Utilização da espectroscopia Raman na verificação da citotoxidade de Tabebuia avellanedae em células Caco-2 in vivo

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ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO E DESENVOLVIMENTO............................................... 1 2. OBJETIVOS............................................................................................3 2.1. Objetivo Geral.......................................................................... 3 2.2. Objetivos Específicos............................................................ 3 3. REVISÃO DA LITERATURA.................................................................. 4 4. METODOLOGIA E AVALIAÇÃO........................................................... 10 4.1. Cultura celular......................................................................... 10 4.2. Aquisição das imagens das células...................................... 10 4.3. Características farmacológicas............................................. 11 4.4. Cultura celular para Espectroscopia Raman........................ 12 4.5. Cultura celular para MTT........................................................ 13 4.6. 4.7. Sistema de Espectroscopia Raman Dispersivo................13 Processamento dos espectros .......................................... 14

5. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO.......................................................... 15 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................17

1. INTRODUÇÃO E DESENVOLVIMENTO
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O termo câncer é utilizado genericamente para representar um conjunto de maisde 100 doenças, incluindo tumores malignos de diferentes localizações. Importante causa de doença e morte no Brasil, desde 2003, as neoplasias malignas constituem-se na segunda causa de morte na população, representando quase 17% dos óbitos de causa conhecida, notificados em 2007 no Sistema de Informações sobre Mortalidade. Compreender e controlar as doenças malignas requer conhecimentos científicos e experiências que vão desde o conhecimento dos complexos mecanismos de regulação molecular intracelular às escolhas individuais do estilo de vida. Também se exige uma gestão competente e o melhor uso dos recursos disponíveis para o planejamento, execução e avaliação das estratégias de controle da doença. A prevenção e o controle de câncer estão entre os mais importantes desafios, científicos e de saúde pública, da nossa época (BRASIL, 2009). A espectroscopia Raman manipula uma mudança na freqüência quando a luz é espalhada por moléculas ou átomos absorvidos no substrato. Portanto, ela provê a identidade molecular ou digital, informação sobre a estrutura molecular, interação intermolecular e dinâmica inerente (LORINCZ et al., 2004; HOSSAIN et al., 2009). É uma técnica não destrutiva e não invasiva, incluindo análises de amostras biológicas in situ e in vivo (HOSSAIN et al., 2009; OWEN et al., 2006). A espectroscopia Raman pode ser levada sob uma larga gama de condições de temperatura, pressão, etc (HOSSAIN et al., 2009). O Ipê-Roxo (Tabebuia avellanedae Lorentz & Grizebach Goett) é tido como um poderoso auxiliar no combate a determinados tipos de tumores cancerígenos. É usado também como analgésico e como auxiliar no tratamento de doenças estomacais e da pele. No passado, foi largamente utilizado no tratamento da sífilis. A árvore do Ipê-roxo é alta e tem como característica as flores tubulares arroxeadas. Os estudos ainda não comprovaram suas propriedades anticancerígenas. A substância com propriedades terapêuticas é encontrada na principalmente na casca, e folhas. O presente trabalho visa sanar a carência de dados a cerca do funcionamento da ação de citotoxidade do extrato vegetal de Tabebuia
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avellanedae em células Caco-2 e possibilitar a investigação de novos fármacos.

2. OBJETIVOS

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2.1. Objetivo Geral O objetivo deste estudo será avaliar a eficácia terapêutica e o uso das concentrações adequadas no combate às células Caco-2 por meio da Espectroscopia Raman Dispersiva. 2.2. Objetivos Específicos - Avaliar a ação do extrato vegetal de Tabebuia avellanedae Lorentz & Grizebach Goett in vitro como antineoplásico em adenocarcinoma de cólon para utilização terapêutica em Medicina; - Avaliar se a Espectroscopia Raman Dispersiva (830nm) poderia ser usada para determinar a eficiência antineoplásica do extrato de T. avellanedae nas concentrações de D3 (0,1 µg/mL), D6 (0,1 ng/mL), D9 (0,1x10-3 ng/mL), D12 (0,1x10-6 ng/mL) e D30 (0,1x10-24 ng/mL) em cultura de células Caco-2; - Comparar os espectros Raman da suspensão das células obtidas após a inoculação do extrato vegetal na cultura das mesmas, obtendo-se, assim, a correlação e a viabilidade através da mensuração da atividade mitocondrial, fornecida pelo teste do ensaio de MTT Assay.

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3. REVISÃO DA LITERATURA Segundo recente relatório da Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC)/OMS (World Cancer Report, 2008), o impacto global do câncer mais que dobrou em 30 anos. Estimou-se que, no ano de 2008, ocorreriam cerca de 12 milhões de casos novos de câncer e 7 milhões de óbitos. O contínuo crescimento populacional, bem como seu envelhecimento, afetará de forma significativa o impacto do câncer no mundo. Esse impacto recairá principalmente sobre os países de médio e baixo desenvolvimento. A IARC/OMS estimou que, em 2008, metade dos casos novos e cerca de dois terços dos óbitos por câncer ocorrerão nessas localidades O câncer é uma doença genética em mamíferos, aves e plantas, resultado da alteração da dupla fita do DNA sofrida por um grupo de células, que lhes confere independência no controle proliferativo. Porém, hoje se sabe que a patogênese do câncer tem incidência de fatores ambientais somados às mutações herdadas que alteram o genoma das células tumorais. Quando isso ocorre desencadeia três fatores importantes: ativação da oncogênese; alterações nos genes reguladores; e apoptose e inativação de genes supressores do câncer (LOPES, 2008). É uma das doenças mais sérias prejudicando a saúde e a vida humana e a sua influência está crescendo. Devido a patogenia do câncer e de algumas doenças correlatas não terem sido encontradas e o diagnóstico efetivo e a terapia completa não poderem ser levadas a cabo no presente, é impossível controlar o progresso do estado da enfermidade para o câncer em pacientes em estágio terminal. É muito difícil diagnosticar câncer em modalidades porque os primeiros sintomas do câncer não são evidentes e eles não têm diferenças distintas das de algumas outras doenças (YAN et al., 2005). É necessário conhecer a biologia da célula cancerígena para que, através do mecanismo de atividade funcional, se possa chegar o mais próximo da detecção pela espectroscopia Raman (LOPES, 2008). Apesar de progressos significativos terem sido feitos tanto no entendimento quanto no tratamento do câncer durante os últimos trinta anos, ele ainda permanece sendo a segunda maior causa de morte nos Estados
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Unidos. Detecção não invasiva do câncer em seus estágios iniciais é de grande interesse desde a sua diagnose precoce, e em combinação com terapias precisas contra o câncer, poderiam significantemente aumentar a taxa de sobrevivência de pacientes (YAN et al., 2005; XIAO et al., 2009). A nanomedicina, uma área emergente de pesquisa que integra nanomateriais e biomedicina, tem o potencial de prover novas ferramentas diagnósticas para detecção de cânceres primários em seus estágios mais precoces, e prover melhora nos protocolos terapêuticos. Pesquisa em nanomedicina liderará também o entendimento dos intricados mecanismos dos nanomateriais (XIAO et al., 2009). A espectroscopia é o estudo do espectro obtido pela interação da radiação eletromagnética com a matéria, cujo principal objetivo é a determinação dos níveis de energia dos átomos ou moléculas. Nesta técnica utiliza-se a radiação eletromagnética para testar o comportamento vibracional de moléculas, observando-se o espalhamento ou absorção dessa radiação (SALA, 1996 in LOPES, 2008). Inicialmente, o efeito Raman foi previsto teoricamente por A. Smekal, em 1923, que utilizou a teoria quântica para este fim (SMEKAL, 1923). Contudo, somente em 1928 é que a observação experimental do fenômeno bem como sua explicação foi dada pelo indiano Chandrasekhara Venkata Raman durante um encontro da Associação de Ciências do Sul da Índia (RAMAN, 1928). Num sistema Raman dispersivo um espectro Raman é obtido quando a luz monocromática de um laser incide sobre a amostra que se deseja estudar. A luz é espalhada em todas as direções, quase que isotropicamente, mas só é possível coletar aqueles fótons que atingirem a abertura do espectrógrafo. Em seguida a luz é dispersa por uma rede de difração dentro do espectrógrafo e seus componentes são recolhidos em um detector que converte a intensidade da luz sinais elétricos que são interpretados em um computador na forma de um espectro Raman (FLORES, 2008). A espectroscopia Raman manipula uma mudança na freqüência quando a luz é espalhada por moléculas ou átomos absorvidos no substrato. Portanto, ela provê a identidade molecular ou digital, informação sobre a estrutura molecular, interação intermolecular e dinâmica inerente (LORINCZ et al., 2004; HOSSAIN et al., 2009). É uma técnica não destrutiva e não invasiva, incluindo
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análises de amostras biológicas in situ e in vivo (HOSSAIN et al., 2009; OWEN et al., 2006). A espectroscopia Raman pode ser levada sob uma larga gama de condições de temperatura, pressão, etc (HOSSAIN et al., 2009). Quando uma amostra é irradiada, uma troca de energia ocorre entre a luz de excitação e as moléculas da amostra, que resulta em uma mudança mensurável do comprimento de onda da luz incidente do laser. O espectro Raman resultante é uma ‘digital bioquímica’, contendo bandas representando os modos normais de vibração de todas as moléculas dentro da região da amostra interrogada. Como as características moleculares de todos os biopolímeros celulares são simultaneamente investigados, há muita informação contida no espectro Raman. O acoplamento do espectrômetro Raman a um microscópio ótico, conhecido como microespectroscopia Raman, facilita a coleta de espectros de volumes < 1 μm3, habilitando a analise de características em microescala de amostras biológicas (SWAIN et al., 2007). Proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e carotenóides têm seu próprio grupo de bandas características. Isso é importante, contudo, para reconhecer que há uma superposição considerável entre as bandas dos diferentes componentes do tecido; por isso, é necessário olhar para todas as muitas bandas de um dado tipo de molécula. Contudo, a espectroscopia Raman provê informação detalhada acerca da composição biomolecular dos tecidos, o que deve ser usado para distinguir entre tecido normal, intermediário ou maligno (LORINCZ et al., 2004; CREELY et al., 2005). A espectroscopia por espalhamento Raman provê informação similar ao que fornece a espectroscopia por absorção no FT-IR (Fourier-transform Infrared). Contudo, a forte absorção da água na mensuração do FT-IR impede a análise de amostras biológicas hidratadas. Ao contrário, a espectroscopia Raman se encaixa melhor no estudo de células vivas, já que os espectros de meios aquosos demonstraram somente uma mínima interferência da água. A espectroscopia Raman ainda pode oferecer resolução espacial superior que a da FT-IR devido ao laser de onda mais curta usado para a excitação (SWAIN et al., 2007). Anexando anticorpos ou outro agente elucidante (como receptores ligantes) à superfície de nanocarregadores para atingir alvos específicos de células cancerosas é uma modalidade promissora para terapia e diagnóstico
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oncológico (PEER et al., 2007). A melhora da eficácia terapêutica dos nanocarregadores marcados tem sido estabelecida em múltiplos modelos de câncer animais e atualmente mais de 120 testes clínicos estão em andamento com várias formulações de nanocarregadores contendo anticorpos (SAPRA, et al., 2003). Os mais comumente explorados nanocarregadores incluem conjugados de polímeros, nanopartículas poliméricas, carregadores baseados em lipídios como os lipossomos e as micelas e dendrímeros (PEER et al., 2007). Avanços recentes em nanotecnologia desenvolveram uma cadeia de novos nanomateriais inorgânicos como as nanocélulas metálicas e nanotubos de carbono, oferecendo propriedades opto-eletrônicas únicas comparadas com os convencionais nanocarregadores orgânicos (HIRSH et al., 2006; YANG et al., 2007). Desde a descoberta de nanotubos de carbono, pesquisadores têm explorado seu potencial em aplicações biológicas e biomédicas. A recente expansão e disponibilidade de modificações químicas e métodos de biofuncionalizações tem tornado possível gerar uma nova classe de nanotubos bioativos que são conjugados com proteínas, carboidratos ou ácidos nucléicos (YANG et al., 2007). Com a investigação de fontes promissoras para o desenvolvimento e produção de novos fármacos voltados ao combate de células cancerosas, é possível isolar o princípio ativo dessa fonte e fazê-lo ser transportado através de nanocarregadores, sem perdas, às células alvo, de forma que haja total aproveitamento da ação do fármaco e menos probabilidade de incitar a resistência ao fármaco por parte das células alvo. JEES et al. (2007) aplicaram a espectroscopia Raman em culturas de células vivas e fixadas para discriminar entre tipos de células definidas. O espectro Raman foi adquirido de queratinócitos primários humano (PHK), PHK expressando p gene E7 do HPV (Papiloma Vírus Humano) 16 (PHKE7) e células CaSki, uma linhagem de células contendo HPV16 derivada de carcinoma cervical. O espectro Raman mostrou variações, principalmente nos picos originados do DNA e das proteínas, consistente com as mudanças associadas à expressão gênica e celular do HPV com neoplasia, em ambas células vivas e fixadas. A componente principal da análise produziu boa discriminação entre os tipos celulares acima de 100% para a comparação de
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PHK fixada e CaSki. Esses resultados demonstram a habilidade da espectroscopia Raman em discriminar entre tipos de células representando diferentes estágios de neoplasia cervical (JESS et al., 2007; OWEN et al., 2006). O Ipê-Roxo (Tabebuia avellanedae Lorentz & Grizebach Goett) é tido como um poderoso auxiliar no combate a determinados tipos de tumores cancerígenos. É usado também como analgésico e como auxiliar no tratamento de doenças estomacais e da pele. No passado, foi largamente utilizado no tratamento da sífilis. A árvore do Ipê-roxo é alta e tem como característica as flores tubulares arroxeadas. Os estudos ainda não comprovaram suas propriedades anticancerígenas. A substância com propriedades terapêuticas é encontrada na principalmente na casca, e folhas. Tabebuia avellanedae possui em sua constituição química ácido tânico, ácido lapáchico, antraquinonas, carboidratos, desoxilapachol, flavonóides, fibras, gorduras, lapachol, naftoquinonas, proteínas, sais minerais, sais alcalinos, saponinas, vitaminas. A β-lapachona (C15H14O3, MM 242,3), conhecida quimicamente por 3,4-diidro-2,2-dimetil-2H-naftol[1,2-b]pirano-5,6-diona, é uma ortonaftoquinona de ocorrência natural isolada do ipê-roxo, ou paud’arco roxo (Tabebuia avellandae Lor), da família Bignoneaceae, que cresce principalmente no Brasil (ALVES et al., 2008). É um produto vegetal simples que tem demonstrado excelente potencial antineoplásico, agindo por um mecanismo particular de apoptose contra diversos tipos de câncer, em especial algumas linhagens de próstata refratárias aos tratamentos convencionais (ALVES et al., 2008; BOOTHMAN et al., 1989). Está sendo desenvolvido pelo Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco – LAFEPE, como parte integrante de seu elenco oncológico, um medicamento à base de β-lapachona na forma farmacêutica cápsula gelatinosa mole. Para isso, é de suma importância a caracterização físico-química do princípio ativo, pois, dessa forma, se estabelece a carta de identidade do produto, possibilitando sua padronização e avaliação de sua pureza, tornando-o adequado para a realização de estudos de pré-formulação (ALVES et al., 2008). Em estudos de BOVERIS et al. (1978) ficou comprovado a ação inibitória de β-lapachona no crescimento em meio líquido de Trypanosoma cruzi. β10

lapachona foi capaz de estimular a produção de H 2O2, causando alterações metabólicas e ultraestruturais severas em T. cruzi, mostrando ser um trypanocida efetivo. O presente trabalho visa sanar a carência de dados a cerca do funcionamento da ação de citotoxidade do extrato vegetal de Tabebuia avellanedae em células Caco-2 e possibilitar a investigação de novos fármacos.

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4. METODOLOGIA E AVALIAÇÃO 4.1. Cultura celular A metodologia adotada está baseada em (LOPES, 2008). As células Caco-2 (CR069, Adenocarcinoma de cólon) serão obtidas junto ao Banco de células do Rio de Janeiro/RJ. A linhagem celular será cultivada em Meio Mínimo Essencial (MEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 mM/mL), fungizona (0,25 µg/mL) e mantida a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2. As células Caco-2 são extraídas de Adenocarcinoma de cólon humano, cultivadas em filtros permeáveis e porosos; se diferenciam espontaneamente em enterócitos, formando uma membrana composta de células em monocamadas aderidas por junções e apresentam como vantagem a rápida multiplicação celular (BALIMANE et al., 2000 in LOPES, 2008). A preparação das células da monocamada requer um período de cultura de três semanas. Entretanto, este tempo pode ser reduzido para menos de uma semana por modificações simultâneas no material de revestimento dos filtros e no meio de crescimento. A redução no período de cultura proporciona monocamada funcional com maior produtividade, além de reduzir a contaminação por fungos/bactérias (CHONG et al., 1997 in LOPES, 2008). Apesar dessas limitações, este é o modelo mais empregado no momento e permite obter importantes informações para o estudo de novos fármacos. 4.2. Aquisição das imagens das células Serão obtidas foto-micrografias de todas as placas das culturas de células através de um microscópio óptico (L40x0,50) e analisadas com software.

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4.3. Características farmacológicas O extrato vegetal será solicitado ao Laboratório de Fitoquímica da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, localizado na cidade de Campo Grande/MS. Nome científico: Tabebuia avellanedae Lorentz & Grizebach Goett. Família: Bignoniaceae. Sinônimos botânicos: Bignonia serratifolia, Gelseminum avellanedae, Handroanthus avellanedae, Handroanthus impetiginosus (Mart. & DC.) Mattos, Handroanthus impetiginosus var. lepidotus (Bureau) Mattos, Tabebuia avellanedae Lorenz & Grizebach., Tabebuia dugandii Standl., Tabebuia ipe (Mart.) Standl., Tabebuia ipe var. integra (Sprague) Sandwith, Tabebuia nicaraguensis S. F. Blake, Tabebuia palmeri Rose, Tabebuia schunkevigoi D. R. Simpson, Tecoma adenophylla Bureau & K. Schum., Tecoma avellanedae (Lorentz ex Grizeb.) Speg., Tecoma avellanedae var. alba Lillo, Tecoma impetiginosa Mart. & DC., Tecoma impetiginosa Mart., Tecoma impetiginosa var. lepidota Bureau, Tecoma integra (Sprague) Chodat, Tecoma ipe fo. leucotricha Hassl., Tecoma ipe var. integra Sprague, Tecoma ipe var. integrifolia Hassl. Outros nomes populares: cabroé, ipê, ipê-de-flor-roxa, ipê-mirim, ipêpreto, ipê-tabaco, ipê-uva-roxa, ipeúva-roxa, pau-d'arco-roxo, peúva, peúva-roxa. Constituintes químicos: ácido tânico, ácido lapáchico, antraquinonas, carboidratos, desoxilapachol, flavonóides, fibras, gorduras, lapachol, naftoquinonas, vitaminas. proteínas, sais minerais, sais alcalinos, saponinas,

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Propriedades medicinais: adstringente, analgésico, antiblenorrágica, antimicrobiana (gram +), antiinflamatória, antiinfecciosa, antitumoral, antinevrálgica, anti-sifilítica, antibactericida, antifungo, depurativa, diurético. Indicações: alergia, anemia, diabete, diarréia, câncer, candidiasis, catarro da uretra, colite, coceira, ovário, estimulante do sistema imunológico (prevenção de leucemia, diabete, câncer), feridas, fígado, fungo, garganta, inflamacão artrítica, leucemia, lupus, mal de Parkson, malária, osteomielite, problemas respiratórios, psoríase, queimaduras, úlcera, útero. Partes utilizadas: casca, folhas. Contra-indicações/cuidados: gravidez, período de lactação.

Altas doses causam náuseas, vômitos, diarréia, efeito anticoagulativo do sangue; abortivo; não foi evidenciada toxidez hepática ou renal. 4.4. Cultura celular para Espectroscopia Raman As células Canco-2 (colo-retal) serão cultivadas em placas de 96 poços, com meio MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. As células serão inoculadas com 100 µg/mL de cada uma das concentrações de T. avellanedae (de acordo com os grupos). Para a leitura na espectroscopia Raman será feita análise após 72 horas de inoculação com o extrato, ocorrendo uma nova administração do produto com intervalo de 24 horas. Grupos: G1 - T. avellanedae D3 + Células caco-2 G2 - T. avellanedae D6 + Células caco-2 G3 - T. avellanedae D9 + Células caco-2 G4 - T. avellanedae D12 + Células caco-2 G5 - T. avellanedae D30 + Células caco-2
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G6 - Células caco-2 4.5. Cultura celular para MTT As culturas celulares incubadas com T. avellanedae nas concentrações D3 (0,1 µg/mL), D6 (0,1 ng/mL), D9 (0,1x10-3 ng/mL), D12 (0,1x10-6 ng/mL) e D30 (0,1x10-24 ng/mL), serão analisadas por microscopia óptica, com base nos registros realizados através de fotomicrografias que documentam o aspecto das células. Para análise da citotoxidade será utilizado o teste de MTT (1mg/mL) ((4,5 dimetiltiazol-2yl)-2-5-difenil-2H tetrazolato de bromo), que consiste num método químico-físico destinado a verificar a viabilidade celular e citotoxidade do agente em questão Para este teste será retirado todo o meio de cultura e adicionado 200 µL de MTT e incubado a 37ºC por 1 hora. Após esse período adiciona-se 200 µL de DMSO (Dimetil sufóxido) com agitação por 30 minutos para diluição dos cristais de formazana. A leitura será realizada com Espectrofotômetro com filtro de 570 nm. 4.8. Sistema de Espectroscopia Raman Dispersivo O sistema Raman Dispersivo que será usado para coletar o sinal de Raman está apresentado na Figura 1. É composto por uma fonte de excitação, através de um laser de diodo em 830 nm, com densidade de potência aproximadamente de 80 mW. Um espectro Raman é obtido quando a luz monocromática de um laser incide sobre a amostra que se deseja estudar. A luz é espalhada em todas as direções, quase que isotropicamente, mas só é possível coletar aqueles fótons que atingirem a cobertura do espectrógrafo e seus componentes são recolhidos em um detector que converte a intensidade da luz em sinais elétricos que são interpretados em um computador na forma de um espectro Raman. Para diminuir o ruído ocasionado pela interferência vibracional das moléculas do próprio equipamento de detecção recorreu-se a refrigeração da câmara CCD (Charged-coupled device) por nitrogênio líquido. Este
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dispositivo multicanal, com excepcional sensibilidade e ruído intrínseco muito baixo, melhorou a relação sinal-ruído e a velocidade de aquisição dos dados.
4.9. Processamento dos espectros

O sinal será coletado por um espectrógrafo e analisado em um detector (CSMA), refrigeração a -95ºC com nitrogênio líquido. Controlada por computador, a abertura da fenda do espectrógrafo será ajustada em 200 µm e a aquisição do sinal será configurada para realizar uma única acumulação com 30 segundos para cada espectro. A obtenção dos espectros Raman encontra uma das maiores dificuldades na presença da fluorescência do tecido biológico. A subtração computacional foi facilitada através de programas que melhoraram crescentemente (KHALIL, 1999 in LOPES, 2008).

Figura 1 – Diagrama esquemático da Espectroscopia Raman Dispersiva a 830 nm e potência de 80 mW do laser e escala espectral de 800 a 1800 cm-1. Fonte: (SATHAIAH, 1996 in LOPES, 2008).

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5. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO ATIVIDADE Revisão bibliográfica Solicitação de orçamentos de equipamentos Solicitação de orçamentos de materiais de consumo Solicitação de células Caco2 Padronização dos experimentos Cultura celular Aquisição das imagens das células Cultura celular para Espectroscopia Raman Cultura celular para MTT Processamento dos espectros Elaboração de resumos para apresentação em encontros científicos Compilação dos dados e X X X
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elaboração de artigos Elaboração e apresentação de relatório final

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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALVES, G. M. C.; ROLIM, L. A.; NETO, P. J. R; LEITE, A. C. L.; BRONDANI, D. J. Purificação e caracterização da β-lapachona e estudo de estabilidade dos cristais em diferentes condições de armazenamento Quim. Nova, v. 31, n. 2, p. 413-416, 2008. BOOTHMAN, D. A.; PARDEE, A. B. Inhibition of radiation-induced neoplastic transformation by β-lapachone Proc. Nati. Acad. Sci. USA, v. 86, p. 4963-4967,1989. BOVERIS, A.; DOCAMPO, R.; TURRENS, J. F.; STOPPANI, A. O. M. Effect of P-Lapachone on Superoxide Anion and Hydrogen Peroxide Production in Trypanosoma cruzi. Biochem. J., v. 175, p. 431-439, 1978. BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Instituto Nacional de Câncer (INCA). Estimativa 2010: incidência de câncer no Brasil/Instituto Nacional de Câncer. – Rio de Janeiro: INCA, 2009. Disponível em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/controle_cancer Acessado em 02/12/2009. CREELY, C. M.; SINGH, G. P.; VOLPE, G.; PETROV, D. V. Raman Spectroscopy on Floating Cells. Biophotonics, 2005. JESS, P. R. T.; SMITH, D. D. W.; MAZILU, M.; DHOLAKIA, K.; RICHES, A. C.; HERRINGTON, C. S. Early detection of cervical neoplasia by Raman spectroscopy. Int. J. Cancer, v. 121, p. 2723–2728, 2007. LOPES, D. F. Utilização da espectroscopia Raman na verificação da citotoxidade de Viscum album em células Caco-2 in vivo. Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba, 2008, 66 p. Dissertação de Mestrado.

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