INTRODUÇÃO

Eletroforese é o movimento de moléculas carregadas em um campo elétrico. É um método importante para separação de moléculas biológicas porque normalmente, não afeta a estrutura nativa de biopolímeros, e devido ser altamente sensível a pequenas diferenças em ambas as cargas e massa.

CONSIDERAÇÕES GERAIS Gel de eletroforese
O meio ideal de apoio para eletroforese é quimicamente inerte, de fácil manuseio e tem porosidade controlável. Embora papel seja o suporte escolhido para algumas aplicações como aminoácidos e pequenos peptídeos, há limitações porque a porosidade não pode ser controlada. Géis com porosidade controlável ou variável são ideais para separação de componentes de alto peso molecular (proteínas e ácidos nucléicos), porque eles permitem fácil movimentação de macromoléculas enquanto previne convecção e minimiza difusão. Géis também adicionam a possibilidade de combinação de separação eletroforética com efeito de peneiramento molecular – permeação do gel. Géis com efeitos peneira podem ser preparados com tamanhos de poros aproximadamente do mesmo tamanho de moléculas a serem separadas pelo controle da concentração do gel. Três tipos de géis são comumente usados – amido, poliacrilamida e agarose – e as propriedades, usos, e preparação do de poliacrilamida serão discutidos agora. Poliacrilamida Acrilamida e bisacrilamida podem ser polimerizados na presença de radicais livres para gerarem géis de variados, mas controlados tamanhos de poros. Isto permite ao meio eletroforético ter um efeito direto na separação eletroforética. Se o tamanho dos poros forem aproximadamente iguais aos das moléculas, moléculas pequenas mover-se-ão livremente num campo elétrico e moléculas maiores serão restringidas na migração delas. Gel de poliacrilamida é formado pela polimerização de acrilamida, com um agente de ligação cruzada N,N’-metileno bisacrilamida. A polimerização é

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Géis de poliacrilamida podem ser formados em cilindros ou em placas planas. usualmente entre 0. MATERIAL E MÉTODOS Extração da proteína Folhas de seringueira do jardim clonal do Setor de Fisiologia Vegetal do Departamento de Biologia da UFLA foram maceradas em almofariz com nitrogênio líquido. Oxigênio irá inibir a polimerização de radical livre. Separações em géis podem ser alcançadas com variáveis contínuas (uma densidade de gel. um tampão. as bandas separam-se em áreas baseadas no tamanho forma moleculares ou na relação carga/massa. ou densidade do gel. o manuseio da placa. em presença de PVPP (polivinilpolipirrolidona).N’tetrametiletilenodiamina (TEMED). onde as propriedades rigidez e expansibilidade e em menor grau o tamanho do poro são mais afetados pela quantidade do agente de ligações cruzadas.N. então retirada de ar de soluções usadas na polimerização é recomendada. e um pH) ou com condições descontínuas (diferentes densidade do gel. No gel de separação. Placas de gel permite correr várias amostras e padrões num simples gel sob condições uniformes. O tamanho do poro no gel de poliacrilamida é influenciado pela concentração total de acrilamida. OBJETIVO ♦ Realizar uma eletroforese em gel de poliacrilamida a fim de separar proteínas. extraídas de folhas de seringueira (Hevea brasiliensis).catalisada por agentes que geram radicais livres. e/ou pH’s dentro do mesmo gel). tampões. como persulfato de amônio. Calor é mais facilmente dissipado de uma placa fina que de um cilindro.7 e 1. composição do tampão. A acumulação é aumentada a cada descontinuidade em pH. pode ser mais difícil que o manuseio com géis cilíndricos. A formação de radicais livres do persulfato de amônio é catalisada por N. Descontinuidade produz zonas de material altamente concentrada e faz possível a separação de misturas de grande número de espécies moleculares diferentes. 2 . ou a separação de misturas de substâncias altamente similares. de diferentes pesos moleculares.5 mm de espessura.N’. Entretanto.

8. 3 .1M pH 7. 144. 1. 100µL de persulfato de amônio.6 mL de SDS 10% Diluir para 1 litro.000G. 1. por 15 minutos a 4oC.0mL de Tris HCl 1. O precipitado foi descartado e o sobrenadante foi quantificado por Bradford.8.30g Tris HCl. Preparo da eletroforese a) Preparo do gel separador - 6.13g de glicina. c) Tampão de corrida 30. O extrato foi centrifugado a 10. 1. 200µL de SDS 10%.5 com 1% de ácido ascórbico na relação de 1 grama para 3mL. Na hora de uso diluir 10 vezes.8. 5.Ao macerado. 15µL de TEMED.4mL de acrilamida solução 6%.6mL de água destilada. - Este gel foi sobreposto ao gel de separação. 22µL de TEMED.5M pH 6. - Este gel foi colocado na cuba de eletroforese. acrescentando-se.7mL de Tris HCl 0. 20µL de persulfato de amônio 10%. depois. b) Preparo do gel de empilhamento - 3. água destilada por cima.9mL de água destilada. para definir a faixa de separação.3mL de Bis/acrilamida 30%. foi adicionado tampão fosfato 0.5M pH 8.

8. 250mL de água destilada. onde foi adicionada solução corante. 0. o gel foi descorado na solução descorante. 50mL de ácido acético. 0.0mL de Tris HCl pH 6.d) Tampão da amostra 3. com a cuba eletroforética pronta. A seguir. à temperatura ambiente. Posteriormente. 1. as amostras foram aplicadas no gel com uma seringa Hamington. 10mL de ácido acético. 0. 4 . e) Solução corante 200mL de metanol. “overnight”.0mL de água destilada.4mL de 2-mercaptoetanol. o gel foi retirado e transferido para uma cuba. visualmente. No dia seguinte. 50mL de água.4mL de azul de bromofenol 1%. a uma corrente de 110V. Preparo das amostras Foram misturados 16µL da amostra em 4µL de tampão da amostra em tubos eppendorff e levados à ebulição por 4 minutos. a extremidade inferior do gel. Condições de corrida As amostras foram submetidas.8mL de glicerol. 20mA e 5W aproximadamente.5g de Comassie Blue. até atingirem. 0. f) Solução descorante 40mL de metanol.

SANTOS.97µ g/µ L). 262 p. Volume 1 (Tradução).. San Diego.D.M.P. 2a ed.F. corrida eletroforética não apresentou nenhuma banda de proteínas. Ed. C. Biochemical Techniques – Theory and practice Waveland Press. 1999. Illinois.. B. 403p. VOET.W. 1990.. 1990. PRATT. C.D.RESULTADOS E CONCLUSÕES Apesar do resultado de quantificação de proteínas totais por Bradford. ABREU. VOET.G.. L.P. Curso de Química – Bioquímica. A . UFLA/FAEPE.J. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DEUTSCHER. Artmed. ter indicado uma alta concentração (0. WHITE. ROBYT. D... 237p. 893p. CORRÊA. Fundamentos de bioquímica. A. São Paulo: Edgard Blucher Ltda.. PAIVA. J.V. Academic Press. 1989. Guide to protein purification – Methods in enzymology. 931p. Lavras. 2000. Bioquímica.. Porto Alegre. 5 .. L. M. C. LEHNINGER. Prospect Heights. J.