BİYOKİMYA I 4.

Peptidler

F. Zihnioğlu

Peptidler
Amino acid Polipeptid Protein

Aminoasitlerin birinin α-karboksil grubu ile diğer aminoasidin α-amino grubu arasında 1 mol su ayrılmasıyla oluşan kovalent bağa peptid bağı denir. Bu bağ amid bağı karakterindedir.
Karboksil Amino grubu grubu

Peptid Bağı

AA1

AA2

Dipeptid

Peptidler

Peptidler yapısına giren aminoasit sayılarına göre;
2 aminoasit : dipeptid 3 aminoasit : tripeptid 4 aminoasit : tetrapeptid 5 aminoasit : pentapeptid <10 aminoasit : Oligopeptid <100 aminoasit : Polipeptid >100 aminoasit : Proteinler

Peptidlerde adlandırma yapılırken karboksil grubu reaksiyona katılan aminoasidin adına –il takısı eklenir.
serin-glisin-tirozin-alanin-Lösin • N-ucu; Serin, C-Ucu; Lösin • 4 peptid bağı • 5 AA; penta peptid • Serilglisiltirozilalanillösin 3 Harfli kısaltma N - terminal C - terminal Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu Tek Harfli kısaltma SGYAL

Alanilglisin
+ H3N N-terminal H C CH3 O C N H H C H O C – O C-terminal

Ala—Gly AG

Alanilglisin ve Glisilalanin yapısal izomerlerdir.
H C CH3 H C H O C N H O C N H H C H H C CH3 O C – O O C – O Alanilglisin Ala—Gly AG

+ H3N

+ H3N

Glisilalanin Gly—Ala GA

Peptid Bağı ve Yapısı

• 40% çift bağı karakteri – Rezonans formülleri – Kısa bağ uzunluğu
Yaklaşık 0.133 nm uzunluğunda – tipik tek bağdan daha kısa ancak çift bağdan uzun

– Çift bağ rotasyona engel olur.
Çift bağ karakterine bağlı olarak peptid bağındaki 6 atom her zaman planar(düzlemsel) yapıdadır.

Peptid Bağı ve Yapısı
• Peptid bağı ; protein yapısı ve fonksiyonunda etkin rol oynar. • Temel özellikler:
– – – – 1. 2. 3. 4. Planar(düzlemsel) Kısmi çift bağ karakterine bağlı olarak; rijit Hemen hemen her zaman trans konfigürasyonda Polar. En az 2 hidrojen bağı oluşturabilir.

Peptid Bağının Planar Yapısı (Amid Düzlemi)
Peptid Grubundaki 6 atom tek bir düzlemde yer alır!

Amid azotu ile karbonil oksijeni arasındaki rezonans nedeni ile peptid bağı planar ve sabittir.

Peptid Bağı Rezonans Formülleri

C=O arasındaki çift bağ C-N bağının rotasyonunu sağlar

C=N arasındaki çift bağ C-N bağının rotasyonunu engeller, ancak O ve N üzerinde yükler oluşur.

Doğru elektron yoğunluğunun bulunduğu araürün. C-N bağı rotasyonu için gerekli enerji bariyeri(88kJ/mol) amid grubunu planar tutmak için yeterli

Peptid iskeleti bağ rotasyonlarındaki limitasyonlar nedeni ile rijittir.

Peptid Bağı Uzunlukları

Bağ Açıları ve Uzunlukları

Peptid Bağı, ω, φ ve Ψ açıları
“Peptid bağı planar ve sabit” Sadece alfa karbona bağlı bağlar etrafında rotasyon mümkümdür.

ω
(omega)

Phi, φ: N-Cα bağında rotasyon, +180 den -180°. Psi, ψ: Cα - C bağında rotasyon, +180 den -180°. Omega, ω : peptid bağında rotasyon, Cα1-{C-N}- Cα2

• ω açısı planardır (0º - cis, veya 180 º - trans) • φ ve ψ esnektir, rotasyon bu bağlarda oluşur • Ancak, bir amino asit artığı için φ ve ψ sterik engeller ile limitlidir.

Amid Düzlemlerinin Rotasyonu
• Eğer (φ,ψ) tüm artıklar için biliniyor ise, peptidin iskelet yapısı da biliniyor demektir. • Pozitif (φ,ψ) değerleri Cα dan bakıldığında saat yönünde rotasyonu ifade eder.

Yasaklanmış Yapılar(sterik engelleme)

(φ,ψ)=(0,180), iki karbonil oksijeni birbirine çok yakın (φ,ψ)=(180,0), iki amid grubu çakışır; (φ,ψ)=(0,0), karbonil oksijeni amid grubu ile çakışır.

Mümkün olan iki konfigürasyon vardır, her ikisi de planardır.

Trans istemli konfigürasyon; özellikle büyük R grupları ile Cis çoğunlukla PRO artıkları, ancak trans form 4:1 daha istemli

Peptid konformasyonları

Trans peptid grubu

Cis peptid grubu

Prolin izomerleri

Prolin, izleyen amino asit artığına göre trans veya cis polipeptid formu oluşturabilir. Beş üyeli halka yapısının varlığı, φ açısının(N ve Cα arasındaki açı) yaklaşık olarak -65o dir.

Bağ rotasyonu; protein katlanması ve 3 boyutlu yapı için önemlidir.

Ramachandran Diyagramları
Phi ve psi açılarının mümkün olan tüm kombinasyonlarını içerir. Bazı açılar proteinlerin spesifik sekonder yapılarının tayini için tanımlayıcıdır. Φ(phi) ye karşı ψ(psi) diyagramları

Ramachandran Plot

Beyaz = sterikçe izin verilmeyen konformasyonlar
(atomlar van der Waals yarıçapları toplamından daha fazla birbirlerine yaklaşırlar)

Mavi = sterikçe izin verilen konformasyonlar

Peptidlerin Titrasyon Eğrisi ve İzoelektrik Nokta
Peptidlerin de serbest aminoasitler gibi karakteristik bir titrasyon eğrisi ve izoelektrik noktası mevcuttur. Örneğin; GluGlyAlaLys tetrapeptidinde çok asidik pH’da pKa nın altında tüm iyonize olan gruplar protonlanmış formda bulunur ve net yükü +2 dir. Bundan sonra NaOH ile titre edilir ve protonlar uzaklaştırılırsa farklı gruplara pH değerine göre pKa değerlerinin üzerinde protonlarını kaybederler. Net yükün 0 olduğu pH, izoelektrik noktadır.

Bir tetrapeptid; Glu-Gly-Ala-Lys N-terminal: Glu, C-terminal: Lys aminoasitleri 3 peptid bağı GlutamilGlisilAlanilLizin

Bir tetrapeptidin poliamfolitik davranışı

PEPTİD YAPI ANALİZİ
♣Aminoasit bileşenlerinin tayini ♣ Aminoasit dizi analizi ♣ Polipeptid zincirinin yapısı ♣ R-gruplarının pozisyonları ♣ Çoklu peptid zincirlerin varlığı ♣ Protein olmayan bileşenlerin belirlenmesi

Aminoasit Bileşenlerinin Tayini
Genelde asit hidrolizi; 6 N HCl ile 110oC de azot altında 24 saatte aminoasitlerine hidrolizlenirler. Aminoasit karışımı; a) Klasik aminoasit analizörü b) HPLC yada c) Gaz-sıvı kromatografisi ile analizi yapılır.

Doğal Yapının Bozundurulması
a) Non-kovalent bağların parçalanması (pH, sıcaklık, kimyasal modifikasyon, denaturantlar (üre, GdnHCl, SDS) b) Kovalent bağların parçalanması; disülfit bağların parçalanması (zincir içi veya zincirlerarası) (performik asit oksidasyonu veya merkaptoetanol ile indirgeme)

Peptid Hidrolizi ve Fragmantasyon
Peptidlerin hidrolizi çeşitli yollarla olur:
1) Asit veya baz hidrolizi: Tüm peptid bağlarının hidrolizi, örn:6 N HCl, 110 oC veya kısmi hidroliz 2) Enzimatik; proteolitik enzimler(proteazlar) 3) Kimyasal; Spesifik peptid bağlarının CNBr ile parçalanması örn: Met’nin C-ucundan hidrolizi

Bazı proteolitik enzimlerin dizi spesifikliği

CNBr Reaksiyonu

N-terminal belirlenmesi
1) Sanger metodu(2,4-DNFB) 2) Edman degradasyonu(PITC) 3) Dansil metodu(Dansyl-Cl) 4) EnzimatikYönt.(aminopeptidaz)

C-terminal belirlenmesi
1)Hidrazinoliz (Hidrazin ile parç.) 2) LiBH4 ile indirgeme 3) Enzimatik(Karboksipeptidaz)

N-terminal belirlenmesi Sanger Metodu
• Frederick Sanger tarafından geliştirilmiştir. • İnsulin dizisinin belirlenmesi için kullanılmıştır. – (6 kDa protein) • 12 yıl bu metod ile uğraşmış • 1958 yılında Nobel ödülü

N-terminal belirlenmesi Sanger Metodu
Sanger metodundaki anahtar reaktif; 1-fluro-2,4-dinitrobenzen “Sanger Reaktifi” “nukleofilik aromatik substitüsyon”
NO2 O2N F

Sanger Metodu(devam)
1-Floro-2,4-dinitrobenzen N-terminal amino asidin amino azotu ile reaksiyona girer.
NO2 O2N O F + H2NCHC O NHCHC O NHCH2C O – NHCHCO CH3

CH(CH3)2 CH2C6H5

- HF
NO2 O2N O NHCHC O NHCHC O NHCH2C O – NHCHCO CH3

CH(CH3)2 CH2C6H5

Sanger Metodu(devam)
Kuvvetli Asit(HF) hidrolizi ile tüm peptid bağları parçalanarak amino asit karışımı oluşur. Bu karışımda sadece N-terminalde yer alan amino asit 2,4-DNP amino asit türevidir.
NO2 O2N O
+

O

NHCHCOH + H3NCHCO– + H3NCH2CO– + H3NCHCO– CH(CH3)2
2,4-DNP Valin

+

O

O
+

CH2C6H5
H3O+

CH3

NO2 O2N

O NHCHC

O NHCHC

O NHCH2C

O – NHCHCO CH3

CH(CH3)2 CH2C6H5

N-terminal belirlenmesi Edman Metodu

Edman Degradasyonu ve Peptidlerin Otomatik Dizi Analizleri

Edman Metodu(Degradasyonu)
peptid peptid İşaretleme İşaretleme (PITC) (PITC) Parçalama Parçalama
Düzenlenme adımı Bağlanma adımı

Diğer döngü Diğer döngü

Edman Degradasyonu (devam)
1. N-terminal amino asit tayin yöntemi 2. Sıralı olarak yapılabildiği için, aynı örnek üzerinde dizi analizlenebilir. Genelde Nterminalden başlıyarak 20 AA(20 döngü) bu metod ile belirlenebilir. 3. 10-10 g örnek yeterlidir. 4. Otomatize edilebilir.

Edman Degradasyonu (devam)
Edman degradasyonundaki anahtar reaktif; “fenil izotiyosiyanat” (PITC)

N

C

S

Edman Degradasyonu (devam)
Fenil izotiyosiyanat N-terminal amino asidin amino azotu ile reaksiyona girer. O + peptid C6H5N C S + H3NCHC NH R S O NH peptid

C6H5NHCNHCHC

R feniltiyokarbamoil türevi (PTC)

Edman Degradasyonu (devam)
PTC türevleri daha sonra TFA(susuz ortam) ile muammele edilerek N-terminal AA peptidden ayrılır.

S

O peptid

C6H5NHCNHCHC NH R TFA C6H5NH C N
tiyazolon

S

C CH R

O +

+ H3N

peptid

Edman Degradasyonu (devam)
C6H5 S N C HN C CH R S C6H5NH C N C CH R O + O
Tiyazolon oluşum koşullarında, tiyazolon tekrar düzenlenerek N-terminal amino asitin feniltiyohidantoin (PTH) türevi oluşur.

+ H3N

peptid

Edman Degradasyonu (devam)
C6H5 S N C HN C CH R
PTH- Amino asit türevi

PTH AA türevi izole edilir ve tanımlanır. O Zarar görmeden kalan peptid(1 AA eksik), tekrar Edman degradasyonuna tabi tutulur.(2.,3.,döngü vb.)

Dansil Metodu ile N-terminal Analizi

Bir çok peptidde N-terminal, N-formil veya N-asetil grupları ile bloke edilmiş formda bulunurken C-terminal ise amidlere modifiye olmuştur.

N-Formil grubu

N-Asetil grubu

C terminal amidi

Peptid Sentezi
Amino asitler arasında peptid bağı oluşturmak zor değildir. Esas önemli olan amino asitleri doğru dizide birleştirmek Örn: fenilalanin ve glisin karışımında gelişigüzel peptid bağı oluşumu 4 tane dipeptid oluşumu ile sonlanır. Phe—Phe, Gly—Gly, Phe—Gly, Gly—Phe

Peptid Sentezi
1. Olasılık sayısını sınırlamak için bir amino asitin amino azotu ile diğer amino asitin karboksil grubunu “koruma” altına almak gerekir. N-Korunmuş fenilalanin O X NHCHCOH CH2C6H5 C-Korunmuş glisin O H2NCH2C Y

Peptid Sentezi
2. İki korunmuş amino asidin bağlanması O O X NHCHCOH CH2C6H5 O X NHCHC O NHCH2C Y H2NCH2C Y

CH2C6H5

Peptid Sentezi
3. N-terminaldeki amino grubu ve C-terminaldeki karboksil grubu korumasının kaldırılması O X NHCHC O NHCH2C Y

CH2C6H5 O O

+ H3NCHC

– NHCH2CO

CH2C6H5

Phe-Gly

Peptid Sentezi: Amino Grubunun Korunması
Amino Gruplarının Amid Formunda Korunması * Amino grupları amidlere dönüştürülerek korunabilirler. * Benziloksikarbonil (C6H5CH2OCO—) yaygın olarak kullanılan koruyucu gruptur ve Z kısaltması ile ifade edilir. * Z-koruması amino asidin benziloksikarbonil klorür ile muammele edilmesi ile gerçekleştirilir.

Amino Gruplarının Amid Formunda Korunması
O CH2OCCl
benziloksikarbonil klorür(Z)

+

+ – H3NCHCO CH2C6H5
1. NaOH, H2O 2. H+

O

Phe

O CH2OC

O NHCHCOH CH2C6H5 (82-87%)

Amino Gruplarının Amid Formunda Korunması
O CH2OC O NHCHCOH CH2C6H5 Kısaltma: O veya Z-Phe

ZNHCHCOH CH2C6H5

Z- Korumasının kaldırılması
Benziloksikarbonil koruyucu grubunun en büyük avantajı kolayca uzaklaştırılabilmesidir. a) hidrojenoliz b) HBr(asetik asitte) ile parçalama

Z-Koruyucu Grubunun Uzaklaştırılması: Hidrojenoliz
O CH2OC O NHCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 H2, Pd O CH3 CO2 H2NCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 (100%)

Z-Koruyucu Grubunun Uzaklaştırılması: HBr ile Parçalama
O CH2OC O NHCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 HBr O

CH2Br

CO2

+ H3NCHCNHCH2CO2CH2CH3 – Br CH2C6H5 (82%)

Peptid Sentezi: Amino Grubunun Korunması
tert-Butoksikarbonil Koruyucu Grup O (CH3)3COC O NHCHCOH CH2C6H5 Kısaltma: O BocNHCHCOH CH2C6H5 veya Boc-Phe

Boc-Koruyucu Grubunun Uzaklaştırılması: HBr ile Parçalama
O (CH3)3COC O NHCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 HBr H3C C H3C CH2 CO2 O

+ H3NCHCNHCH2CO2CH2CH3 – Br CH2C6H5 (86%)

Peptid Sentezi: Karboksil Grubunun Korunması Karboksil Gruplarının Ester Formunda Korunması Karboksil grupları genelde ester formunda korunur. Metil ve etil esterlerinden korumanın kaldırılması bazik ortamda hidroliz ile gerçekleştirilir. Benzil esterler hidrojenoliz ile parçalanırlar.

Benzil Esterlerinin Hidrojenolizi
O C6H5CH2OC O O NHCHCNHCH2COCH2C6H5 CH2C6H5 H2, Pd + – H3NCHCNHCH2CO CH2C6H5 (87%) O

C6H5CH3 CO2

CH3C6H5

Katı-Faz Peptid Sentezi: Merrifield Metodu
Katı(solid) faz sentezinde başlangıç materyali inert katı bir destek materyaline bağlanır. Reaktantlar çözeltiye eklenir. Reaksiyon; katı ve solüsyon arasındaki arayüzede gerçekleşir. Başlangıç materyali katı destek üzerine bağlı olduğundan oluşan her ürün de katı destek materyaline bağlı olarak kalır. Saflaştırma; katı destek materyalinden basit bir yıkama ile yan ürünlerin uzaklaştırılması ile gerçekleşir.

Katı Destek Materyali
CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH

Stiren ve divinilbenzen kopolimeri Yukarıda polstiren gösterilmiştir, divinilbenzen ile çapraz bağlama ile daha rijit bir polimer elde edilmektedir. Polimerik desteğin klorometilmetil eter ve SnCl4 ile muammele edilmesi ile benzen halkalarında ClCH2 yan zincirlerinin oluşmasını sağlar.

Katı Destek Materyali
CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH

CH2Cl Klorometil grubu bir benzil halojenürdür ve nukleofilik sübstitüsyona reaktiftir(SN2). Klorometillenmiş destek materyaline Boc-korumalı C-terminal amino asit ilave edilir, nükleofilik sübtitüsyon oluşur ve Boc-korumalı amino asit reçineye ester olarak bağlanır.

Merrifield Yöntemi
O

+

– BocNHCHCO R

Daha sonra Boc koruyucu grup HCl ile uzaklaştırılır.

Merrifield Yöntemi
Amino grubunun aktivasyonu (DCC) O sonrası ikinci – amino asidin BocNHCHCO bağlanması R2

Boc koruyucu grubun uzaklaştırılması

Bir sonraki amino asidin eklenmesi ve döngünün tekrarlanması

Merrifield Yöntemi

Sentezlenen peptidin katı destek materyalinden ayrılması (CF3CO2H de hazırlanmış HBr)

Merrifield Yöntemi
Merrifield yöntemi otomasyona uygun Bir nanopeptid (bradykinin),1962 yılında, 8 günde 68% verim ile sentezlenmiştir. Ribonukleaz (124 amino asit), 1969
369 reaksiyon; 11,391 adım

Kimyada Nobel Ödülü: 1984

Fizyolojik Öneme Sahip Küçük Peptidler