IBO – 2011

TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Student Code:

22nd INTERNATIONAL BIOLOGY OLYMPIAD
July 10-17, 2011
Taipei, Taiwan

PRACTICAL TEST 1 [ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ 1]
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY
[ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ]
Total Points: 100
Duration: 90 minutes

1

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Dear Participants, [Αγαπητοί συμμετέχοντες]

In this test, you have been given the following 3 tasks [στη δοκιμασία αυτή έχετε 3 στόχους]:
Task I: Protein electrophoresis [Πείραμα 1: Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών] (35 points)
Task II: Protein quantification [Πείραμα 2: Ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών] (30 points)
Task III: Protein purification [Πείραμα 3: Καθαρισμός πρωτεϊνών] (35 points)




Check your Student Code on the Answer Sheet before starting the test. [Ελέγξτε τον
Κωδικό Εξεταζομένου στο Φύλλο Απαντήσεων πριν ξεκινήσετε τη δοκιμασία]
Write down your results and answers in the Answer Sheet. Answers written in the Question
Paper will not be evaluated. [Γράψτε τα αποτελέσματα και τις απαντήσεις στο Φύλλο
Απαντήσεων. Απαντήσεις στο Φύλλο Ερωτήσεων δεν θα ληφθούν υπόψη]
Make sure that you have received all the materials listed for each task. If any of the listed items is
missing, raise your sign. [Βεβαιωθείτε πως έχετε στα χέρια σας όλα τα απαραίτητα υλικά για το
κάθε πείραμα. Εάν κάποιο από τα υλικά λείπει σηκώστε την πινακίδα σας]
Use pen only [Χρησιμοποιήστε μόνο στυλό].
You should organize your work efficiently but ensure that you complete task II early
enough to obtain the spectrophotometer readings to answer the questions that follow
[Οργανώστε το χρόνο εργασίας σας αποτελεσματικά και βεβαιωθείτε ότι ολοκληρώσατε το
πείραμα ΙΙ αρκετά νωρίς ώστε να δείτε τα αποτελέσματα στο φασματοφωτόμετρο/
σπεκτροφωτόμετρο, που είναι κοινό όργανο για όλους, ώστε να απαντήσετε τις σχετικές
ερωτήσεις].
Stop answering immediately after the end bell rings. [Σταματήστε να απαντάτε αμέσως μετά το
χτύπο του κουδουνιού]
After test, enclose both the Answer sheets, Question paper, and Data printout in the provided
envelope. Our lab assistants will collect it promptly. [Μετά τη δοκιμασία κλείστε μέσα στο
φάκελο που σας έχει δοθεί τα Φύλλα Απαντήσεων, Φύλλα Ερωτήσεων, καθώς και τα
Εκτυπωμένα δεδομένα του πειράματος. Οι βοηθοί εργαστηρίου θα τα συγκεντρώσουν αμέσως]
No paper or materials should be taken out of the laboratory. [Δεν πρέπει να πάρετε μαζί σας
κανένα χαρτί ή υλικό]

Good Luck!! [Καλή Επιτυχία!!]

2

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Shared instruments [Κοινόχρηστα όργανα]:
Camera, spectrophotometer, printer [Κάμερα, φασματοφωτόμετρο/σπεκτροφωτόμετρο,
εκτυπωτής]

Equipments and Materials [Συσκευές και Υλικά]:
Equipments [Συσκευές]:

Quantity

1 Power supply [Τροφοδοτικό ηλεκτροφόρησης]

1

2 Electrophoresis tank (with gel and buffer) [Συσκευή ηλεκτροφόρησης (με 1
πήκτωμα/gel αγαρόζης και ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης)]
3 Micropipettes P20 and P200 [Μικροπιπέττες 20 και 200]

1 each

4 80-well microcentrifuge tube rack [Βάση στήριξης σωληναρίων 80-θέσεων]

1

5 Wire test tube rack with 15-mL centrifuge tubes (×6) (yellow cap) 1
[Συρμάτινη βάση στήριξης για x6 σωλήνες φυγοκέντρου 15 ml (φέρουν
κίτρινο καπάκι) ]
6 4-way test tube rack [Βάση στήριξης 4-πλευρών για διαφορετικού τύπου 1
σωλήνες]
7 Plastic droppers in 15-mL centrifuge tubes [Πλαστικά σταγονόμετρα σε 2
σωλήνες φυγοκέντρου 15-mL]
8 Micropipette tips (for P20 and P200) [Τιπς/ρύγχη μικροπιπεττών 20 και 1 each
200 ]
9 Timer [χρονόμετρο]

1

10 96-well microplate [μικροπλάκα 96 πηγαδιών/θέσεων]

1

11 Marker pen & paper label [Μαρκαδόρο και ετικέτες για επισήμανση]

1 each

12 600-mL beaker for waste disposal [Ποτήρι 600-ml για την απόρριψη των 1
αχρήστων]
13 Scissors and ruler [Ψαλίδι και χάρακα/ρίγα]

3

1

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

14 Double-sticker to attach the results [Διπλά κολλητική ταινία για να 1
κολλήσετε τα αποτελέσματά σας]
15 Student Code sticker [Ετικέτα με τον Αριθμό Εξεταζομένου]

1

16 Tissue paper [Χαρτί]

1

17

Mini centrifuge (if you need to spin down the samples in the 1
microcentrifuge

tubes)

[Μικροφυγόκεντρος

εάν

χρειαστεί

να

φυγοκεντρήσετε/σπινάρετε τα δείγματα που βρίσκονται στα σωληνάρια
μικροφυγοκέντρησης]

Materials [Υλικά]:

Quantity

1 Loading dye (microcentrifuge tube-L) (pink tube with orange label)

1

[Χρωστική φόρτωσης (σωλήνας μικροφυγοκέντρου-L) (ροζ σωληνάριο με
πορτοκαλί ετικέτα)]
2 Pre-stained protein molecular weight marker (microcentrifuge tube-M) (pink 1
tube with orange label) [Προ-χρωματισμένος δείκτης μοριακού βάρους
πρωτεϊνών (σωλήνας μικροφυγοκέντρου-Μ) (ροζ σωληνάριο με πορτοκαλί
ετικέτα)]
3 Unknown pre-stained protein samples (microcentrifuge tubes-U1 and U2)

1

(pink tube with orange label) [Άγνωστα προ-χρωματισμένα δείγματα
πρωτεϊνών (σωληνάρια μικροφυγοκέντρου-U1 και U2)]
4 CBG reagent in 50-mL centrifuge tube [αντιδραστήριο CBG σε σωλήνα των

1

50-ml]
5 Bovine serum albumin (BSA) concentration standard (0.5 mg/mL) in
microcentrifuge tube (green tube with yellow label) [Αλβουμίνη ορού

4

1

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

βοδιού (BSA) συγκέντρωσης (0.5 mg/mL) για την κατασκευή πρότυπης
καμπύλης ποσοτικοποίησης σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης (πράσινο
σωληνάριο με κίτρινη ετικέτα)]
6 Enzyme E in two microcentrifuge tubes: concentrations X and Y (green tube

1

with yellow label) [Ένζυμο Ε σε δύο σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης
άγνωστης συγκέντρωσης Χ και Υ (πράσινα σωληνάρια με κίτρινη ετικέτα)]
7 Distilled water (microcentrifuge tube-ddH2O) (green tube with yellow label)

1

[Απεσταγμένο νερό (σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης-ddH2O) (πράσινο
σωληνάριο με κίτρινη ετικέτα)]
8 Protein sample (microcentrifuge tube-C) (blue tube with blue label)

1

[Άγνωστο δείγμα πρωτεΐνης (Σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης-C) (μπλε
σωληνάριο με μπλε ετικέτα)]
9 Anion exchange chromatography column on 15-mL centrifuge tube

1

[Ανιονική στήλη χρωματογραφίας σε σωληνάριο των 15-mL]
10 Anionic buffers A and B (5 mL each in two separated 15-mL centrifuge

1

tubes) (green cap) [Ανιονικά ρυθμιστικά διαλύματα Α και Β (5 mL από το
καθένα σε δυο ξεχωριστούς σωλήνες φυγοκέντρου των 15-mL)]
11 Coomassie brilliant blue G-250 (CBG) reagent 1 mL in each of six 15-mL
centrifuge tubes (A1 to A3 & B1 to B3, red cap) [Αντιδραστήριο Coomassie
brilliant blue G-250 (CBG) 1 mL σε καθέναν από έξι σωλήνες φυγοκέντρου
15-mL]

5

1

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Task I (35 points) [Πείραμα Ι (35 μονάδες)]
Protein electrophoresis [Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών]
Introduction (εισαγωγή):
Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) is a common technique for protein study. It can be
used to separate different proteins based on their charges or sizes. A type of PAGE is termed
SDS-PAGE, in which the negatively charged chemical, SDS, is added before protein
electrophoresis. The amount of SDS that binds to proteins is proportional to the size of the protein
which confers each protein a similar charge-to-mass ratio and renders the intrinsic charge of the
protein insignificant, at least for this experiment. Thus, the major factor that affects the migration
of protein is the molecular weight (MW) of the protein during SDS-PAGE. The relative mobility
(Rf) of the protein can be calculated as the ratio of the distance migrated by the protein to that
migrated by the dye-front. The value of Rf is inversely proportional to the log of its molecular
weight.
[Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα/gel πολυακρυλαμίδης (PAGE) είναι μια κοινή τεχνική για τη
μελέτη πρωτεϊνών. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό διαφορετικών πρωτεϊνών με
βάση το φορτίο ή το μέγεθός τους. Mια κατηγορία της PAGE είναι η SDS-PAGE, στην οποία ένα
αρνητικά φορτισμένο χημικό αντιδραστήριο, το SDS, προστίθεται πριν την έναρξη της
ηλεκτροφόρησης. Η ποσότητα του SDS που προσδένεται στις πρωτεΐνες είναι ανάλογη του

6

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

μεγέθους της πρωτεΐνης, προσδίδοντας σε κάθε πρωτεΐνη ένα χαρακτηριστικό λόγο φορτίου προς
μάζα, ενώ ταυτόχρονα εξουδετερώνει το φυσικό φορτίο της πρωτεΐνης. Έτσι, κατά την
ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, ο διαχωρισμός/ανάλυση/μετακίνηση των πρωτεϊνών μέσα στο
πήκτωμα/gel και η απόσταση που τελικά φτάνουν εξαρτώνται από το μοριακό τους βάρος (MW).
Η σχετική μετακίνηση (Rf) της πρωτεΐνης μπορεί να υπολογιστεί σαν ο λόγος της απόστασης
μετακίνησης προς την απόσταση που έχει διατρέξει η χρωστική/μέτωπο ηλεκτροφόρησης. Η τιμή
του Rf είναι αντιστρόφως ανάλογη του λογάριθμου/log του μοριακού της βάρους.]
In the problem set, you will perform the following experiment [στα πλαίσια του
προβλήματος θα πραγματοποιήσετε τα ακόλουθα πειράματα]:
1. An electrophoresis tank has been set up for SDS-PAGE, in which a polyacrylamide gel has been
secured on electrode assembly and electrophoresis buffer has been filled. There are 10 wells for
sample loading on the top of the gel. To load the sample, use the P20 micropipette with tip to
withdraw protein sample, and carefully place the tip on the top of the well. By injecting slowly
the sample will sink to the bottom of the well by gravity (Figure 1).
[Μια συσκευή ηλεκτροφόρησης έχει προετοιμαστεί για SDS-PAGE, στην οποία το
πήκτωμα/gel πολυακρυλαμίδης έχει τοποθετηθεί κατάλληλα στα ηλεκτρόδια και έχει γεμιστεί
με διάλυμα ηλεκτροφόρησης. Υπάρχουν 10 πηγάδια/θέσεις για τη φόρτωση δειγμάτων στο
επάνω μέρος του πηκτώματος. Για να φορτώσετε τα δείγματα χρησιμοποιήστε την 20άρα

7

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

μικροπιπέττα με κατάλληλο τιπ/ρύγχος ώστε να ρίξετε το δείγμα της πρωτεΐνης προσεκτικά
στο πάνω μέρος του πηκτώματος, εντός των πηγαδιών. Απελευθερώνοντας το δείγμα αργά
αυτό θα βυθιστεί εξαιτίας της βαρύτητας στον πυθμένα του πηγαδιού (Εικόνα 1).]
2. If you need to practice, use the P20 micropipette with tip to withdraw 10 µL of loading dye
from microcentrifuge tube L (pink tube with orange label) on rack. Load the dye into wells 1 to
3 or 7 to 10.
[Εφόσον χρειάζεται να εξασκηθείτε αν θέλετε, φορτώστε 10 µL χρωστικής από το σωληνάριο
L (ροζ σωληνάριο με πορτοκαλί ετικέτα). Μπορείτε να φορτώσετε χρωστική για δοκιμή στα
πηγάδια από 1 εως 3 και από 7 εώς 10.]
3. Each of the microcentrifuge tubes M, U1 and U2 (pink tube with orange label) contains 15 µL
of protein molecular weight marker, unknown protein U1 and unknown protein U2, respectively.
Use micropipette P20 to withdraw 10 µL solution from each tube and load the samples into
wells 4 to 6 as shown in Figure 1.
[Κάθε σωληνάριο από τα M, U1 και U2 (ροζ σωληνάρια με πορτοκαλί ετικέτα) περιέχει 15 μL
από δείκτη μοριακού βάρους πρωτεϊνών, άγνωστη πρωτεΐνη U1 και άγνωστη πρωτεΐνη U2,
αντίστοιχα. Χρησιμοποιήστε την 20άρα μικροπιπέττα για να ρίξετε 10 μL δείγματος από το
κάθε σωληνάριο και να φορτώσετε τα δείγματα στα πηγάδια/θέσεις 4 έως 6 όπως φαίνεται
στην Εικόνα 1.]

8

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

4. As soon as you finish sample loading, Lift the sign, lab assistants will connect the power cord
to power supply and set the voltage to 200 V for you. The gel will run for 25 minutes. The timer
will be set up by an assistant to countdown.
[Μόλις ολοκληρώσετε τη φόρτωση των δειγμάτων, Σηκώστε την πινακίδα, οι βοηθοί
εργαστηρίου θα συνδέσουν το καλώδιο στο τροφοδωτικό και θα ρυθμίσουν τη διαφορά
δυναμικού στα 200 V για εσάς. Το πήκτωμα/gel θα αναλυθεί/τρέξει/ηλεκτροφορηθεί για 25
λεπτά. Ένας βοηθός θα θέσει σε λειτουργία το χρονόμετρο για την αντίστροφη μέτρηση.]
5. After finishing electrophoresis, Lift the sign, lab assistants will disassemble the electrophoresis
set-up and give back your gel. Wipe clean the surface of gel with tissue papers and label the gel
with your Student Code sticker. Lab assistants will take the photo of your gel. Put the photo
on the answer sheet using double-sticker (5 points).
[Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης Σηκώστε την πινακίδα, οι βοηθοί εργαστηρίου θα
αποσυνδέσουν την ηλεκτροφόρηση και θα σας δώσουν το πήκτωμα/gel. Καθαρίστε την
επιφάνεια του πηκτώματος/gel με χαρτοπετσέτα και μαρκάρετε το με ένα αυτοκόλητο που
φέρει των Αριθμό Εξεταζομένου. Οι βοηθοί εργαστηρίου θα πάρουν φωτογραφία από το
πήκτωμα/gel σας. Κολλήστε την στο φύλλο απαντήσεων με κολλητική ταινία διπλής όψης (5
μονάδες).]

9

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Figure 1 [Εικόνα 1]
Answer the following questions [Απαντήστε τις ακόλουθες ερωτήσεις]:
Q.1.1. (2 points) Figure 2 shows a photograph of a SDS-PAGE gel. The electrophoresis start point
and dye-front are indicated. Which side of the gel should be connected to the anode (+ charge) of
the power supply? Mark your answer (X) on the answer sheet.
[Q.1.1. (2 points) Εικόνα 2 δείχνει μια φωτογραφία από ένα SDS-PAGE πήκτωμα/gel.
Σημειώνονται με βέλη το σημείο έναρξης της ηλεκτροφόρησης και το μέτωπο της
ηλεκτροφόρησης. Ποια πλευρά του πηκτώματος/gel πρέπει να συνδεθεί στην άνοδο (+ φορτίο)
του τροφοδοτικού; Σημειώστε με ένα (X) την απάντησή σας στο Φύλλο Απαντήσεων.]

10

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Figure 2 [Εικόνα 2]

Q.1.2. (8 points) Based on the information provided in Figure 2, plot a graph molecular weight

values on graph paper provided of the five marker proteins versus their relative migration-Rf

values on the answer sheet (4 points). Use the graph to estimate the molecular weights of

unknown proteins on lanes A and B (4 points). Write down your answers on the answer sheet.

[Q.1.2. (8 points) Με βάση τα δεδομένα της Εικόνας 2, σχεδιάστε τη γραφική παράσταση του
μοριακού βάρους των πέντε πρωτεϊνών του δείκτη/marker μοριακού βάρους προς την σχετική
μετακίνησή τους-Rf, στο μιλλιμετρέ χαρτί που παρέχεται στο Φύλλο Απαντήσεων (4 μονάδες).
11

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Χρησιμοποιήστε αυτή τη γραφική παράσταση για να υπολογίσετε το μοριακό βάρος των
άγνωστων πρωτεϊνών στις διαδρομές A και B (4 μονάδες). Γράψτε τις απαντήσεις σας στο Φύλλο
Απαντήσεων.]

Q.1.3. (5 points) A protein complex of molecular weight 246 kDa is composed of multiple

subunits bound by non-covalent interaction. Two protein bands of 57 and 33 kDa were identified

after SDS-PAGE. How many 57-kDa and 33-kDa subunits, respectively, are included in the

protein complex? Write down your answers on the answer sheet.

[Q.1.3. (5 points) Ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών που έχει μοριακό βάρος 246 kDa αποτελείται από
πολλαπλές υπομονάδες ενωμένες με μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις/δεσμούς. Δύο πρωτεϊνικές
ζώνες μεγέθους 57 και 33 kDa ανιχνεύθηκαν μετά από SDS-PAGE. Από πόσες υπομονάδες των
57-kDa και 33-kDa, αντίστοιχα, απαρτίζεται το πρωτεϊνικό σύμπλοκο; Γράψτε τις απαντήσεις σας
στο Φύλλο Απαντήσεων.]

Q.1.4. (5 points) The average molecular weight of amino acid residues is about 110 daltons. How

many amino acids are there in the 33-kDa protein subunit? How many nucleotides of RNA are

translated into the protein? Write down your answers on the answer sheet.

12

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

[Q.1.4. (5 points) Το μέσο μοριακό βάρος ενός αμινοξέος/αμινοξικού καταλοίπου είναι περίπου
110 daltons. Από πόσα αμινοξέα αποτελείται η πρωτεϊνική υπομονάδα των 33-kDa; Πόσα
νουκλεοτίδια RNA είναι μεταφρασμένα στην πρωτεΐνη; Γράψτε τις απαντήσεις σας στο Φύλλο
Απαντήσεων.]
Q.1.5. (5 points) Suppose the average molecular weight of nucleotides is 330 daltons. Excluding
intron and stop codon, what is the mass ratio of dsDNA encoding the 33-kDa protein to the
33-kDa protein? Write down your answer on the answer sheet.
[Q.1.5. (5 points) Έστω ότι το μέσο μοριακό βάρος των νουκλεοτιδίων είναι 330 daltons.
Εξαιρώντας εσώνια/intron και κωδικόνια λήξης/stop codon, ποιος είναι ο λόγος/ratio μάζας του

dsDNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη 33-kDa προς την πρωτεΐνη 33-kDa; Γράψτε την απάντησή
σας στο Φύλλο Απαντήσεων.]
Q.1.6. (5 points) Suppose a protein P can bind to a protein Q (MW = 1000 daltons). The binding
can be revealed by gel-mobility shift assay. Now 200 pmol of protein P were mixed with various
amounts (0 to 500 ng) of protein Q. These mixtures were resolved by 10% (w/v) polyacrylamide
gel. Gel was stained by Coomassie blue and is shown in Figure 3. Calculate the binding molar
ratio of proteins P and Q? Write down your answer on the answer sheet.
[Q.1.6. (5 points) Μια πρωτεΐνη P μπορεί να προσδεθεί σε μια πρωτεΐνη Q (MW = 1000 daltons).

13

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Η πρόσδεση/δέσμευση της πρωτεΐνης μπορεί να μελετηθεί σε μια δοκιμασία αλλαγής
ηλεκτροφορητικής μετακίνησης/gel-mobility shift assay. Τώρα, 200 pmol της πρωτεΐνης P
αναμειγνύονται με διαφορετικές ποσότητες (0 ως 500 ng) της πρωτεΐνης Q. Τα μείγματα αυτά
αναλύονται σε ένα πήκτωμα/gel πολυακρυλαμίδης 10% (β.ο. w/v). Το πήκτωμα/gel
χρωματίστηκε/stained με Coomassie blue και απεικονίζεται στην Εικόνα 3. Υπολογίστε το λόγο
μοριακής πρόσδεσης των πρωτεϊνών P και Q. Γράψτε την απάντηση στο Φύλλο Απαντήσεων.]

Figure 3 [Εικόνα 3]

14

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Task II (30 Points) [Πείραμα ΙΙ (30 Μονάδες)]
Protein quantification [Ποσοτικοποίηση Πρωτεϊνών]
Introduction [Εισαγωγή]:
Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBG) is a protein staining reagent. It appears in a different
color under different pH conditions. It looks reddish brown in acidic solution, whereas it turns blue
under neutral or alkaline condition. Since proteins can provide a relative neutral environment,
CBG will turn blue with the maximum absorbance at a wavelength of 595 nm when binding to
protein. The more protein there is in a sample, the more CBG will bind to it, and thus, the higher
intensity of blue color will be. In other words, the absorbance at 595 nm is proportional to the
amount of protein in a sample. Based on this, one can determine the concentration of protein by
measuring the blue intensity of a sample.
[Η χρωστική Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBG) χρησιμοποιείται για τη χρώση
πρωτεϊνών. Το χρώμα της αλλάζει σε διαφορετικές τιμές pH. Σε όξινα διαλύματα το χρώμα της
είναι κόκκινο-καφέ, ενώ γίνεται μπλε σε ουδέτερο και αλκαλικό περιβάλλον. Καθώς οι πρωτεΐνες
παρέχουν ένα σχετικά ουδέτερο περιβάλλον, το CBG θα γίνει μπλε με ένα μέγιστο απορρόφησης
στο μήκος κύματος 595 nm όταν συνδέεται σε πρωτεΐνες. Όσο περισσότερη πρωτείνη υπάρχει σε
ένα δείγμα τόσο περισσότερο CBG θα δεσμευτεί και έτσι τόσο υψηλότερη θα είναι και η ένταση
του μπλε χρώματος. Με άλλα λόγια, η απορρόφηση στα 595 nm είναι ανάλογη με την ποσότητα

15

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

πρωτεΐνης σε ένα δείγμα. Βασισμένοι σε αυτό, μπορούμε να προσδιορίσουμε την συγκέντρωση
πρωτεΐνης μετρώντας την ένταση του μπλε που παίρνει ένα δείγμα.]
In the problem set, you will perform the following experiment [Στα πλαίσια του
προβλήματος, θα πραγματοποιήσετε το ακόλουθο πείραμα]:
1. To make BSA concentration standards (Table 1), add 0, 2, 4, 6, 8 and 10 µL of 0.5 mg/mL BSA
(green color) in A1 to A6 wells of a microplate (Figure 4). Make duplicated BSA concentration
standards in B1 to B6 wells. If this step is incorrect, you can repeat the procedure in wells A7 to
A12 and/or B7 to B12. Adjust the total volume of each BSA solution to 10 µL by adding an
appropriate volume of H2O (Table 1).
[Προκειμένου να παρασκευάσετε πρότυπες/standards συγκεντρώσεις BSA (Πίνακας 1),
προσθέστε 0, 2, 4, 6, 8 και 10 µL από το διάλυμα 0.5 mg/mL BSA (πράσινο χρώμα) που σας
δόθηκε στα πηγάδια/θέσεις από A1 ως A6 μιας μικροπλάκας/microplate (Εικόνα 4). Κάντε
επαναλήψεις/duplicated των πρότυπων/standards συγκεντρώσεων BSA στα πηγάδια B1 ως B6.
Εάν σ’ αυτό το βήμα κάνετε λάθος, μπορείτε να επαναλάβετε την διαδικασία στα
πηγάδια/θέσεις A7 ως A12 και/ή στα B7 ως B12. Συμπληρώστε προσθέτοντας τον κατάλληλο
όγκο H2O ώστε ο συνολικός όγκος σε κάθε διάλυμα BSA να είναι τα 10 µL (Πίνακας 1).]
2. Add 200 µL of CBG reagent per well in A1 to A6 & B1 to B6. Mix and observe the color
change. [Προσθέστε 200 μL από το αντιδραστήριο CBG ανά πηγάδι/θέση στα Α1 ως Α6 και

16

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Β1 ως Β6. Αναμείξτε και παρατηρήστε την αλλαγή του χρώματος.]

3. To determine the two concentrations X and Y of enzyme E, add various amounts (2, 4, 6, 8 and
10 µL) of enzyme E (green color) in duplicate to empty wells and bring up the volume to 10
µL with H2O.
[Προκειμένου να υπολογίσετε τις δύο συγκεντρώσεις X και Y του ενζύμου Ε, προσθέστε
διαφορετικές ποσότητες (2, 4, 6, 8 και 10 μL) του ενζύμου Ε (πράσινο χρώμα) εις διπλούν σε
άδεια πηγάδια/θέσεις και συμπληρώστε με H2O μέχρι συνολικού όγκου 10 μL.]
4. Add 200 µL of CBG reagent per well to the diluted enzyme E. Mix and observe the color
change. [Προσθέστε 200 μL από το αντιδραστήριο CBG ανά πηγάδι/θέση στο αναδιαλυμένο
ένζυμο Ε. Αναμείξτε και παρατηρήστε την αλλαγή του χρώματος.]

5. Lift the sign, lab assistants will accompany you to measure the absorbance values of your
samples at 595 nm using spectrophotometer. Put your Student Code on the print-out data with
marker pen. [Σηκώστε την πινακίδα, οι εργαστηριακοί βοηθοί θα σας συνοδέψουν για να
μετρήσετε τις τιμές απορρόφησης των δειγμάτων σας στα 595 nm με τη βοήθεια
φασματοφωτομέτρου/σπεκτροφωτομέτρου. Γράψτε με μαρκαδόρο τον Αριθμό Εξεταζομένου
στα εκτυπωμένα αποτελέσματα.]

6. Return to your work bench, and put the result on the answer sheet using double-sticker.

17

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

[Επιστρέψτε στον πάγκο σας και τοποθετήστε τα αποτελέσματα στο Φύλλο Απαντήσεων
χρησιμοποιώντας ταινία διπλής όψης.]
Table 1 [Πίνακας 1]
Well of a microplate [Πηγάδι/θέση στην μικροπλάκα]
Materials [Υλικά]

A1 & B1

A2 & B2

A3 & B3

A4 & B4

A5 & B5

A6 & B6

0.5 mg/mL BSA (µL)

0

2

4

6

8

10

H2O (µL)

10

8

6

4

2

0

Diluted BSA
concentration
[Συγκέντρωση
διαλυμένης BSA]
(mg/mL)

0

A1

A2

A3

A4

A5

A6

B1

B2

B3

B4

B5

B6

Figure 4 [Εικόνα 4]

18

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Answer the following questions [Απαντήστε τις ακόλουθες ερωτήσεις]:
Q.2.1. (10 points) Calculate the concentrations of BSA in each sample (10 µL) and fill in the
blanks in the table on the answer sheet (Q2.1.1. 5points). Use these values to plot a standard
curve of BSA concentrations (X-axis) versus mean absorbance values of duplicated standards
(Y-axis) on the answer sheet (Q.2.1.2. 5points).
[Q.2.1. (10 points) Υπολογίστε τις συγκεντρώσεις BSA σε κάθε δείγμα (10 µL) και
συμπληρώστε

τα

κενά

στον

πίνακα

στο

Φύλλο

Απαντήσεων

(Q2.1.1.

5points).

Χρησιμοποιήστε αυτές τις τιμές για να σχεδιάσετε μια πρότυπη καμπύλη συγκέντρωσης BSA
(στον άξονα των X) προς τις μέσες τιμές απορρόφησης από τις δύο πρότυπα/standards
επαναλήψεις (άξονας των Y) στο Φύλλο Απαντήσεων (Q.2.1.2. 5points).]
Q.2.2. (12 points) Choose the best sample solution of diluted solutions X and Y within the
range of BSA standard curve and fill in the table on the answer sheet.
[Q.2.2. (12 points) Επιλέξτε την καλύτερη αναδιάλυση/αραίωση των διαλυμάτων Χ και Υ
μέσα στο εύρος των τιμών της πρότυπης καμπύλης που κατασκευάσατε για την BSA και
συμπληρώστε τον πίνακα στο Φύλλο Απαντήσεων.]
Q.2.3. (8 points) Based on the best sample solution you chose, calculate the original
concentrations (X and Y) of enzyme E from the standard curve of BSA concentration. The
concentrations should be expressed in units of mg/mL. Write down your answers on the answer

19

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

sheet.
[Q.2.3. (8 points) Με βάση την καλύτερη αραίωση που θα επιλέξετε, υπολογίστε τις αρχικές
συγκεντρώσεις των διαλυμάτων (Χ και Υ) του ενζύμου Ε από την πρότυπη καμπύλη
συγκέντρωσης BSA. Οι συγκεντρώσεις πρέπει να εκφραστούν σε μονάδες mg/mL. Γράψτε τις
απαντήσεις σας στο Φύλλο Απαντήσεων.]

20

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Task III (35 points) [Πείραμα ΙΙΙ (35 μονάδες)]
Protein purification [Καθαρισμός πρωτεϊνών]
Introduction [Εισαγωγή]:
Column chromatography is commonly used for purification of proteins. The column is made
by packing solid porous material (stationary phase) in a column filled with buffer solution
(mobile phase). The protein solution to be separated is loaded on top of the column and allowed
to percolate into the solid matrix (stationary phase). A reservoir at the top supplies elution buffer
constantly which flows through the matrix and passes out of the column at the bottom (the
eluent). Since proteins interact with solid matrix in different degree, individual proteins migrate
faster or more slowly through the column depending on their properties. Therefore, one can
obtain purified proteins by collecting eluent at different times (Figure 5).
[Η χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιείται συχνά για τον καθαρισμό πρωτεϊνών. Η στήλη
κατασκευάζεται με πακετάρισμα ενός στερεού πορώδους υλικού (στατική φάση) σε μια στήλη
γεμάτη με ρυθμστικό διάλυμα (κινητή φάση). Το διάλυμα πρωτεϊνών που πρόκειται να
διαχωριστεί φορτώνεται στο επάνω τμήμα της στήλης και αφήνεται να διηθηθεί/φιλτραριστεί
μέσα στο στερεό υλικό (στατική φάση). Μια δεξαμενή στο επάνω μέρος παρέχει ρυθμιστικό
διάλυμα έκλουσης/έκπλυσης συνεχώς, το οποίο ρέει μέσα από τη στερεή φάση/matrix και περνά
από την στήλη ως το τέρμα στο πυθμένα (έκπλυμα). Καθώς οι πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με τη

21

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

στερεή φάση σε διαφορετικό βαθμό, εξατομικευμένα κάθε πρωτεΐνη μετακινείται γρηγορότερα ή
πιο αργά διαμέσου της στήλης ανάλογα με τις ιδιότητές της. Έτσι, είναι δυνατό να καθαρίσουμε
πρωτεΐνες από μείγματα συλλέγοντας το έκπλυμα σε διαφορετικές χρονικές στιγμές (Εικόνα 5).]
Ion-exchange chromatography can be used to separate proteins with different electric charge
at a given pH. In anion exchange chromatography, negatively charged proteins bind to positively
charged stationary phase. Using solution containing anions to compete with proteins for the
adsorption of solid matrix, the bound proteins will be eluted. In practical, proteins are eluted first
with buffer containing lower concentration of anion, then with buffer containing higher
concentration of anion. Since different charged proteins interact with the stationary phase in
different strength, they can be separately eluted by different concentrations of anionic buffers.
[Στην χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων/ιοντοανταλλαγής πρωτεΐνες με διαφορετικό
ηλεκτρικό φορτίο μπορούν να διαχωριστούν σε συγκεκριμένο pH. Στην χρωματογραφία
ανταλλαγής ανιόντων, αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες προσδένονται σε μια θετικά φορτισμένη
στατική φάση. Χρησιμοποιώντας διάλυμα που περιέχει ανιόντα τα οποία ανταγωνίζονται τις
πρωτεΐνες για την προσρόφηση στη στερεή φάση οι πρωτεΐνες που είχαν αρχικά προσροφηθεί
εκλούονται/ξεπλένονται. Πρακτικά, οι πρωτεΐνες εκλούονται/ξεπλένονται πρώτα σε χαμηλή
συγκέντρωση ανιόντων και προοδευτικά σε υψηλότερη συγκέντρωση ανιόντων. Καθώς
διαφορετικά φορτισμένες πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με τη στατική φάση σε διαφορετικό βαθμό,

22

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

εκλούονται/ξεπλένονται χωριστά από διαφορετικές συγκεντρώσεις ανιονικού ρυθμιστικού
διαλύματος.]

Figure 5
[Εικόνα 5]
[Επάνω: Δεξαμενή με διάλυμα έκλουσης, Μέση: Δείγμα, Στήλη χρωματογραφίας, Κάτω:
Κλάσματα που συλλέγονται διαδοχικά]

23

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

In the problem set, you will perform the following experiment [Στα πλαίσια αυτού του
προβλήματος θα πραγματοποιήσετε το ακόλουθο πείραμα] (5 points):
1. Label six 15-mL centrifuge tubes (yellow cap) a1 to a3 and b1 to b3 accordingly, with a
marker pen. [Σημειώστε έξι σωλήνες φυγοκέντρησης των 15-mL (κίτρινο καπάκι) σαν a1 ως
a3 και b1 ως b3 ανάλογα, με τον μαρκαδόρο.]
2. Take the anion chromatography column (Figure 6A), un-plug the tube and allow the solution
to be drained by gravity in the same centrifuge tube. Plug the tube intermediately when the
liquid surface reaches the top of the disc (Figure 6A, white arrow). Do not over-dry the gel as
it may affect protein purification. [Πάρτε την στήλη χρωματογραφίας ανιόντων (Εικόνα 6Α),
αφαιρέστε το πώμα από το σωληνάριο. και αφήστε το διάλυμα να στάξει στον ίδιο σωλήνα
φυγοκέντρησης με την βοήθεια της βαρύτητας χωρίς να στραγγίξει τελείως. Μόλις η υδατική
φάση πλησιάσει την στερεή φάση της στήλης ξαναβάλτε το πώμα (Εικόνα 6Α, λευκό βέλος).
Μην αφήσετε να στεγνώσει η στερεή φάση καθώς κάτι τέτοιο μπορεί να επηρεάσει τον
καθαρισμό πρωτεϊνών.]
3. Withdraw 200 µL of protein solution from microcentrifuge tube C (blue tube with blue label)
using a P200 micropipette, apply the sample to the chromatography column slowly by
touching the filled pipette tip lightly against the inside wall of the tube (Figure 6B).
[Πιπετάρετε 200 μL διαλύματος πρωτεΐνης από το σωλήνα C (μπλε σωλήνας με μπλε ετικέτα)

24

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

χρησιμοποιώντας την 200άρα μικροπιπέττα, και αφήστε το δείγμα στην στήλη
χρωματογραφίας αργά αγγίζοντας ελαφρά το εσωτερικό του σωλήνα με την άκρη του γεμάτου
τιπ/ρύγχους της πιπέττας.]
4. Un-plug the column and allow the protein sample to drain out, then transfer the column to
centrifuge tube a1 (yellow cap). Withdraw 3 mL of anion buffer A (green cap) with a plastic
dropper and apply the solution to gel by touching pipette tip against the wall of the tube
(Figure 6C). [Αφαιρέστε το πώμα της στήλης και αφήστε το δείγμα της πρωτεΐνης να
στραγγίξει, έπειτα μεταφέρετε τη στήλη στο σωλήνα a1 (κίτρινο καπάκι). Προσθέστε 3 mL
από το διάλυμα ανιόντων Α (πράσινο καπάκι) με μια πλαστική πιπέτα παστέρ ρίχνοντας
προσεκτικά ακουμπόντας την άκρη της στο τοίχωμα του σωλήνα (Εικόνα 6C)]
5. Collect ~1 mL eluent in centrifuge tubes a1 to a3 (yellow cap) sequentially. It takes about 2 to
3 minutes for each tube. [Συλλέξτε ~1 mL εκπλύμα στους σωλήνες φυγοκέντρησης a1 ως a3
(κίτρινο καπάκι) διαδοχικά. Ο χρόνος που χρειάζεται είναι περίπου 2-3 λεπτά για κάθε
σωλήνα.]
6. Allow the contents of the column drain entirely out then transfer the column to centrifuge
tube b1 (yellow cap). Withdraw 3 mL of anion buffer B (green cap) with a plastic dropper and
apply the solution to gel by touching pipette tip against the wall of the tube (Figure 6C).
[Αφήστε το περιεχόμενο της στήλης να στραγγίξει εντελώς και μεταφέρετε τη στήλη στο

25

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

σωλήνα φυγοκέντρησης b1 (κίτρινο καπάκι). Προσθέστε 3 mL από το ανιονικό διάλυμα Β
(πράσινο καπάκι) με μια πλαστική πιπέττα παστέρ ακουμπώντας με προσοχή απέναντι από το
τοίχωμα του σωλήνα της στήλης (Εικόνα 6C).]
7. Collect ~1 mL eluent in centrifuge tubes b1 to b3 (yellow cap) sequentially. It takes about 2 to
3 minutes for each tube. [Συλλέξτε ~1 mL έκπλυμα στους σωλήνες φυγοκέντρησης b1 ως b3
(κίτρινο καπάκι) διαδοχικά. Χρειάζονται περίπου 2-3 λεπτά για καθένα σωλήνα.]
8. Withdraw 50 µL of eluent from tubes a1 to a3 & b1 to b3 (yellow cap) and transfer to
centrifuge tubes A1 to A3 & B1 to B3 (red cap), respectively. Mix and observe color change.
CBG (see introduction in Task II) reagent in tubes A1 to A3 & B1 to B3 will turn blue when it
reacts with the eluted protein. [Πάρτε 50 μL από το έκπλυμα στους σωλήνες a1 ως a3 και b1
ως b3 (κίτρινο καπάκι) και μεταφέρετε στους σωλήνες Α1 ως Α3 και Β1 ως Β3 (κόκκινο
καπάκι), αντίστοιχα. Αναμείξτε και παρατηρήστε την αλλαγή στο χρώμα. Το αντιδραστήριο
CBG (βλέπε την εισαγωγή του Πειράματος ΙΙ) στους σωλήνες Α1 ως Α3 και Β1 ως Β3 θα
γίνει μπλε όταν αντιδράσει με την εκλουόμενη/ξεπλυμένη πρωτεΐνη.]
9. After finishing all the experiments, Lift the sign, lab assistants will take photo of your
experiment results and put a stamp mark on your answer sheet. Without the stamp mark, you
will not be evaluated for Q.3.1.1. and Q.3.1.2. [Αφού τελειώσετε όλα τα πειράματα, Σηκώστε
το ταμπελάκι, οι βοηθοί εργαστηρίου θα φωτογραφήσουν τα πειραματικά σας αποτελέσματα

26

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

και θα βάλουν μια σφραγίδα στο Φύλλο Απαντήσεών σας. Χωρίς την σφραγίδα δεν θα
βαθμολογηθείτε για τα Q.3.1.1. and Q.3.1.2.]

Figure 6
[Εικόνα 6] [Επάνω: Στήλη χρωματογραφίας ανιόντων, Μέση: στερεή φάση, Κάτω: πώμα]

Q.3.1. (7 points) Mark the deepest color change (X) on the answer sheet (Q.3.1.1. 5 points).
Which of the following buffers (buffer A or buffer B) can be used to elute the protein? Mark your
answer (X) on the answer sheet (Q.3.1.2. 2 points). [Σημειώστε τις βαθύτερες αλλαγές χρώματος
με (Χ) στο Φύλλο Απαντήσεων (Q.3.1.1. 5 points) Ποιό από τα ακόλουθα διαλύματα (το
διάλυμα Α ή το διάλυμα Β) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την έκλουση/ξέπλυμα της
πρωτεΐνης; Σημειώστε με (Χ) την απάντηση στο Φύλλο Απαντήσεων (Q.3.1.2. 2 points)]
Q.3.2. (5 points) Enzyme A is a protein whose surface is evenly distributed with electric charges.

27

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

If enzyme A can be eluted from anionic exchange chromatography by high concentration of
anionic buffer, what is the property of enzyme A with respect to electric charge? Mark (X) the
answer on the answer sheet.
(A) High negative net charges
(B) Low negative net charges
(C) Zero net charge
(D) Low positive net charges
(E) High positive net charges
[Q.3.2. (5 points) Το ένζυμο Α είναι μια πρωτεΐνη στης οποίας την εξωτερική επιφάνεια είναι
κατανεμημένα ομοιόμορφα ηλεκτρικά φορτία. Εάν το ένζυμο Α μπορεί να εκλουθεί/ξεπλυθεί
από μια χρωματογραφιά ανταλλαγής ανιόντων από υψηλή συγκέντρωση διαλύματος ανιόντων,
ποια ιδιότητα έχει το ένζυμο Α ως προς το ηλεκτρικό του φορτίο; Σημειώστε με (Χ) την
απάντηση στο Φύλλο Απαντήσεων.
(A) Υψηλό αρνητικό φορτίο
(B) Χαμηλό αρνητικό φορτίο
(C) Μηδενικό φορτίο
(D) Χαμηλό θετικό φορτίο
(E) Υψηλό θετικό φορτίο]

28

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Q.3.3. (4 points) Different amino acids differ in the chemical nature of the R group (side chain).
Figure 7 shows four amino acids A, B, C, and D in their prevailing ionic forms at pH 7.2, with
the side chain marked in white box. Which of the following amino acids in Figure 7 would be
present more frequently on enzyme A? Write down your answer (X) on the answer sheet.
[Q.3.3. (4 points) Διαφορετικά αμινοξέα διαφέρουν ως προς την φύση της πλευρικής ομάδας R
(πλευρική αλυσίδα). Η Εικόνα 7 δείχνει τέσσερα αμινοξέα A, B, C, και D στην επικρατέστερη
ιοντική τους κατάσταση σε pH 7.2, με τις πλευρικές αλυσίδες πλαισιομένες/σημειωμένες με
λευκό κουτί. Ποιο από τα ακόλουθα αμινοξέα της Εικόνας 7 θα εμφανίζεται συχνότερα στο
ένζυμο Α; Σημειώστε με (Χ) της σωστή απάντηση στο Φύλλο Απαντήσεων.]

Figure 7 [Εικόνα 7]
Q.3.4. (5 points) Hydrophobic interaction chromatography can be used to separate proteins
based on their hydrophobicity. To perform the chromatography, protein samples were first treated
with buffer containing high concentration of salts such as ammonium sulfate (NH4)2SO4, which
will remove water molecules from the protein surface. This causes the hydrophobic area on the
surface of the protein to be exposed. When the salt-treated proteins are subjected for

29

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

chromatography, they will be absorbed on the stationary phase through hydrophobic interactions.
The higher the hydrophobicity of the protein, the stronger the absorption. As salt concentration
can affect the hydrophobic interaction between the protein and the stationary phase, different
proteins can be separately eluted by using different concentrations of salt-containing buffers. If
enzyme A is highly hydrophobic, which of the following buffers should be used to separate
enzyme A from other proteins by chromatography? Mark (X) the answer on the answer sheet.
(A) Low-salt buffer
(B) High-salt buffer
(C) Buffer without salt
(D) Low-salt buffer first then high-salt buffer
(E) High-salt buffer first then low-salt buffer
[Q.3.4. (5 points) Η χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων μπορεί να χρησιμοποιηθεί
για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών με βάση το πόσο υδρόφοβες είναι. Για αυτή τη χρωματογραφία
τα δείγματα πρωτεϊνών επεξεργάζονται με ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει υψηλή
συγκέντρωση αλάτων όπως το θειικό αμμώνιο (NH4)2SO4, τα οποία μπορούν και απομακρύνουν
τα μόρια νερού από την εξωτερική επιφάνεια της πρωτεΐνης. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την
αποκάλυψη του υδρόφοβου τμήματος της πρωτεΐνης. Όταν οι πρωτεΐνες αυτές μετά την
κατεργασία με τα άλατα μπουν στη χρωματογραφία θα προσροφηθούν στη στερεή φάση

30

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

διαμέσου υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Όσο πιο υδρόφοβη είναι μια πρωτεΐνη τόσο
ισχυρότερη και η προσρόφηση. Καθώς η συγκέντρωση αλάτων μπορεί να επηρεάσει τις
υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών και στατικής φάσης, διαφορετικές πρωτεΐνες
μπορεί να εκλουθούν/ξεπλυθούν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις αλατότητας διαλυμάτων. Εάν
το ένζυμο Α είναι πολύ υδρόφοβο, ποιο από τα ακόλουθα διαλύματα θα πρέπει να
χρησιμοποιηθεί για τον καθαρισμό του ενζύμου Α από άλλες πρωτεΐνες με χρωματογραφία;
Σημειώστε με (Χ) την απάντησή σας στο Φύλλο Απαντήσεων.
(A) Διάλυμα χαμηλής αλατότητας
(B) Διάλυμα υψηλής αλατότητας
(C) Διάλυμα χωρίς αλάτι
(D) Αρχικά διάλυμα χαμηλής αλατότητας και έπειτα υψηλής αλατότητας
(E) Διάλυμα υψηλής αλατότητας και έπειτα διάλυμα χαμηλής αλατότητας]
Q.3.5. (4 points) If enzyme A is highly hydrophobic, which of the amino acids in Figure 7
would be present more frequently on enzyme A? Mark (X) the answer on the answer sheet.
[Q.3.5. (4 points) Αν το ένζυμο Α είναι πολύ υδρόφοβο, ποιο από τα αμινοξέα της Εικόνας 7 θα
απαντάται συχνότερα στο ένζυμο Α; Σημειώστε με (Χ) την απάντησή σας στο Φύλλο
Απαντήσεων.]
Q.3.6. (5 points) Gel filtration chromatography separates proteins based on their sizes. The gel,

31

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

or stationary phase, consists of cross-linked polymer beads with engineered pores of a particular
size. Small proteins enter the pores and are retarded by their more labyrinthine path. Large
proteins cannot enter the pores and so take a short path through the column, around the beads.
Table 2 is a list of gels and their fractionation ranges. Suppose both enzyme A (22 kDa) and
protein B (44 kDa) are single-subunit proteins. One would like to purify enzyme A from a
mixture containing enzyme A and protein B using gel filtration chromatography. Which gel is
best suited for the job? Mark your answer (X) on the answer sheet.
[Q.3.6. (5 points) Η χρωματογραφία σε πήκτωμα/gel, χρωματογραφία συγγένειας, διαχωρίζει
πρωτεΐνες με βάση το μέγεθός τους. Το πήκτωμα/gel, η στατική φάση αποτελείται από
διασυνδεμένα σφαιρίδια πολυμερών με πόρους συγκεκριμένου μεγέθους. Οι μικρές πρωτεΐνες
εισέρχονται στους πόρους και καθυστερούν περισσότερο να ξεπλυθούν γιατί ακολουθούν μια
λαβυρινθώδη διαδρομή. Οι μεγάλες πρωτεΐνες δεν μπορούν να εισέλθουν στους πόρους και
ακολουθούν το σύντομο δρόμο μέσα από τη στήλη, γύρω από τα σφαιρίδια. Στο Πίνακα 2
παρουσιάζεται

μια

λίστα

από

πηκτώματα/gels

διαφορετικής

περιοχής

κλασμάτωσης/διαχωρισμού πρωτεϊνών. Έστω ένα ένζυμο Α (22 kDa) και μια πρωτεΐνη B (44
kDa) οι οποίες είναι πρωτεΐνες που αποτελούνται από μια μόνο υπομονάδα. Κάποιος θέλει να
καθαρίσει το ένζυμο Α από ένα μείγμα που περιέχει ένζυμο Α και πρωτεΐνη Β χρησιμοποιώντας
χρωματογραφία σε πήκτωμα/gel. Ποιο πήκτωμα/gel είναι το καλύτερο για αυτό το σκοπό;

32

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

Σημειώστε με (Χ) τη σωστή απάντηση στο Φύλλο Απαντήσεων.]

Table 2 [Πίνακας 2]
Types of stationary phase
[Τύποι στατικής φασης]

Fractionation range (MW, Da)

G-10

<700

G-15

<1500

G-25

1,000-6,000

G-50

1,500-30,000

G-75

3,000-70,000

G-100

4,000-150,000

G-150

5,000-400,000

G-200

5,000-800,000

Περιοχή κλασμάτωσης/διαχωρισμού (ΜΒ, Da)

Q.3.7. (5 points) Assume that the concentration of total proteins in the original solution is 1
mg/mL and the activity of enzyme A is 0.5 units in 1-mL protein sample. The concentration of
total proteins after purification is 0.1 mg/mL and the activity of enzyme A is 1 unit in 1-mL
protein sample. Calculate the purification factor (times of purity improvement) of enzyme A.
Write down your answer on the answer sheet.

33

IBO – 2011
TAIWAN
PRACTICAL TEST 1
BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY

[Q.3.7. (5 points) Υποθέστε πως η συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης σε ένα διάλυμα είναι 1
mg/mL και η ενεργότητα/δραστικότητα του ενζύμου A είναι 0.5 units σε 1-mL δείγματος
πρωτεΐνης. Η συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης μετά από καθαρισμό είναι 0.1 mg/mL και η
ενεργότητα/δραστικότητα του ενζύμου Α είναι 1 unit σε 1-mL δείγματος πρωτεΐνης. Υπολογίστε
το συντελεστή καθαρότητας, που δείχνει πόσο πολύ καθαρίστηκε το ένζυμο Α (σαν φορές
βελτίωσης της καθαρότητάς του επί της αρχικής). Γράψτε την απάντησή σας στο Φύλλο
Απαντήσεων.]

34

Master your semester with Scribd & The New York Times

Special offer for students: Only $4.99/month.

Master your semester with Scribd & The New York Times

Cancel anytime.