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INTRODUO TCNICA HISTOLGICA (TECIDOS ANIMAIS)

Sumrio: Introduo Obteno de preparaes definitivas Fixao Incluso Cortes Colagem dos cortes Colorao Montagem Preparaes que no necessitam de incluso Tecido epitelial Tecido conjuntivo Tecido cartilagneo Tecido sseo Tecido sanguneo Tecido muscular Tecido nervoso Preparao de solues e reagentes Soluo de Ringer Hemalumen de Mayer

Ao pretendermos estudar os tecidos animais deparamos com duas dificuldades bsicas: - os tecidos animais constituem na sua grande maioria estruturas opacas que no podem ser estudadas directamente ao microscpio. - falta de contraste entre os componentes dos tecidos, bem como falta de contraste entre os organitos celulares. No primeiro caso a dificuldade pode, em grande parte, ser ultrapassada reduzindo as estruturas a cortes suficientemente finos para que sejam transparentes, ou alternativamente dissociando tanto quanto possvel os componentes do tecido. A segunda dificuldade pode tambm em parte ser ultrapassada com auxlio de corantes selectivos. Atendendo s limitaes de material que existem na maioria das Escolas Secundrias, pensamos que a execuo de cortes finos em tecidos animais e a elaborao das respectivas preparaes definitivas no ser vivel, pelo que faremos aqui apenas uma descrio sumria destas tcnicas. Todavia, mesmo com material muito elementar possvel ilustrar certos aspectos morfolgicos dos tipos bsicos de tecidos. Na segunda parte deste manual descrevem-se experincias que envolvem unicamente tcnicas de dissociao e colorao e que por conseguinte no requerem material sofisticado para a sua execuo. OBTENO DE PREPARAES DEFINITIVAS A PARTIR DE CORTES A preparao de material biolgico para observao ao microscpio leva algum tempo e corre-se o risco de enzimas celulares destrurem parte das estruturas que pretendamos observar (autlise). Para impedir este processo procede-se em primeiro lugar chamada fixao. Aps a fixao o material tem de ser reduzido a cortes finos. A fraca consistncia dos tecidos animais (exceptuam-se os tecidos sseo e cartilagneo) no permite todavia que se faam manualmente cortes finos. Assim os tecidos tem de ser previamente endurecidos, o que se consegue por congelamento ou por incluso em celoidina ou em parafina, e em seguida cortados com auxlio de instrumentos mais ou menos sofisticados chamados micrtomos. Uma vez obtidos os cortes procede-se colorao e montagem do material. Fixao A fixao consiste por um lado em matar rapidamente as clulas e interromper os processos autolticos j iniciados; por outro lado endurecer parcialmente os tecidos para poderem suportar sem deformao a aco de reagentes e manipulaes tcnicas a utilizar posteriormente. 2

O fixador mais vulgar o lquido Boiun que tem a seguinte composio: - Formol ............................................................ 5 partes - Soluto aquoso saturado de cido pcrico ..........15 partes - cido actico .................................................. 1 parte As peas so deixadas 24 horas neste lquido e passam-se depois para lcool a 70. Resumo da tcnica de incluso Como j foi referido a incluso tem por fim endurecer os tecidos para que se possam executar cortes finos. As diferentes etapas que a seguir se descrevem podem racionalizar-se assim: 1) remoo da gua dos tecidos com alcoois de grau cada vez mais elevado; 2) substituio do lcool por um lquido que seja capaz de funcionar como veculo de parafina; 3) parafina. Indicamos a seguir as etapas e tempos utilizados correntemente.

primeiro dia
Deixar as peas em lcool a 70 de um dia para o outro.

segundo dia
s 9h ....................................................... lcool a 90 11h ......................................................... lcool absoluto 12h ......................................................... renovar o lcool absoluto 13h ......................................................... xilol e lcool (partes iguais) 15h ......................................................... xilol puro 17h ......................................................... xilol c/ parafina (soluto saturado)

terceiro dia
11h ......................................................... xilol e parafina na estufa 13h ......................................................... banho de parafina mole 14h ......................................................... banho de parafina fundida na estufa 15h ......................................................... formao do bloco 3

Cortes Os blocos de parafina devem ser arrefecidos em gua e cortados com a forma de tronco de pirmide. Em seguida os blocos so colocados na "cabea do micrtomo". Esta colagem feita por fuso da parafina da base do bloco. A faca do micrtomo deve estar inclinada em relao ao bloco de tal modo que a face voltada para a pea seja paralela superfcie do bloco. Se a incluso estiver bem feita, aps cada movimento da pea sai um corte, e o que se segue vem colar-se ao anterior pela aresta vizinha de forma que se constituem assim fitas ou tnias de cortes. Colagem de cortes Os cortes so separados da faca com um pequeno pincel ou uma agulha e em seguida so colocados sobre lminas. A colagem faz-se geralmente com gua albuminosa (albumina glicerinada) ou com uma substncia conhecida pelo nome comercial de "tissue tac". A gua albuminosa prepara-se da seguinte maneira: deita-se uma clara de ovo num copo graduado, adiciona-se igual volume de glicerina, agita-se at homogeneizao e filtra-se. Para se efectuar a colagem procede-se da seguinte maneira: coloca-se uma gota de substncia colante, espalha-se e espera-se que seque. Seguidamente coloca-se uma gota de gua e sobre ela o corte. Escorre-se a gua e leva-se a lmina chama de uma lamparina para que o corte distenda, mas evitando a fuso da parafina. Colorao Para se proceder colorao torna-se necessrio remover a parafina e hidratar os cortes. A sequncia que se utiliza neste passo pois inversa da incluso: - xilol para desparafinar - lcool a 90 para remover o xilol - lcool a 70 - hidratao com gua destilada - colorao e lavagem Existem vrias tcnicas de colorao. A que a seguir indicamos uma das mais simples e em regra d bons resultados. Na etapa de colorao distinguem-se duas fases: colorao nuclear e colorao citoplasmtica. Para a colorao dos ncleos 4

filtram-se umas gotas de hemalmen sobre os cortes, aguarda-se 15 minutos, escorrese o corante e lava-se com gua. Para a colorao citoplasmtica pode utilizar-se soluto de eosina que se deixa actuar o tempo necessrio para o aparecimento de um tom rseo, escorre-se o corte e lava-se com gua. Montagem A montagem, ltima fase das preparaes definitivas, feita em blsamo do Canad ou em euparal, substncias que so insolveis em gua. Da que aps a colorao se torna necessrio desidratar os cortes como se indica a seguir: - lcool a 70 - lcool absoluto - xilol - blsamo ou euparal - colocao da lamela

PREPARAES QUE NO NECESSITAM INCLUSO Seguidamente descrevem-se algumas preparaes que podem ser facilmente executadas em qualquer Escola Secundria uma vez que no requerem micrtomos ou outro material sofisticado. Tecido epitelial Um material de fcil obteno para ilustrao da morfologia do epitlio pavimentoso a camada superficial da pele da r. Efectivamente os Batrquios largam e renovam com grande facilidade a camada superficial da pele. Para o efeito proceder da seguinte maneira: 1. Deixar uma ou mais rs num recipiente com gua durante 2 ou 3 dias temperatura ambiente. Notar-se- o aparecimento de farrapos epiteliais. Caso isso no acontea, tentar raspar com um escalpelo o ventre da r dentro de gua. 2. Com um pincel recolher alguns farrapos e agit-los em gua. Com duas agulhas estend-los sobre uma lmina de maneira a obter uma preparao sem pregas. 3. Colocar uma gota de gua, cobrir com uma lamela e observar. Se se pretender obter uma preparao definitiva fazer o seguinte: 5

4. Estender um fragmento de epitlio numa lmina e deitar sobre esta umas gotas de lcool a 90. Deixar actuar 5-10 minutos (fixao). 5. Lav-lo com gua. Adicionar umas gotas de hemalmen (ver "Preparao de Solues e Corantes"). 6. Passados 10 minutos lavar novamente o fragmento de epitlio agitando-o dentro de gua. recolh-lo com a lmina e cor-lo com eosina por mais 10 minutos (colorao). 7. Lav-lo e estend-lo outra vez sobre a lmina. 8. Deitar sobre o fragmento umas gotas de lcool a 90 e renovar o lcool por vrias vezes. repetir este processo utilizando agora lcool absoluto (desidratao). 9. Esclarecer com xilol (diafinizao), com duas agulhas secas estender o fragmento de modo a evitar pregas. 10. Montar a preparao utilizando blsamo ou euparal.

Tecido conjuntivo propriamente dito Os aspectos genricos da morfologia do tecido conjuntivo propriamente dito podem ser estudados utilizando a variedade tecido conjuntivo frouxo. Para o efeito proceder da seguinte forma: 1. Sacrificar um coelho. Fazer uma inciso na pele da linha mdia do abdmen. Puxar com as mos, rasgando a pele em direco s patas posteriores. Notar-se-o finas lamelas de tecido subcutneo que ligam a pele s aponevroses do msculo. Estas lamelas aparecem com maior dimenso na regio posterior da perna do animal. 2. Introduzir uma lamela, bem limpa e desengordurada, sob uma destas membranas conjuntivas de modo que ela adira superfcie do vidro. Quando o tecido tiver aderido cort-lo em torno da lamela e dobrar as margens que excederam esta, para que o tecido continue distendido durante as fases subsequentes. 3. Fixar com umas gotas de lcool a 90. 4. Lavar com gua e corar com hemalmen e eosina conforme descrito na preparao anteriror. Se se pretender uma preparao definitiva proceder conforme foi explicado na preparao anterior. 6

Tecido cartilagneo A estrutura bsica do tecido cartilagneo pode ser estudada utilizando a cartilagem hialina do externo da r ou a cartilagem que recobre superfcies articulares. No primeiro caso proceder assim: 1. Cortar as partes inferior ou superior do externo da r. 2. Colocar um fragmento de tecido numa gota de soluto isotnico de NaCl (0,15 M) e cobrir com uma lamela. No caso de se pretender utilizar uma cartilagem articular proceder assim: 1. Com uma navalha de barba bem afiada (alternativamente com uma lmina de bisturi ou uma lmina do tipo "Gillette") fazer cortes to finos quanto possvel na cartilagem que se encontra na extremidade do fmur da r. 2. Montar e examinar como no caso anterior. Se se pretender uma preparao corada fixar com o fixador de Boiun e corar com hemalmen e eosina conforme descrito anteriormente. Tecido sseo Esta preparao um pouco morosa e requer muita pacincia. 1. Com uma serra de dente muito fino cortar, longitudinalmente ou transversalmente, lminas delgadas (< 1mm) de um osso seco. 2. Colocar o fragmento do osso entre dois pedaos de pedra pomes, com faces planas, ou entre duas pedras de afiar. Adelgaar o fragmento raspando-o com duas pedras at ficar praticamente transparente. 3. Montar o fragmento em blsamo do Canad ou em euparal. No caso de utilizar blsamo deve aquecer a Lmina, tendo todavia o cuidado de no deixar que o blsamo fique demasiado lquido para que no penetre nas cavidades sseas.

Tecido sanguneo A tcnica mais correntemente utilizada para observao das clulas do sangue conhecida pela designao de esfregao: 1. Limpar a ponta de um dedo (de preferncia o anelar da mo menos utilizada) com algodo embebido em lcool ou ter. Picar a parte desinfectada com uma agulha ou uma lanceta esterilizada e desprezar a 1 gota de sangue. 2. Colocar uma gota de sangue a cerca de 1 cm da extremidade de uma lmina que tenha permanecido em lcool durante algumas horas. 3. Encostar uma lmina de bordos esmerilados lmina normal de maneira que as duas formem um ngulo de 45. Fazer deslizar a Lmina de bordos esmerilados at que ela contacte com a gota de sangue. Aguardar que o sangue se estenda ao longo da aresta; em seguida deslocar a Lmina em sentido inverso, sem interrupes e mantendo o ngulo de 45. 4. Secar o esfregao ao ar. 5. Cobrir o esfregao com 5 gotas de reagente de Wright e deixar actuar por 2,5 minutos. Adicionar umas gotas de gua, homogeneizar a mistura e deixar actuar 3 a 4 minutos. 6. Escorrer o corante e lavar com gua destilada. 7. Secar ao ar. Se pretender obter uma preparao definitiva basta colocar uma gota de blsamo do Canad ou de euparal, cobrir com uma lamela e deixar secar alguns dias. Tecido muscular O tecido muscular liso pode ser estudado por observao directa da bexiga de um Batrquio. 1. Sacrificar uma r. Abrir a cavidade abdominal tendo o cuidado de no cortar a bexiga. Cortar a bexiga no ponto em que ela se liga cloaca. Se a bexiga estiver cheia melhor ser, pois isso facilita as operaes subsequentes. Neste caso dever-se, com auxlio de um fio, dar um n para que o rgo seja extrado com lquido. 2. Abrir a bexiga no sentido do comprimento e encostar-lhe uma lamela fazendo o possvel para que a face interna fique voltada e colada lamela. 3. Montar o conjunto numa lmina contendo uma gota de NaCl (0,15 M). 8

Para um estudo simples do tecido muscular estriado poder-se- utilizar um fragmento do msculo das patas posteriores do animal sacrificado na preparao anterior. 1. cortar um pedacinho de msculo de uma pata posterior da r. Dissociar rapidamente com auxlio de duas agulhas numa gota de NaCl (0,15 M). Cobrir com uma lamela e observar. 2. Os ncleos podem ser tornados mais evidentes removendo a soluo de NaCl e adicionando agora uma gota de cido actico a 1%. Tecido nervoso O estudo do tecido nervoso pode ser acompanhado da execuo de duas preparaes muito simples: dissociao de clulas da medula de boi (ilustrao de tipos de clulas de tecido nervoso); dissociao do nervo citico da r (ilustrao da estrutura de um nervo). Para a dissociao das clulas da medula de boi proceder assim: 1. Obter uma seco de medula de boi e cort-la transversalmente de modo a conseguir alguns fragmentos com 2-3 mm de espessura. Colocar os fragmentos em lcool a 30% durante 24 h. 2. Com auxlio de uma agulha retirar pedacinhos de substncia cinzenta da "zona dos corpos anteriores" de um dos fragmentos. Introduzir o material retirado num tubo de ensaio contendo gua at 1/4 da sua altura. 3. Tapar o tubo e agit-lo fortemente. Juntar em seguida umas gotas de picrocarmim. 4. Uma hora depois adicionar algumas gotas de cido smico a 1%. 5. Decorridas algumas horas decantar o sobrenadante e lavar o sedimento vrias vezes com gua destilada. 6. Aps a ltima lavagem deixar o material sedimentar novamente. Com auxlio de uma pipeta retirar uma gota do fundo e coloc-la numa lmina, cobrir com uma lamela e observar. Para estudar a estrutura do nervo citico da r proceder como se indica a seguir: 1. Sacrificar uma r, tirar a pele dos membros posteriores e dissecar os msculos com auxlio de 2 agulhas. Ver-se- aparecer um "cordo" branco-amarelado que o nervo citico.

2. Seccionar o nervo na parte superior e inferior e com o auxlio de um palito coloc-lo num frasco contendo cido smico a 1% (evitar aqui o contacto com objectos metlicos com o cido smico). 3. No dia seguinte retirar o nervo e lav-lo com gua numa tina pequena. Cort-lo em 3 ou 4 fragmentos e colocar um deles numa lmina contendo uma gota de gua. 4. Prender uma das pontas do fragmento com uma agulha e dissociar longitudinalmente com outra. 5. Retirar o excesso de gua e observar.

PREPARAO DE SOLUES E CORANTES Soluo de Ringer Podem-se preparar vrias solues de Ringer de acordo com o material em que vo ser usadas. Todas elas so solues isotnicas tamponadas, isto , amortecedoras das variaes de pH. Para preparar 1 litro de soluo de Ringer para tecidos de r: 1. Pesar: 0,42 g de cloreto de potssio 0, 24 g de cloreto de clcio 0, 20 g de bicarbonato de sdio 7,50 g de cloreto de sdio 2. Dissolver em gua; 3. Acertar o volume com gua at 1 litro. Hemalumen de Mayer hematoxilina cristalizada .............................. 1 g iodato de sdio ou de potssio ..................0,2 g almen de potssio ....................................50 g gua destilada ........................................1000 g

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