutras de metales alcalinos. cambian profundamente la estructura secundaria. las proteínas desde el estado de sal coagulan irreversiblemente en gel. esta reacción debe ser negativa. plata. 40 . Para la precipitación de las proteínas con sales de metales pesados se necesitan bajas concentraciones y pequeñas cantidades des estas sales. como resultado. mercurio. ) .2. En disoluciones pobres en sales. cobre. terciaria y cuaternaria de la proteína. es decir. los metales pesados anulan la carga eléctrica y. cobre. 3.

disolución al 3 %. entonces. Nitrato de plata.5 %. Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. La reacción con ácido nítrico se emplea ampliamente para las investigaciones diagnósticas. observándose. En el primer tubo se añade. Acetato de plomo. la disolución de acetato de plomo. Esta precipitación se explica por el fenómeno de la deshidratación de las partículas coloidales de proteína.6 Precipitación de las proteínas con ácidos minerales. Varillas de vidrio. En los tubos de ensayo con los precipitado obtenidos con acetato de plomo y sulfato cúprico se añade el exceso de estas sales. etc.2. Los ácidos minerales concentrados (menos el ácido fosfórico) causan precipitación irreversible de las proteínas desde sus disoluciones. en el segundo la de sulfato cúprico. 3. Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. disolución al 5 %. formación de sales de la proteína y el ácido. 41 . Disolución saturada de cloruro sódico. Sulfato cúprico. gota a gota.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. En los tres tubos se forman precipitados de proteínas. Marcha de los trabajos: En tres tubos de ensayo se vierten en cada uno de 1 a2 ml de disolución de proteína. la disolución de los precipitados. y ellas se utilizan no sólo para el aislamiento de las proteínas desde disoluciones y líquidos biológicos sino también para liberar estos últimos de las proteínas. Reactivos: Disolución de clara de huevo en 20 volúmenes de agua que se filtra a través de varias capas de gasa. LUPE JIBAJA Las reacciones de precipitación de las proteínas con sales de metales pesados transcurren con plenitud. en el tercero la de nitrato de plata. disolución al 0. la anulación de su carga.

Así .. LUPE JIBAJA Reactivos: Acido Clorhídrico concentrado.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. por ejemplo. La precipitación de las proteínas con ayuda de ácido tricloroacético de concentración final de 2. las amidas de los aminoácidos. El precipitado se disuelve en los dos primeros tubos de ensayo donde hay exceso de ácidos clorhídrico y sulfúrico. Las proteínas pueden precipitarse de sus disoluciones también con ácidos orgánicos. los aminoácidos. 3. yq eue las proteínas no se disuelven en el exceso de ácido nítrico. Cada tubo de ensayo se agita con cuidado.2. Disolución de proteína para las reacciones de precipitación Marcha de los trabajos: En tres tubos de ensayo se vierten con cuidado 1 ml de ácidos en cada uno: ácido clorhídrico en el primero. la urea. en el tercer tubo. En el contacto de dos líquidos aparece un precipitado de proteínas en forma de pequeño círculo (anillo) blanco. en relación a las proteínas.7 Precipitación de las proteínas con ácidos orgánicos. que contiene ácido nítrico.5 a 5 % se usa para eliminar completamente las proteínas desde los líquidos biológicos u homogeneizados de los tejidos. reactivos muy específicos y fuertes y se aplican ampliamente en la práctica de investigación. se quedan 42 . aunque distintos ácidos actúan sobre la proteína de diferentes maneras. esto es. el ácido tricloroacético ( CCl3COOH ) y el ácido sulfosalicílico [C6H3 (OH) COO—HSO3H ] son. mientras que los productos de su desintegración (metabolismo). Acido Sulfúrico concentrado. los péptidos de bajo peso molecular etc. el ácido úrico. el precipitado no desaparece en el curso de la agitación. En todos los tubos de ensayo se aplica con cuidado sobre el ácido una capa de disolución de proteína(alrededor de 1 ml ). ácido sulfúrico en el segundo y el nítrico en el tercero. puesto que el ácido tricloroacético precipita sólo las proteínas.

Reactivos: Acido tricloroacético. la desnaturalización no logra realizarse. lo que conduce a la merma de su estabilidad en disolución. Si en la disolución de proteína hay presentes sales (Na Cl).2. Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. LUPE JIBAJA en disolución. entonces. Disolución de proteína para la precipitación Marcha de los trabajos: En dos tubos de ensayo se vierten 1 ó 2 ml de disolución de proteína y se añaden al primer tubo varias gotas de disolución de ácido tricloroacético al 5 % y al segundo. varias gotas de ácido sulfosalicílico.8 Precipitación de las proteínas con alcohol y acetona Los disolventes orgánicos precipitan las proteínas de una disolución neutra o débilmente ácida. la proteína puede ser de nuevo disuelta en agua. Los tubos de ensayo se agitan y se observa la precipitación de la proteína. disolución al 5 %. 3. el precipitado se forma más rápidamente debido a la anulación de la carga desde la partícula coloidal. la proteína se desnaturaliza y se vuelve insoluble en el disolvente inicial. Acido sulfosalicílico disolución al 20%. es decir. Esto tiene importancia para determinar por separado el nitrógeno proteínico y no proteínico (restante) en los tejidos. y la precipitación resulta ser reversible. Este fenómeno disminuye aún más estabilidad de la disolución de la proteína. Ellos desplazan las proteínas de las disoluciones acuosas. Durante una estancia prolongada con alcohol. Si la precipitación se hace en frío y el precipitado se separa rápidamente del alcohol.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. 43 . sus propiedades no varían. El mecanismo de acción del alcohol y otros disolventes orgánicos puede ser explicado por la deshidratación de las micelas de proteína.

3 Reacciones de reconocimiento de las proteínas La determinación cualitativa de las proteínas se basa en dos tipos de reacciones: a) las reacciones en que intervienen los enlaces peptídicos de la molécula proteínica. Marcha de los trabajos: En dos tubos de ensayo se vierten 1 ó 2 ml de disolución de proteína. 2 ó 3 ml de acetona. Acetona. 44 .2 ó 0. 154).Alcohol etílico al 96 %. Los tubos se agitan enérgicamente y después de 3 ó 6 min se observa la formación de un precipitado fino de proteínas.Cloruro sódico cristalino. Al primer tubo de ensayo se añaden gradualmente (gota a gota) 2 ó 3 ml de alcohol. b) las reacciones de los grupos amino presentes en la molécula de la proteína.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. y al segundo. 3. Estas son reacciones coloreadas de reconocimiento de las proteínas.3 g) de cloruro sódico y se agita enérgicamente. LUPE JIBAJA Reactivos: Disolución de proteína para las reacciones de precipitación (véase su preparación en la pág. con cucharita se añade un poco (0.

la oxamida.3.1 Descubrimiento de los enlaces peptídicos en las moléculas de proteínas (reacción del biuret) En la disolución alcalina. puede representarse del modo siguiente: O - O NH NH - - HN O Cu NH O NH NH Como se ve en la fórmula indicada más arriba.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. al añadir sulfato cúprico. en condiciones apropiadas. los polipéptidos y las proteínas forman sales complejas coloreadas de un color violeta. da esta reacción. tales sustancias como el biuret. LUPE JIBAJA 3. El biuret se forma en el curso del calentamiento de la urea con desprendimiento de amoniaco: H2N CO NH H* H2N CO NH2 calentamiento NH3 H2N CO NH CO NH2 urea Biuret La estructura de la sal compleja coloreada de Cu-Na-biuret que se forma en medio alcalino. que. el biuret en un medio alcalino sufre la ionización completa según el esquema H2N CO NH CO NH2 H2N C OH NH C OH NH2 45 . Esta reacción es condicionada por la presencia de la unión O péptida ( H3C NH C CH3 ) El nombre de «reacción del biuret» proviene de un derivado de la urea. el biuret.

Reactivos: Urea cristalina. En caso de formarse complejos cúpricos con participación de tres o dos átomos de nitrógeno. su coloración es preferentemente violeta y azul (el máximo de absorción es de 540 a 580 nm y de 615 a 670 nm). disolución al 1%. LUPE JIBAJA Dos moléculas de biuret en forma dienólica se combinan con el hidróxido cúprico formando un complejo en que los enlaces de coordinación son formados a cuenta de los pares electrónicos de los grupos imino.5 g) de urea y se calcina con cuidado en la llama de un mechero de gas. Disolución de proteína (claras de dos huevos mezcladas con un litro de agua destilada). R2 C N R1 HC C O N C OH cadena C O Cu - N CH R3 C OH N HC R4 cadena De un modo análogo esta constituido el complejo de cobre con los grupos enolizados peptídicos de cualquier proteína o polipéptido. En un tubo de ensayo seco se toma una pequeña cantidad (0. un color rojo (el máximo de absorción esta situado en la región de 520 a 535 nm). del azul al rojo.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. Marcha de los trabajos: Reacción con el biuret. La urea primero se funde en el curso del calentamiento 46 . con preponderancia del color violeta. Los complejos de este tipo poseen sobre todo. Sulfato cúprico. Hidróxido sódico disoluciones al 10 % y 30%. Por lo tanto la coloración de las disoluciones varia. al verificarse la reacción del biuret.

por ejemplo. aplicando sobre la capa de disolución de proteína en álcali 1 ml de disolución de sulfato cúprico al 1%. Se mezcla cuidadosamente y se agregan 2 ó 3 gotas de disolución de sulfato cúprico al 1%. a la masa fundida se le añade 1 ó 2 ml de hidróxido sódico al 10% y varias gotas de disolución de sulfato cúprico al 1 %. Este método puede emplearse para la determinación de la proteína en la orina. Espátula 47 . la sensibilidad de la reacción puede ser aumentada. Después de agitada la mezcla. Se desarrolla una coloración roji-violeta. A 1 ó 2 ml de disolución de proteína se le añade un volumen doble de disolución de hidróxido sódico al 30%. Reacción con la proteína. se reduce formando el ácido picrámico. Siendo pequeña la concentración de la proteína. Esta reacción puede realizarse también con otros reductores. con la glucosa: OH O2N NO2 OH + 6H O2N NH2 + 2H2O NO2 Ácido pícrico NO2 Ácido picrámico Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. Estando el tubo de ensayo en reposo. en el contacto de dos capas aparece un anillo violeta.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. De nuevo se mezcla cuidadosamente.3. LUPE JIBAJA ulterior se desprende amoniaco. Al enfriarse. 3.2 Reacción con el ácido pícrico El ácido pícrico al ser calentado con la proteína en un medio alcalino. se desarrolla una coloración violeta azul de la disolución.

1 Reacción del triptófano Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo.3 a 0. El tubo de ensayo se calienta durante varios minutos en la llama del mechero. Hidrocarbonato sódico seco. 3. Pipetas de 1 ml. Reactivos: Disolución de proteína. Glucosa. En el otro tubo de ensayo se efectúa la misma reacción con disolución de glucosa al 0.1 %. LUPE JIBAJA Reactivos: Acido pícrico. luego se agrega 1 ml de disolución saturada de ácido pícrico. disolución saturada. aproximadamente. Se observan los mismos fenómenos que en el caso de la proteína.1 % en lugar de la proteína. Acido sulfúrico concentrado. Sacarosa. La coloración amarilla de la disolución gradualmente pasa a ser roja debido a la reducción del ácido pícrico en picrámico. Marcha de los trabajos: En un tubo de ensayo se vierten 2 ml de disolución de proteína y se añade de 0. En el contacto de los líquidos aparece una coloración guinda roja en forma de un anillo. Luego mediante la pipeta se deja bajar al fondo 1 ml de ácido sulfúrico concentrado. 48 . Marcha de los trabajos: En el tubo de ensayo se vierte 1 ml de disolución de proteína. y se añaden 2 gotas de disolución de sacarosa.4. Disolución de proteína. disolución al 10 %.5 g de Hidrocarbonato sódico. disolución al 0.4 Reacciones De Reconocimiento De Los Aminoacidos 3.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra.

se enfrían y se añaden bajo la campana de humos. al combinarse con el ∝-naftol. disolución al 10%.2 Reacción de la arginina La arginina en presencia del ∝-naftol se oxida con hipobromito. antes de usar 5 ml de dicha disolución básica se diluye 5 veces con agua ). Reactivos: Hidróxido sódico. Hipobromito sódico (preparación: se disuelven 300g de hidróxido sódico en 1 l de agua. El triptófano. disolución al 0. la disolución se guarda en un frasco oscuro 49 . dan una coloración roja con hipobromito o hipoclorito y ∝-naftol en medio alcalino. ∝-naftol. perdiendo a la vez un grupo imino. Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. La arginina oxidada.2 % (preparación: se disuelve 0. LUPE JIBAJA La esencia de la reacción se reduce a que bajo la influencia del ácido sulfúrico ocurre la hidrólisis de la sacarosa hasta monosacáridos que se deshidratan. forma una sustancia de color rojo que se supone posee la estructura siguiente: NH2 O C N CH2 CH2 H CH2 CH NH2 COOH Las proteínas que tienen en su composición arginina . 50g de bromo puro (alrededor de 16 ml).5 g de ∝-naftol en 50 ml de alcohol etílico.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. convirtiéndose en hidroximetilfurfural. al combinarse con el hidroximetilfurfural. forma un complejo de color guinda rojo. 3. con cuidado y removiendo constantemente.4.

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durante tres meses). Arginina, disolución al 0.01 % en ácido sulfúrico 0,1N. Disolución de proteína: (véase su preparación en la página 154). Marcha de los trabajos: En un tubo de ensayo se vierten 2 ml de disolución de proteína. Se añaden 2 o 3 gotas de disolución de hidróxido sódico y 2 gotas de ∝naftol. El contenido del tubo de ensayo se mezcla y se agrega hipobromito. Aparece una coloración carmesí roja. En el mismo orden que se efectúa la reacción con la disolución de arginina. Aparece una coloración roja ladrillo. 1 gota de

3.4.3 Reacción de los aminoácidos que contienen azufre

En la composición molecular de la mayoría de las proteínas entran aminoácidos que contienen azufre: la cisteína, cistina y metionina. Al calentarse con álcali, de estos aminoácidos se desprende azufre en forma de sulfuro de hidrógeno que se detecta en la reacción con el acetato de plomo:
H2C OH NH2 COOH

1)

H2C HC H2C

SH NH2 COOH

+

2NaOH

HC H2C

+

Na2S

+

H2O

2)

Na2S + (CH3COO)2Pb

2CH3COONa + PbS

Instrumentos: Soporte con tubos do ensayo. Reactivos: Clara de huevo no diluida. Hidróxido sódico, disolución al 20%. Acetato de plomo, disolución al 0,5% Marcha de los trabajos: En un tubo de ensayo se vierten 1 ó 2 mi de clara de huevo y se añade igual volumen de disolución de hidróxido sódico, se calienta hasta la

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ebullición y se agregan 1 ó 2 gotas de acetato de plomo. Se observa un oscurecimiento paulatino de la disolución.

3.4.4 Reacción de reconocimiento del glutatión

El glutatión es un tripéptido compuesto de los restos del ácido glutámico, la cisteína y la glicina:
O C HO CH2 CH2 C O NH CH H2C SH O C NH CH2 C OH O

En los tejidos y células del organismo animal el glutatión se encuentra en forma reducida (como tripéptido G—SH) y en forma oxidada (como tripéptido GS—S—S— G). La reducción del glutatión se realiza a través de la reacción con el DANPH2: G − S − S − G + DANPH 2 → 2G − SH + DANP En el organismo el glutatión se oxida, interaccionando con los aminoácidos de proteínas. La función más importante del glutatión es mantener en el estado reducido los grupos tioles de la cisteína en las proteínas. El glutatión puede servir de agente de transferencia de hidrógeno intermediario en las reacciones de oxidación del aldehído fosfoglicérico y de activador de una serie de enzimas (proteinasas). Sobre la catalasa, fosfatasa y algunas otras enzimas el glutatión ejerce una acción inhibidora. Contienen glutatión la sangre, el hígado, los músculos, los riñones, las glándulas suprarrenales y otros órganos. En la sangre de los animales sanos se contiene de 51

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4,4 a 32,3 mg% de glutatión, mientras que por ejemplo en la sangre de las vacas enfermas de cetosis su contenido alcanza a 22,5-23,2 mg%. Estos indicadores reflejan la alteración de los procesos de oxidación-reducción en los tejidos del animal. El principio del método. En el medio alcalino del glutatión se desprende el sulfuro sódico que, al combinarse con el nitroprusiato de sodio, forma un compuesto de color carmesí: 2Na Fe( CN) 5 NO + Na S → 2Na Fe( CN) 5 NO + S 2 2 Nitroprusi ato de sodio Complejo coloreado

[

]

[

]

Instrumentos: Mortero con machaca. Polvo de vidrio. Soporte con tubos de ensayo. Pipetas. Infernilla. Reactivos: Hígado fresco. Sulfato amónico, disolución saturada. Nitroprusiato de sodio, disolución al 2%. Amoníaco concentrado. Marcha de los trabajos: En el mortero se trituran cerca de 1 g de hígado con una pequeña cantidad de polvo de vidrio y 3 ó 4 mi de disolución saturada de sulfato amónico. El contenido del mortero se divide en dos porciones iguales que se ponen en dos tubos de ensayo. El tubo de ensayo 1 sirve de control, él se calienta hasta la ebullición para desnaturar las proteínas y el glutatión. En el tubo de ensayo 2 (experimental) el glutatión queda intacto. En ambos tubos se añaden 2 mi de amoníaco y 1 mi de disolución de nitroprusiato de sodio. En el tubo de ensayo 2 se observa la aparición de una coloración carmesí.

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El color depende de la formación de los azocompuestos coloreados a partir de los restos de aminoácidos. ü. Al cabo do 5 min se agregan. 154). La disolución se agita y se deja sobre el hielo durante 15 ruin.4. Aparece una coloración roja anaranjada. Reactivos: Reactivo diazo (preparación: 0. LUPE JIBAJA 3. La disolución puede guardarse en hielo durante 24 h. Disolución de proteína (véase su preparación en la pág.5 mi de disolución de nitrito sódico recién preparado.5 mi de disolución de sosa y 1 mi de reactivo diazo. Carbonato sódico. otros 6 mi de disolución de nitrito sódico al 5% . el triptófano y la histidina Con el diazorreactivo las proteínas dan una coloración roja anaranjada. disolución al 10°o.5 Diazorreacción de reconocimiento de la tirosina. Tirosina.1 N. Instrumentos: Soporto con tubos de ensayo. 53 .01°o en ácido sulfúrico 0. Se toma 1.5 mi de disolución básica de ácido sulfanílico y se vierte en un matraz aforado de 50 mi puesto en hielo. se añaden 1. disolución 0. el triptófano y la histidina que forman parte de la composición de la molécula proteínica. Marcha de los trabajos: En un tubo de ensayo se vierten 2 mi de disolución de tirosina. la tirosina. De manera análoga se efectúa con la proteína utilizando la disolución de proteína en lugar de la de tirosina. Tras 1 min se añade poco a poco (durante el enfriamiento) agua hasta la raya de enrase. Ésta es una disolución básica que puedo guardarse largo tiempo. En este caso también aparece una coloración roja anaranjada. agitando. La diazorreacción se emplea para la determinación cuantitativa y cualitativa de la tirosina e histidina en los hidrolizados proteínicos.9 g de ácido sulianílico se disuelven en 9 mi de ácido clorhídrico concentrado y se agrega agua hasta completar 100 mi.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra.

LUPE JIBAJA 3. En ambos tubos se deposita en el fondo. de 4 a 6 gotas de disolución de timol. Se realiza la misma reacción con la disolución de proteína. a-Naftol. Esta coloración aparece como resultado de la interacción con el anaftol o el timol del furfural e hidroximetilfurfural que se forman bajo la influencia del ácido sulfúrico concentrado (deshidratación de los monosacáridos). En dos tubos de ensayo se vierten.1 Aislamento de la desoxirribonucleoproteina Las desoxirribonucleoproteínas son la componente principal de los núcleos de las células. Marcha de los trabajos. La mejor 54 . En presencia del ácido sulfúrico concentrado tales proteínas dan una coloración característica para los hidratos de carbono: violeta con α -naftol y roja con timol.1% Disolución de proteína. Acido sulfúrico concentrado. disolución al 1% en alcohol. Se anota la reacción positiva de reconocimiento del componente de hidrato de carbono. Se observa una coloración violeta (en el caso del a-naftol) o roja (en el caso del timol) en la unión del ácido sulfúrico y la disolución de glucosa.6 Descubrimiento del componente de hidrato de carbono en las proteínas Ciertas proteínas (glicoproteínas. Ellas se denominan también proteínas de núcleo o nucleoproteínas. con cuidado.) tienen en su composición hidratos de carbono.5 Proteínas conjugadas 3.2% que se prepara disolviendo 0. 3. Reactivos. Glucosa. en cada uno. Timol. Instrumentos.5 g de α -naftol en 50 mi de alcohol etílico. Al primer tubo se le añaden de 4 a 6 gotas de disolución de anaftol. formando una capa. Soporte con tubos de ensayo. 1 ó 2 mi de ácido sulfúrico concentrado. al otro tubo.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. disolución al 0.4. disolución al 0. 2 mi de disolución de glucosa.5. nucleoproteínas. etc.

limo o hígado (de conejo o bovino).BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. Varilla de madera con entallados. Marcha de los trabajos:. glándulas linfáticas.p. timocitos. Centrífuga de 2500 ó 3000 revoluciones.m. 2 g de tejido se desmenuzan primero con tijeras sobre el vidrio de reloj y luego se trituran en el mortero. Al ser precipitadas desde las disoluciones salinas. Luego el líquido se decanta en la probeta graduada y se mide su volumen. La disolución viscosa obtenida se reparte en las probetas de centrífuga graduadas (10 ml en cada una) y se centrífuga durante 10 min a una velocidad de 2500 a 3000 r. se vierte en el vaso. Instrumentos: Mortero con machaca. espermatozoides. disolución 1 N. y girando lentamente la varilla de madera en el agua. mamas y el oviducto de las aves). por porciones pequeñas. Vidrio de reloj. Probetas de centrífuga graduadas (10 mi). Probeta graduada de 100 mi. Cloruro sódico. Balanza técnica. En el mortero se añaden. Ellas constituyen la parte principal de las llamadas proteínas estructurales de diferentes tejidos. y su insolubilidad en las disoluciones salinas diluidas. se le agrega el líquido centrifugado. 55 . esplenitis. hígado. Una propiedad característica de las proteínas de núcleo es su capacidad de formar disoluciones muy viscosas en las disoluciones concentradas de sales (cloruro sódico y otras). Glándula linfática. Reactivos: Esplenitis. Vaso GC- 300 ó 400 mi. LUPE JIBAJA fuente de desoxirribonucleoproteína son los tejidos ricos en núcleos celulares (leucocitos. Se toma un volumen séxtuplo de agua (con respecto al líquido centrifugado). las proteínas de núcleo se sedimentan en forma de hilos. de 70 a 80 ml de disolución de cloruro sódico 1 N. triturando el contenido cuidadosamente durante 10 ó 15 min.

Instrumentos. Centrífuga de 2500 ó 3000 r.p.m. Vaso o matraz de 50 a 100 ml.p. Probeta Probetas de centrífuga 56 . disolución al 5%. El líquido de todas las probetas se decanta en un vaso donde se vierte la disolución de ácido acético (12 ml) removiendo constantemente con la varilla hasta la completa precipitación de la nulceoproteína.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. Pipeta de 10 ml. llevando el volumen a 10 ml. Éter dietílico. Varilla de vidrio. Levadura prensada.5. una pulgarada de arena de vidrio. y precipitado por acidulación. disolución al 0. Se centrifugan durante 5 ó 10 min a 2500 r. El precipitado de la nulceoproteína se separa mediante otra centrifugación y se utiliza para la reacción de hidrólisis. 3. Marcha de los trabajos. se trasladan con cuidado a un tubo de ensayo y se usan posteriormente para realizar las reacciones de reconocimiento del ADN.m. Estas pueden ser extraídas de las células de levadura destruidas en un medio alcalino de la disolución. Ácido acético. LUPE JIBAJA Los hilos de proteína de núcleo formados se arrollan sobre la varilla. Hidróxido de sodio . se tritura cuidadosamente. graduada de 100ml. graduadas ( de 10 ml ) .2 Obtención de la nucleoproteína a partir de la levadura Las levaduras son ricas en ribonucleoproteínas. se añaden 10 gotas de éter y 10 gotas de agua. En el mortero se colocan 5 g de levadura . Reactivos. A la masa homogeneizada se le agregan 30 ml de disolución de hidróxido sódico y se sigue triturando durante 15 min más. El contenido del mortero se reparte en tres probetas de centrífuga.4%. Mortero con machaca. Arena de vidrio.

la del biuret y la de reconocimiento de la tirosina (Ensayo de Millon). Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. Soporte con tubos de ensayo. también se somete a una hidrólisis parcial hasta polipéptidos de bajo peso molecular y aminoácidos. La proteína. En el hidrolizado pueden ser determinados. consecuentemente.5.4 Detección de las proteínas sencillas Para este fin pueden emplearse dos reacciones. El matraz se cierra con un tapón provisto de refrigerante de reflujo y se hierve con cuidado durante 1h.5. 57 . LUPE JIBAJA 3. la nucleoproteína se desdobla en proteína y ácido nucleico. disolución al 5%. el hidrolizado se filtra en el vaso químico y se utiliza para el análisis de los productos de hidrólisis. Al enfriarse. 3. Marcha de los trabajos: La nucleoproteína obtenida a partir de la levadura se traslada al matraz para hidrólisis y se le añaden 15 ml de disolución de ácido sulfúrico al 5%. Embudo con filtro. de los cuales luego se desprenden el ácido fosfórico y las bases púricas (adenina y guanina). Matraz con refrigerante de reflujo. Instrumentos.3 Hidrólisis de la nucleoproteína Esta reacción puede verificarse mediante la ebullición de la nucleoproteína con el ácido sulfúrico al 5% durante 1h. la proteína. Vaso químico de 100 ml Reactivos: Acido sulfúrico. Este último se descompone en mononucleótidos individuales. Entonces. mientras tanto.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. las bases púricas. la pentosa y el ácido fosfórico.

3 ml de reactivo de Millon. Instrumentos. 172) Marcha de los trabajos. Soporte con tubos de ensayo. 58 . y el precipitado adquiere un color rosado o rojo ladrillo. En un tubo de ensayo se vierte 0. LUPE JIBAJA Reactivos. éste se neutraliza por el papel de tornasol con hidróxido sódico y se añade 0. el tubo se agita.5 ml de hidrolizado y éste se neutraliza por el papel de tornasol con disolución de álcali. En el otro tubo de ensayo se vierte 1 ml de hidrolizado y se añade 0.5. El tubo de ensayo se agita y se observa la reacción del biuret positiva ( coloración rosada o violeta ).5 Detección de las pentosas Se realiza una de las reacciones de oxidación de las aldopentosas. 3. Reactivos. luego se agregan 2 ó 3 gotas de sulfato cúprico. Hidróxido sódico. Marcha de los trabajos. Hidróxido sódico. Reactivo de Millon (véase su preparación en la pág. disolución al 10%. 96).5ml de hidrolizado filtrado.5 ml de hidróxido sódico. disolución al 1%. Se calienta. En un tubo de ensayo se vierte 0. Al hidrolizado neutralizado se añade igual volumen de reactivo de Fehling. Para ello es cómoda la reacción con el licor de Fehling. Reactivo de Fehling ( véase su preparación en la pág. Sulfato cúprico. y la capa superior del líquido se calienta.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. disolución al 10%. Se observa la aparición de un precipitado rojo amarillo de óxido cuproso e hidróxido cuproso.

6 3. deteniendo el floculo con la varilla. cuyo exceso no disuelve la mucina. De la disolución alcalina la mucina se precipita con ácido acético. disolución al 0.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. A los mucopolisacáridos pertenecen la heparina. los ácidos hialurónico y condroitinsulfúrico. La mucína es una proieína de propiedades acidas.1 Aislamiento de la mucina de la saliva Las mucinas se encuentran en la saliva. Algunos mucopolisacáridos contienen ácidos siálicos. Soporte con tubos de ensayo. de saliva en cada uno y se añade.1%. Hidróxido sódicdisolución al 10%. gota a gota. α-naftol. 59 . Acido acético. disolución al 1%.2%. Marcha de los trabajos. disolución al 1%. como de heteropolísacárídos.7 Glicoproteínas Las glicoproteínas son proteínas conjugadas compuestas por las proteínas sencillas y grupo prostético en cuya composición entran los hidratos de carbono tanto del tipo de homopolisacáridos. 3. Sulfato cúprico. Varilla de vidrio Reactivos. disolución al 0. Los grupos prostéticos de ciertas glicoproteínas se denominan mucopolisacáridos. Instrumentos. Acido sulfúrico concentrado. la mucosidad de vías gástricas y de otros órganos. una disolución de ácido acético al 1% hasta aparecer los floculos de mucina. LUPE JIBAJA 3. insoluble en agua pero muy soluble en álcalis y en el ácido clorhidrico.7. Acido clorhirico. En tres tubos de ensayo se colecta 1 ó 2 ml. El precipitado de mucina se lava cuidadosamente con agua.

8 Métodos de determinación de la cantidad de proteínas en los tejidos y de algunos productos de su metabolismo Una serie de los métodos de determinación cuantitativa de las proteínas se basa en la medición de la cantidad total de nitrógeno en una muestra pesada de tejido. al floculo de la mucina en el primer tubo de ensayo se le añade 1 ml de disolución de hidróxido sódico al 10%.25g se calcula el contenido de proteína en ese tejido. y al diluirse la mucina.25 g de proteína (100:16 = 6. 60 . Partiendo de este índi-ce. La reacción es debida a la presencia. 2. y estos últimos dan con el α-naftol sustancias coloreadas. se realiza la reacción de biuret Para ello se añade 5 a 6 gotas de hidroxido sódico y 1 ó 2 gotas de sulfato cúprico. El nitrógeno total en las proteínas de los tejidos y órganos anímales es una magnitud relativamente estable y constituye de 15 a 17%. La última cifra es coeficiente proteínico medio. 3. Al flóculo de mucina en el tercer tubo se le añaden 5 0 6 gotas de ∞-naftol. en el grupo prostético. ácido sulfúrico concentrado. Después del lavado. a 6. y 1 g de nitrógeno. LUPE JIBAJA 1. de la mucina de los monosacáridos y sus derivados que bajo la influencia del ácido sulfúrico se convierten en furfural e hidroximetilfurfural.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. un 16% en promedio.25). 16 g de nitrógeno corresponden a 100 g de proteína. En el segundo tubo de ensayo se añade 1 ml de disolución de ácido clorhídrico al 0. 3. se mezcla y se agrega. El tubo de ensayo se agita y se observa un cambio del color por el rosa o violeta. es decir.1%. Multiplicando el contenido de nitrógeno en d tejido hallado (en un tanto por ciento) por 6. con cuidado. En el límite entre dos capas de líquido surge una coloración violeta. y se observa la disolución de la mucina. se mezcla.

Clara de huevo diluida con agua 4 veces.8. disolución al 1%. Instrumentos. En un tubo de ensayo se vierten 10 ml de disolución estándar de gelatina. Marcha de los trabajos. Gelatina. Embudos con filtros Espectrocolorímetro.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. Hidróxido sódico (potásico). Sulfato cúprico. 10 ml de clara de huevo diluida. Reactivos. En ambos tubos de ensayo se añaden 1 ml de disolución de álcali al 30% y 1 ml de disolución de sulfato cúprico al 1%. se mezcla bien. disolución al 30%. La cantidad de proteína (%) en una disolución de concentración desconocida se calcula por la formula: x= 1⋅ h ⋅ 4 h1 donde x es la cantidad de proteína. %. Soporte con tubos de ensayo. disolución al 1%. en el otro. 4 es el grado de dilución de la clara de huevo. 1 es la concentración de la disolución estándar.1 Determinación cuantitativa de la proteína mediante la reacción del biuret El método se basa en la capacidad de las proteínas de dar con sulfato cúprico una coloración violeta cuya intensidad depende de la cantidad de proteína (enlaces peptídicos) en el tejido a investigar.8. h es la altura de la columna del liquido estándar. Pipetas de 1 y 10 ml. 3. LUPE JIBAJA 3. se filtra y se mide la coloración. h1 es la altura de la columna de la disolución a investigar.2 Determinación cuantitativa de la proteína en los líquidos biológicos con ayuda del ácido nítrico 61 .

2 ml de ácido nítrico concentrado. del segundo tubo de ensayo también se traslada 1 ml de disolución de proteína y se aplica sobre el ácido nítrico del segundo tubo de ensayo. se mezcla. se mezcla. desde el quinto tubo de ensayo se toma 1 ml y se bota en un vaso. 1 ml de agua destilada en cada uno. anotando el tiempo. Se numeran 5 ó 6 tubos de ensayo. se toma 1 ml del cuarto tubo de ensayo y se traslada en el quinto. se disuelven en 500 ml de agua y se filtran a través de cuatro capas de gasa). y así se procede con los demás tubos de ensayo.125 5 En otros cinco tubos de ensayo se vierten. Luego 1 ml de disolución de proteína del primer tubo de ensayo se aplica. La 5 0. LUPE JIBAJA El método esta basado en la capacidad del ácido nítrico de precipitar la proteína al cabo do dos minutos.0 2 0. siendo la concentración de la proteína en disolución no menos de 0. se toma 1 ml del tercer tubo de ensayo y se traslada en el cuarto.5 3 0. se mezcla con agua. Soporte con tubos de ensayo. Pipetas de 1 y 2 ml. Marcha de los trabajos. con cuidado. Ácido nítrico concentrado. se toma 1 ml de esta mezcla y se traslada en el tercer tubo de ensayo. en cada uno. registrando el tiempo. se mezcla. Reactivos. se obtiene la siguiente serie de diluciones: Tabla 1: Diluciones Numero del tubo de ensayo Dilución 1 1.25 4 0.0033%. sobre el ácido nítrico en el primer tubo de ensayo de esta serie. En el primer tubo de ensayo se vierte 1 ml de disolución de proteína. Disolución de proteína (la preparación: se separan claras de dos huevos de gallina.062 62 .BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. En el segundo tubo de ensayo se añade 1 ml de disolución de proteína. Instrumentos. en los otros. De esta manera.

3 Determinación cuantitativa de la proteína según el método de Lowry Entre los métodos basados en la determinación cuantitativa de las proteínas por sus reacciones coloreadas.n.0033. Esta reacción consisto en la reducción de una mezcla de ácidos fosfowolfrámico y fosfomolíbdico (reactivo de Folin) con formación de un complejo de color azul. LUPE JIBAJA ultima disolución en que aparece un anillo blanco de precipitado al final del segundo o al principio del tercer minuto. 165) y la reacción con las unidades de tirosina y cisteina en la molécula proteínica. La cantidad de proteína en la disolución a investigar es igual a x = 0. este método se usa para analizar las proteínas en elevados de las columnas en la cromatografía de intercambio iónico o en la filtración por gel. Como regla. como también para determinar las 63 . contendrá 0.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra.0033% de proteína. lo que tiene aplicación en la practica de veterinaria y medicina. donde n es la dilución en dicho tubo de ensayo. Este método puede utilizarse para la determinación de la cantidad de proteína en la orina y otros líquidos biológicos. 3. pero muy sensible.8. Por lo tanto el método de Lowry permite determinar las proteínas en disoluciones muy diluidas en que su cantidad se expresa en términos de una o varias decenas de microgramos por mililitro. el mis ampliamente usado y el más sensible es el método de Lowry. El método de Lowry se basa en la medición de la intensidad de la coloración de la disolución en que se verifican simultáneamente por lo menos dos reacciones coloreadas: la reacción del buiret (véase la pag. La segunda reacción no es muy especifica.

se agregan 160 g de sulfato de litio. Disolución B: sulfato cúprico. Disolución C: la mezcla de 50 ml disolución A y 1 ml de disolución B (exactamente) que se prepara antes del experimento. la se hierve bajo la campana de humos (sin refrigerante) durante un tiempo de 10 a 15 min. Esta mezcla se hierve con refrigerante de reflujo durante 10—12 h. se añaden 50 ml do disolución de ácido ortobórico al85% y 100 ml de ácido clorhídrico concentrado. de esta manera se obtiene la disolución B. LUPE JIBAJA proteínas en el suero de la sangre. Instrumentos: Soporte con tubos de ensayo. Para eliminar el exceso de bromo. 64 . Inmediatamente antes de usar. y a base de los resultados de valoración se diluye con agua hasta obtener la disolución 1 N. recristalizada cuatro voces. Pipetas graduadas de 1.5 y 10 ml.BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra. Albúmina de huevo. 50 ml de agua y varias gotas de bromo. Fotoelectrocolorímetro. o disolución D (la preparación: en 700 ml de agua se disuelven 100 ml dc wolframato sódico Na2W04. disolución al 1%. Terminada la ebullición. tartrato potásico. la disolución se filtra a través de algodón de vidrio y se guarda en un frasco bien cerrado con tapón de goma.2H2O. Reactivo de Folin. Probetas graduadas de 10 y 50 ml. la mezcla se diluye con agua hasta 1 L se filtra a través de algodón de vidrio lavado previamente con agua destilada. Esta disolución se prepara en tal cantidad que alcance para trabajar con todos los grupos de disoluciones. Una vez preparada. El reactivo de Folin se valora con disolución 1 N de hidróxido sódico según la fenoftaleina. Al enfriarse. Reactivos: Disolución A: carbonato sódico al 2% en disolución de hidróxido sódico al 1%. ambas disoluciones se mezclan en proporción 1:1. Se guarda en frasco oscuro).2H20 y 25 g de molibdato sódico Na2Mo04. la linfa y los homogeneizados desgrasados de los tejidos. disolución al 2%.

BIOQUIMICA PRÁCTICA Dra.2 1 Extinción 0. Las pruebas se dejan en reposo durante 30 min.2 0 0 20 40 60 80 10 12 14 16 18 0 0 0 0 0 Contenido de proteina de la prueba Ilustración 3. 1. al cabo de los cuales la coloración se prepara con filtro de luz roja. se mezcla bien y se deja en re poso durante 10 min a temperatura ambiente..9 ml de reactivo D y el contenido se mezcla en seguida (!). LUPE JIBAJA Marcha de los trabajos: En un tubo de ensayo se echa 0.6 0. se añaden 9 ml de reactivo C.8 0. Luego se añaden 0. El calculo se hace según el grafico de calibración que se prepara con disoluciones estándar de albúmina de huevo.4 0. 65 .Curva de calibración para determinar la concentración de la proteína.1 ml de suero de la sangre o disolución de otra proteína.

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