FACULTAD DE INGENIERÍA CIVIL Y AMBIENTAL PRÁCTICA DE TOXICOLOGÍA TEMA: BIOENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON ALLIUM CEPA L (CEBOLLA) MEDIANTE

LA EVALU ACIÓN DE LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO PROMEDIO DE RAÍCES. 1.- OBJETIVOS: Evaluar los efectos fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el p roceso de crecimiento de las raíces de cebolla (allium cepa L) en un período de prue ba de 96 horas . 2.- TEORÍA: Cuando un bulbo de cebolla (Allium sp) se rehidrata, se produce una estimulación d el crecimiento de las células, lo cual permite la elongación de las raíces de la plant a. Sin embargo, cuando la hidratación se lleva a cabo en presencia de sustancias tóx icas, la división celular de los meristemas radiculares puede inhibirse, ya sea re tardando el proceso de mitosis o destruyendo las células. Este tipo de alteracione s generalmente impide el crecimiento normal de la raíz y, por tanto, su elongación ( Fis esjö, 1985, 1993, 1997). El efecto puede determinarse en forma indirecta, mediante la comparación de la elo ngación de las raíces de cebollas expuestas al tóxico con las de cebollas no expuestas , luego de un periodo de 72 h de prueba. La cuantificación del efecto se realiza e stableciendo el porcentaje de inhibición del crecimiento de las raíces respecto a la longitud promedio de las raíces del control. 3.- MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS: Materiales 1. 1 Bisturí. 2. 5 vasos de precipitación de 100 ml. 3. 1 Pipeta de 10 ml 4. 1 Probeta de 25 ml. Equipos 1. Plancha de agitación Reactivos 1. Solución de dicromato de potasio 5 M. 2. Agua dura. 3. 4. Agua destilada. 72 bulbos de cebolla.

4.- PROCEDIMIENTO: 1. Selección de los individuos de prueba Para la elaboración de las pruebas se deben seleccionar bulbos de Allium sp (cebol la amarilla) de 1,5 cm de diámetro, secos y sin formación de hojas y/o raíz. Pueden se r obtenidos del mercado local o adquiridos a través de algún proveedor. Previo al montaje de la prueba, los bulbos deben limpiarse eliminando la epiderm is seca y removiendo, con un bisturí o instrumento punzante, los restos de tejido y raíces del área radicular (Ilustración Nº1). No se deben dañar las raíces primordiales. Co n el fin de eliminar los restos de tejidos es conveniente colocar los bulbos en agua destilada por dos horas y secar. Ilustración 1 Esquema de los pasos a seguir para la realización de la prueba. 1) Lim pieza y pelado de bulbos. 2) Ubicación de los bulbos en tubos de ensayo 3) Colocac ión de tubos en soporte. 4) Colocación de las soluciones. 5) Medición. 2. Elaboración del El medio de crecimiento Tabla Nº 1. La solución ces con agua destilada, Medio De Crecimiento utilizado para el desarrollo del ensayo se indica en la madre preparada de acuerdo con lo indicado se diluye diez ve y el pH se ajusta a siete antes de utilizar.

 

adicionando cuidadosamente el volumen con ayuda de una pipeta Pasteur. etcétera. sin embargo. el almacenamiento está limitado a unos pocos días.1. 5. 10. Ensayo de toxicidad Cuando se trabaja con bulbos de diámetro pequeño. A continuación se colocan los bulbos limpios sobre la boca del tubo.0645(*) NaMnO4 0. 1. 0. En algunas regiones.Tabla 1 Medio de crecimiento para Allium. un control negativ o. lo cual per mitirá establecer el intervalo de concentración conveniente para la determinación de l a concentración inhibitoria media (CI50). los bulbos pueden mantener se almacenados hasta por un año. Almacenamiento de los bulbos de cebolla Se recomienda adquirir los bulbos en vísperas de la realización de pruebas o en su d efecto. en zonas geográficas donde la temperat ura y humedad son altas. Se recomienda inclinar el bulbo sin sacar las raíces del tubo. Es importante destacar que la profundidad de los recipientes d ebe ser tal que. este l lenado deber hacerse hasta el borde del tubo. 4.55(*) CuCl2 0.23(*) (*) Los componentes correspondientes a elementos traza deben ser adicionados a p artir de una solución stoc También se puede utilizar agua dura o agua de la llave como medio de crecimiento.3. en el caso de bulbos de mayor d iámetro pueden utilizarse tubos o recipientes de mayor volumen. En la prueba se utilizan cinco concentraciones de la muestra. Para su preparación se emplea el méto do de dilución en forma secuencial aplicando un factor de 0.1 Fe EDTA•3H2O 67. almacenarlos en un lugar donde se puedan garantizar condiciones secas. En la ilustración Nº 2 se resumen las condiciones de prueba y en la tabla Nº 2 se obse   . En el caso de usar cualquiera de estas opciones el control negativo y el agua ut ilizada para preparar las diluciones de los compuestos químicos o las muestras deb erá ser la misma. cada una con doce réplicas. El ensayo se inici a con el llenado de los tubos con cada una de las diluciones y controles. Cuando se va a llevar a cabo una evaluación presuntiva puede emplearse una serie d e diluciones logarítmicas. 3. Dos veces al día durante el periodo de prueba se debe restablecer el volumen perdi do por evaporación o absorción. así como par a la preparación de las diluciones de la muestra y la preparación del control positi vo con el tóxico de referencia. la elongación máxima no alcance el fondo del recipiente. Para restablecer este volumen se utiliza la muestra o dilución correspondiente. dependiendo del ta maño de los mismos.6 Elementos traza Reactivo mg MnSO4 0. Masa de sal para disolver en un litro de agua destilada Reactivo mg Ca (NO3)2•4H2O 236.2 o 0. 0. y una temperatura entre 10 y 20 °C.0007(*) H3BO3 0. al término de la prueba. las pruebas se realizan en tubos d e ensayo de 10 cm de longitud x 1.001(*) ZnSO4 0. la cual se localiza sobre una mesa que no presente vibraciones y se mantienen a temperatura ambiente (20 °C) por un periodo de 96 horas.01.5 cm de ancho.1 KNO3 202 MgSO4•7H2O 246 KH2PO4 136. Se recomienda igualmente utilizar agua dura para el control negativo. Debe evitarse la iluminación directa. y uno o dos controles positivos. dos o t res controles positivos y un control negativo. cuidando que la zona radicular quede inmersa en el líquido. Los tubos se colocan en una gradilla. por ejemplo: 100. Preparación de diluciones Generalmente se sugiere el empleo de una serie de cinco concentraciones.

Resumen de las condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad c on Allium cepa L. Tabla 2. ambiente Calidad de luz Fluorescente. G.. 1993. Toxicol. REFERENCIAS Fis esjö. in: Plants for Environmental Studies. Se efectúa la estimación en cada tubo y se ob tiene el promedio matemático de diez réplicas (los dos valores más extremos se descart an). PARÁMETROS VALOR Tipo de ensayo Estático Temperatura 20 °C. Heredita s. blanco-frio Iluminación Indirecta Recipientes Tubos de ensayo de 10 × 1. 1985.. La medición se lleva a cabo colocando la escala en el margen del tubo.EXPRESIÓN DE RESULTADOS Al término del periodo de exposición se registra la longitud promedio de las raíces. G. promedios móviles o Sperman & Karber (Consultar bibliografía sobre "Métodos esta dísticos para el análisis de resultados de toxicidad").102. "The Allium Test in Wastewater Monitoring". Fis esjö. pp. 291-298. Wat. Qual. Env. 1997. Fis esjö. 99-12. pp. "Allium Test for Screening Chemicals.rvan los parámetros de realización del ensayo..5 cm de diámetro Condición de los bulbos Pelar los bulbos y la base. Wancheng..       . G. 8. se ubica el valor de longitud mínimo y máximo donde incide la mayoría de las raíces y el p unto medio se define como el promedio. l a cual se lleva a cabo con ayuda de una regla común con escala en milímetros (Ilustr ación Nº 3). 5. Ilustración 3 Elongación de las raíces de bulbos de cebolla después de un proceso de hid ratación. evitar dañar el anillo radicul ar Agua de dilución Agua de la Ilave O canilla O medio de crecimiento Número de concentraciones Cinco Duración de la prueba 72 h Efecto medido Inhibición de crecimiento de las raíces Control negativo Agua de la Ilave o medio de crecimiento Control positivo Agua dura Resultado final CI50 Ilustración 2 Ensayo de toxicidad con Allium cepa L.5 cm de diámetro Número de réplicas 12 Material biológico Bulbos de aproximadamente 1. Evaluation of Cytologica l Parameters". 6. “The Allium Test as Standard in Environmental Monitoring”. Para obtener el porcentaje de efecto de inhibición se debe realizar la siguiente o peración: (Longitud del control–Longitud de la muestra) x 100/longitud del control Con estos valores se construye una gráfica de concentración en función del porcentaje de inhibición y se calcula la CI50 mediante cualquiera de los siguientes métodos: Pr obit.