IBP1936_12 EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ESPECTROSCÓPICA DO MATERIAL LIPÍDICO DA MICROALGA Monoraphidium sp, VISANDO Á PRODUÇÃO DE BIODIESEL. Anderson F.

Gomes1, Marta Costa 2

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Copyright 2012, Instituto Brasileiro de Petróleo, Gás e Biocombustíveis - IBP Este Trabalho Técnico foi preparado para apresentação na Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012, realizado no período de 17 a 20 de setembro de 2012, no Rio de Janeiro. Este Trabalho Técnico foi selecionado para apresentação pelo Comitê Técnico do evento, seguindo as informações contidas no trabalho completo submetido pelo(s) autor(es). Os organizadores não irão traduzir ou corr igir os textos recebidos. O material conforme, apresentado, não necessariamente reflete as opiniões do Instituto Brasileiro de Petróleo, Gás e Biocombustíveis, Sócios e Representantes. É de conhecimento e aprovação do(s) autor(es) que este Trabalho Técnico seja publicado nos Anais da Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012.

Resumo
Excelente fonte de biomassa, apresentando ciclo de cultivo curtíssimo, as microalgas, independe de solos férteis, pois demandam de pouca água para seu plantio. As prerrogativas supracitadas tornam o emprego da biomassa microalgal bastante viável para produção de biodiesel. No entanto, o rompimento da parede celular da microalga é essencialmente importante, pois desta maneira é possível aumentar a eficiência na extração dos lipídeos. O referido trabalho descreve os resultados da extração do material lipídico (ML) da microalga Monoraphidium sp, utilizando diferentes métodos de rompimento celular, além disso, caracterizou-se o material extraído por técnicas espectroscópicas (FTIR e UV/Vís). A biomassa seca foi macerada com auxilio de um almofariz e pistilo, homogeneizada com uma peneira granulométrica de 32 mesh. A extração do ML foi realizada utilizando três diferentes sistemas de rompimento celular. O cisalhamento foi avaliado observando a influência da rotação sobre o valor de ML extraído, assim como, o uso acoplado do ultrassom com agitação mecânica. O fator tempo foi analisado nos seguintes intervalos: 0.5, 1, 2 e 4 horas. Os resultados evidenciaram que o aumento da rotação durante as extrações gerou maior eficiência no rompimento da parede celular da microalga, que é ratificado com o aumento do ML extraído, sendo que o tempo ideal para extração é de 2 horas (14000 rpm/agitador mecânico). O uso acoplado da agitação mecânica com o ultrassom possibilitou bons rendimentos na extração sem o uso de altas rotações. Os dados espectroscópicos mostraram que os materiais obtidos nas extrações são basicamente ácidos graxos, triacilglicerídeos e carotenoides.

Abstract
Excellent fonts of biomass have presented a very short cultivation cycle, the microalgae, without fertile soil; demand not much water for its cultivation. The prerogatives above make the use of microalgal biomass sufficiently viable for biodiesel production. However, the disruption of the cell wall of microalgae is vitally important because this is possible to increase the efficiency lipids extraction. This paper describes the results of the lipid material (LM) extraction of the microalgae Monoraphidium sp, using different methods of cell disruption, moreover, characterized the extracted material by spectroscopic techniques (FTIR and UV/Vis). The dried biomass was macerated with the aid of a mortar and pistil, homogenized with a particle size of 32 mesh sieve. The LM extraction was performed using three different systems for cell disruption. The shear strength was evaluated by observing the influence of rotation in the yield of extracted lipid fraction, as well as the use of ultrasound coupled with mechanical stirring. The factor time was analyzed at the following intervals: 0.5, 1, 2 and 4 hours. The results showed that increasing the rotation during the extraction, increase efficiency in tearing the microalgae cell walls, which is ratified with the increase of LM extracted, and optimal time for extraction is 2 hours (14000 rpm /mechanical strirrer). The use of mechanical agitation coupled with ultrasound allowed good yields in the extraction, without the use of high rotation. Spectroscopic data showed that the materials obtained in extractions are mainly fatty acids, triglycerides and carotenoids.

______________________________ 1 Mestrando, Química - UFRN 2 Docente, Química - UFRN

Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012

1. INTRODUÇÃO
Os problemas relacionados ao aquecimento global repercutem em todo planeta, aliado a está preocupação estão o uso assaz dos combustíveis fosseis, pois a literatura reporta que os gases provenientes da queima destes combustíveis têm relevante contribuição no agravamento do efeito estufa (AMIN, 2009). Desta maneira, a produção de biodiesel usando diferente s matérias-primas, tais como microalgas, gordura animal e óleos vegetais, tem sido tentada como fontes de energia alternativa (VASUDEVAN; BRIGGS, 2008). Contudo, as microalgas aparecem atualmente como uma fonte promissora, pois apresenta grandes vantagens em relação à cultura de outras oleaginosas, incluindo o crescimento de maneira exponencial, necessidade de menor área para o cultivo e considerável percentual lipídico (AHMAD et al., 2011; LEE et al., 2010). Devido ao seu alto teor de lipídios, as microalgas constituem uma das mais promissoras fontes de biomassa. Em laboratório, superam a produtividade dos grãos de oleaginosas, produzindo óleo dez vezes mais que o dendê, considerada uma das oleaginosas mais ricas, com produção de 4.400 quilos por hectare. Seu cultivo não depende de solo fértil e pode ser realizado sobre áreas secas, pois demandam menos água para manutenção do que as irrigações das lavouras (REYNOL, 2008). No entanto, o rompimento da parede celular da microalga é essencialmente importante, pois desta maneira é possível aumentar a eficiência na extração dos lipídeos. Diferentes métodos, tais como microondas, incubadora e ultrassom são algumas das técnicas empregadas para rompimento de parede celular (CRAVOTTO et al., 2008; VIROT et al., 2008). Diante dos aspectos ressaltados, o referido trabalho descreve os resultados da extração do material lipídico (ML) da microalga Monoraphidium sp, utilizando diferentes métodos de rompimento celular (agitação mecânica e cavitação), além disso, caracterizou-se o material extraído por FTIR e UV/Vís.

2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Obtenção das Microalgas As amostras da Monoraphidium sp foram cedidas através do projeto: “Implementação de um planta piloto para produção de biomassa de microalgas, visando à obtenção de biodiesel”, parceria Petrobras/CENPES-UFRN. A espécie de microalgas foi cultivada em garrafões de 20 L, durante um período de 4 dias, salinidade de 15% e percentual de 85% de N2 indicado no meio de cultura. 2.2 Determinação da Umidade da Biomassa O teor de umidade foi determinado por analise gravimétrica (SKOOG et al., 2009) aquecendo-se a biomassa (Synechosystis sp2), em estufa, a 100 – 110ºC, até que seu peso se mantenha inalterado. 2.3 Métodos de Extração do Material Lipídicos da Monoraphium sp A biomassa seca foi macerada com auxilio de um almofariz e pistilo, homogeneizada com uma peneira granulométrica de 32 mesh. A extração do material lipídico foi realizada com três diferentes sistema de rompimento celular, empregando-se 300 mg de biomassa, 100 mL de n-hexano e 4 intervalos de tempo (0.5, 1, 2 e 4 horas). 2.3.1 Extração com Agitação Mecânica O sistema de rompimento celular utilizando agitação mecânica consiste no cisalhamento proporcionado por lâminas acopladas aos equipamentos. Diferentes agitações foram utilizadas, 2000 e 14000 rpm, para o emprego das rotações supracitadas foram utilizados um agitador mecânico e o dipersor ME-147 (Figuras 1 e 2 respectivamente).

Figura 1. Agitador mecânico utilizado nas extrações do ML da Monoraphidium sp.

Figura 2. Dispersor ME-147 utilizado nas extrações do ML da Monoraphidium sp. 2

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2.3.2 Extração com Agitação Mecânica Acoplada ao Ultrassom O agitador mecânico foi conectado ao ultrassom (freqüência 40 kHz, temporizador digital de 0-30 min, potência de 120 Watts, modelo USC 1600, da UNIQUE) como indicado na Figura 3. Posteriormente, sulfato de sódio anidro (agente secante) foi adicionado ao material resultante. Após filtração, o filtrado foi levado ao evaporador rotativo, á 68°C, para remoção do solvente.

Figura 3. Sistema agitador mecânico acoplado ao ultrassom utilizado nas extrações do ML da Monoraphidium sp. 2.4 Cálculo do Teor Lipídico e Tratamento Estatístico dos Dados As análises foram realizadas em triplicata, com determinação de desvio padrão e o teor lipídico obtido foi considerado como a média aritmética e calculado de acordo com a Equação 1:

Onde: MML é a massa do material lipídico extraído; MB a massa da microalga e U é a umidade da amostra. As médias dos ML’s extraídos por cada método foram comparadas, quando necessário, através do teste t segundo SKOOG et al (2009), de acordo com a Equação 2:

As condições adotadas para comparação das médias foram 4 graus de liberdade e 95% de confiabilidade. 2.5 Caracterização Espectroscópica do Material Lipídico da Monoraphidium sp A caracterização espectroscópica na região do UV/Vís foi realizada em um espectrofotômetro Evolution 60 da Thermo Scientific, através da dissolução de aproximadamente 0,05 mL de óleo em 3 mL no solvente (usado como extrator e também como branco na análise). Foi realizada uma varredura de 200 à 800 nm, com intervalos de 1 nm e medidas de absorbância de 0-10A, de 0,1A. A análise por FTIR foi realizada em um espectrofotômetro JASCO, modelo FT/IR- 4200, empregando faixa espectral de 600 – 4000 cm-1, com resolução máxima 0,5 cm-1 e 32 varreduras. A amostra foi preparada através da dissolução do óleo em diclorometano e, posterior, deposição do filme fino em pastilhas de KBr.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados evidenciaram que as extrações (vide Tabela 1) realizadas com rotação de 14000 rpm e duração de 4 horas foram as condições que possibilitaram maior obtenção de material lipídico com 12,51+0,84%, no entanto é importante salientar, que o teste t mostrou inexistência, quanto a diferenças estatísticas entre os valores médios das frações lipídicas extraídas, durante o período de 2 horas (11,95+0,46 %) sobre as mesmas condições, pois t obtido na comparação entre as médias (1,02) é menor que tcrítico (2,78) na situação estatísticas proposta no estudo. Em relação à influência da rotação sobre o percentual lipídico, observou-se uma variação significativa, pois os melhores resultados empregando 2000 rpm (Tabela 2) foram 5,78+0,34 % isso com 4 horas de extração, consequentemente é possível inferir 3

Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012 que o aumento da rotação implicou em um rompimento mais efetivo da parede celular da microalga, e que há uma relação de proporcionalidade entre a taxa de cisalhamento e a rotação aplicada pelo agitador. Tabela 1. Material lipídico (ML) extraído da microalga Monoraphidium sp empregando agitação mecânica e 14000 rpm. Tempo (h) 0,5 1 2 4 ML Extraído (%) 6,03+0,14 7,62+0,42 11,95+0,46 12,51+0,84

Tabela 2. Material lipídico (ML) extraído da microalga Monoraphidium sp utilizando agitação mecânica e 2000 rpm. Tempo (h) 0,5 1 2 4 ML Extraído (%) 4,08+0,08 4,24+0,06 5,34+0,11 5,78+0,34

O sistema de extração utilizando o agitador mecânico (2000 rpm) acoplado ao ultrassom durante 4 horas forneceu resultado significativo (ver Tabela 3) em relação ao material lipídico obtido (11,46+0,32%), tal comportamento pode ser atribuído ao fato de existirem dois efeitos simultâneos que contribuem para o rompimento da parede celular, a cavitação gerada pelas ondas sonoras do ultrassom, bem como, o cisalhamento proporcionado pelas lâminas do agitador mecânico. Quando comparados estatisticamente pelo teste t, as médias obtidas pelo sistema acoplado e o método empregando 14000 rpm, apresentam t(1,98)< tcrítico (2,78), logo os resultados ratificam que não há diferença estatística entre os valores médios de ML extraído pelos sistemas. Tabela 3. Material lipídico (ML) extraído da microalga Monoraphidium sp empregando agitação mecânica e (2000 rpm) acoplado ao ultrassom. Tempo (h) 0,5 1 2 4 ML Extraído (%) 8.62+0,16 9,56+0,31 10,89+0,09 11,46+0,36

O comportamento quanto aos valores médios de ML extraídos da Monoraphidium sp em cada sistema de rompimento celular estão descritos no gráfico abaixo:

Gráfico 1. Material lipídico (ML) extraído da microalga Monoraphidium sp empregando diferentes sistemas de rompimento celular..

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Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012 Os resultados de FTIR, indicados na Figura 4, evidenciam deformação axial em 1743 cm -1 referente ao estiramento C=O (5), característico de carbonila de ésteres. A banda na região 3000-3600 cm-1 (2) ratifica presença de água na amostra. Os estiramentos (3) C-H em alquenos (sp2-s) é verificado em 3012 cm-1, corroborando a existência de material insaturado. O sinal (4) em 2922 cm -1 referente à banda de deformação axial C-H (sp3-s), evidenciando a presença de cadeia carbônica saturada comumente encontrada em lipídios. A região do espectro representado por (1) mostra um overtone da carbonila de éster. Na região digital (finger printer) do espectro ocorre absorção em 723 cm -1(6), referente à deformação assimétrica de grupos metilênicos. O comportamento supracitado é característico de cadeias longas de hidrocarbonetos contendo interligados (-CH2-) n (SILVERSTAIN; et al .,1991).

Gráfico 2. Espectro de FTIR do ML extraído da microalga. A análise espectrofotométrica na região do ultravioleta fornece informações sobre a qualidade do óleo e revela seu perfil graxo. De acordo com a literatura, devido às ligações duplas isoladas carbono-carbono presentes nos ácidos graxos, os triglicerídeos foram observados em 210 nm (REDA, 2004). Ácidos graxos conjugados (dienos e trienos conjugados) mostraram intensa absorção na região de 232 nm (TOLENTINO, 2008) enquanto que os pigmentos (carotenoides) apresentaram bandas de absorção em 477 nm (OGAWA et al.,2007; MORETTO; FETT, 1998).

4. CONCLUSÕES
Diante dos procedidos é possível inferir que o aumento da rotação nas extrações gerou maior eficiência no rompimento da parede celular da microalga, que é ratificado com o aumento do material lipídico extraído, sendo que o tempo ideal para extração é de 2 horas (14000 rpm/agitador mecânico), como mostrado pelo teste t. O uso acoplado da agitação mecânica com o ultrassom possibilitou bons rendimentos na extração sem o uso de altas rotações. Os dados espectroscópicos mostraram que os materiais obtidos nas extrações são basicamente ácidos graxos, triacilglicerídeos e carotenóides.

5. AGRADECIMENTOS Ao CNPq pela bolsa de mestrado e ao CENPES/PETROBRAS pelas amostras de microalgas cedidas. 6. REFERÊNCIAS
AMIN S. Review on biofuel oil and gas production processes from microalgae.Energy Convers Manage 2009;50:1834– 40. VASUDEVAN, P.T., Briggs, M., 2008. Biodiesel production – current state of the art andchallenges. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35, 421–430. AHMAD, A.L; YASIN N.H. M; C.J.C. Derek, J.K. Lim, Microalgae as a sustainable energy source for biodiesel production: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 15 (2011) 584–593. LEE, J. Y; YOO, Chan; JUN, S. Y;AHN ,C. Y; , Hee-Mock OH; Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresource Technology 101 (2010) 575–577 5

Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012 CRAVOTTO, G., BOFFA, L., MANTEGNA, S., PEREGO, P., AVOGADRO, M., CINTAS, P., 2008. Improved extraction of vegetable oils under high-intensity ultrasound and/ormicrowaves. Ultrason. Sonochem. 15, 898–902. VIROT, M., TOMAO, V., GINIES, C., VISINONI, F., CHEMAT, F., 2008. Microwave-integrated extraction of total fats and oils. J. Chromatography. A 1196–1197, 57–64. SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Umidade em amostras p. 987. In: Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J.; Crouch, S. R. Fundamentos de Química Analítica. 8a ed. São Paulo: Cengage Learning, 2009.
SILVERSTEIN R. M, BASSLER G. C, MORRILL T. Spectrometric identification of organic compounds. New York: Wiley; 1991.

RENDA, S. Y. Estudo comparativo de óleos vegetais submetidos a estresse térmico. 2004, Dissertação (Mestrado)Universidade Estadual de Ponta Grossa, Ponta Grossa, 2004. OGAWA, M.; MAIA, E. L.; FERNANDES, A. C.; NUNES, M. L.; OLIVEIRA, M. E. B.; FREITAS, S. T. Resíduos do beneficiamento do camarão cultivado: obtenção de pigmentos carotenóides. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 27(2): 333-337, abr.-jun. 2007. MORETTO, E.; FETT, R. Tecnologia de óleos e gorduras vegetais na indústria de alimentos. São Paulo: Livraria Varela, 1998. TOLENTINO, M. C. Avaliação da qualidade de óleos vegetais sob estresse fotoxidativo e termoxidativo por espectroscopia de UV e RMN de 1H. Dissertação (Mestrado)- Universidade Estadual de Ponta Grossa, Ponta Grossa, 2004.

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