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Ultrassom pulsado de baixa intensidade no tratamento de úlceras venosas crônicas: avaliação histopatológica pelo ImageJ

Ana Elisa S. Jorge1 e Marco Andrey C. Frade1,2 1 Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia – EESC/ FMRP/ IQSC – USP, São Carlos, Brasil 2 Divisão de Dermatologia do Departamento de Clínica Médica – FMRP/ USP, Ribeirão Preto, Brasil anaelisa.jorge@gmail.com
Resumo - A úlcera venosa representa a maior incidência (70 a 80 %) das úlceras de perna. Os impactos psicossocial e econômico dessas lesões crônicas repercutem em elevados custos financeiros e em má qualidade de vida aos pacientes acometidos. Este artigo apresenta a avaliação histopatológica de úlceras venosas crônicas tratadas pelo ultrassom pulsado de baixa intensidade. Para tanto, durante 90 dias, úlceras venosas (N = 8) foram irradiadas 3 vezes por semana com um aparelho de US (intesidade SATA de 30 mW/cm2; frequência de ressonância de 1,5 MHz; modo pulsado) elaborado pelo Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia da Escola de Engenharia de São Carlos/USP. As biópsias, realizadas na borda e no centro dessas feridas, foram colhidas no 1º (inicial) e 45º dias de seguimento terapêutico. A partir das lâminas processadas com hematoxilina-eosina, as imagens obtidas foram analisadas pelo software ImageJ para quantificação de fibroblastos, células inflamatórias e vasos sanguíneos. Os resultados estatísticos (modelo de Poisson com efeitos aleatórios) apontaram diferenças significativas (p < 0,05) tanto entre as duas regiões observadas (borda/centro) quanto nos diferentes períodos realizados (1º/45º dias) para as diferentes variáveis. Com isso, podemos afirmar que a aplicação da onda sonora estimula o reparo tecidual de úlceras venosas crônicas por acelerar a fase inflamatória e ativar a fase proliferativa da cicatrização. Palavras-chave – úlcera venosa, ultrassom, análise histopatológica, ImageJ.

fundamentais para a cicatrização. Desempenha também um papel importante no recrutamento de fibroblastos [9] – [11], os quais sintetizam matriz extra-celular para dar suporte ao tecido neo-formado. Além disso, esse estímulo sonoro incrementa a angiogênese local [12], [13], [14], o que contribui para a formação do tecido de granulação, que dará suporte à migração dos fibroblastos. Dessa forma, o US acelera as fases inflamatória e proliferativa da cicatrização, o que favorece o reparo tecidual das úlceras crônicas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia do tratamento de úlceras venosas crônicas com US pulsado de baixa intensidade pela análise histopatológica - contagem de fibroblastos, células inflamatórias e vasos sanguíneos. II.
MATERIAIS E MÉTODOS

I. INTRODUÇÃO s úlceras venosas são feridas crônicas que advêm da Insuficiência Venosa Crônica (IVC), caracterizada pela hipertensão venosa crônica. Tal deficiência ocasiona mudanças estruturais nos capilares sanguíneos, edema, inflamação, necrose, ulceração e fibrose da pele [1]. O objetivo das pesquisas no reparo dessas feridas é desenvolver produtos, técnicas e métodos que estimulem e acelerem o processo cicatricial e evitem recidivas. Dentre as inúmeras formas de tratamento das úlceras venosas crônicas, o uso terapêutico do ultrassom (US) pulsado de baixa intensidade está indicado como co-adjuvante. Desde a década de 60, pesquisas apontam evidências consideráveis sobre uso do US como recurso terapêutico na cicatrização dessas feridas [2] – [7]. O US pulsado de baixa intensidade é tido como um agente pró-inflamatório, pois potencializa a resposta macrofágica [8] no sítio da lesão, facilitando o desbridamento de tecidos desvitalizados ou necróticos da ferida e aumentando a liberação de fatores de crescimento

A

Oito pacientes com úlceras venosas crônicas (caracterizadas clinicamente pelos sinais de IVC, como edema, varicosidades, eczema e lipodermatoesclerose) foram tratados no Ambulatório de Úlceras da Dermatologia (AUD) do Centro Saúde Escola (CSE) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do CSE conforme processo número 019/2008. O tratamento consistiu na troca do curativo diariamente (comumente realizado apenas com gazes e soro fisiológico 0,9%) e na aplicação do US, realizada pelo fisioterapeuta responsável. A. Aplicação do US O Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia da Escola de Engenharia de São Carlos/USP forneceu o aparelho de US com as seguintes características: baixa intensidade (30 mW/cm2); modo pulsado com burst de 1,5 MHz; largura de pulso 200 µs; frequência de repetição de pulso de 1 kHz e diâmetro do transdutor de 22 mm. Após assepsia com álcool 70%, o transdutor foi coberto por um filme de PVC a fim de promover higiene adequada na interface aparelho/paciente. Como agente acoplador, foi utilizado um gel estéril à base de água, demonstrado pela Fig. 1.

Fig. 3 – Amostragem para a variável Fibroblasto. Com aumento de 400 vezes. Fig. células inflamatórias e vasos sanguíneos do tecido ulcerado a partir do ImageJ.0 (Leica® Microsystems . Estudo Histopatológico As biópsias foram executadas pelo dermatologista responsável do AUD em duas etapas: 1º dia (prétratamento) e após 45 dias. os testes foram estabelecidos com 95% de potência (p < 0. respectivamente. III. como mostra a Fig.05) a fim de verificar possíveis diferenças significantes entre os grupos. coradas por Hematoxilina-Eosina (HE). foi possível fazer a contagem do número de fibroblastos. Análise das Imagens Para análise das imagens foi utilizado o programa ImageJ versão 1. células inflamatórias e vasos sanguíneos encontram-se nas Fig. RESULTADOS E DISCUSSÃO Fig. A análise estatística dos dados obtidos pela contagem de fibroblastos. 2. Análise Estatística O modelo de Poisson com efeito aleatório foi utilizado para analisar a contagem de Fibroblastos.36. 4 e 5. Com um punch de 6 mm foram colhidos fragmentos da borda e do centro das úlceras. C. processa e analisa imagens em computadores que possuam Java. 4 – Amostragem para a variável Células Inflamatórias. Células Inflamatórias e Vasos Sanguíneos nos diferentes dias analisados (1º e 45º dia) e em ambos locais da ferida (borda e centro). para posterior processamento.Wetzlar. B. de acesso livre. 1: Aparelho de US e seu transdutor devidamente acondicionado. 3.2.versão 3. As imagens dessas lâminas foram capturadas pela câmera Leica® DFC 280 embutida no microscópio óptico Leica® DM 4000B e processadas pelo software LAS Leica® Application Suite . emblocagem e confecção das lâminas. células inflamatórias e vasos sanguíneos corados com HE (400x). . foram obtidos 10 campos (264 x 211 µm) aleatórios de cada lâmina para posterior quantificação no ImageJ. Fig. O US foi aplicado sobre o leito da úlcera na técnica estacionária durante 3 minutos até cobrir toda extensão dessa ferida.D. 2 .Contagem de fibroblastos. Alemanha) no Laboratório da Dermatologia da FMRP/USP. Para tanto. Com as imagens obtidas pelo software LAS. Esse software.

Essa observação é corroborada pelo estudo de [9]. p. B. São Carlos. Schöpf e W. “Molecular mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts” The Journal of Biological Chemistry. Sept. J. 1993 M. L. Peschen. Seufferlein. T. 2. o estímulo sonoro diminuiu significantemente a quantidade do infiltrado inflamatório do centro da úlcera. Santana. local em que ocorre a proliferação das células quiescentes que darão suporte à reepitelização da ferida. 3. Breitbart. Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia. Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia. que observaram um aumento significativo de fibroblastos em lesão de pele de ratos tratada com US pulsado de intensidade SATA de 0. Dyson e W. pp. Dyson. J. M. Schmelz. n. EESC/FMRP/ IQSC/USP. 4. 1990. vol. Dyson. 89 pp. Uhlemann. 77. Zhao. Devido a isso. vol. 1978. “Tratamento de úlceras venosas por ultra-som de baixa intensidade: avaliação por análise de imagem e imunohistoquímica”. Essa observação está de acordo com o estudo de [10]. por aumentar significantemente o número de vasos sanguíneos na borda da úlcera. 5 – Amostragem para a variável Vasos Sanguíneos. [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] . 232236. Weichenthal. que também indica um aumento na resposta macrofágica em culturas de células irradiadas com US de intensidade baixa (0. S.75MHz. Já na variável células inflamatórias. 3. pelo apoio financeiro. R. 1976. 153 pp. 54463-54469. n. F.. EESC/FMRP/IQSC/USP. Stegmann e E. 175-80. [2] [3] [4] [5] [6] [7] Fig. Callam. Ultrasound in Medicine and Biology. Acta Dermatology and Venereology (Stockholm). vol. vol.. quanto no centro da úlcera. vol. 1990. Zhou. Webster. São Carlos: EESC/FMRP/IQSC -USP. 2006.1 W/cm2. P. Vanscheidt. Li e J. L. 2004. 4. “Reparação Epitelial em Úlceras Vasculares após Estimulação do Ultra-Som Pulsado de Baixa Intensidade”. D. 127 pp. “The effect of therapeutic ultrasound on angiogenesis”. Wollina. Harvey. “Lowfrequency ultrasound treatment of chronic venous ulcers” Wound Repair and Regeneration. n. n. A. pp. pp. S. 2000. W. 1997. vol. S.. 52. 5. 2003. C. Marilena Heredia e à CAPES. “Macrophage responsiveness to therapeutic ultrasound”. 28. Young e M. M. 187. A. “Lowfrequency ultrasound treatment of chronic venous leg ulcers in an outpatient therapy”. 204-206. Heinig e U. o US pode acelerar a cicatrização da úlcera por atingir a fase proliferativa mais rapidamente. “Therapeutic ultrasound in lower extremity wound management”. 343-51. J. 1990. Hilário. pp. M. AGRADECIMENTOS À técnica do Laboratório da Dermatologia da FMRP/USP. Pond. São Carlos. 3. pp. The Lancet. podemos afirmar que o US incrementou significantemente a proliferação dessas células. IV. C. R. W. 1997. M. pp. n. Dissertação de Mestrado. vol. vol. M. R. CONCLUSÃO Podemos afirmar que a aplicação do US pulsado de baixa intensidade estimula o reparo tecidual de úlceras venosas crônicas por acelerar a fase inflamatória e ativar a fase proliferativa da cicatrização. Dyson. 65S-70S. vol. S. onde inicialmente continha mais células. Isso ocorre porque o estímulo sonoro potencializa a resposta macrofágica. B. Em relação ao número de fibroblastos antes do tratamento e após 45 dias. D. Franks e J. Young e M. vol. tanto na borda. Anastácio. “Stimulation of healing of varicose ulcers by ultrasound”. 261-269. pp. M. Weichenthal. Mohr. Young e M. Ultrasound in Medicine and Biology. 279. 2004. 152-7. “Understanding chronic wounds: a unifying hypothesis on their pathogenesis and implications for therapy” The American Journal of Surgery. A. M. n. 16. pp. E. 2. July 1987. 16. Suckling. encurtando a fase inflamatória. Dyson. n. O US apresentou também um papel angiogênico [14].REFERÊNCIAS [1] T. 14. 311-4. vol. 8. pp. 5. 1. aumentando a síntese da matriz extra-celular (principalmente colágeno). pp. Mustoe. Dissertação de Mestrado. “A controlled trial weekly ultrasound therapy in chronic leg ulceration”. 18-22. “Radiação Ultra-Sônica de Baixa Intensidade na Reparação Tecidual de Úlceras Tróficas de Perna”. n. Y.5 W/cm2) e frequência de 0. 809-816. Ultrasonics. Dissertação (Mestrado) Programa de PósGraduação Interunidades em Bioengenharia. Lower Extremity Wounds. “The role of cavitation in the in vitro stimulation of protein synthesis in human fibroblasts by ultrasound” Ultrasound in Medicine and Biology. “Effect of therapeutic ultrasound on the healing of full-thickness excised skin lesions” Ultrasonics.