ISSN 1517-7076

Revista Matéria, v. 9, n. 4, pp. 378 – 385, 2004 http://www.materia.coppe.ufrj.br/sarra/artigos/artigo10622

Produção e Caracterização de Poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) por Ralstonia eutropha Utilizando Resíduo da Indústria de Arroz
R. C. RODRIGUES; M. L. FIORESE; E. P. ARNOSTI; R. A. W. RAMOS; A. P. T. PEZZIN; G. M. F. ARAGÃO Universidade Federal de Santa Catarina Centro Tecnológico - Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos Cx. Postal 476 - CEP: 88040-900 Florianópolis - SC, Brasil. e-mail: rafael@enq.ufsc.br, monica_fiorese@yahoo.com.br, erikaarnosti@yahoo.com.br, renatoawr@hotmail.com, paulapezzin@univille.edu.br, glaucia@enq.ufsc.br RESUMO Este trabalho teve como objetivo, utilizar o resíduo da indústria de arroz, para a produção de poli(3hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato), P(3HB-co-3HV), como substrato para Ralstonia eutropha, a fim de reduzir os custos de produção do polímero. Os ensaios foram conduzidos através de culturas submersas descontínuas, em frascos agitados, onde a fonte de carbono utilizada foi o hidrolisado do resíduo da indústria de arroz. As culturas de R. eutropha foram realizadas por 28h a 30ºC, com limitação em nitrogênio na fase de produção de polímero. Amostras foram retiradas a cada 2h para análise de crescimento celular por turbidimetria e peso seco, açúcares redutores pelo método de DNS, e dosagem do polímero P(3HB-co-3HV) por cromatografia gasosa. A caracterização do polímero foi feita pelas técnicas de calorimetria exploratória diferencial (DTA), análise termogravimétrica (TGA), difratometria de raios-X (DRX) e espectroscopia no infravermelho (FTIR). Os resultados obtidos demonstraram que o crescimento da bactéria no hidrolisado de arroz apresentou velocidade específica de crescimento na fase exponencial semelhante à encontrada em glicose/frutose, considerado como meio padrão. Com isso, concluiu-se que é possível a utilização do resíduo da indústria de arroz na biossíntese de polihidroxialcanoatos, contribuindo desta forma para a redução dos custos de produção, tornando-os mais competitivos no mercado. Palavras chaves: Polihidroxialcanoatos, resíduos, arroz.

Production and Characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Ralstonia eutropha Using Residues from the Rice Industry
ABSTRACT This work had as objective, to use the waste from rice industry, for poly(3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyvalerate) production, P(3HB-co-3HV), as substrate for Ralstonia eutropha, in order to reduce the costs of polymer production. The assays were carried out, through discontinous submerged cultures, in rotatory flasks, where the carbon source was the hydrolysed waste of the rice industry. Cultures of R. eutropha were realized by 28h at 30ºC, with nitrogen limitation in the phase of polymer production. Samples were collected to each 2h for analysis of cellular growth for turbidimetric measurements and dry weight, reducing sugars for the DNS method, and dosage of polymer P(3HB-co-3HV) by gas chromatography. The characterization of polymer was made by thermal analysis through the DTA technique, termogravimetric analysis (TGA), X-ray diffraction measurements and fourier transformed infrared spectrocopy (FTIR). The results had demonstrated that the growth of the bacterium in the hydrolysed rice waste presented specific growth rate in the exponential phase similar to found in glucose/fructose, considered as standard medium. So, it was concluded that the use of waste from rice industry in biosynthesis of polyhydroxyalkanoates is possible, contributing for the reduction of production costs, becoming them more competitive in the market. Keywords: Polyhydroxyalkanoates, wastes, rice.

Autora Responsável: G. M. F. ARAGÃO

a produção industrial de PHA. 378 – 385. Anderson e Dawes.. O ou Mg. 1999). P. 2000).. podendo atingir até 80% de sua massa seca em polímero. Os PHAs têm recebido muita atenção devido à sua similaridade aos plásticos convencionais e sua completa biodegradabilidade (Lee. Inicialmente. associado ao fornecimento não limitado de fonte de carbono. as células foram cultivadas em um meio de enriquecimento. 9. v. S. gram-negativa. PEZZIN.RODRIGUES. R. com acúmulo intracelular de polímero (Dawes e Senior. Marangoni et al. bem como caracterizar o polímero obtido. 1996) a 30°C. E. intracelularmente em vários microrganismos sob condição de limitação de um nutriente essencial como N. pp. quanto as suas propriedades físicas e térmicas. Byrom. como o ácido propiônico. 1985. Outra solução para reduzir estes resíduos é o uso de plásticos biodegradáveis.5 g KH2PO4 L1. uma solução estéril de fosfato foi assepticamente adicionada ao meio de cultura para obter uma concentração final de 8. 1990). o amido sofre uma hidrólise à glicose (Kim. Uma forma de reduzir estes custos é a utilização de fontes de carbono alternativas. Alguns fatores como. O poli(3-hidroxibutirato) [P(3HB)] e o poli(3-hidroxibutirato-co-3hidroxivalerato) [P(3HB-co-3HV)] são os polímeros mais estudado da família dos polihidroxialcanoatos.. Revista Matéria. Após autoclavado.C. foi possível a obtenção de glicose para utilização como fonte de carbono pelo microrganismo. Devido a seus altos rendimentos. A. (2) limitação ou exaustão de um nutriente essencial. pode-se utilizar o resíduo da indústria processadora de arroz. Este polímero apresenta propriedades físicas e mecânicas similares àquelas encontradas no polipropileno. 2001).. e habilidade para crescer em fontes de carbono renováveis.P. Este resíduo encontra-se em abundância na Região Sul do Brasil. O gasto com matéria-prima pode chegar a 40% do custo total de produção dos polihidroxialcanoatos.F.1 MATERIAIS E MÉTODOS Microrganismo e Meio de Cultura A cepa utilizada foi Ralstonia eutropha DSM 545.. Antes do processo fermentativo.A. 1 INTRODUÇÃO Materiais plásticos que têm sido universalmente usados em nossas vidas estão causando sérios problemas ambientais devido à sua baixa degradabilidade. que podem ser resíduos ou sub-produtos das indústrias de alimentos como soro de leite ou açúcar invertido (Marangoni et al. eutropha (Squio et al. e principalmente redução dos custos com matéria-prima. Ralstonia eutropha.L. G. é o microrganismo mais utilizado em processos industriais (Doi. processos de recuperação e extração mais eficientes.M. 1987. o objetivo deste trabalho foi estudar a utilização do resíduo da indústria processadora de arroz para a produção de P(3HB-co-3HV). Com isso. A bactéria. (Holmes. e na presença de excesso de fonte de carbono (Lee et al. formando o copolímero. O inóculo utilizado nas culturas foi preparado por 28h em frascos de 1 L contendo 300 mL de meio mineral (MM) (Aragão et al. plástico de origem petroquímica (Tsuge. a 30°C por 24 h. desenvolvimento de melhores cepas. 4.. FIORESE. que são polímeros acumulados como material de reserva de carbono e/ou energia. 1973).W. poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) [P(3HB-co-3HV)] pela R. 2003. Apesar de apresentar vantagens em relação aos plásticos convencionais. 1996). ARNOSTI. com o objetivo de geração de biomassa. foram iniciados.5 g Na2HPO4. eutropha acontece em duas fases: (1) crescimento celular não limitado. Dentre os principais plásticos biodegradáveis em desenvolvimento. Na busca para reduzir a quantidade de resíduos plásticos. Byrom 1992). em um meio de cultura balanceado. Uma outra fonte disponível em grandes quantidades é o amido.. Rusendi e Sheppard (1995) utilizaram resíduo da indústria processadora de batatas para a produção de P(3HB). A cultura foi divida em duas fases: uma fase de crescimento na qual não houve 379 . M.P.T. como a reciclagem. O processo de produção de P(3HB-co-3HV)em R. 1995). possui um custo ainda muito elevado quando comparado aos polímeros de origem petroquímica.12H2O L1 e 1. ARAGÃO. 2002. RAMOS. o meio de cultura acima citado. embora já ocorra. 2 2. De forma análoga.. 1999. R. 1990). é o microrganismo mais utilizado para a produção de polihidroxialcanoatos. n. caldo nutriente (NB). Através de uma hidrólise enzimática. podem contribuir para tornar os PHA mais competitivos no mercado (Choi e Lee. e possui as características necessárias para a utilização nos processos biotecnológicos de produção de polihidroxialcanoatos. encontram-se os polihidroxialcanoatos (PHAs). 2002). como o fato de serem materiais biocompatíveis e biodegradáveis. A utilização de um precursor. programas mundiais para gerenciamento eficiente de materiais plásticos usados. por sua grande capacidade de acúmulo de polímero e possibilidade de crescimento em glicose como fonte de carbono (mutante espontâneo). leva à incorporação de unidades de 3-hidroxivalerato (3HV) nas moléculas de P(3HB). 2004. Lee e Chang.. contendo 5 g de peptona de carne L-1 e 3 g de extrato de carne L-1.

fez-se necessário a realização de um processo de hidrólise para a quebra do amido em glicose. ao invés de secas.T. 2004. A hidrólise ácida foi feita adicionando-se (1:10) de ácido clorídrico 10% para extrato de amido e aquecido a 110°C for 2. O pH da cultura foi mantido em 7.0 pela adição de 5% (v/v) NH4OH ou 1M HCl. As evoluções de biomassa total (Xt) e residual (Xr).RODRIGUES.. P(3HB-co-3HV): amostras de células para análise de polímero foram obtidas de forma semelhante àquelas para análise de biomassa. v. ARNOSTI.F. ARAGÃO. M. detecção e coluna utilizadas foram 190. A fonte de carbono foi adicionada de forma a obter-se uma concentração inicial de 30 g. (2000).53 mm x 30 m). sob atmosfera de argônio. 4.A. Glicose: a dosagem de glicose foi feita pelo método do ácido 3-5-dinitrosalicílico (DNS). 2. ao longo do processo de cultivo estão apresentada na figura 1. Revista Matéria. Os metil-ésteres resultantes da reação de metanólise foram quantificados pela injeção de 1 μL em cromatógrafo a gás (CG-90) equipado com uma coluna de sílica fundida (Supercowax-10 . copolímero [P(3HBco-3HV)] e consumo de açúcar.. com ângulo 2θ com uma varredura de 10 .L-1 no meio. foi preparado o meio de cultura com a concentração de açúcar de 30 g L-1. R. 230 e 100oC. dividida pelo intervalo de tempo correspondente. G. e a fase de produção com limitação de nitrogênio. 9.0. limitação de nutriente. Biomassa: a densidade celular foi determinada por turbidimetria a 600 nm e a concentração celular através de análise gravimétrica. Análise Cinética: a produtividade foi calculada pela diferença entre a concentração de polímero em um instante t e a concentração inicial de polímero. Para tornar possível a utilização desta fonte pelo microrganismo. para subseqüente análise e foram preparadas conforme descrito por Marangoni et al. eutropha pudesse utilizá-lo como substrato para seu crescimento.. que determina a concentração de açúcares redutores. Espectroscopia no infravermelho com transformada de fourier (FTIR) As análises FTIR foram realizadas em equipamento da Perkin-Elmer Spectrum One por reflectância difusa de 4000 a 100 cm-1.5h. ou seja.W. PEZZIN.L.3 Determinações analíticas Para as determinações analíticas. R. Foram determinados os açúcares redutores na solução para se conhecer a concentração de glicose. 2. Em seguida o meio foi neutralizado com uma solução de hidróxido de sódio (10%).C. Poli(3-hidroxibutirato-co-3hidroxivalerato) (Sigma) foi usado como padrão externo.. A partir do hidrolisado obtido. para que a bactéria R. A cultura foi realizada por um período de aproximadamente 28 horas. foi necessária a hidrólise do amido em glicose.4 Caracterização do polímero sintetizado Difração de raios-X (DRX) O difratograma de raios-X foi obtido em um Difratômetro de raios-X da marca SHIMATZU modelo XRD 6000 como fonte de radiação CuKα. A.. E.1 RESULTADOS E DISCUSSÃO Produção de P(3HB-co-3HV) Para realização do processo de produção de polihidroxialcanoatos utilizando o resíduo da indústria de arroz.P. produtividadepol=(polt-poli)/(tt-ti). FIORESE. para análise pelos métodos descritos abaixo. A amostra foi aquecida de 25 a 600°C a uma taxa de aquecimento de 10 °C min-1. n. As temperaturas de injeção.2 Fonte de carbono A fonte de carbono utilizada neste trabalho foi o resíduo da indústria processadora de arroz. 378 – 385.M. com a diferença que foram congeladas. 2. 380 . Análise térmica diferencial (DTA) e Análise Termogravimétrica (TGA) As análises de DTA e TGA foram realizadas em um equipamento NETZSCH – Gerätebau GmbH Thermal Analysis Proteus. pp.60°.P. respectivamente.. onde amostras de 2mL do meio de cultura foram centrifugadas e os pelets foram lavados duas vezes com água destilada e colocados em estufa a 100°C até peso constante. Os dados experimentais foram ajustados pelo software LISSAGE desenvolvido pelo “Instituit National des Sciences Appliquees de Toulouse”. 3 3. amostras foram retiradas a cada 2h. RAMOS. França.

378 – 385. observa-se que a partir do ponto de limitação. 2004. Da mesma forma. A produção de P(3HB) encontrada pelos autores foi de 5 g. com um conteúdo acumulado de 76.L-1.. PEZZIN. iniciou-se a fase de produção que teve a duração de 14h.M. M. No final da cultura. A produção de polímero por R. Rusendi e Sheppard (1995). Xr (—) e glicose ( ) em função do tempo. apresentando picos de difração em 2θ iguais a 13. Revista Matéria. v. eutropha é realizada em duas fases. 20. caracterizando o copolímero como o P(3HB-co-3HV).9% do total de células secas. Kim 2000) e resíduos contendo óleos vegetais e ácidos orgânicos (Tsuge. a concentração de massa celular total no meio foi de 7.L-1. Em trabalho semelhante. semelhante à encontrada por Aragão et al. caracterizando o polímero como semicristalino com grau de cristalinidade elevado.C.75 g. O perfil de difração é similar ao padrão mostrado por Kunioka (1989). P(3HB-co -3HV) (g. 8 Xt.5. R. Yu. a linha pontilhada representa o início da fase de produção de polímero.2 3.1 Caracterização do polímero obtido Difração de raios-X O perfil de difração de raios-X para o PHA sintetizado é mostrado na Figura 2.22 h-1.L-1 das concentrações de Xt ( ).L. 2001).P. n.F. da exaustão do nitrogênio. 16.RODRIGUES. RAMOS.L ) 7 6 5 4 3 2 1 0 0 4 8 12 16 20 24 28 Tempo (h) 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Glicose (g. R.03 g L-1. indicando que a partir deste momento. 4. Após a limitação. 2002.L ) -1 Figura 1: Evolução em g. como descrito neste trabalho.5. -1 381 . 2002.43 % de P(3HB-co-3HV). pp. 27 e 30. 22. a biomassa residual (Xr) permanece constante.A. tem sido motivo em várias pesquisas. o que representa 53.. ARNOSTI. sendo uma fase inicial de crescimento não limitado. mais especificamente a produção de polímeros biodegradáveis. ou seja. foi necessário o processo de hidrólise para a utilização deste subproduto como fonte de carbono pelo o microrganismo. Observa-se um perfil de difração misto entre P(HB) e P(HV). 9. 3. O conteúdo de 3-hidroxivalerato encontrado através da análise por cromatografia gasosa foi em torno de 8%. seguido da fase limitada com o acúmulo de polímero. A fase inicial de crescimento exponencial para a cultura estudada teve a duração de 14 h. Alguns dos principais subprodutos avaliados são. 25.2..17 g P(3HB-co-3HV) L-1 h-1. Xr. o aumento de biomassa é devido ao acúmulo de polímero. No momento da limitação. A velocidade de crescimento específica máxima (μmax) encontrada foi 0.. O aproveitamento de resíduos das indústrias de alimentos em processos biotecnológicos. G. P(3HB-co-3HV) ( ). o soro de leite (Marangoni et al.T. A produtividade de P(3HB-co-3HV) encontrada na fase de produção foi de 0. A.P. utilizaram o resíduo da indústria processadora de batata para a produção de P(3HB).9. ARAGÃO.W. Na figura 1.. tinha-se uma biomassa de cerca de 5.. FIORESE. O grau de cristalinidade do P(3HB-co-3HV). calculado por DRX ficou em cerca de 66 %. (1996) utilizando meio padrão (glicose/frutose). E.55 g L-1 e a concentração de polímero de 4.

observou-se que o copolímero sofre apenas um estágio de perda de massa. de acordo com o aumento da fração de 3HV a partir de 0 a 45 % mol (Kunioka & Doi. Revista Matéria. ARNOSTI. Análise térmica diferencial (DTA) e análise termogravimétrica (TGA) A curva de DTA para o PHA sintetizado (curvas azul) observada na Figura 4 apresenta temperatura de fusão (Tm) em 165 °C. R. 4. 3. A. v.. 9. estima-se que o teor de 3HV do copolímero sintetizado é de 7 a 9 %. RAMOS. PEZZIN. apresentando temperatura de início de degradação (Tonset = 217. E. 378 – 385. 1990). ARAGÃO.. o valor mínimo (cerca de 75°C) foi observado para o copolímero com 40% mol de 3HV. 2004. Comparando o valor de Tm encontrado para o nosso polímero com o gráfico de Tm x 3HV (%mol).2 Figura 4: Curva de DTA e termograma de TGA do copolímero sintetizado.C..T. enquanto que o P(3HB) apresenta Tm igual 177 °C.2. (1989).A. Pelo termograma da Figura 4 (curva vermelha). M. 382 .F. n. concordando com os resultados obtidos por CG...M. G.W.P. Sabe-se da literatura que os copolímeros P(3HB)-co-(3HV) apresentam valores de Tm que decrescem de 177 até 75°C.L. O valor de Tpeak foi determinado a partir da temperatura máxima do pico observado na primeira derivada da curva de TGA (curva preta).7 °C) e temperatura máxima de degradação (Tpeak = 231°C). Como reportado por Kunioka et al.P.RODRIGUES. 2000 1500 1000 500 0 10 20 30 40 50 60 Ângulo de Difração 2-theta Figura 2: Perfil de difração de raios-X para o copolímero P(3HB)-co-(3HV). pp. R.. FIORESE.

metabolism.51 515. 54 (4). para aumentar o conteúdo de polímero acumulado e melhorar a produtividade. 1232 e 1187 cm-1. Observa-se também bandas de deformação angular assimétrica e simétrica no plano dos grupos CH3 em 1458 e 1379 cm-1..91 895.56 2933. G.2.96 1458. 378 – 385.86 624. 1990. and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates.T.0 2975.79 2097. mostrou-se que é possível a utilização do resíduo da indústria processadora de arroz na produção de P(3HB-co-3HV). 9. Estes resíduos são matérias-primas com baixo valor agregado e de grande disponibilidade. DAWES.35 3975.87 929.. Neste trabalho.. n. 4. 50.08 2053.08 826. devido às ligações C-O-C (Pereira et al. RAMOS. 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] ANDERSON.W. Observa-se uma banda intensa e alargada em 1749 cm-1.86 1102.C. 450-472.96 1883. respectivamente e da ligação C-C em 980 cm-1. FIORESE. E.RODRIGUES..P. 383 . obtendo um conteúdo de polímero acumulado de 26. 2001).43 980. 5 AGRADECIMENTOS Os autores agradecem gentilmente o Professor Dr Sérgio Henrique Pezzin. ARAGÃO. o alargamento da absorção da carbonila em relação ao espectro do P(3HB) é devido à presença desta nos dois diferentes monômeros que compõem o P(3HB)-co-(3HV). R.P. v.7 48 46 44 42 40 %R 38 36 34 32 30 28 25. Microbiological Reviews.97 1299..0 3000 2000 cm-1 1500 1000 450. R.. estão sendo desenvolvidos.78 3. E. 4 CONCLUSÃO A utilização de resíduo de arroz como substrato na produção de polihidroxialcanoatos. A.88 1749.h-1.97 2557. devido às deformações axiais da carbonila (C=O). (2003).26 1062. onde se observam as deformações axiais assimétrica e simétrica da ligação C-H em 2975 e 2933 cm-1. J.. Espectroscopia no infravermelho com transformada de fourier (FTIR) A Figura 5 mostra o espectro de FTIR que o polímero sintetizado apresenta bandas características do P(3HB)-co-(3HV).A.L-1. A.4 4000.12 g.6% do total de massa seca. com uma produtividade de 0.16 Figura 5: FTIR do polímero sintetizado.44 3191.M.L.43 2230. A.89 1716. pp. ainda não foi reportada na literatura. Alguns sinais também podem ser observados em 1262. ARNOSTI. Occurrence.90 1232. PEZZIN. Estudos em maior escala (biorreator) e a utilização de processos em batelada alimentada. na fase de produção.75 2873..77 1135.3 2428. alta cristalinidade 66% e baixa estabilidade térmica.67 3436. O polímero obtido foi caracterizado por diversas técnicas e indica que é o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) com baixo teor de 3HV (cerca de 7 a 9 %).80 1934. Segundo Rosa & Pantano.95 2191.16 678.29 1803. do Programa de Mestrado em Ciência e Engenharia de Materiais da UDESC/ Joinville pelas análises.63 1379.33 1187.10 727. M. Revista Matéria. respectivamente.76 1262. 2004.F. que podem auxiliar na redução dos altos custos de produção dos polihidroxialcanoatos. metabolic role.

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