UNIVERSITATEA TRANSILVANIA BRAŞOV FACULTATEA DE ALIMENTAŢIE ŞI TURISM

LUCRĂRI PRACTICE DE MICROBIOLOGIE ALIMENTARA

Dr. Puchianu Gheorghe Medic Primar Veterinar Doctor în Ştiinţe Medicale Veterinare

Dr. Drăghici Emilia Medic Veterinar Cercetător Ştiinţific

2010

1

Condiţiile pentru funcţionarea laboratoarelor supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor

Funcţionarea laboratoarelor în care se desfăşoară activităţi supuse autorizării sanitare veterinare şi/sau pentru siguranţa alimentelor este condiţionată de autorizarea acestora de către autorităţile competente. Categoriile de laboratoare supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor, sunt: laboratoarele de referinţă: pentru siguranţa alimentelor, organizate în cadrul Institutului de Igienă şi Sănătate Publică Veterinară; • alte laboratoare naţionale de referinţă desemnate prin ordin al preşedintelui Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor; • laboratoare sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene, respectiv al municipiului Bucureşti, organizate în cadrul direcţiilor sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene, respectiv a municipiului Bucureşti; • laboratoare sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor organizate în cadrul unităţilor de învăţământ medical veterinar superior de stat, desemnate de autoritatea competentă să efectueze anumite analize sau examene în cadrul controlului oficial; • laboratoare organizate în cadrul institutelor de cercetare de stat în care se desfăşoară activităţi supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor; • laboratoarele private sanitare veterinare şi/sau pentru siguranţa alimentelor, care includ:laboratoare sanitare veterinare şi/sau pentru siguranţa alimentelor particulare ori organizate în unităţi private în care se desfăşoară activităţi sanitare veterinare şi/sau pentru siguranţa alimentelor;laboratoare organizate în unităţi în care se desfăşoară activităţi supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor, cunoscute sub denumirea de laboratoare uzinale; • laboratoare sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor organizate în cadrul unităţilor de învăţământ medical veterinar superior privat, desemnate de autoritatea competentă să efectueze anumite analize sau examene în cadrul controlului oficial; • laboratoare organizate în cadrul institutelor de cercetare private în care se desfăşoară activităţi supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor. Laboratoarele naţionale de referinţă sunt autorităţi centrale pentru domeniile de competenţă autorizate, iar laboratoarele sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene, respectiv al municipiului Bucureşti, sunt autorităţi judeţene în domeniu. Acestea funcţionează sub coordonarea tehnică şi operaţională a Serviciului de coordonare tehnică a institutelor de referinţă şi a laboratoarelor
2

sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor din cadrul Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor. Laboratoarele sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor de supraveghere şi diagnostic din structura institutelor veterinare centrale sunt autorităţi centrale pentru domeniul lor de competenţă şi funcţionează sub coordonarea tehnică, controlul şi supravegherea Serviciului de coordonare tehnică a institutelor de referinţă şi a laboratoarelor sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor din cadrul Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor. Laboratoarele sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene, respectiv al municipiului Bucureşti, sunt autorităţi judeţene pentru domeniile lor de competenţă şi funcţionează în cadrul direcţiilor sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene şi a municipiului Bucureşti, sub coordonarea tehnică a laboratoarelor din cadrul institutelor veterinare centrale şi coordonarea operaţională prin Serviciul de coordonare tehnică a institutelor de referinţă şi a laboratoarelor sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor din cadrul Autorităţii Naţionale Sanitare Veterinare şi pentru Siguranţa Alimentelor. Laboratoarele sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor organizate în cadrul unităţilor de învăţământ medical veterinar superior de stat şi privat nu au statutul de autorităţi în domeniu şi funcţionează sub supravegherea tehnică a institutelor veterinare centrale. Laboratoarele organizate în cadrul institutelor de cercetare de stat şi private în care se desfăşoară activităţi supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor nu sunt autorităţi în domeniu şi funcţionează sub supravegherea tehnică a institutelor veterinare centrale. Celelalte laboratoare private în care se desfăşoară activităţi supuse controlului sanitar veterinar şi pentru siguranţa alimentelor nu sunt autorităţi în domeniu şi funcţionează sub supravegherea tehnică a direcţiilor sanitar-veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene şi a municipiului Bucureşti, prin laboratoarele sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene, respectiv al municipiului Bucureşti. Buletinele de analiză emise de laboratoarele autorizate – Laboratoarele naţionale de Referinţă şi Laboratoarele sanitare veterinare Judeţene, precum şi cele emise de laboratoarele sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor organizate în cadrul unităţilor de învăţământ medical veterinar superior de stat şi privat autorizate au caracter oficial. Activităţile pentru care se autorizează laboratoarele în care se desfăşoară activităţi supuse autorizării sanitare veterinare şi/sau pentru siguranţa alimentelor, menţionate în domeniul siguranţei alimentare sunt următoarele: 1. laborator de microbiologia alimentelor şi a hranei pentru animale - cu profilurile: a) microbiologia produselor şi subproduselor animaliere şi de origine animală; b) microbiologia produselor de origine nonanimală;
3

c) microbiologia hranei pentru animale şi apei; 2. laborator de analize fizico-chimice ale alimentelor şi hranei pentru animale - cu profilurile: a) analize fizico-chimice ale produselor şi subproduselor animaliere şi de origine animală; b) analize fizico-chimice ale produselor de origine nonanimală; c) analize fizico-chimice ale hranei pentru animale; 3. laborator pentru controlul radioactivităţii şi detecţia alimentelor iradiate cu profilurile: a) controlul radioactivităţii; b) detecţia alimentelor iradiate; 4. laborator pentru controlul reziduurilor - cu profilurile: a) control reziduuri la animale vii; b) control reziduuri la produse animaliere şi de origine animală; c) control reziduuri din apă şi hrană pentru animale; d) control reziduuri la produse de origine nonanimală.

Condiţii pe care trebuie să le îndeplinească un laborator Condiţii de amplasare - trebuie să includă: referinţe generale privind distanţele, structura terenului şi nivelul apei freatice, existenţa căilor de acces adecvate, a unei suprafeţe de teren de rezervă sau tampon pentru eventuala extindere. Amplasarea clădirilor destinate laboratoarelor se face astfel încât: distanţa faţă de clădirile învecinate şi drumurile publice să fie astfel proiectată încât să asigure respectarea prevederilor legale privind protecţia mediului, siguranţa clădirilor, sănătatea publică şi sănătatea animalelor; structura terenului şi nivelul apelor freatice să permită amplasarea construcţiei în conformitate cu reglementările în vigoare; să aibă căi de acces proprii adecvate scopului de activitate. • Condiţii pentru construcţie 1. Condiţiile pentru construcţie trebuie să includă: natura şi calitatea materialelor de construcţie, a fundaţiei, a pavimentelor, a suprafeţelor interioare, a uşilor şi ferestrelor, a acoperişului şi a echipamentelor de iluminare, ventilaţie şi protecţie antiseismică. 2. Construcţia realizată trebuie să fie rezistentă, să aibă spaţiu suficient pentru desfăşurarea proceselor de lucru şi să asigure condiţiile pentru aplicarea măsurilor de igienizare, realizarea confortului termic şi condiţiile tehnice de funcţionare a echipamentelor.
4 •

3. Materialele de construcţie trebuie să fie netoxice, impermeabile,

netede, rezistente la uzură şi coroziune şi să se poată curăţa uşor. Nu se acceptă folosirea materialelor absorbante, poroase, greu de curăţat. 4. Pavimentele şi pereţii interiori trebuie construiţi din materiale netoxice, rezistente la agenţi fizici şi chimici, impermeabile, neputrezibile şi netede, încât să permită igienizarea uşoară şi eficientă a acestora, protecţia termică şi protecţia fonică. 5. Tavanele din spaţiile de lucru trebuie construite din materiale netoxice, rezistente la agenţi fizici şi chimici, impermeabile, neputrezibile şi netede, încât să permită igienizarea uşoară şi eficientă a acestora, protecţia termică şi protecţia fonică, şi să fie situate la o înălţime corespunzătoare, adecvată specificului activităţii. 6. Instalaţiile electrice trebuie astfel proiectate şi instalate încât să respecte reglementările în vigoare cu privire la energia consumată, protecţia mediului, a sănătăţii publice şi sănătăţii animalelor. 7. Corpurile de iluminat trebuie astfel amplasate încât să asigure iluminatul adecvat specific activităţii. 8. Uşile şi ferestrele trebuie confecţionate din materiale netoxice, rezistente la agenţi fizici şi chimici, impermeabile, neputrezibile şi netede, încât să permită igienizarea uşoară şi eficientă a acestora, protecţia termică, protecţia fonică, adecvate specificului activităţii. 9. Acoperişul trebuie să fie construit din materiale rezistente şi impermeabile. 10. Ventilaţia se asigură în toate spaţiile de lucru şi administrative prin mijloace adecvate, prin sisteme generale şi/sau autonome de climatizare, cu excepţia spaţiilor speciale în care se realizează activităţi ce necesită presiune negativă sau alte mijloace de biosecuritate. Condiţii privind utilităţile 1. Condiţiile privind utilităţile trebuie să includă: aprovizionarea cu apă potabilă şi utilitară, alimentarea cu energie electrică, asigurarea condiţiilor de microclimat, gestionarea şi neutralizarea deşeurilor, sistemul de canalizare, aprovizionarea cu gaze naturale, protecţia mediului şi condiţii de biosecuritate. 2. Laboratorul trebuie să se aprovizioneze numai cu apă potabilă în cantităţi suficiente pentru necesităţile pe flux şi pentru procesul de igienizare. Apa potabilă trebuie să provină fie din reţeaua de aprovizionare a municipiului sau localităţii, fie din sursă proprie. 3. În cazul în care unitatea/instituţia posedă staţie de clorinare proprie, se prelevă obligatoriu probe de apă din conducta de aducţie a apei, apă neclorinată şi după clorinare, pentru a se urmări eficienţa operaţiei de clorinare a apei. 4. Apa potabilă trebuie distribuită în toată reţeaua sub presiune adecvată şi continuă şi în cantităţi suficiente pentru acoperirea tuturor necesităţilor de funcţionare a instituţiei. 5. Trebuie să se asigure atât apă rece, cât şi apă caldă. Apa caldă este furnizată dintr-o instalaţie centrală pentru încălzirea şi distribuirea apei calde sau de la instalaţii parţiale.
5

Incinta de utilitate a instituţiei trebuie să fie betonată sau asfaltată şi prevăzută cu sistem de canalizare corespunzător. Examenul bacteriologic Examenul bacteriologic presupune izolarea. 11. instalaţii pentru menţinerea parametrilor de temperatură în spaţiile de lucru sau în cele în care este amplasată aparatura de lucru. în special aparatura de înaltă precizie. Grupurile sociale trebuie dimensionate în funcţie de personalul care activează în laboratoare. Laboratorul trebuie să fie prevăzut cu o reţea de canalizare corespunzătoare.verde. Conductele de apă trebuie să fie precis identificate. Având în vedere profilul de activitate al laboratorului şi amplasamentul acestuia. Acestea nu trebuie să constituie un pericol de contaminare pentru spaţiile de lucru sau pentru zonele învecinate. conducte de canalizare . Alimentarea cu energie electrică trebuie să se realizeze din linia de joasă tensiune de 380/220 V şi sursă proprie. racordată la reţeaua de canalizare a localităţii/oraşului sau la un sistem propriu de evacuare. 15. 13. Apele uzate provenite din laborator trebuie tratate pentru a se preveni diseminarea oricărui factor de risc. în conformitate cu prevederile legale. cultivarea si identificarea germenilor bacterieni din diferite alimente suspecte de contaminare.6. după care acestea sunt preluate de o unitate specializată. 10. conducte de încălzire . Trebuie să existe o delimitare separată a fluxului de apă potabilă faţă de cel de apă nepotabilă.negru.galben. şi anume: conducte pentru apa potabilă . duşuri şi vestiare. conducte de gaze naturale . De-a lungul părţii externe a sistemului de canalizare trebuie amplasate guri de vizitare. În vederea prevenirii contaminării spaţiilor de lucru. în caz de avarie. 14. 8. Fata de 6 .roşu. Instalaţii pentru asigurarea parametrilor de microclimat în spaţiile de lucru. prin sistem separat de conducte.negru. 16. dotate cu instalaţie de apă rece şi caldă. pentru curăţenia curentă sau pentru deblocare în caz de accidente. precum şi procedura generală internă privind gestionarea deşeurilor. Pentru managementul deşeurilor rezultate din activităţile ce au loc în cadrul laboratoarelor sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene trebuie să se respecte reglementările în vigoare. Nu se admite utilizarea apei nepotabile în procesul de igienizare a spaţiilor de lucru şi a căilor de acces. conducte pentru apa nepotabilă . 9. Pentru aparatura cu risc de electrocutare trebuie asigurată centura de împământare. 7. astfel: instalaţii de captare şi evacuare a unor factori nocivi din spaţiile de lucru. Construcţia şi incintele trebuie să respecte condiţiile de mediu. 12. conductele interioare vor fi identificate vizibil prin culori diferite. materialul patologic şi deşeurile rezultate în urma activităţilor din laborator trebuie denaturate şi inactivate prin mijloace adecvate.

facând câteva miscari spre interior. d) Prin introducerea direct. in mediu a portiunilor de aliment. antraxului etc. flambând gura lor imediat dupa deschidere si inainte de inchidere. de exemplu darea in consum a unor produse animaliere care pot provoca la om infectii sau toxiinfectii. metodele bacteriologice complexe permit. mai ales carnea animalelor sacrificate de necesitate. la care intreruperea procesului patologic. Se cauterizeaza suprafafa probei cu o spatula incalzita. Ca principiu general. o cantitate de lichid organic din profunzime si se insaminteaza intâi pe mediul lichid (bulion). agar ou ser etc. prin sacrificare. Dupa fiecare proba. flambata si ea si racita. Este suficient sa se aminteasca pericolul pe care-l prezinta. se va evita deschiderea probelor alimentare sau secţionarea tesuturilor inainte de recoltarea materialului pentru examenul bacteriologic. Tehnica îsamânţarii .). acul se sterilizeaza prin inrosire la flacara.ca tehnici de insamintare pot fi aplicate mai multe procedee: a) Cu pipeta Pasteur. In unele laboratoare aceasta tehnica este folosita aproape in exclusivitate. uneori cu evolutie grava. prin aceste examene evitindu-se. toate transmisibile la om. iar dupa racire se inteapa prin suprafaţa cauterizata. Se scoate acul din si se face insamântarea prin clatirea acestuia in mediul lichid. pe lânga izolare si cercetarea diferitelor insusiri biologice care-l caracterizeaza. 7 . La inchiderea si deschiderea tuburilor se iau toate masurile de asigurare a sterilitatii. in special cind se banuieste saracia in germeni a materialului patologic. Fara a se flamba. b) Cu ajutorul acului de insamintare drept. eliminarea ei. leptospirozei. Examenul bacteriologic da adesea si indicii referitoare la sursa de infectie si permite deci. prin inclinari repetate. Un examen bacteriologic insa poate pune in evidenta agentii unei salmoneloze. agar cu singe. iar apoi pe mediul solid (agar inclinat. Metoda se foloseste mai rar. care permite decelarea prezentei agentului etiologic. se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur. Recoltarea si manipularea acestuia trebuie sa se faca in conditii de sterilitate perfecte. iar cu una din suprafeţele sectiunii se disperseaza materialul patologic pe suprafaţa unei placi cu mediu. dupa care se umecteaza intreaga suprafaţa a mediului cu acest lichid. face ca modificarile organoleptice si organice sa nu trezeasca suspiciune la examinare.examenul microscopic. Se cauterizeaza suprafaţa produsului alimentar si se sterilizeaza acul prin incalzire la rosu (tija se trece si ea de 3 ori prin flacara). sau se clateste acul in lichidul de condensare. Faptul are o deosebita importanta si din punct de vedere epidemiologic. incepând de la baza mediului spre partea superioara. acul se introduce apoi in tubul cu mediul solid. Când alimentul a fost recoltat in conditii de sterilitate (mai ales in cazul animalelor mici) se poate recurge la secţionarea unor bucaţi cu ajutorul unor instrumente sterile. facându-se pe suprafaţa acestuia miscari in zig-zag. c) Cu porţiuni de aliment.

în timpul operaţiunilor de însămânţare se evită pe cât posibil conversaţia şi orice mişcare de prisos în jurul operatorului. transplantarea se face cu pipeta Pasteur sau cu ansa de insamintare. etc. fie menţinerea lor in timp.4). conditiile lor optime de dezvoltare. In general. daca este cazul). 8 . In cel de al doilea. Un mediu de cultura trebuie sa asigure substratul nutritiv pentru cresterea si multiplicarea microbilor. imediat după însămânţare se face notarea tuburilor cu creioane speciale fără a se omite data însămânţării. Are ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor germeni in stare pura.Tehnica transplantarilor. sigur si prompt. masă de lucru.). se recolteaza o cantitate arbitrara (câteva picaturi) din cultura veche. sterile sau însămânţate sunt deschise. - Mediile de culture folosite pentru izolarea diferitelor tipuri de bacterii Pentru a pune un diagnostic bacteriologic corect. dupa care se face insamântarea pe mediile proaspete (intâi in mediul lichid si apoi in mediul solid. care apoi se depune pe mediile proaspete. este necesar sa se aiba in vedere câteva reguli general valabile: însămânţările se execută în boxe sterile sau în hote speciale care permit sterilizarea periodică şi nu permit formarea de curenţi de aer în timpul lucrului. In primul caz. folosirea unor medii de cultivare corespunzatoare este de o importanta hotărâtoare. sa asigure condiţiile de aerobioza sau anaerobioza. microbii patogeni se dezvolta optim la temperature corpului speciei de la care sunt izolati. in conditii de laborator (tulpini de colectie). in funcţie de specia microorganismului in cauza. transplantarea se face cu ansa. sa aibe un pH care sa permita desfasurarea normala a proceselor metabolice microbiene (in general 7. ansa cu care se execută însămânţarea nu trebuie să fie atinsă de nici un obiect nesteril (mână. bacteriologul trebuie sa foloseasca mediile cele mai eficiente si indicate de izolare. raclând o cantitate foarte redusa de cultura.2—7. se introduce ansa flambata si racita in cultura veche. halat. însămânţările se vor executa cât mai repede. Din culturile pe medii solide. vor fi ţinute în poziţie înclinată cât mai aproape de flacără pentru a evita contaminarea cu germeni sau spori din atmosferă. Cunoscânduse insusirile germenilor cautati. In timpul insamântarilor de orice natura. Din culturile pe medii lichide. sa fie pastrate in recipiente care sa impiedice contaminarea cu alti microbi si sa fie usor de manevrat. în timpul cât recipientele sau tuburile de cultură. care apoi se insamânteaza in mediul proaspat. cu scopul de a reduce la minim contactul materialului de însămânţat cu atmosfera ambiantă.

dar care are largi utilizari.apa distilata . cultivarii si cercetarii insusirilor biologice ale anumitor specii de germeni. in special când i se adauga zaharuri. Ele pot fi: pentru bacterii aerobe. Mediile de cultura se pot imparti in doua categorii: medii uzuale (obişnuite) . Ele evidenţiaza anumite procese biochimice caracteristice metabolismului anumitor specii de bacterii.favorizeaza dezvoltarea anumitor germeni. — medii speciale. oxidoreductoare etc. Ele mai pot fi sistematizate în medii: de izolare. Exista si medii . mediile sintetice au avantajul ca permit anumite determinari capabile sa ofere relatii asupra metabolismului bacterian (prin dozarea inainte si dupa cultivare a diferitelor componente se poate cunoaste ce anume a fost consumat in cursul multiplicarii si in ce cantitate). Astfel de medii sint mediul Kaufmann—Muller (pentru enterobacteriaceae). In comparatie cu bulionul. lichide. ei necesitând anumite condiţii speciale sau anumiţi . Dintre cele mai frecvent folosite medii de cultura sunt : Apa peptonata . prin compoziţia lor chimica.). Mediile selective favorizeaza.peptona . Se prepara din: . agarul sau alte medii ale caror componente nu sunt identificate chimic in totalitate.sintetice" bazate pe componente cunoscute din punctul de vedere al structurii lor chimice. pentru bacterii anaerobe. Astfel sint mediul Wilson—Blair si Drigalski (pentru salmonele).0 ml 1. mediile Czapek. Salmonella). selective. mediul Istrati —Meitert (pentru Escherichia.pe care se dezvolta majoritatea germenilor patogeni. Includerea in componenţa acestor medii a unor substanţe indicatoare sau revelatoare este menita sa faca vizibil procesul respectiv. Shigella. destinate izolarii.. zaharolitice.Sunt insa si specii microbiene care prefera temperaturi mai joase ( ex. Mediile diferenţiale permit cresterea diferenţiata a unor specii microbiene sau pun in evidenţa anumite particularitati metabolice cu semnificaţie diagnostică.factori de plecare". in vederea determinarii spectrului zaharolitic al diferitelor specii de bacterii. • mediile speciale de izolare . diferentiale . Sabouraud (pentru ciuperci). mediul Chapman (pentru stafilococi patogeni). dezvoltarea anumitor germeni. leptospirele se multiplica la 28—30°C). • • • Dupa starea lor fizica mediile se pot imparti in: solide.este unul din cele mai simple medii de cultura. permitând in acest fel identificarea lor (fenomene proteolitice. semisolide. Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe.0 g 0.5 g 9 . care nu se pot cultiva de la inceput pe mediile obisnuite. de imbogatire.NaCl 100.. Mediile de imbogăţire sunt folosite pentru cazurile in care in produsul patologic de examinat se bănuieste o cantitate mica de germeni patogeni si un numar mare de germeni din flora de asociaţie.

La ora actuala. prevazute cu un tub de cauciuc si clemă. sau se toaca la masina de tocat came.4. in autoclavul cu capacul deschis (pentru a evita solidificarea pe parcursul filtrarii). reglabil (aşa numitele turnătoare de medii). mai rar din cea de pasare. care se astupa cu dopuri de vata si se sterilizeaza 30 minute la auitoclav la 115°C. timp de 15 minute la autoclav. Pentru repartizare se pot folosi pipete de 25—50 ml. Se astupa cu dopuri de vata. tendoane. Muschii se curaţa de aponevroze. dar cel mai practic este sa se folosesca dispozitive speciale constând din vase cu tubulura inferioara sau pâlnii suspendate. Oxoid etc.2—7. Se incalzeste la autoclav la 115°C timp de 15 minute. Pastrarea lui se poate face vreme indelungata in vase bine inchise. Apoi se face repartizarea in tuburi. Bulionul astfel preparat are un aspect asemanator cu untdelemnul si trebuie sa fie perfect limpede. Când se adauga zaharurile. 3 zile consecutiv. se sterilizeaza 20 de minute la 120°C dupa care eprubetele se pun in pziţie inclinata pentru solidificare. La 1 litru de bulion. pentru macerare. Se incalzeste la 80—90°C si se adauga peptona 10 g si NaCl 5 g la 1000 ml lichid. La 500 g tocatura.Se ajusteaza pH-ul la 7. se adauga albastru de bromtimol (12 ml la 1 litru de mediu) ca indicator si se sterilizeaza prin tindalizare 30 de minute. se incalzeşte 15 minute la 115°C pentru precipitare. acestea se pun in proportie de 1% in balonane separate. fascii si grasime. care se topeste apoi prin incalzire la 115°C. purificata si standardizata. Bulionul de carne se prepara mai ales din came de bovine şi cabaline. este din ce in ce mai raspindita folosirea extractelor de carne care sint livrate in stare deshidratata. in incaperi reci si la adapost de lumina.2—7. Se repartizeaza in eprubete sau alte recipiente unde urmeaza a fi pastrat. se tine 24 de ore la rece. In unele laboratoare exista dispozitive automatizate care asigura un debit constant. Acesta nu are nici un rol nutritiv. se decanteaza şi se stoarce. se calculeaza 30 g agar fibre sau 25 g agar pulvis. se adauga 1000 ml apa de robinet. Soluţia de albastru de bromtimol folosita in acest scop se prepara din: 1 g albastru de bromtimol + 25 ml NaOH n/10 + 475 ml apa distilata. dar determina solidificarea mediului.6) prin metoda colorimetrica. iar lichidul obtinut se filtreaza prin mai multe straturi de tifon si se completeaza cu apa la volumul iniţial. in cantitate de cca 5 ml. ceea ce impune o filtrare prin hirtie de filtru. Se filtreaza prin vata. se filtreaza prin hârtie de filtru si se sterilizeaza din nou !a autoclav. Agarul nutritiv (geloza) este un mediu solid obtinut prin adaugarea la bulionul de carne a agarului (fibre sau pulvis).). 10 . ceea ce asigura obţinerea unor medii de o calitate superioara (extractele Merck. se taie bucati mici. Incalzirea in prezenta NaOH produce o precipitare abundenta. apoi se fierbe 30 minute. Se ajusteaza pH-ul cu o solutie de NaOH n :1 (la 7. in sticle sau baloane.

ia nastere prin depunerea la fundul tubului a germenilor care s-au dezvoltat in mediu. In mediile lichide. germenii constituie. mediul folosit si uneori condiţiile de cultivare. dar in general este bine sa nu se prepare sarje prea mari pentru a dispune de mediu cât mai proaspat. Depozitul . aderent sau nu la fundul tubului. profilul. depozitul si formatiunile de suprafaţa. rugoasa. consistenta.Pastrarea se poate face in flacoane inchise etans pentru a evita pierderea apei. suprafata. incretita sau neteda. se au in vedere: dimensiunile.poate fi pronuntata. El poate fi discret sau abundent. prin multiplicare. culoarea. pina la ciţiva milimetri diametru. Examenul caracterelor culturale Dezvoltarea germenilor bacterieni pe mediile de cultura ia aspecte diferite in functie de specia in cauza. emulsionabilitatea. In aprecierea lor. discreta sau poate sa lipseasca. forma in ansamblu. opacitatea. Sub aspectul dimensiunii. Suprafata . vâscos sau pulverulent.mediului poate oferi aspectul unei membrane de grosimi variabile. vizibile cu ochiul liber sau cu lupa. in aprecierea dezvoltarii bacteriilor se au in vedere turbiditatea. marginile. o serie de caractere culturale reprezinta particularitati deosebit de pretioase pentru identificarea lor. sau al unui inel de grosimi variabile la suprafata lichidului. omogenizabil sau neomogenizabil prin agitare. aglomerări cunoscute sub numele de colonii. Pentru unele specii. • Pe mediile solide. coloniile pot fi de talie variabila. granular. granulara. • • Turbiditatea . 11 .

12 .

ovalara. galben. uneori usor albastrui. transparente.piocianic). coli da colonii rotunde cu margini si suprafeţe netede de 3—5 mm diametru. neregulate sau cu prelungiri. Culoarea coloniilor este diferita in funcţie de prezenta si natura pigmentului pe care eventual il conţin (alb. mediul poate fi clar. uleioasa. cele visooase adera. efilate. plisata la suprafaţa. lucioase. Marginile pot fi uniforme. • • • • • Suprafata poate fi neteda. de culoare alba-laptoasa. radiata sau neregulata. mediul prezinta o membrana uscata la suprafata (Bacillus subtilis). uscate. mediul este colorat in verdealbastrui (b. pot fi edificatoare. antraxului da colonii cu suprafata aspra si cu margini avind prelungiri laterale. convex. abia vizibile. rugoasa. mediul poate fi tulbure cu un inel pe perete la limita superioara a mediului (E. In medii lichide: • • • mediul poate fi tulbure omogen (salmonele. cu un depozit floconos si aderent la fundul tubului (bacilul coli). verde. granulara. Sub raportul opacitatii. au aspectul unor ondulaţii ale firelor de par. tuberculozei umane produce colonii rugoase. mamelonat sau papiliform. streptococii dau colonii mici bombate. aspra. intre ele existind grade intermediare. ombilicat. . coloniile pot fi translucide sau opace.• • Forma poate fi circulara. stafilococii dau colonii rotunde. cu margini si suprafe|. mediul poate fi clar. • Emulsionabilitatea poate fi usoara sau dificila si face ca suspensiile care se practica sa fie omogene sau neuniforme. mediul prezinta o membrana groasa. rosu. Consistenta este si ea variabila: untoasa. viscoasa. grun-joasa. lucioasa sau mata. Profilul (in secţiune prezumtiva) poate avea un aspect plat. tuberculosis). bombate.e netede. b. friabila. aderente la mediu. concav. stafilococi). insa la fund prezinta un depozit grunjos sau nisipos (streptococi). mediul prezinta un val subtire la suprafaţa (vibrionul holeric). filanta. determinind o dificultate in desprinderea lor. auriu sau citrin. Citeva exemple in acest sens. unele din ele pigmentate in alb. de regula. cu mar gini neregulate. care privite cu lupa. restul lichidului raminând limpede (M.). Pe medii solide: • • • • • • • • • E. portocaliu etc. Pasteurella da. • antraxului). In timp ce coloniile de consistentă untoasa şi granulara se desprind cu usurinta. ea determinind cel mai adesea si gradul de aderenta la suprafaţa mediului. colonii mici.

Bacteriile mobile ( Cl. ramnoza. se produce o tulburare uniforma cu sau fara producţie de gaze. polizaharide – inulina. În mediul zaharat. polialcoli . in functie de difuzibilitatea germenilor in mediu. manoza. roşu neutru). Mediul se repartizează de preferinţă în tuburi de reacţie tip Wasermann. dizaharide – maltoza. vizibile sub forma unor bule fie in intimitatea lui. inozita). hexoze – glucoza. in general.Bacteriile anaerobe ofera şi ele aspecte variabile in functie de mediul folosit in cultivarea lor. alcooli trivalenţi (glicerina). 3. • In cazul mediilor lichide. • In cazul mediilor semisolide (geloza Veillon) se pot forma doua tipuri de colonii. insusire legata de prezenta mobilitatii . galactoza. Substanţele hidrocarbonate care se folosesc cel mai frecvent în acest scop sunt: 1. hexavalenţi (manita. • Reacţii de punere în evidenţă a capacităţii zaharolitice – fermentarea zaharurilor se datorează elaborării de către germeni a unor enzime capabile să scindeze glucidele cu formare de aldehide. de talie variabila Examinarea caracterelor metabolice (biochimice) ale germenilor bacterieni Au o importanţă deosebită pentru confirmarea datelor furnizate în urma examinărilor morfo – culturale. glicozide – salicina. Modificare culorii mediului are loc în timpul incubaţiei la 37C după o perioadă variabilă în funcţie de rapiditatea cu care fenomenele fermentative au loc. însămânţarea tulpinii bacteriene de cercetat se soldează cu virarea culorii mediului în caz că s-a produs fermentarea sau cu păstrarea culorii iniţiale dacă aceasta nu s-a produs. Dintre mediile de cultură lichide cel mai frecvent se utilizează apa peptonată în care se dizolvă în proporţie de 1% substanţa hidrocarbonată ce urmează a se identifica şi o soluţie indicatoare (albastru de bromtimol. glicogenul. 4. 8. tetani ) produc colonii pufoase de aspect sferoid . sorbita. dulcita. tinctură de turnesol. hidrogen. acizi şi gaze (dioxid de carbon. 2. Ea se determină prin folosirea unor medii de cultură lichide sau solide la care se adaugă diferite zaharuri şi un indicator care să releve transformările biochimice care survin deobicei consecutive modificării pH-lui mediului. perfringens ) produc colonii de aspect lenticular . xiloza. Ele se bazează pe anumite particularităţi metabolice ale bacteriilor care sunt variabile în funcţie de specia microbiană sau chiar de tulpină şi au la bază existenţa unui echipament enzimatic diferit care le conferă capacitatea de a acţiona asupra unor substanţe conţinute în mediu sau de a elabora în cursul multiplicării lor anumite substanţe noi identificabile prin diverse reacţii chimice. fie la suprafata. 5. amidonul. in timp ce cele imobile ( Cl. La . pentavalenţi (adonita). esculina. pentoze – arabinoza. lactoza. metan). zaharoza sau sucroza. tetravalenţi (aritrina). fructoza. 7. trizaharide – rafinoza. 6.

Citirea se face după o incubaţie de 24 ore la 37C Testul indolului – indolul rezultă din dezintegrarea triptofanului. bovine. stafilococi.glucoză negativ (nu fermentează glucoza) Negru . Mediile solide folisite pentru a evidenţia capacitatea fermentativă a bacteriilor au înglobate în ele zaharul respectiv şi un indicator care relevă prin virarea culorii prezenţa procesului de fermentare. streptococci.unele specii aceasta se produce după câteva ore în timp ce la altele este nevoie de o incubaţie mai îndelungată de câteva zile sau chiar săptămâni.formare de hidrogen sulfurat (H2S) Bule de gaz sau spargerea agarului formare de gaz din glucoză • Partea înclinată • • Galben lactoză zaharuri sunt folosite) şi/sau zaharoză pozitiv (unul sau ambele Roşu sau neschimbat . astfel: Partea dreaptă • • • galben . oaie. Hemliza poate fi de tip alfa care se caracterizează prin producerea în dreptul şi în jurul coloniei a unei decolorări mai mult sau mai puţi întinse însoţită de o înverzire a mediului (datorită modificărilor chimice de oxidare ale hemoglobinei – effect viridans) şi beta care se caracterizează numai prin decolorarea mediului din dreptul şi din jurul coloniei şi denotă o liză totală a globulelor roşii di zona respectivă. Perfringens. om). listerii. etc. Însuşirea este prezentă numai la anumite specii bacteriene şi este de cele mai muşte ori legată de patogenitatea acestora.glucoză pozitiv (fermentează glucoza) Roşu sau nescimbat . Tulpinile care pe medii cu sânge nu au nici un fel de acţiune asupra globulelor roşii se numesc anhemolitice sau de tip gamma şi caracterizează de regulă germenii lipsiţi de patogenitate atât în condiţii experimentale cât şi naturale. Testul de hemoliză – se foloseşte pentru a determina capacitatea de a hemoliza globulele roşii aparţinând unor specii variate (cal. Cl. cobia. Capacitatea hemolizantă este prezentă în diferite grade la unele tulpini de E. Pentru stabilirea capacităţii hemolitice. iepure.lactoză şi zaharoză negativ (nici un zahar nu este folosit • Reacţii de punere în evidenţă a existenţei fermentilor active faţă de substanţele proteice şi aminoacizi şi existenţa unor produşi rezultaţi din dezintegrarea substanţelor proteice. însămânţarea se face la suprafaţă în plăci Petri pe mediu ce conţine sânge defibrinat de diferite specii în proprţie de 5%. Tehnica efectuarii frotiurilor . coli.

iar in cazul mediilor solide se face prelevarea cu ansa bacteriologica a unei cantitati reduse de cultura care se emulsionează bine intr-o picatura de apa distilata. Din organe. Pelicula de material patologic este recomandabil sa fie cit mai fina şi sa aibe o intindere mai redusa decat marginile lamei de microscop. Fixarea termica presupune trecerea frotiului uscat de 3—4 ori prin flacara unui bec de gaz sau a unei lampi cu alcool. In cazul culturilor in medii solidificate in pozitie verticală (de exemplu geloza Veillon) se recurge la o pipeta Pasteur la care se adapteaza un tub de cauciuc. cu ajutonil unei anse bacteriologice sau a unei lame şlefuite pe lame de microscop obişnuite. in cazul mediior lichide frotiul se face cu ansa bacteriologica. Efectuarea frotiului din organe In cazul unor organe bogate in lichide (sânge. Frotiurile astfel obtinute se fixeaza dupa uscare la flacara şi se coloreaza. sau cu pipeta Pasteur. Dacă este vorba de frotiuri ce se practica din culturi. Fixarea este necesara pentru a realiza o buna aderenta a materialului patologic pe lama si implicit evitarea desprinderii de catre solutiile colorante a materialului de examinat pe de o parte si inactivarea germenilor etalati pe de alta. la glisarea unei portiuni de organ. Si în acest caz se prefera frotiurile cit mai fine. sau din culturi ale diferitilor germeni. Tehnica efectuarii frotiurilor diferă în funcţie de materialul din care se face şi de natura germenilor in cauză. Materialul microbian se recolteaza prin aspirarea coloniilor izolate. in acest fel raminind o impresiune corespunzatoare formei suprafetei atinse (metoda amprenta). exsudate) frotiul se poate face prin depunerea cu ajutorul unei anse bacteriologice sau a unei pipete Pasteur pe lama de microscop a unei cantitati reduse de material patologic si etalarea lui in strat subtire. avându-se grijă de a nu se atinge marginile lamei. tăiată geometric. care se gasesc in diferite puncte ale mediului.Frotiul este un preparat expeditiv. se depune o formatiune nodulara suspecta pe o lama si cu o a doua se striveşte prin compresiune. In acest scop. pentru a se putea examina frotiurile mai subtiri ( ultimile amprente sunt intotdeauna mai fine). de asemenea. Fixarea se poate obtine prin mijloace termice sau chimice. frotiurile se executa prin strivirea intre doua lame (in cazul unor leziuni de tip nodular. lichide patologice etc. in asa fel ca in final temperatura lamei sa fie in jur de 60°C. Uneori. Se poate recurge. Din lichide frotiurile se realizeaza prin intinderea materialului respectiv intr-un strat subtire. având grija ca lama sa fie orientata spre flacara cu partea opusa celei pe care s-a etalat materialul. Cel mai frecvent se face prin aplicarea unei lame de microscop pe suprafafa de sectiune a probei de examinat.). pe suprafaţa unei lame de microscop. Viteza de trecere este moderata. Este bine ca pe aceeasi lama sa se practice mai multe amprente. care permite punerea in evidenta a formatiunilor celulare şi cerecetarea însuşirilor lor morfologice si tinctoriale. din mediul de cultura. efectuat din diferite produse patologice (organe. . pusa in prealabil pe o lama de microscop bine degresata si apoi se intinde suspensia in strat subtire. in asa fel ca el sa permita manipularea pipetei in profunzimea mediului sub control vizual. frotiul se poate realiza in mod diferit in functie de natura acestora.

Acestea se pun in cantitate suficienta pentru a acoperi pelicula de material de pe lama si se lasa pâna la evaporarea totala. Germenii Gram pozitivi vor aparea colorati in albastru-violet iar cei Gram negativi in rosu. Exista metode care se aplica în mod curent si metode speciale. Este o metoda de baza in practica bacteriologica. eter si alcool metilic). facilitindu-se in acest fel precizarea diagnosticului. Coloratia Gram se foloseste pentru diferentierea germenilor Gram pozitivi de cei Gram negativi din frotiurile efectuate din diferite tesuturi sau din culturi microbiene. Metodele de colorare sunt diverse si se aplica in mod diferentiat. metilic sau alcool-acetona (din bateria de colorare Gram) si dindu-li-se foc imediat dupa scurgerea excesului de alcool. forma. asa incit in acest caz nu mai este necesara fixarea prealabila. Aceasta diferenta de colorare rezulta din faptul ca germenii Gram pozitivi fixeaza violetul de Gentiana in asa fel incit prin tratarea cu solutia de alcool-acetona nu se decoloreaza. se spala cu apa. se usuca.Fixarea termica se poate face si prin flambare. Trebuie mentionat ca unii coloranti (de exemplu soluţia Giemsa din metoda cu acelasi nume) au si capacitates de a fixa frotiurile. punând pe frotiu citeva picaturi de alcool etilic. in funcţie de scopul urmarit. In acest scop se acopera frotiul fixat cu o solutie de albastru de metilen 3% şi. afinitati tinctoriale) ca si relaţiile cu ţesuturile în care se afla. Ea consta in: colorare cu solute de violet de Gentiana lo/ 0 timp de 1 minut • varsarea colorantului de pe lama • tratarea frotiului cu solutie Lugol timp de 2 minute • decolarea cu amestec de alcool-acetona pâna cind amestecul ce se scurge de pe lama nu mai este colorat • spalare cu apa de robinet • recolorare cu fucsina diluata 1/10 timp de 20—30 secunde • spalare cu apa de robinet • uscare • examinarea la microscop. Fixarea chimica se realizeaza prin folosirea unor substance fixatoare (alcool etilic. care este bine sa se faca cât mai curând dupa efectuarea frotiurilor. amestec de alcool etilic. Germenii vor aparea colorati in • . Dupa fixarea si racirea frotiului urmeaza colorarea. se examineaza. in timp ce cei Gram negativi se decoloreaza si apar ca urmare colorari in rosu cu cel de al doi-lea colorant (fucsina diluata). fara a-i diferentia sub raportul afinitatii lor tinctoriale. Sporii bacterieni apar sub forma de vacuole. dupa 2 —5 minute.se foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor intr-un material patologic. Metode de colorare şi examinarea microscopică a frotiurilor Metodele cele mai importante de colorare pentru examenul bacteriologic Prin colorare se pot stabili unele particulariţi morfologice ale germenilor (dimensiuni. Coloratia cu albastru de metilen (Loffler) . mai pretentioase si aplicate numai in anumite situatii.

acestea fiind un pericol pentru sănătatea consumatorului în cazul consumului de alimente contaminate. in timp ce ceilalţi se decoloreaza sub influenza tratarii cu acid.s e foloseste pentru colorarea lepto spirelor • Pentru colorarea capsulei bacteriene : coloraţia G sa. Alte metode de colorare: • Coloratia Koster . etc. La examenul frotiurilor. Metoda permite si observarea unor particularitati morfologice cum ar fi prezenta capsulei si sporului. Capsula se coloreaza in roz-pal. m iem etoda de colorare negativa a capsulei cu tus de China. Metoda se aplică următoarelor produse: .se foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor acidorezistenti. timp de cca 2 minute • spalare cu apa • tratare cu alcool absolut timp de 5 minute • spalare cu apa • recolorare cu solutie de albastru de metilen 1% timp de 2—3 minute • spalare cu apa • uscare si examinare cu imersie. Metoda Pooman. care nu se coloreaza prin metodele obisnuite (mai ales micobacteriile): • acoperirea frotiului. Pentru acest motiv.albastru. Metoda cu verde de malahit • Pentru colorarea cililor . iar sporul apare sub forma unei vacuole.se foloseste pentru colorarea brucelelor • Metoda Koslovski .Metoda Casares—Gill Determinarea bacteriilor din genul Salmonella Metoda stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene din genul Salmonella în produsele cercetate. germenii acidorezistenti nu sunt colorabili prin metode obisnuite. in sensul ca in cazul acidorezistenţilor acesta fiind bogat in substanţe lipoide impiedica patrunderea acidului decolorant ca dealtfel si a coloranţilor (fucsina patrunde datorita concentraţiei ridicate si a caldurii). uniform. Acidorezistenta rezida in structura chimica particulara a peretelui celular al germenilor. • Pentru colorarea sporilor: Metoda Moller. Primii fixeaza fucsina Ziehl si nu se decoloreaza sub acţiunea acidului. Coloraţia Ziehl—Neelsen .se foloseste pentru colorarea brucelelor.. in prealabil fixat la flacara. cu soluţie de fucsina Ziehl • incalzirea la flacara pâna la aparitia vaporilor si mentinerea prin incalziri repetate timp de 5—10 minute (se va avea grija ca soluţia coloranta sa nu fiarba si sa se completeze in caz că s-a evaporat de pe anumite portiuni de frotiu) • varsarea colorantului • decolorarea cu o solutie de acid sulfuric 1/4 sau acetic 1/3. germenii se pot prezenta coloraţi in roşu (acidorezistenti) sau in albastru (neacidorezistenti). • Metoda Tribondeau—Fontana .

marinate calde nepasteurizate. salamuri semiafumate) Mâncăruri gătite congelate şi mâncăruri gătite. salate cu maioneză Gelatină alimentară Prăjituri cu cremă Torturi cu diferite creme. sana) Iaurt cu fructe Smântână dulce pentru frişcă şi frişcă bătută Brânzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (caş. biftec) Produse crude (şniţel. înlocuitori de frişcă Paste făinoase (macaroane. caşcavaş pane) Peşte proaspăt. marinate calde pasteurizate. torturi de îngheţată Praf de îngheţată Lapte concentrat cu zahăr creme vegetală (înlocuitori de frişcă) Carne tocată şi semipreparate din carne tocată (hamburger. telemea proaspătă) Brânză proaspătă din zer Brânză maturată în saramură din lapte pasteurizat Brânză maturată în saramură din lapte nepasteurizat Brânză fermentată cu pastă tare (svaiţer). kefir. semitare (moeciu). fructe Maioneză Pulberi de maioneză (înlocuitori de maioneză) Vegetale congelate Vegetale deshidratate Prafuri de budinci şi creme deshidratate. care se consumă reci. taga. decapitat şi eviscerat Produse semiconservate (marinate reci. peşte afumat la rece Preparate culinare din peşte Ouă umplute. servite calde Preparate din carne. mixte sau simple. fidea) . produse din icre şi din lapţi) Icre sărate Salată de icre cu adaos de ulei Peşte sărat Peşte sărat cu ceapă Peşte afumat la cald. moale (Camembert. lapte bătut.- - - Lapte crud Lapte praf Produse lactate praf pentru copii Produse lactate acide (iaurt. fără altă prelucrare (piftii. frişcă. nasal) Brânzeturi cu pastă filată (caşcavaluri). telemea proaspătă) Brânzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (caş. gata pregătite. pastă de mititei. smântână fermentată. cârnaţi proaspeţi etc. pateuri din carne şi organe. afumate şi neafumate Brânzeturi fermentate Unt Margarină de consum Margarină cu lapte Îngheţată.) Preparate din carne sărate şi/sau afumate Mezeluri (prospături.

ISO 6887/96 ISO 7218 Principiul metodei: Germenii din genul Salmonella pot fi prezenţi în număr mic şi sunt deseori însoţiţi de un număr mult mai mare de alte microorganisme din familia Enterobacteriaceae sau din alte familii. fosfarin) Produse de panificaţie cu umpluturi Derivate din cereale tratate termic (fulgi de porumb.- - Paste făinoase cu umplutură (ciuperci. orez.ISO 17025/2001 . rahat.SR EN 12824/2001 . produse expandate) Biscuiţi uscaţi şi biscuiţi glazuraţi Biscuiţi. mâncăruri tip fast-food. În consecinţă este necesară îmbogăţirea selectivă în plus deseori este necesară preîmbogăţirea pentru a evidenţia acei germeni Salmonella care au fost supuşi alterării. Aparatură şi sticlărie folosită . gemuri. napolitane cu diferite creme Cacao. fructe confiate Arome alimentare naturale sau sintetice Emulsie pentru băuturi răcoritoare Concentrate alimentare (supe. orezin. bomboane fine şi extrafine de ciocolată Ciocolată umplută cu cremă Specialităţi din ciocolată umplute cu cremă grasă sau de tip fondant Bomboane altele decât ciocolată Jeleuri. ciocolată tablete. cuburi de carne) Oţet alimentar Ceai (plantă) Borş Cafea crudă prăjită şi instant Melanj din ouă praf Produse din grâu germinat Fructe de mare refrigerate Pepsină (pulbere în maestec cu sare) sandviciuri. Documente de referinţă: . şerbeturi. carne brânză) Condimente şi amestecuri Băuturi răcoritoare şi sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile Pulberi pentru sucuri Ape minerale şi carbogazoase. dulceţuri. pudră. ciocolată cu adaos. ghiaţă artificială Bere nepasteurizată. filtrată şi nefiltrată Bere pasteurizată Făinuri alimentare altele decât făinuri pentru panificaţie (făină de orez. pateuri Fursecuri.

Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute - Lampă U.balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumente Stomacher 1000 ml.2 ml Aparat pentru sterilizare uscată sau umedă ISO 7218 Etuvă ventilată prin convecţie reglabilă la 37oC şi la 55oC pH metru cu compensare de temperatură cu exactitate 0.000 7/min).V. porţelan. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor de lucru - Balanţă analitică . nealterat sau modificat în timpul transportului sau depozitării în corelaţie cu standardul internaţional specific al produsului.1 unităţi de pH la 25o C Anse bacteriologice cu bucla cu diam de 3 mm din platină-iridiu sau nichel-crom Eprubete de 16 x 160 mm sterile Flacoane pentru medii de cultură Eprubete cu diam de 8/160 mm Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml Mojar cu pistil.este important ca laboratorul să primească un eşantion cu adevărat reprezentativ. 150 şi 250 ml - - - - Eşantionarea . pungi de material plastic pentru stomacher. turmix tip Atomix de înaltă turaţie (15-20.realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură.asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă. 55oC şi 70oC Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm Pipete gradate sterile de 1 ml+. . 37o +-0.radiaţii U.V.5oC. vată. hârtie. 42oC microbiană - – aparat electric pentru dezvoltarea Etuvă 160 – 180oC . 45oC.Termostat 35oC.0. instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 3060 minute Autoclav . produse patologice obiecte de cauciuc. sterile Eprubete gradate Baloane erlenmayer cu capacitatea de 90.02 ml sau de 10 ml +. Reguli de procedură .0. cu cupe sterilizabile - Baie de apă reglabilă la temperatură 35oC sau 37oC.

iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute. examenul cerut. instrumente. data de valabilitate. se mojarează. Pentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente. Eşantionul se pregăteşte conform standardului internaţional specific al produsului respective: lapte materie primă şi produse lactate – se cântăresc 25 g eşantion într-un balon Erlenmayer steril peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire (APT).V. Însămânţare şi incubare • .- Modul de analiză. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180oC timp de 30 minute. Din proba de analizat se introduc în mojar 25 g. se încălzeşte într-o baie de apă la 45oC peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire. (înainte şi după însămânţare) Folosirea hotei de însămânţare Pipetele sunt prevăzute cu dop de vată nehidrofilă pentru a preveni aspirarea accidentală a eşantionului Flambarea ansei se face întâi la baza flăcării şi apoi la vârf pentru a împiedica râspăndirea germenilor Dezinfecţia suprafeţelor de lucru cu soluţii dezinfectante Protecţia mijloacelor de încercare şi/sau măsurare - Modul de lucru • Sticlăria sterilă se păstrează în dulapuri speciale Sticlăria sterilă se foloseşte maxim 6 zile Executarea periodică a serviciilor de întreţinere şi curăţire zilnică a aparaturii Verificarea şi înregistrarea temperaturii din încăperea de lucru Pregătirea eşantionului pentru analiză . Pregătirea eşantionului pentru analiză. peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire. Alimentul cu consistenţă solidă se mărunţeşte în bucăţi mici înainte de mojarare. sticlării) să fie steril.se efectuează conform standardului internaţional pentru produsul de analizat. locul prelevării. Se mojarează. sigiliul. martorii prelevării. se transferă într-un balon steril. lapte praf. ziua şi data prelevării. untul – se cântăresc 25 g eşantion într-un balon erlenmayer steril. brânza şi brânza topită – se cântăresc 25 g probă într-un mojar steril. se transferă într-un balon erlenmayer steril peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire (ATP) - - Acţiuni şi/sau măsuri preventive Protecţia personalului Obligatorie purtarea halatului Folosirea lampei de U. acceptare şi înregistrare a comenzilor – eşantioanele trebuie să fie etichetateşi iar procesul verbal de prelevare probe să conţină următoarele date:produsul recoltat. cine a prelevat proba. zer dulce şi lactoză – se cântăresc 25 g eşantion într-un balon erlenmayer steril peste care se adaugă 225 g mediu de preîmbogăţire.

• Interpretare Coloniile caracteristice de Salmonella dezvoltate pe mediu ARFVB provoacă virarea culorii mediului de la roz la roşu.bule de gaz sau fisuri-formare de gaz din glucoză Panta mediului – galbenă – lactoză şi/sau zaharoză pozitiv . Faza de îmbogăţire selectivă Din cultura obţinută conform 10. Se incubează la temperatura de 35o 37oC timp de 24 h.1 ml în 10 ml mediu RV şi 10 ml într-un flacon ce conţine 100 ml mediu SC. Din cultura obţinută în mediu SC. se reţin toate coloniile caracteristice sau suspecte.roşie sau nemodificată – glucoză negativ (lipsa fermentării glucozei) . după 48 h incubare se repetă operaţiunile descrise mai sus. 2. • Test de confirmare Pentru confirmare. Se interpretează modificările care se produc în mediu în modul următor: Baza mediului – galbenă – glucoză pozitiv (fermentarea glucozei) .Se incubează cele două medii selective însămânţate la temperatur de 35o 37oC timp de 24 h. Din cultura obţinută în mediu RV după 24 h de incubare cu o ansă bacteriologică se însămânţează suprafaţa primului mediu de însămânţare selectivă (ARFVB) în cutii Petri sterile. Se incubează la temperatura de 35o 37oC timp de 16-20 h.neagră – formare de hidrogen sulfurat . Se cântăresc 25 g produs într-un balon erlenmayer steril peste care se adugă 225 ml mediu APT . din fiecare cutie Petri din fiecare din cele două medii selective se recoltează câte 5 colonii considerate caracteristice sau suspecte.1. Dacă dezvoltarea este slabă sau nu se evidenţiază coloniile caracteristice de Salmonella cutiile Petri însămânţate se incubează în continuare la temperatura de 35o 37oC (conform acordului) timp de 18-24 h. Izolare şi identificare.După 24 h incubare în ambele situaţii se examinează cutiile pentru a cerceta prezenţa coloniilor caracteristic de Salmonella. timp de 18-24 h. Pentru conformările biochimice şi serologice se utilizează culturi pure. se trec 0. Dacă se găseşte o cutie cu mai puţin de 5 colonii caracteristice sau suspecte. Confirmări biochimice Cu ajutorul ansei efilate se însămânţează mediile indicate de la până la cu fiecare din culturile obţinute din coloniile reţinute 1. Se incubează cutiile astfel însămânţate la temperatura de 35o 37oC. a) mediul RV însămânţat la temperatura de 42oC timp de 24 h b) mediul SC însămânţat la temperatura de 35o 37oC (conform acordului)timp de 48 h 3. Agar TSI Se însămânţează coloana agarului TSI prin striere.Se reexaminează cutiile Petri pentru a cerceta prezenţa coloniilor caracteristice de Salmonella.3.Se striază coloniile selecţionate pe suprafaţa agarului nutritiv din cutii Petri în prealabil uscate astfel încât să se obţină o dezvoltare de colonii bine izolate.1. Se procedează la fel cu cel de-al doilea mediu de izolare selectivă (AMC) folosindu-se o altă prelevare cu ansa bacteriologică şi cutii Petri sterile de dimensiuni adecvate. iar panta prin trasare. Se incubează cele două medii însămânţate după cum urmează:. Faza de preîmbogăţire neselectivă.

O culoare galbenă indică o reacţie pozitivă. Se incubează la 35o sau 37oC timp de 24 h. Agar cu uree. se incubează la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h.25 ml Reactiv pentru evidenţierea betagalactozidazei şi se amestecă.. 2.TSI (formare de acid) pozitiv + .2 ml VP. Formarea unui inel roşu indică o reacţie pozitivă. Se adaugă 0. Se reintroduc eprubetele în baia de apă la 35o sau 37oC (conform acordului) şi se lasă 24 examinându-le din timp în timp. 3. 4. Mediu pentru decarboxilarea L-lizinei Se însămânţează mediul lichid sub suprafaţă. Formarea unui inel galben brun indică o reacţie negativă. Se însămânţează panta agarului în striuri. În consecinţă o confirmare preliminară a culturilor de Salmonella nu trebuie să se bazeze doar pe rezultatele obţinute pe agarul TSI. Se incubează la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h şi se examinează din când în când. Formarea unei coloraţii roz până la roşu aprins într-un interval de 15 minute indică o reacţie pozitivă 6. se adaugă o picătură de toluen şi se agită eprubeta. Se introduce eprubeta în baie de apă reglată la 35o sau 37oC (conform acordului) şi se lasă să stea câteva minute. În cazul folosirii discurilor de hârtie gata preparate se respectă instrucţiunile fabricantului. Tabelul 1 Test1) Reacţie pozitivă sau negativă Procentajul însămânţărilor de Salmonella care prezintă reacţia2) 100 Glucoză. 5. Mediu pentru reacţia VP Se dispersează o ansă din colonia suspectă într-o eprubetă conţinând 0. După incubare se adaugă 2 picături din soluţia de creatină. 3 picături din soluţia alcoolică de l-naftol şi apoi 2 picături din soluţia de hidroxid de potasiu agitând după adăugarea fiecărui reactiv. O culoare galbenă indică o reacţie negativă. După incubare se adaugă 1 ml reactiv Kovacs. deseori reacţia este vizibilă în 20 minute. Evidenţierea betagalactozidazei Se dispersează o ansă din colonia suspectă într-o eprubetă ce conţine 0.roşie sau nemodificată lactoză şi zaharoză negativ (neutilizarea lactozei şi a zaharozei Culturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (roşie) cu formare de gaz şi a unei baze acide (galbenă) cu formarea (90% din cazuri) hidrogenului sulfurat (înnegrirea agarului. O culoare violet apărută după incubare indică o reacţie pozitivă. Atunci când se izolează o Salmonella lactoză pozitiv panta agarului TSI este galbenă.25 ml soluţie salină. Mediu pentru evidenţierea indolului Se însămânţează o eprubetă ce conţine 5 ml mediu triptonă-triptofan cu colonia suspectă Se incubează la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. În cazul reacţiei pozitive descompunerea ureei produce degajarea amoniacului. făcând să vireze roşu de fenol la roz apoi la roşu închis Reacţia este deseori vizibilă după 2 până la 4 h.

TSI Zaharoză. Se utilizează serurile poli şi monovalente unul după altul.9 2) – Aceste procentaje indică doar faptul că toate speciile de Salmonella nu dau reacţii pozitive sau negative.24) 99. se dispersează în această picătură o fracţiune din colonia de testat aşa fel încât să se obţină o suspensie omogenă şi tulbure prin mişcarea lamei timp de 30-60 secunde. Dacă bacteriile se adună în grămezi. Acest procentaj poate varia de la o ţară la alta şi de la un produs la altul 3) – Salmonella typhi este anaerogenă (nu produce gaze în anaerobioză) 4) – Germeni Salmonella din subgenul 3(arizona) dau reacţie lactoză pozitiv sau negativ. Evidenţierea antigenelor H. Dacă se produce aglutinarea reacţia este pozitivă. TSI Hidrigen Sulfurat. dar dau reacţia betagalactozidază pozitiv. dar în locul soluţiei saline se foloseşte o picătură de antiser O.0 94. Evidenţierea antigenelor Vi. TSI (formare de gaz) Lactoză. Dacă se produce aglutinarea reacţia este considerată pozitivă. se utilizează această cultură pentru examenul antigenelor H procedâmd ca mai sus. 5) – Salmonella paratyphi A este negativ Confirmare serologică Cercetarea prezenţei antigenelor O Vi sau H de Salmonella se efectuează prin aglutinare pe lamă cu seruri adecvate din colonii pure şi după eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Interpretarea reacţiilor biochimice şi serologice . Germenii Salmonella din subgenul 2 dau reacţie lactoză negativ. dar sunt betagalactozidază pozitiv. Examinarea se face cu ajutorul unei lupe pe fond negru Evidenţierea antigenelor O.93) 99. Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. TSI Descompunerea ureei Decarboxilarea lizinei Evidenţierea betagalactozidazei Reacţia Voges Prostkauer Evidenţierea Indolului pozitiv + negativ – negativ – pozitiv + negativ – pozitiv + negativ – negativ – negativ - 99.65) 98. Se depune pe o lamă de sticlă curată o picătură de soluţie salină.Glucoză. Se însămânţează un agar nutritiv semisolid cu o colinie pură neautoaglutinabilă.5 91. dar folosind o picătură antiser H. Dintr-o colonie pură cunoscută ca neaglutinabilă se procedează ca mai sus. Se procedează ca mai sus utilizând o picătură de antiser Vi. tulpina este considerată autoaglutinabilă şi nu mai trebuie supusă examinărilor ulterioare.6 99. Pentru studiul speciilor poate fi utilă efectuarea unor teste biochimice suplimentare.Dacă se produce aglutinarea reacţia este considerată pozitivă.54) 100 98. se incubează la 35o 37oC timp de 24 h.

Tabelul prezintă interpretrarea testelor de confirmare pe colonii selecţionate. Vi sau H pozitive toate reacţiile negative neefectuate tipice lipsa reacţiilor tipice da nu antigene O. Reacţii biochimice tipice Autoaglutinare nu Reacţii serologice antigene O. Exprimarea rezultatelor În funcţie de rezultatele interpretării se indică prezenţa sau absenţa germenilor din genul Salmonella în x grame de probă de analizat. LIMITELE DE ÎNCREDRE PENTRU ESTIMĂRI DE NUMERE MICI Număr de microorganisme 1 Limite de încredere la nivelul de 95% Inferioară Superioară <1 2 .Vi sau H pozitive toate reacţiile negative lipsa reacţiilor tipice nu nu sunt considerate ca fiind Salmonella ar putea fi Salmonella Interpretare tulpini considerate ca fiind Salmonella tipice nu Confirmare definitivă Tulpinile considerate ca fiind Salmonella sau că ar putea fi Salmonella (a se vedea tabelul 2) se trimit la Institurul de Igienă şi Sănătate Publică Veterinară pentru identificarea germenilor din genul Salmonella. Această expediere trebuie însoţită de toate informaţiile disponibile referitoare la tulpină (tulpini). pentru determinarea definitivă a serotipului.

3 h la 41.C la h la 37 +/.2) timp de Incubare timp dede 24+/.1 ml cultura fiecare placa se testeaza cultura De pe o tamponata la + + colonie caracteristica .10 h la 370 C +/.50 C +/.2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 <1 <1 1 2 2 2 3 4 4 5 6 7 7 8 4 5 6 9 10 12 13 14 16 18 19 20 21 23 Diagrama modului de lucru Imbogatire selectiva Preimbogatire Confirmare Izolare se Apa peptonata – 1 ml 0.3C C +/.1 Confirmare h +/.3 h la 03737 +/. Daca rezultatul e 10 ml bullion RVS Agar nutritive10ml bullion MKTTNn temperature camerei alegere Mediu XLD si al doilea agar lacolonii negativ h Incubare timp de 24 h Incubare timp de 24 se testeaza alte 4 18 0 0 Incubare (9.100 Incubare timp 24 h h +/.2 C Confirmare 0 Exprimare C 1 C .3 h+/.

DETERMINAREANUMĂRULUI TOTAL DE GERMENI AEROBI DIN PRODUSELE ALIMENTARE (NTG) .

În aceleaşi condiţii se face însămânţarea diluţiilor decimale din eşantionul de analizat sau suspensia mamă (iniţială). fosfarin) . cuburi de carne) . pateuri din carne şi organe. orezin. Metoda se aplică următoarelor produse: Lapte crud Lapte pentru consum.Prăjituri cu cremă . în vederea stopării vinderii produsului.Făinuri alimentare altele decât făinuri pentru panificaţie (făină de orez.Maioneză .Specialităţi din ciocolată umplute cu cremă grasă sau de tip fondant .Concentrate alimentare (supe.Melanj din ouă praf . congelată şi organe de pasăre Mâncăruri gătite congelate şi mâncăruri gătite. decapitat şi eviscerat . acestea fiind un pericol pentru sănătatea consumatorului în caz de contaminare. servite calde Preparate din carne. mâncăruri tip fast-food . care se consumă reci. fără altă prelucrare (piftii. înlocuitori de frişcă .furaje pentru animale STAS-uri folosite pentru produsele enumerate mai sus sunt următoarele: - ISO 17025/2001 SR ISO 4833/91 ISO 707 ISO 8261 (pentru lapte şi produse lactate) ISO 7218/85 STAS 2356 – 1982 (pentru produse carnate) SR ISO 6887/96 STAS 11499 – 1981 (pentru produse zaharoase) SR ISO 8924 – 1995 (pentru recipiente închise) Principiul metodei -însămânţarea în profunzime a unui mediu solid turnat în două cutii Petri cu o cantitate determinată de eşantion pentru analiză dacă produsul care se examinează este lichid sau cu o cantitate determinată de suspensie mamă în cazul altor produse.Fructe de mare refrigerate .Stabileşte prezenţa sau absenţa de microorganisme aerobe în produsele alimentare cercetate prin metoda numărării coloniilor la temperatura de 30 o C.sandviciuri. biftec) .Băuturi răcoritoare şi sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile . mixte sau simple.Peşte proaspăt. Lapte UHT Lapte praf Produse lactate praf pentru copii Smântână dulce pentru frişcă şi frişcă bătută Lapte concentrat cu zahăr Carne zvântată. refrigerată.Ceai (plantă) . gata pregătite. .Produse din grâu germinat .Prafuri de budinci şi creme deshidratate.Specialităţi din ciocolată umplute cu cremă grasă sau de tip fondant .Pulberi pentru sucuri .

trebuie să se efectueze conform standardului internaţional specific al produsului respectiv Se prepară atâtea diluţii de lucru încât într-o cutie Petri să se obţină cel mult 300 de colonii. Pentru a se evita lezarea microorganismelor datorită schimbărilor bruşte de temperatură. Reguli de procedură • Pentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente. porţelan.0. Pregătirea materialului de sterilizat: spălarea şi sterilizarea sticlăriei se face respectând următoarele reguli: Spălarea sticlăriei cu apă cu detergent. Punerea de dopuri de vată cu tifon. Incubarea cutiilor Petri se realizează timp de 72 de ore la temperatura de 30 oC. produse patologice obiecte de cauciuc. Introducerea în etuvă pentru 30 de minute la 121oC . vată.0. dacă nu există alte prescripţii. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180oC timp de 30 minute. soluţia de diluare trebuie să albă aproximativ aceeaşi temperatură cu proba. în condiţii de aerobioză Aparatură şi sticlărie • • • • • • • • • • • • • • • • Termostat 30o +-0.asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă. învelirea cu hârtie a gâtului eprubetelor sau baloanelor. iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute.02 ml sau de 10 ml +.balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumente Baie de apă reglabilă la 45oC Cutii Petri sterile din sticlă cu diametrul de 90-100 mm Pipete gradate sterile de 1 ml+.Însămânţarea se face prin înglobare în mediul de cultură solid fie a unei cantităţi cunoscute din proba de lucru reprezentată prin gram sau a unei serii de diluţii decimale în cutii Petri prin încorporare după solidificarea mediului. instrumente. după care spălarea cu apă distilată.V.5oC – aparat electric pentru dezvoltarea microbiană Etuvă 160 – 180oC . sterile Material curent în laboratorul de microbilogie Aparat de numărare a coloniilor cu sistem de iluminare Eşantionarea .V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor de lucru Balanţă analitică . apoi limpezirea la jet continuu de apă. sticlării) să fie steril.1 unităţi de pH la 25o C Baloane cu capacitatea de 150 mlpână la 500 ml pentru sterilizarea şi păstrarea mediilor de cultură Mojar cu pistil.realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură. instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 3060 minute Autoclav . Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute Lampă U.radiaţii U. hârtie. .2 ml Pipete cu scurgere totală de 1 ml Baghete de sticlă sterile pH metro cu compensare de temperatură cu exactitate 0.

1. Modul de lucru • Pregătirea eşantionului pentru analiză şi a diluţiei iniţiale Cu o nouă pipetă sterilă se introduce 1 ml din soluţia iniţială într-o eprubetă care conţine 9 ml de soluţie diluare sterilă. dacă nu există alte prescripţii. 3. Lapte şi produse lactate – se agită energic eşantionul de analizat pentru a asigura o repartizare uniformă a microorganismelor răsturnând rapid de 25 de ori recipientul cu eşantion.0001 • x) în cazul produselor solide sau semi-solide această diluţie se află în recipientul omogenizatorului sau în mojar.Se prepară atâtea diluţii de lucru încât într-o cutie Petri să se obţină cel mult 300 de colonii. Lapte praf. Pentru a se evita lezarea microorganismelor datorită schimbărilor bruşte de temperatură.1 1/100 0.• Pregătirea eşantionului pentru analiză . . Din proba de analizat se introduc în mojar 1g/10g + cantitatea egală de nisip steril. 2.. zer dulce – se amestecă direct conţinutul recipientului închis. prin agitări şi răsturnări repetate. Pipeta se schimbă pentru fiecare diluţie.01 1/1000 0. Se obţine astfel o diluţie de 10-1. soluţia de diluare trebuie să albă aproximativ aceeaşi temperatură cu proba.prin operaţia de diluţie în tuburile cu diluţii se vor obţine cantităţile de probă ilustrate în tabel. Trebuie evitată formarea spumei iar cea formată trebuie dispersată. din care reiese că între două diluţii consecutive. Alimentul cu consistenţă solidă se mărunţeşte în bucăţi mici după care se mojarează. tub 1 2 3 4 Diluţia Cantitate (g) sau volum (ml) Sau Din proba iniţială pe ml diluţie xx) 10-1 Sau 10-2 Sau 10-3 Sau 10-4 1/10 x) 0. Alimentul cu consistenţă semisolidă se omogenizează ca atare .Se cântăresc 10 g eşantion într-un vas de sticlă şi se răstoarnă praful în sticlă cu soluţia de diluare (90 ml de soluţie adecvată la 45+-1oC în baie de apă). Diluţii decimale următoare . Intervalul dintre omogenizarea eşantionului şi prelevarea probei necesare analizei nu trebuie să depăşească 3 minute.001 1/10000 0. Se menţin flacoanele în baia de apă timp de 5 minute agitând din când în când. Se triturează adăugându-se treptat lichid de diluţie de 9 ori mai mare decât eşantionul. xx) în cazul însămânţării a 1 ml produse lichide sau 1 g produse solide sau semi-solide (10 ml diluţie 10-1) această cantitate se notează cu 10-0. diferenţa de concentraţie este de 10 ori (diluţii decimale): Nr.

dacă a fost efectuată trebuie menţionată în buletinul de analiză. • Calculul Se reţin cutiile care conţin de la 15 la 300 de colonii la nivelul a două diluţii succesive. Timpul care se scurge între sfârşitul preparării diluţiei iniţiale (sau a diluţiei 10-1 în cazul unui produs lichid) şi momentul în care diluţiile vin în contact cu mediul de cultură nu trebuie să depăşească 15 minute. • Interpretarea După expirarea perioadei de incubare specificată la punctul 10. diluţia şi data. 3. se procedează la numărarea coloniilor din fiecare cutie Petri care conţine cel mult 300 de colonii. Nu trebuie puse mai mult de 6 cutii una peste alta. Incubarea se face la 30+-1oC timp de 72+-2 de ore. 2. Σ C – suma coloniilor numărate în toate cutiile reţinute . Se toarnă în fiecare cutie Petri în care s-a depus inoculul cca 15 ml mediu agar nutritiv sau geloză albă la 45+-1oC.• Însămânţare şi incubare 1. Pe fiecare cutie se notează numărul probei.1 n2) x d unde. se calculează.4. După solidificarea completă şi numai în cazul în care se bănuieşte că eşantionul de analizat conţine microorganisme ale căror colonii ar putea invada suprafaţa mediilor. Cu o nouă pipetă sterilă se introduce în fiecare cutie câte 1 ml din prima diluţie decimală a eşantionului de analizat (10-1). se toarnă pe suprafaţa mediului însămânţat 4 ml geloză albă la 45 oC. 4.Se iau alte două cutii Petri sterile. N. ca medie ponderată cu următoarea formulă: ΣC N = -----------------------(n1 + 0. Această operaţie.4. dacă produsul este lichid sau câte 1 ml din prima diluţie decimală a suspensiei iniţiale (10 -2) în cazul altor produse. Se amestecă cu grijă inoculul cu mediul de cultură şi se lasă să se solidifice punând cutiile Petri pe o suprafaţă rece şi orizontală. Se incubează cutiile Petri cu capacul în jos. Se iau două cutii Petri în care se introduce cu o pipetă sterilă câte 1 ml eşantion de analizat dacă produsul este lichid sau câte 1 ml din diluţie iniţială a produselor solide şi semi-solide. Se lasă să se solidifice aşa cum s-a descris mai sus. • Exprimarea rezultatelor Pentru numărătoare se utilizează cutiile ce conţin cel mult 300 de colonii şi cel puţin 15 colonii. Se repetă aceste operaţii cu diluţiile următoare folosind câte o nouă pipetă sterilă pentru fiecare diluţie decimală. Numărul de microorganisme pe ml sau gram de produs.

162 (n1 + 0.numărul cutiilor reţinute la adoua diluţie d – factorul de diluţie corespunzător primei diluţii Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative. . Estimarea numerelor mici .000 UFC – unităţi formatoare de colonii) • Fidelitate . Rezultatul se dă sub forma: . Exemplu: O numărătoare de microorganisme obţinute la 30oC a dat următoarele rezultate.n1 – numărul cutiilor reţinute la prima diluţie n2 . .0 şi 9. - la prima diluţie reţinută 10-2: 168 şi 215 colonii la a doua diluţie reţinută 10-3: 14 şi 25 de colonii ΣC 168 + 215 + 14+ 25 422 N = ----------------------------------= _________________ =________=19.9 x 10x unde x este puterea atribuită lui 10.000 sau 1.01 n3) x d [2+(0.din considerente de ordin exclusiv statistic. în care d este factorul de diluţie al diluţiei iniţiale. Nici o colonie . raportându-ne la prevederile legislaţiei în vigoare ( ex.dacă cele două cutii la nivelul eşantionului de analizat (produse lichide) sau al diluţiei iniţiale (alte produse) conţin mai puţin de 15 colonii se face media aritmetică.1 n2 + 0.număr de microorganisme estimat pe ml NE = m(produse lichide) număr de microorganisme estimat pe gram: NE = m x d-1 (alte produse).dacă cele două cutii corespunzătoare eşantionului de analizat (produse lichide) sau diluţiei iniţiale (alte produse) nu conţin nici o colonie rezultatul se dă sub forma: mai mic decât limita minimă admisă.022 Se rotunjeşte la două cifre semnificative adică 19. Ca rezultat se ia numărul de microorganisme pe ml sau pe gram de eşantion exprimat printr-un număr cuprins între 1. 92/46 prevede limita de 100. Pentru laptele materie primă Directiva UE nr.01x 2)]x10-2 0.1x2)+(0.9 x 10 -4 microorganisme pe ml sau pe gram de produs.m. în 95% din cazuri limitele de încredre ale acestei metode variază de la 12% la 37%. În practică se pot costata variaţii şi mai mari mai ales între rezultatele obţinute de microbiologi diferiţi- Limitele de încredere pentru estimările de numere mici de microorganisme sunt indicate în tabelul A1. a coloniilor numărate în cele două cutii.

LIMITELE DE ÎNCREDRE PENTRU ESTIMĂRI DE NUMERE MICI Număr de microorganisme 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Limite de încredere la nivelul de 95% Inferioară Superioară <1 <1 <1 1 2 2 2 3 4 4 5 6 7 7 8 2 4 5 6 9 10 12 13 14 16 18 19 20 21 23 .

care se consumă reci. semitare (moeciu). kefir. taga.DETERMINAREA STAFILOCOCULUI (AUREUS) COAGULAZĂ POZITIV DIN PRODUSELE ALIMENTARE Metoda stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene stafilococ (aureus) coagulază pozitiv în produsele alimentare cercetate. pastă de mititei. salate cu maioneză . Metoda se aplică următoarelor produse: Lapte crud Lapte praf Produse lactate praf pentru copii Produse lactate acide (iaurt. decapitat şi eviscerat Produse semiconservate (marinate reci. marinate calde pasteurizate. afumate şi neafumate Brânzeturi fermentate Unt Margarină de consum Margarină cu lapte Îngheţată. telemea proaspătă) Brânzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (caş. servite calde Preparate din carne. gata pregătite. cârnaţi proaspeţi etc. moale (Camembert. sana) Iaurt cu fructe Smântână dulce pentru frişcă şi frişcă bătută Brânzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (caş. caşcavaş pane) Peşte proaspăt. biftec) Produse crude (şniţel. smântână fermentată. salamuri semiafumate) Mâncăruri gătite congelate şi mâncăruri gătite. produse din icre şi din lapţi) Icre sărate Salată de icre cu adaos de ulei Peşte sărat Peşte sărat cu ceapă Peşte afumat la cald.) Preparate din carne sărate şi/sau afumate Mezeluri (prospături. marinate calde nepasteurizate. lapte bătut. fără altă prelucrare (piftii. telemea proaspătă) Brânză proaspătă din zer Brânză maturată în saramură din lapte pasteurizat Brânză maturată în saramură din lapte nepasteurizat Brânză fermentată cu pastă tare (svaiţer). torturi de îngheţată Praf de îngheţată Lapte concentrat cu zahăr creme vegetală (înlocuitori de frişcă) Carne tocată şi semipreparate din carne tocată (hamburger. mixte sau simple. nasal) Brânzeturi cu pastă filată (caşcavaluri). pateuri din carne şi organe. peşte afumat la rece Preparate culinare din peşte Ouă umplute.

ciocolată tablete. orez. ciocolată cu adaos. fosfarin) Produse de panificaţie cu umpluturi Derivate din cereale tratate termic (fulgi de porumb. fructe Maioneză Pulberi de maioneză (înlocuitori de maioneză) Vegetale congelate Vegetale deshidratate Prafuri de budinci şi creme deshidratate. napolitane cu diferite creme Cacao. înlocuitori de frişcă Paste făinoase (macaroane. rahat. produse expandate) Biscuiţi uscaţi şi biscuiţi glazuraţi Biscuiţi. orezin. fidea) Paste făinoase cu umplutură (ciuperci. şerbeturi. pateuri Fursecuri. mâncăruri tip fast-food Documente de referinţă STAS-uri folosite pentru produsele enumerate la punctul anterior sunt următoarele: ISO 17025/2001 ISO 5541/1 – 1986 (pentru produse lactate şi derivate) STAS 6349/4 – 1980 (pentru produse lactate) . cuburi de carne) Oţet alimentar Ceai (plantă) Borş Cafea crudă prăjită şi instant Melanj din ouă praf Produse din grâu germinat Fructe de mare refrigerate Pepsină (pulbere în maestec cu sare) sandviciuri.- Gelatină alimentară Prăjituri cu cremă Torturi cu diferite creme. frişcă. dulceţuri. bomboane fine şi extrafine de ciocolată Ciocolată umplută cu cremă Specialităţi din ciocolată umplute cu cremă grasă sau de tip fondant Bomboane altele decât ciocolată Jeleuri. carne brânză) Condimente şi amestecuri Băuturi răcoritoare şi sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile Pulberi pentru sucuri Ape minerale şi carbogazoase. filtrată şi nefiltrată Bere pasteurizată Făinuri alimentare altele decât făinuri pentru panificaţie (făină de orez. ghiaţă artificială Bere nepasteurizată. fructe confiate Arome alimentare naturale sau sintetice Emulsie pentru băuturi răcoritoare Concentrate alimentare (supe. gemuri. pudră.

astfel încât după sterilizare fiecare flacon sau sticlă să conţină 90 ml soluţie de diluare sau un multiplu de 9 ml. Dacă soluţiile de diluare nu sunt folosite imediat. Eprubetele. Sterilizarea trebuie făcută în autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Cantităţile trebuie astfel repartizate.- ISO 707 ISO 8261 (pentru lapte şi produse lactate) ISO 4832 – 1992 (pentru produse carnate) STAS 2356 – 1982 (pentru produse carnate) SR ISO 6887/96 STAS 11499 – 1981 (pentru produse zaharoase) SR ISO 8924 – 1995 (pentru recipiente închise) Principiul metodei • • • Însămânţare în suprafaţa unui mediu selectiv solid. Medii de cultură Bulion hipersalin cu manită şi indicator (chapman lichid) Agar hipersalin cu manită şi indicator (chapman solid) Plasmă citratată de om sau de iepure .48 de h la 35oC sau 37oC. ele trebuie păstrate la întuneric între 05oC maxim o lună pentru evitarea oricărei modificări a volumului sau compoziţiei lor. sterilizarea şi păstrarea soluţiilor de diluare Se repartizează soluţiile de diluare pentru diluţiile iniţiale în flacoane sau sticle iar pentru diluţiie următoare în eprubete sau sticle. Calculul numărului de stafilococcus aureus pe ml sau pe gram de eşantion pornind de la numărul de colonii caracteristice şi/sau necaracteristice care se obţin în plăcile alese. SOLUŢII DE DILUARE ŞI MEDII DE CULTURĂ Soluţii de diluare de utilizare generală Soluţie salină sterilă Soluţii de utilizare specială bulion hipersalin cu manită şi indicator (chapman lichid) agar hipersalin cu manită şi indicator (chapman solid) plasmă citratată de om sau de iepure bulion de inimă de creier Repartizarea. Incubarea acestor plăci timp de 24 . turnat în două serii de plăci Petri cu o cantitate determinată din eşantionul de analizat dacă produsul este lichid sau din suspensia mamă în cazul altor produse. la nivelurile de diluţie care dau rezultate semnificative şi care se confirmă prin proba coagulazei. flacoanele sau sticlele trebuie închise cu dopuri. În aceleaşi condiţii se însămânţează şi diluţiile decimale obţinute din eşantionul de analizat sau din suspensia mamă în prealabil însămânţate într-un mediu de îmbogăţire (chapman lichid).

37o +-0.5oC Baie de apă reglabilă sau echipament similar reglabil la 50+-0.02 ml sau de 10 ml +. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute Lampă U.radiaţii U.asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă. Eşantioanele sunt etichetate. steril Perle de sticlă cu diametrul de cca 6 mm Flacoane cu capacitatea de 90.5 ml şi lungimea de 20 cm îndoite în unghi drept la cca 3 cm de una din extremităţi. ziua şi data prelevării.realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură.5oC Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm Pipete gradate sterile de 1 ml+. instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute Autoclav .2 ml Baghete de etalare din sticlă (tip crosă de hochei) cu diametrul de 3. porţelan.balanţă electronică cureglare automată funcţie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumente Baie de apă reglabilă sau echipament similar reglabil la 45+-0.1 ml şi al căror orificiu de scurgere are un diametru de 2-3 ml Etuvă sau incubator ventilat (ă) (care permite uscarea mediului gelozat turnat în plăci) reglabil(ă) la 50+-1oC EŞANTIONARE Eşantionarea se efectuează conform standardului specific al produsului de analizat.V. locul prelevării.V. Trebuie evitată formarea spumei iar cea formată trebuie . pH metru cu compensare de temperatură cu exactitate 0.0. cuprinzănd: produsul recoltat. martorii prelevării.0.1 unităţi de pH la 25o C Eprubete de 18/180 mm şi flacoane pentru cultură cu capacitatea de 125-300 ml pentru sterilizarea şi păstrarea mediilor de cultură Eprubete cu diametrul de 10 ml x 75 ml necesare pentru determinarea coagulazei Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml Mojar cu pistil. examenul cerut. extremităţile tăiate trebuie să fie rotunjite la cald. sigiliul. Dacă nu există standard specific se recomandă ca părţile interesate să se pună de acord asupra acestui subiect. 150 şi 250 ml Pipete etalonate special pentru uz bacteriologic cu capacitate nominală de 1 ml cu diviziuni de 0. sterile.5oC – aparat electric pentru dezvoltarea microbiană Etuvă 160 – 180oC . hârtie. produse patologice obiecte de cauciuc. data de valabilitate. Eşantionul se pregăteşte conform standardului internaţional specific al produsului respective: • Lapte crud şi produse lactate – se agită energic eşantionul de analizat pentru a asigura o repartizare uniformă a microorganismelor răsturnând rapid de 25 de ori recipientul cu eşantion. . cine a prelevat. vată.Bulion de inimă de creier Aparatură şi sticlărie pentru sterilizarea cu căldură uscată sau cu căldură umedă (ISO 7218) • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Termostat 35oC. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor de lucru Balanţă analitică .

sticlării) să fie steril. Se triturează adăugându-se treptat lichid de diluţie de 9 ori mai mare decât eşantionul. zer dulce şi lactoză – se amestecă direct conţinutul recipientului închis. Se obţine astfel diluţia 10-1.. Folosirea hotei de însămânţare Metodologia de lucru • Însămânţare şi incubare Din produsul omogenizat şi din fiecare diluţie se însămânţează câte 1 ml în câte o eprubetă cu 10 ml chapman lichid. (înainte şi după însămânţare). Pregătirea materialului de sterilizat: - Spălarea sticlăriei cu apă cu detergent. Introducerea în etuvă pentru 30 de minute la 121oC. apoi limpezirea la jet continuu de apă. Se obţine diluţie de 101 .În cazul celorlalte produse din suspensia mamă se însămânţează câte 10 ml în câte o eprubetă cu 10 ml chapman lichid. Lapte praf. Se agită de fiecare dată înaintea transferului următor. Se obţine astfel o diluţie de 10-1. Din proba de analizat se introduc în mojar 1g/10g + cantitatea egală de nisip steril. Intervalul dintre omogenizarea eşantionului şi prelevarea probei necesare analizei nu trebuie să depăşească 3 minute. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180oC timp de 30 minute. Punerea de dopuri de vată cu tifon. Acţiuni şi/sau măsuri preventive Pentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente. iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute.• • • • • dispersată.V. Se menţin flacoanele în baia de apă timp de 5 minute agitând din când în când. Se adaugă restul de diluare până la întregul volum de 90 ml soluţie de diluare. Alimentele cu consistenţă solidă se mărunţeşte în bucăţi mici înainte de mojarare. Se agită pentru a uşura topirea şi se menţine până la topirea completă. prin agitări şi răsturnări repetate. Pentru obţinerea diluţiilor se poate lucra alternativ numai cu fază apoasă. învelirea cu hârtie a gâtului eprubetelor sau baloanelor. . instrumente. Brânza şi brânza topită – se folosesc 10 g probă într-o capsulă cu o cantitate mică de soluţie de diluare şi se omogenizează cu pistilul. Protecţia personalului: Obligatorie purtarea halatului. după care spălarea cu apă distilată. Alimentele cu consistenţă semisolidă se omogenizează ca atare. Folosirea lampei de U. Untul – se pune recipientul cu eşantion într-o baie de apă la 45oC. Se agită şi cu o pipetă încălzită la cca 45oC se introduc 10 ml într-un flacon care conţine 90 ml soluţie de diluţie.Se cântăresc 10 g eşantion într-un vas de sticlă şi se răstoarnă praful în sticla cu soluţia de diluare (90 ml de soluţie adecvată la 45 +1oC în baie de apă).

5.2. Se adaugă în mod steril câte 0. luând în considerare pentru fiecare factorul de diluţie. Interpretarea Se controlează plăcile Petri însămânţate şi din cele unde s-au dezvoltat colonii caracteristice şi/sau necaracteristice. şi 10. Se consideră că reacţia coagulazei este pozitivă când coagulul ocupă mai mult de trei pătrimi din volumul ocupat iniţial de lichid.1. în acest caz se reţine ca rezultat valoarea cea mai mică.7. • EXPRIMAREA REZULTATELOR Cu rezultatele obţinute în cele două serii de cutii sau cu cele două diluţii consecutive se calculează numărul mediu de stafilococcus aureus.7.Se adună mediile de stafilococcus aureus obţinute din coloniile caracteristice şi/sau necaracteristice. Pentru ca reacţia să fie valabilă plasma din eprubeta martor nu trebuie să prezinte semne de coagulare.).3ml) şi se incubează fără însămânţare. Din fiecare placă Petri se aleg pentru confirmare câte 5 colonii caracteristice şi/sau necaracteristice după caz. • Calculul Dacă cel puţin 80% din coloniile selecţionate sunt coagulază pozitiv se ia ca număr de stafilococcus (aureus) numărul prezumtiv dat de numărătoarea făcută conform punctului 10.6. şi se face media aritmetică a celor două valori obţinute exceptănd cazul când raportul dintre valoarea cea mai mare şi valoarea cea mai mică este peste 2. Se examinează coagularea plasmei după 4 – 6 h. Cutiile care conţin între 15 şi 150 colonii caracteristice şi/sau necaracteristice pentru două diluţii consecutive numărul de stafilococcus aureus pentru fiecare diluţie se calculează aşa cum se indică la punctul 10. se reţin plăcile care conţin între 15 şi 150 colonii caracteristice şi/sau necaracteristice. Se incubează la 35 o sau 37oC timp de 20 – 24 h.5.1 ml din fiecare cultură la câte 0. Pentru control se adaugă 0. Plăcile Petri astfel însămânţate se incubează la 35o 37oC timp de 24 – 48 h. În toate celelalte cazuri numărul se calculează pornind de la numărul de stafilococcus aureus prezumtiv (punctul 10.Se incubează eprubetele însămânţate cu mediu de îmbogăţire timp de 24 – 48 h la temperatura de 35o 37oC.3 ml plasmă de iepure în eprubete sterile cu diametru de 10 x 75 ml şi se incubează la 35 o sau 37oC. • Test de confirmare (proba coagulazei) Cu ajutorul unei anse bacteriologice sterile se prelevează o parte din fiecare colonie selecţionată şi se însămânţează într-o eprubetă cu bulion de inimă creier. Nu se reţin decât două cifre semnificative procedând după cum urmează: dacă numărul este mai mic de 100 se rotunjeşte la cel mai apropiat multiplu de 5 .) care sunt coagulază pozitiv (punctul 10. Din fiecare eprubetă în care au apărut semne de dezvoltare microbienă prin virarea culorii mediului de îmbogăţire se fac treceri pe suprafaţa unui mediu selectiv (chapman solid) turnat în plăci Petri sterile prin strierea cu ajutorul unei anse de însămânţare.1 ml bulion de inimă creier steril la cantitatea recomandată de plasmă de iepure (0.

mai puţin de 15 x ne Stafilococcus aureus pe ml. Dacă pentru cutiile însămânţate cu eşantion de analizat ( produs lichid) sau suspensie mamă (alte produse) numărul mediu al coloniilor confirmate calculat conform punctului 11. se rotunjeşte la cel mai apropiat multiplu de 20 .0 şi 9.mai puţin de 15 x Ne Stafilococcus aureus pe gram unde Ne= _____1_______ x ____________1___________ Volum de inocul diluţia eşantionului de analizat c) pentru estimarea numerelor mici în produsele lichide: m x ne Stafilococcus aureus pe ml unde m este numărul de colonii confirmate d) pentru estimarea numerelor mici în celelalte produse: m x Ne Stafilococcus aureus pe gram unde m este numărul mediu de colonii comfirmate.dacă numărul este mai mare de 100 şi nu se termină cu 5.1. unde ne este inversul volumului de inocul: ne = : ______1_______ Volum de inocul b) pentru celelalte produse: . unde n este puterea corespunzătoare. se rotunjeşte la cel mai apropiat multiplu 10 Pentru a se obţine numărul de stafilococcus aureus pe gram de produs după caz se multiplică această valoare cu inversul volumului inoculului şi apoi cu inversul ratei de diluţie a eşantionului de analizat Rezultatul se exprimă printr-un număr cuprins între 1.9 multiplicat cu 10 n. Pentru estimarea numerelor mici se face o medie din numărul coloniilor confirmate caracteristice şi necaracteristice şi se rotunjeşte la numărul întreg următor cel mai apropiat. este mai mic de 15 rezultatul se dă sub forma a) pentru prdusele lichide .dacă numărul este mai mare de 100 şi se termină cu 5. DETERMINAREA LISTERIEI MONOCYTOGENES DIN PRODUSELE ALIMENTARE .

semitare (moeciu). mixte sau simple. servite calde Preparate din carne. monocytogenes în produsele alimentare. caşcavaş pane) Prăjituri cu cremă Torturi cu diferite creme. pateuri din carne şi organe. fructe Concentrate alimentare (supe. frişcă. catalază pozitiv. nu reduce nitratul. mâncăruri tip fast-food Listeria moncytogenes– este bacterie gram pozitivă cu formă de bastonaş scurt nesporogenă cu mobilitate prin rostogolire la 25oC betahemolitică şi care dă testul camp pozitiv pentru S. fără altă prelucrare (piftii. Documente de referinţă STAS-uri folosite pentru produsele enumerate la punctul anterior sunt următoarele: ISO17025/2001 ISO 5541/1 – 1986 (pentru produse lactate şi derivate) STAS 6349/4 – 1980 (pentru produse lactate) ISO 707 . care se consumă reci. cuburi de carne) Fructe de mare refrigerate Pepsină (pulbere în maestec cu sare) sandviciuri.. telemea proaspătă) Brânză proaspătă din zer Brânză maturată în saramură din lapte pasteurizat Brânză maturată în saramură din lapte nepasteurizat Brânză fermentată cu pastă tare (svaiţer). nu fermentează xiloza şi manita. telemea proaspătă) Brânzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (caş.) Preparate din carne sărate şi/sau afumate Mezeluri (prospături. aureus pe agarul cu sânge de oaie.ER/VP pozitivă. moale (Camembert. taga. Metoda se aplică următoarelor produse: Lapte pentru consum Lapte praf Produse lactate praf pentru copii Smântână dulce pentru frişcă şi frişcă bătută Brânzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (caş. biftec) Produse crude (şniţel. gata pregătite. nasal) Brânzeturi cu pastă filată (caşcavaluri). afumate şi neafumate Brânzeturi fermentate Margarină cu lapte Lapte concentrat cu zahăr creme vegetală (înlocuitori de frişcă) Carne tocată şi semipreparate din carne tocată (hamburger. pastă de mititei. cârnaţi proaspeţi etc. bilăesculină pozitivă.Metoda stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene cu L. fermentează glocuza şi rahnoza. salamuri semiafumate) Mâncăruri gătite congelate şi mâncăruri gătite. oxidază pozitiv.

Din mediu de preîmbogăţire se striază pe două medii solide selective (agar Oxford şi agar Palcam.monocytogenes necesită patru faze succesive de lucru. Faza de izolare selectivă .- ISO 8261 (pentru lapte şi produse lactate) ISO 4832 – 1992 (pentru produse carnate) STAS 2356 – 1982 (pentru produse carnate) SR ISO 6887/96 STAS 11499 – 1981 (pentru produse zaharoase) SR ISO 8924 – 1995 (pentru recipiente închise) Principiul metodei Însămânţarea unei cantităţi de eşantion determinată – 25 ml (produs) – 25 g (alte produse) Identificarea L. Tuburile inoculate se incubează la 35oC timp de 48 h.Însămânţarea unei cantităţi din eşantion pe un mediu lichid de preîmbogăţire şi incubarea acestuia la temperatura de 35oC timp de 48 h. monocytogenes din produsele alimentare este destul de dificilă din cauza microorganismelor competitive prezente în număr mare. 1% dihidroclorură de tetrametilenparafenilendiamină – benzi livrate de Cantacuzino mediu cu glucoză.Din cultura pe mediu fraser cu ansa bacteriologică se însămânţează pe două medii de izolare selectivă (agar Oxford şi agar Palcam) turnate în plăci Petri sterile. Izolarea L. (mediu de bază + supliment) .Din cultura cu mediu demifraser se inoculează 0. Faza de izolare selectivă . manită. turnat în plăci Petri sterile) se incubează la 35oC timp de 24 – 48 h. Soluţii de utilizare specială şi medii de cultură folosite • Soluţii de utilizare specială agar moale peroxid de hidrogen 3% sol. xiloză şi rhamnoză mediu Klarc – MR/VP mediu cu bilă esculină reactiv Griess mediu pentru testul camp • Medii de cultură Bulion demifraser (mediu de bază + supliment) Bulion fraser (mediu de bază + supliment) Agar oxford. se incubează la 35oC timp de 24 . Faza de îmbogăţire selectivă .(mediu demifraser).1 ml în 10 ml mediu lichid fraser.48 h. • • • • Faza de preîmbogăţire selectivă .

porţelan.0. locul prelevării. • Lapte şi produse lactate – se agită energic eşantionul de analizat pentru a asigura o repartizare uniformă a microorganismelor răsturnând rapid de 25 de ori recipientul cu eşantion. examenul cerut. produse patologice obiecte de cauciuc. ziua şi data prelevării. sigiliul. apoi limpezirea la jet continuu de apă. hârtie. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180oC timp de 30 minute. .eşantioanele sunt etichetate. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute Lampă . învelirea cu hârtie a gâtului eprubetelor sau baloanelor Introducerea în etuvă pentru 30 de minute la 121oC Eşantionare .balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumentar Baie de apă reglabilă la temperatură mai mare de 100oC sau reglabilă la 45oC Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm Pipete gradate sterile de 1 ml+. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor de lucru Balanţă analitică . data de valabilitate.radiaţii U. iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute. instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute • • • • • • • • • • • • • Autoclav (17148 / 3802) .Agar palcam (mediu de bază + supliment) Sterilizarea mediilor de cultură trebuie făcută în autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dacă mediile de cultură nu sunt folosite imediat. sticlării) să fie steril. cine a prelevat.2 ml pH metru . Echipamente de încercare şi mijloace de măsurare utilizate • • Termostat 35o +-0.cu compensare de temperatură cu exactitate 0. după care spălarea cu apă distilată Punerea de dopuri de vată cu tifon. martorii prelevării. ele trebuie păstrate la întuneric între 0-5oC maxim 7 zile pentru evitarea oricărei modificări a volumului sau compoziţiei lor. sterile Pentru a obţine o cultură pură de germeni de L. cuprinzând: produsul recoltat.V. vată.02 ml sau de 10 ml +. Trebuie evitată formarea spumei iar cea formată trebuie dispersată. Pregătirea materialului de sterilizat:spălarea şi sterilizarea sticlăriei - Spălarea sticlăriei cu apă cu detergent. monocytogenes este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente.realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură. instrumente.1 unităţi de pH la 25o C Flacoane cu capacitatea de 250 ml pentru sterilizarea şi păstrarea mediilor de cultură Eprubete de 16 x 160 mm sterile Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml Mojar cu pistil.5oC (LP 116 / 3622) – aparat electric pentru dezvoltarea microbiană Etuvă 160 – 180oC (SP 125G 0220/90 /3620) asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă.0.

prin agitări şi răsturnări repetate.Verificarea şi înregistrarea temperaturii din încăperea de lucru Verificarea stării de funcţionare şi confirmarea metrologică a mijloacelor de măsurare .Folosirea hotei de însămânţare .Intervalul dintre omogenizarea eşantionului şi prelevarea probei necesare analizei nu trebuie să depăşească 3 minute.Flambarea ansei se face întâi la baza flăcării şi apoi la vârf pentru a împiedica râspăndirea germenilor . Alimentul cu consistenţă solidă se mărunţeşte în bucăţi mici înainte de mojarare. după care se introduc în flacoane sterile • Însămânţare şi incubare .Obligatorie purtarea halatului . se transferă într-un flacon steril peste care se adaugă mediu de preîmbogăţire. se triturează. Se triturează.Sticlăria sterilă se foloseşte maxim 6 zile . Din proba de analizat se introduc în mojar 25g/10g + cantitatea egală de nisip steril.Executarea periodică a serviciilor de întreţinere şi curăţire zilnică a aparaturii . zer dulce – se amestecă direct conţinutul recipientului închis. Acţiuni şi/sau măsuri preventive • Protecţia personalului .Pipetele sunt prevăzute cu dop de vată nehidrofilă pentru a preveni aspirarea accidentală a eşantionului .Cu instrumente sterile.V. • Lapte praf.Dezinfecţia suprafeţelor de lucru cu soluţii dezinfectante Protecţia mijloacelor de încercare şi/sau măsurare . (înainte şi după însămânţare) . Se transferă proba într-un flacon steril peste care se adaugă mediu de preîmbogăţire lichid • Omogenizare prin mojarare Alimentul cu consistenţă semisolidă se omogenizează ca atare.Teste privind efectuarea corectă a sterilizării: fizico-chimice microbiologice (stearotest şi test Subtilis) Controlul indirect al sterilizării – controlul sterilităţii materialelor de laborator Termostatarea 24-48 ore a mediilor de cultură gata pregătite Tulpinile de referinţă pentru medii de cultură din ziua respectivă • • Modul de lucru • Pregătirea eşantionului pentru analiză .Verificarea de două ori pe zi a temperaturii termostatelor . Se cântăresc 25 g eşantion într-un vas de sticlă şi se răstoarnă praful în flaconul cu mediu de preîmbogăţire Se menţin flacoanele în baia de apă timp de 5 minute agitând din când în când. se recoltează 25 ml din eşantion în cazul produselor lichide şi 25 g din eşantionele semisolide şi solide în mojare cu pistil sterile. • Brânza şi brânza topită – se folosesc 25 g probă într-un mojar cu pistil steril.Folosirea lampei de U.Sticlăria sterilă se păstrează în dulapuri speciale .

se striază cu o ansă bacteriologică sterilă. manită. Se termostatează la 35oC timp de 24 h după care examinează.. Reacţia reducerii nitratului în nitrit –negativă 7. Din cultura obţinută la punctul 10. După care se examinează placa Petri observându-se hemoliză beta.4.. suspecte ca fiind L.Culturile obţinute pe suprafaţa agarului Oxford şi Palcam(Se reţin 5 colonii specifice sau suspecte). Reacţia MR/VP. 3.Pe suprafaţa agarului cu sânge de oaie turnat în cutii Petri se striază în linie dreaptă pe tot diametrul cutiei cultură de 24 h de Stafilococcus aureus şi R. Fermentarea hidraţilor de carbon (glucoză. se triturează. se incubează la 35oC timp de 48 h. 1.6. se inoculează 0.1 ml din cultura obţinută în bulion nutritiv.1.Pe agar cu sânge se striază o ansă bacteriologică din cultura obţinută la punctul 10. Reacţia este pozitivă la glucoză şi rhamnoză.se foloseşte mediu Clarc şi reacţia este pozitivă 6.4.1 ml în 10 ml mediu de îmbogăţire Fraser. pe medii selective agar Oxford şi Palcam turnate în cutii Petri sterile.eqvi. după incubare de 24 h la 35oC . Răspunsul caracteristic pentru fiecare specie este pozitiv la Stafilocococus aureus şi pozitiv sau negativ la R. se striază cu o ansă bacteriologică sterilă pe medii selective agar Oxford şi Palcam. 2. cutiile Petri însămânţate la punctul 10.După incubare. Testul hemolizei . se recoltează 25 ml într-un flacon steril peste care se adaugă 225 ml mediu de preîmbogăţire în cazul eşantionului lichid şi 25 g din eşantioanele semisolide şi solide în mojare cu pistil sterile.O ansă de cultură se introduce într-o picătură de peroxid de hidrogen 3% depusă pe o lamă de sticlă. Din cultura obţinută la punctul 10. Examen cultural în agar moale (dezvoltare sub formă de umbrelă la 25oC) 2. se incubează la 35oC timp de 24 h după care se supun următoarelor teste: 1. monocytogenes. 5. reacţia este negativă la manită şi xiloză. Cu instrumente sterile..4.între lamă şi lamelă.monocytogenes. după care se introduc în flacoane sterile peste care se adaugă 225 ml nediu de preîmbogăţire (demifraser).Se termostatează la 35oC timp de 24 h. Reacţia catalazei .4. Testul CAMP . se incubează la 35 oC timp de 24 h.1. • • Interpretarea .3. se incubează la 35oC timp de 48 h. 4. monocytogenes.eqvila distanţă de 3-4 cm una de alta şi pe cât se paote linii paralele.se examinează şi se reţin cele în care s-au dezvoltat colonii suspecte de L. 3. xiloză şi rhamnoză) În eprubetele cu zaharurile mai sus menţionate. Tulpinile de testat se striază pe suprafaţa agarului perpendicular pe primele două strii în aşa fel ca striile culturilor de testat să se oprească la 2-3 mm de acestea. Test de confirmare .4.Examen microscopic. 4. se transplantează pe bulion şi agar nutritiv. Din cultura obţinută la 10. cu o pipetă sterilă se introduc câte 0. Apariţia imediată a bulelor de gaze se interpretează ca reacţie pozitivă şi este specifică pentru L. Se incubează timp 48 h la temperatura de 35oC. Mobilitate .

aureus CAMP-R.Exprimarea rezultatelor Testul biochimic L. welsh imerii + + V + + - L. monoc ytogen es + + + + - L. seelige ri + + + + - L.mur rayi Producerea de acid din: D-glucoză D-xiloză D-manitol D-rhamnoză maltoză + + + + + + + V + + + Ptoducere de : catalază H2S/TSI H2S/benzi de acetat de plumb betahemoliz ă + + + + + + +/- + + + + + + + + + + - + + + + - + + + + + + - + + + - + + + + - Hidroliza esculinei Hidroliza hipuratului Hidroliza ureei Reducerea nitraţilot Reacţia Voges-Prostkauer Reacţia Roşului de metil CAMP-S. grayi L. ivanovi i + + + + - L.eqvi . innocu a + V + + - L.

într-un scurt interval de timp nu trebuie să depăşească 30% din rezultatul cel mai mic. ***) Când condiţiile de repetabilitate nu sunt îndeplinite în 5% sau mai mult din cazuri. 225ml incubare la 30oC timp de 24+-2 h 0. utilizând aceeaşi aparatură.În funcţie de rezultatele interpretării se indică prezenţa sau absenţa germenilor din genul Listeria monocytogenes în x grame de probă de analizat. de către acelaşi operator. Repetabilitate Diferenţa absolută dintre două rezultate ale analizelor individuale. 25g + mediu de îmbogăţire primară (DEMIFRASER). se recomandă a se căuta sursele posibile de eroare.1ml cultură în 10 ml FRASER striere pe agar OXFORD striere pe agar PALCAM incubare la 35o – 37oC timp de 48+-2 h striere pe agar OXFORD striere pe agar PALCAM . obţinute cu ajutorul aceleeaşi metode. SCHEMA MODULUI DE LUCRU Probă de analizat. pe un material identic supus analizei. în acelaşi laborator. A se vedea în ISO 5725. definiţia repetabilităţii.

Agar Karmali.ISO 707 . • • . selective la 42oC. dintr-o cantitate dată de produs şi care manifestă caracteristicile de mobilitate şi proprietăţile biochimice specifice. • Confirmare . • Izolare şi identificare .Carne de pasăre Documente de referinţă: .confirmare DETECTAREA SPECIILOR TERMOTOLERANTE DE CAMPYLOBACTER Bacteriile din genul Campylobacter sunt microorganisme care formează colonii tipice pe mediile solide.efectuare de teste biochimice şi serologice adecvate. • Medii de cultură .Bulion Preston.SR ISO 6887/96 Principiul metodei: Pentru detectarea speciilor termotolerante de Campylobacter se cer următoarele faze: Îmbogăţire în mediu lichid . Sterilizarea trebuie făcută în autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Dacă soluţiile de diluare nu sunt folosite imediat. Soluţii de diluare şi medii de cultură folosite: Soluţii de utilizare specială: Bulion Brucella. Agar TSI.însămanţarea probei luate în lucru în mediu lichid (bulion Preston) şi incubare la 42oC timp de 18 h. Procedura stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene din genul Campylobacter în produsele cercetate.din culturile obţinute se face însămanţarea mediului selectiv solid (Agar Karmali) şi incubare la 42oC timp de 24-72 h. ele trebuie păstrate la întuneric între 0-5oC maxim 7 zile pentru evitarea oricărei modificări a volumului sau compoziţiei lor. Metoda se aplică următoarelor produse: . Agar Columbia cu sange.SR ISO 10272/2000 .Lapte crud .

reglabil la 42oC Etuvă 160 – 180oC . martorii prelevării. apoi limpezirea la jet continuu de apă.este important ca laboratorul să primească un eşantion cu adevărat reprezentativ • • Reguli de procedură pentru determinarea germenilor din genul campylobacter Modul de analiză. Pentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente. cuprinzănd. acceptare şi înregistrare a comenzilor este conform Manualului de Calitate LM – 02 Eşantioanele sunt etichetate.realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură. instrumente. Se triturează adăugânduse treptat lichid de diluţie de 9 ori mai mare decât eşantionul. examenul cerut. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute • Lampă U. data de valabilitate. • Cutii petri de sticlă sau de material plastic cu diametrul de 90 mm şi 100 mm • Mojar cu pistil. care să permită circulaţia gazelor pentru a se realiza atmosfera microaerobă necesară. vată.asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă.alimentul cu consistenţă lichidă se omogenizează ca atare. zua şi data prelevării. hârtie. împachetarea cu hârtie a gâtului eprubetelor sau baloanelor . Din proba de analizat se introduc în mojar 1g/10g + cantitatea egală de nisip steril. produse patologice obiecte de cauciuc. locul prelevării. sticlării) să fie steril. iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute. porţelan. .1 unităţi de pH la 25o C • Microscop • Recipiente în principal eprubete de 16 mm x 160 mm şi de 9 mm x 180 mm.Punerea de dopuri de vată cu tifon. instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute • Autoclav .Introducerea în etuvă pentru 30 de minute la 121oC Omogenizare prin mojarare .radiaţii U. cine a prelevat.balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura camerei • Sterilizator electric pentru instrumente • Ansă buclată din paltină-iridiu sau nichel-crom cu diametrul de 3 mm • Pipete gradate sterile cu scurgere totală de 1 ml. Pregătirea materialului de sterilizat: Spălarea sticlăriei cu apă cu detergent. Acţiuni şi/sau măsuri preventive • . de 10 ml şi pipete Pasteur • Lupă cu putere de mărire de 3x • pH metru cu compensare de temperatură cu exactitate 0. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180oC timp de 30 minute. după care spălarea cu apă distilată .V. sticle cu capace metalice netoxice şi/sau flacoane prevăzute cu dopuri de bumbac.Echipamente de încercare şi mijloace de măsurare Termostat . sigiliul. eprubete pentru hemoliză de 13 mm x 75 mm. Alimentul cu consistenţă solidă se mărunţeşte în bucăţi mici înainte de mojarare. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor de lucru • Balanţă analitică . produsul recoltat.V. sterile Eeşantionare .

Sticlăria sterilă se păstrează în dulapuri speciale ...Flambarea ansei se face întâi la baza flăcării şi apoi la vârf pentru a împiedica râspăndirea germenilor .• Protecţia personalului . la 42oC timp de 24 h. (înainte şi după însămânţare) ...72 h (pană la 5 zile dacă este necesar) .V.Folosirea hotei de însămânţare .Pipetele sunt prevăzute cu dop de vată nehidrofilă pentru a preveni aspirarea accidentală a eşantionului .Executarea periodică a serviciilor de întreţinere şi curăţire zilnică a aparaturii ..Protecţia mijloacelor de încercare şi/sau măsurare .Folosirea lampei de U..Dezinfecţia suprafeţelor de lucru cu soluţii dezinfectante ...Sticlăria sterilă se foloseşte maxim 6 zile . la 42oC timp de 18 h striere agar Karmali Incubare în atmosferă microaerobă.Verificarea şi înregistrarea temperaturii din încăperea de lucru DIAGRAMA MODULUI DE LUCRU Probă de testat x g sau x ml 9 x bulion Preston îmbogăţire Incubare în atmosferă microaerobă.Obligatorie purtarea halatului .

Însănanţare şi incubare 2. de tirbuşon. o Se examinează la microscop morfologia şi mobilitatea fiecărei colonii selectate.Dacă într-o cutie Petri sunt mai puţin de 5 colonii tipice şi/sau suspecte. cu o ansă bacteriologică se însămanţează. Cutiile Petri însămanţate. curbaţi cu o mişcare în spirală. 4. prin striere suprafaţa agarului Karmali. din două cutii Petri. Dacă nu există standard internaţional de produs se recomandă ca părţile interesate să se pună de acord asupra subiectului.5 colonii caracteristice teste suplimentare exprimare rezultate Factorii care influenţează fidelitatea metodei sunt următorii: Tipul de aparatură pentru omogenizare Durata omogenizării Mediu lichid de îmbogăţire Pregătirea eşantionului pentru analiză Se efectuează conform standardului internaţional pentru produsul de analizat. Izolare şi Identificare Din cultura obţinută prin îmbogăţire în bulion Preston. Suspensia obţinută. o Se ia o colonie din cele 5 alese şi se omogenizează într-un 1 ml bulion Brucella. după 18 h incubare. se incubează la 42oC. într-o atmosferă microaerobă timp de 18 h. Interpretare Pe mediul agar Karmali coloniile tipice sunt plate asemănătoare unor picături alungite. Examinarea caracterelor morfologice şi de mobilitate o Din fiecare cutie Petri se utilizează cate o colonie perfect izolată pentru realizarea unui frotiu colorat Gram. 1. după care se examinează cutiile Petri în vederea detectării prezenţei coloniilor tipice de Campylobacter termotolerant. din toate cutiile Petri inoculate cate 5 colonii tipice şi/sau suspecte. se reţin suspensiile în care se evidenţiază bacili Gram negativi. o Pentru examinările ulterioare. Faza de îmbogăţire Pentru a prepara suspensia iniţială se adaugă o porţiune din eşantionul de examinat (masă sau volum) în 9 ml mediu de îmbogăţire. se incubează în atmosferă microaerobă la 42oC timp de 24 h. 48 h sau chiar 3 pană la 5 zile. 3. caracteristică. . se iau toate pentru confirmare. Test de confirmare Alegerea coloniilor pentru confirmare Pentru confirmare se aleg. bulion Preston pentru a obţine un raport de 1/10 (masă/volum sau volum/volum) între produsul de examinat şi mediu. 5.

timp de 24 h şi chiar 5 zile.Studiu morfologic Din suspensiile selectate se fac strieri cu ansa pe agar Columbia cu sange pentru a obţine colonii bine izolate. Se incubează în atmosferă microaerobă la 42oC. se incubează la 25oC. Apariţia în 10 sec a unei culori mov.După incubare se examinează prezenţa sau absenţa creşterii. Cutiile Petri inoculate se incubează în atmosferă microaerobă. pe partea înclinată a acestuia. dacă este necesar. apoi se descarcă. Se înţeapă cu ansa. culturile pure. Interpretarea reacţiilor se face în felul următor: Partea dreaptă galben Roşu sau nescimbat Negru Bule de gaz sau spargerea agarului glucoză pozitiv (fermentează glucoza) glucoză negativ (nu fermentează glucoza) formare de hidrogen sulfurat (H2S) formare de gaz din glucoză Partea înclinată Galben lactoză şi/sau zaharoză pozitiv (unul sau ambele zaharuri sunt folosite) Roşu sau neschimbat lactoză şi zaharoză negativ (nici un zahar nu este folosit o Detectarea catalazei . timp de 24 h şi se utilizează pentru testele biochimice. în atmosferă microaerobă timp de două pană la cinci zile. din fiecare cutie Petri şi se descarcă pe o hartie de filtru îmbibată cu reactiv pentru oxidază. Creştere la 25oC Din cutiile Petri cu agar Columbia cu sange se ia cate o colonie şi se descarcă într-un tub de bulion Brucella. prin striere. la 42oC. Cand se utilizează chituri de testare provenite din comerţ. se respectă instrucţiunile producătorului. Confirmări biochimice o Detectarea oxidazei Cu o ansă bacteriologică sau cu o baghetă de sticlă se ia o porţiune dintr-o colonie bine izolată. o Agar TSI Din fiecare colonie selectată se face inocularea agarului cu ansa. partea dreptă a agarului. pe toată lungimea sa. violet sau albastru închis indică o reacţie pozitivă. Pentru confirmarea rezultatelor pozitive sau negative se utilizează tulpini martor.

Se inundă cu suspensia diluată suprafaţa agarului Mueller-Hinton cu 5% sange dintr-o cutie Petri. a bulelor de gaz indică reacţie pozitivă.Din culturile obţinute pe agar TSI se omogenizează cu ansa. după care se înlătură suspensia în exces. Se agită tubul uşor şi se incubează într-o baie de apă la 37oC timp de 24 h. o Detectarea sensibilităţii la acid nalidixic şi cefalotină Se inoculează cu ansa. prin menţinere în etuvă.. unde se observă inhibarea creşterii. Se adaugă foarte uşor 0.2 ml soluţie de ninhidrină pe suprafaţa soluţiei de hipurat de sodiu. într-o picătură de soluţie de peroxid de hidrogen depusă pe o lamă microscopică în stare curată. se consideră sensibilitate.5 pe scara Mac-Farland. Se incubează în baie de apă la 37oC timp de 10 min. Interpretarea creşterii bacteriene se face în felul următor. Nu se agită.în funcţie de rezultatele interpretării se indică prezenţa sau absenţa germenilor din genul Campylobacter termotolerant în x grame de probă de analizat . coloniile selectate. la 37 oC.4 ml soluţie de hipurat de sodiu. în bulion Brucella. -prezenţa unei zone de o anumită mărime. Se lasă în contact 5 min. Reacţia este pozitivă atunci cand apare culoarea violet închis. Eexprimarea rezultatelor . Culoarea violet deschis sau lipsa modificării culorii indică reacţie negativă. pană cand se realizează o suspensie cu densitatea de 0. timp de 24 h. Apariţia în 30 sec. Se incubează într-o atmosferă microaerobă la 37oC timp de 24 h. Suspensia realizată se diluează 1 : 10 cu bulion Brucella.Pe suprafaţa agarului uscat se aplică un disc cu acid nalidixic şi un altul cu cefalotină. o Detectarea hidrolizei hipuratului Coloniile selectate de pe agar Columbia cu sange se inoculează cu o ansă într-un tub Waserman (de hemoliză) 0. Se usucă suprafaţa mediului din cutii. -creştere realizată în contact cu discul se consideră rezistenţă.

Apă peptonată cu sorbitol şi ABT cu sorbitol .Incubare la 35oC timp de 24 h.MCS – Agar MacConkey cu sorbitol .Bulion nutritiv .ABT sorbitol Principiul metodei • • • • Însămânţarea a unei cantităţi de 25 g de produs în 225 ml bulion EC cu novobiocină.SR ISO 6887/96 Simboluri şi prescurtări . Din cultura cu bulion de îmbogăţire se efectuează diluţii decimale de la 10-1 până la 105 .BBLV +n – Bulion EC cu novobiocină .Agar nutritiv înclinat .Apă peptonată cu sorbitol .Apă peptonată cu celobioză şi ABT celobioză . dezvoltate pe suprafaţa agarului MacConkey se însămânţează fiecare colonie în următoarele medii: .STAS 2356 – 1982 (pentru produse carnate) .Carne de vită şi produse din carne care conţin carne de vită Documente de referinţă STAS-uri folosite pentru produsele enumerate la punctul anterior sunt următoarele: . Identificare.ISO 707 .DETERMINARE DE ESCHERICHIA COLI O157 H7 DIN CARNEA DE BOVINĂ Scop .Din ultimele două diluţii se striază cu ansa bacteriologică pe suprafaţa unui mediu selectiv (agar Mac Conkey cu sorbitol) turnat în plăci Petri sterile. 5 colonii cu aspect caracteristic din fiecare probă.Bulion EC în eprubete cu tub de fermentaţie .Agar TSI .SR ISO 16654/99 . Metoda se aplică următoarelor produse: .Agar cu citrat (SIMON) .Agar cu lizină şi fier (LIA) . Incubare la 35oC timp de 24 h. Această procedură cuprinde directive generale pentru determinarea numărului de unităţi formatoare de colonii (UFC) de microorganisme prin metoda numărării coloniilor la 30 o C.Procedura stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene coliforme în produsele cercetate.ISO17025/2001 .ISO 4832 – 1992 (pentru produse carnate) .

vată. Sterilizarea trebuie făcută în autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari).Agar Levine Incubare la 35oC timp de 24 h. Executarea reacţiei de seroaglutinare pe lamă cu cultura dezvoltată pe suprafaţa agarului înclnat cu serul anti O157 şi separat cu serul anti H7. Stimularea mobilităţii în cazul seroaglutinării negative cu antiserul H7. Eprubetele. flacoanele sau sticlele trebuie închise cu dopuri.asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă. Dacă soluţiile de diluare nu sunt folosite imediat. Citirea rezultatelor la testele executate. Medii de cultură Bulion EC modificat cu novobiocină Agar MacConkey cu sorbitol (BCIG) Agar Levine Agar cu sorbitol roşu de fenol şi 4-metylunbelliferyl-beta-de-glucuronoid(PRS MUG) Echipamente de încercare şi mijloace de măsurare o o o o o o Termostat 30o +-0. Soluţii de utilizare specială - Bulion nutritiv Bulion EC în eprubete cu tub de fermentaţie Apă peptonată cu sorbitol şi ABT cu sorbitol Apă peptonată cu celobioză şi ABT celobioză Agar nutritiv înclinat Agar TSI Agar cu lizină şi fier (LIA) Agar cu citrat (SIMON) Agar nutritiv moale în coloană sau SIM Agar Levine Ser aglutinant O157 Ser aglutinat H7 Repartizarea. hârtie. ele trebuie păstrate la întuneric între 05oC maxim o lună pentru evitarea oricărei modificări a volumului sau compoziţiei lor.. Executarea reacţiei betagalactozidazei cu cultura dezvoltată pe agarul înclinat.5oC – aparat electric pentru dezvoltarea microbiană Etuvă 160 – 180oC . porţelan. instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute .Agar nutritiv moale în coloană sau SIM . sterilizarea şi păstrarea soluţiilor de diluare şi mediilor de cultură Se repartizează soluţiile de diluare pentru diluţiile iniţiale în flacoane sau sticle iar pentru diluţiie următoare în eprubete sau sticle. Cantităţile trebuie astfel repartizate astfel încât după sterilizare fiecare flecon sau sticlă să conţină 90 ml soluţie de diluare sau un multiplu de 9 ml.

după care spălarea cu apă distilată . învelirea cu hârtie a gâtului eprubetelor sau baloanelor . produsul recoltat.Introducerea în etuvă pentru 30 de minute la 121oC Pregătirea eşantionului pentru analiză Eşantionul se pregăteşte conform standardului internaţional specific al produsului respectiv Pentru a se evita lezarea microorganismelor datorită schimbărilor bruşte de temperatură. data de valabilitate.dispozitiv de mărunţire.Punerea de dopuri de vată cu tifon. locul prelevării. ziua şi data prelevării. tocare şi omogenizare Baie de apă reglabilă la temperatură mai mare de 100oC sau reglabilă la 45oC Cutii Petri sterile cu diametrul de 100x15 mm. cuprinzănd. apoi limpezirea la jet continuu de apă.1 unităţi de pH la 25o C Alte materiale ce se folosesc curent în laboratoarele de microbiologie (lame microscopice de sticlă. dacă nu există alte prescripţii. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă la 180oC timp de 30 minute. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute Lampă U.V. sigiliul. Autoclav . calibrate pentru a repartiza 100 microlitri Anse bacteriologice din nichel-crom pH metru cu compensare de temperatură cu exactitate 0. examenul cerut .balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura camerei Stomacher . sticlării) să fie steril. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor şi a suprafeţelor de lucru Balanţă analitică . iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute. cine a prelevat Pentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente. mediu de îmbogăţire selectivă trebuie să aibă aproximativ aceeaşi temperatură cu proba. Pregătirea materialului de sterilizat: Spălarea sticlăriei cu apă cu detergent.realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultură. eprubete şi pipete gradate de diferite capacităţi. . sterile Protecţia personalului Obligatorie purtarea halatului . 60x15 mm Pipete automate cu vârfuri de plastic sterile pentru o singură folosire.V.o o o o o o o o o o o o o o o Eşantioanele sunt etichetate. instrumente.radiaţii U. produse patologice obiecte de cauciuc. etc) Pungi de plastic sterile pentru stomacher sau baloane erlenmayer cu gura largă de 300 sau 500ml Tuburi Durham cu dimensiuni corespunzătoare pentru utilizare în eprubete de 16 x 160 mm Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml Mojar cu pistil. martorii prelevării.150x15 mm.

coli O157 H7 în 25 g produs examinat. Incubare la 35oC timp de 24 h. Identificare. A se vedea în ISO 5725. agar Levine-colinii caracteristice 5. coli O157 imobilă. 2. se recomandă a se căuta sursele posibile de eroare. obţinute cu ajutorul aceleeaşi metode. agar nutritiv moale în coloană sau SIM-mobilitate pozitivă. agar nutritiv înclinat-R. Citirea rezultatelor. Repetabilitate . executarea reacţiilor de seroaglutinare pe lamă cu cultura dezvoltată pe suprafaţa agarului înclinat şi serul anti O157 şi separat cu serul anti H7.În funcţie de rezultatele interpretării se indică prezenţa sau absenţa a Escherichiei coli O157 H7 în x grame de probă de analizat. într-un scurt interval de timp nu trebuie să depăşească 30% din rezultatul cel mai mic. Din plăcile cu BCIG se iau 5 colonii suspecte (colonii albe) ca fiind colonii de E. 6. agar cu citrat (SIMON)-negativ. Cele 5 colonii cu aspect caracteristic din fiecare placă Petri se însămânţează fiecare pe următoarele medii:bulion nutritiv-indol pozitiv.1 ml pe suprafaţa agarului MacConkey cu sorbitol (BCIG) turnat în plăci Petri sterile. Se incubează la 35oC timp de 24 h 3. Interpretarea . se mărunţeşte şi se omogenizează cu ajutorul stomacherului peste care se adaugă 225 ml bulion m EC + n. pe un material identic supus analizei. definiţia repetabilităţii. Obţinerea de colonii izolate: Din cultura obţinută se fac diluţii în ser fiziologic: de la 10-1 până la 10-5. apă peptonată cu sorbitol şi ABT-sorbitol negativ. Din ultimele două diluţii se striază câte 0. Stimularea mobilităţii în cazul seroaglutinării negative cu antiserul H7. agar TSI-galben H2 S-negativ.Răspunsul caracteristic la testele biochimice şi seroaglutinarea pozitivă cu antiserurile O157 H7 demonstrează prezenţa E. 7.beta-galactoxidază pozitivă. Îmbogăţire selectivă. se incubează plăcile timp 24 h la temperatura de 35oC.V. de către acelaşi operator.Se cântăreşte 25g din eşantion. 4. executarea reacţiei beta galactozidazei cu cultura dezvoltată pe agarul înclinat. agar cu lizină şi fier (LIA)-lizin decarboxilază pozitiv. Se incubează la 35oC timp de 24 h. iar seroaglutinarea cu serul H7 este negativă şi după operaţiunea de stimulare a mobilităţii se va concluziona că în 25 g produs s-a decelat prezanţa E. Când condiţiile de repetabilitate nu sunt îndeplinite în 5% sau mai mult din cazuri. coli O 157 H7 . (înainte şi după însămânţare) Folosirea hotei de însămânţare Pipetele sunt prevăzute cu dop de vată nehidrofilă pentru a preveni aspirarea accidentală a eşantionului Flambarea ansei se face întâi la baza flăcării şi apoi la vârf pentru a împiedica râspăndirea germenilor Dezinfecţia suprafeţelor de lucru cu soluţii dezinfectante Modul de lucru o Însămânţare şi incubare 1. . utilizând aceeaşi aparatură.- Folosirea lampei de U. bulion EC în eprubete cu tub de fermentaţie-dezvoltare de gaze. În cazul că toate testele sunt caracteristice pentru E.Diferenţa absolută dintre două rezultate ale analizelor individuale. . apă peptonată cu celobioză şi ABT-celobioză negativ. coli O157H7 şi se striază pe suprafaţa mediului PRS-MUG turnat în plăci Petri sterile. în acelaşi laborator. Exprimarea rezultatelor .

coli O157 H7 colonii de mărime medie. H2S-negativ pozitivă negativă negativă .Testul Caracterul coloniilor pe: Folosirea citratului Aspectul pe: Lizin decarboxilază Fermentarea celobiozei Producerea de betagalacto-xidază Mediul folosit EMB (Levine) Agar cu citrat (Simons) Agar TSI LIA sau Moeller Apă triptonată + celobioză Agar înclinat + BCIG Reacţia caracteristică pentru E. violet-maronii cu luciu metalic negativă coloană şi pantă galbene.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful