II 1.

2 Imunositokimia Semua kelas lekosit manusia menunjukkan antigen khusus ( CD 45 ) yang dapat dideteksi menggunakan antibodi monoklonal yang sesuai ( Mab; lihat Gambar 2.2 ). Dengan mengubah sifat antibodi pertama, tatacara umum ini dapat diadaptasi untuk mengetahui jenis – jenis lekosit lainnya seperti makrofag, neutrofil, sel B atau sel T. ///. 2.1 (I) Reagensia Dapar fosfat salin Dulbecco ( Dulbecco's Phosphate buffered saline/ PBS ). Unsur – unsur larutan dapar fosfat salin : CaCI2 2H2O KCI KH2PO4 MgCI 2.6H2O NaCI Na2HPO 4 Bubuhkan air sampai 1 liter (2) Dapar salin Tris (Tris Buffered Saline/TBS: larutan induk 10 x disiapkan dan diencerkan 1 : 10 segera sebelum pemakaian). Unsur-unsur larut an dapar salin Tris 10 x : BasaTrizma NaCI Bubuh kan air, atur pH 8,6 dengan 1 air sampai 1 lite
M

0.132g 0,2 0,2 0,1 8,0 g g g g

1.15 g

60,55 g 85,2 g HCI (mol/1) Bubuhkan

(3) Substrat fosfatase lindi disiapkan seperti yang diuraikan di bawah dan disaring. Unsur-unsur substrat fosfatase lindi: Naphthol AS-MX fosfat Dimelilformamid 0,1 M daparTris (0,1 mol/1) pH 8,2" 1 M Levamisol (I mol/1) 2 mg

0,2 ml 9,7 ml 0,1 ml

Garam Fast RedTR, dibubuhkan tepat sebelum pemakaian 10 mg
-

1,21 g basa Trizma dilarutkan dalam air, pH diatur 8,2 dengan 1M HC1, bubuhkan air sampai 100 ml. Antibodi pertama, antibodi monoklonal lawan antigen lekosit umum, berkode CD45 dan tersedia secara luas dan komersial. Antibodi kedua, Immunoglobulin anti-tikus (anti-mouse) diperoleh dari kelinci. Pengenceran yang dipakai akan tergantung dari titer antibodi dan sumber (contoh DAKO). pengenceran 1:25 antibodi Z259 buatan

(4)

(5)

(6)

Fosfatase lindi: kompleks fosfatase anti-lindi (anti-alkaline phos phatase complex (APAAP)). Kembali pengenceran akan tergantung pada titer antibodi dan sumber (contoh pengenceran 1:50 kompleks D651 produksi DAKO).

III. 2.2.

Penyiapan sel Tata cara

(i) Aliquot semen yang sudah mencair (mendekati 0,5 ml) dicampur dengan 5 volume dapar salin fosfat (PBS) dan disentrifugasi pada kecepatan 500 g selama 5 menit pada suhu ruang. Tata cara ini diulangi sebanyak 2 x dan pellet sel diresuspensi dalam PBS ke volume semula dari siapan semen. Suspensi tersebut kemudian dilarutkan dengan volume PBS 2-5 x tergantung dari jumlah sperma. Dua 5 ml aliquot sel ini selanjutnya dikeringkan di udara di atas kaca obyek bersih, difiksasi dan dipulas dengan segera atau dibungkus dalam kertas alumin dan disimpan pada suhu -70°C untuk analisis berikutnya. (ii) Sel-sel yang kering di udara difiksasi dalam aseton jenuh selama 10 menit atau dalam campuran aseton, metanol dan 400 g/l formaldehid (dalam perbandingan volumetrik 95 : 95 : 10) selama 90 detik, dicuci 2 x dengan dapar salin Tris (TBS;

lihat III 2.1.), dan dibiarkan kering.

(iii) Masing-masing aliquot sel-sel yaaig difiksasi ditutup dengan 10 µl Mab pertama dan dieram dalam kamar yang Iembab selama 30 menit, pada suhu kamar. Kaca obyek selanjutnya dicuci sebanyak 2 x dengan TBS dan dibiarkan kering. (iv) Sel-sel ditutup dengan 10 µl antibodi kedua, dieram selama 30 menit dalam kamar Iembab pada suhu kamar, dicuci 2 x dengan TBS dan dikeringkan. (v) Untuk masing-masing siapan ditambahkan 10 µl fosfatase lindi: kompleks fosfatase anti-lindi (anti-alkaline phosphatase complex) (APAAP) dan siapan dieram selama 1 jam dalam kamar Iembab pada suhu kamar sebelum dicuci sebanyak 2 x dalam TBS dan dikeringkan. (vi) Untuk memperkuat hasil reaksi, pemulasan dengan antibodi kedua dan APAAP dapat diulang, dengan waktu eram 15 menit untuk masing-masing reagensia. (vii) Sel-sel dicuci sebanyak 2 x dengan TBS, dikeringkan, dan dieram dengan 10 µl substrat fosfatase lindi selama 18 menit. (viii) Sesudah reaksi warna fosfatase lindi selesai, kaca obyek dicuci dengan TBS (Tris buffered saline) dan akhirnya dipulas untuk beberapa dctik dengan hematoksilin sebelum dicuci dalam air mengalir dan ditutup dengan medium penutup cair Apathy.

.2 Tatacara (i) Campurkan salu tetes (10. Buat larutan 0. yaitu 10% dalam akuades). IV.1.15 µl) semen segar dengan satu tetes larutan Eosin 0.2 menit amati siapan melalui mikroskop biasa atau beda-fase dengan pembesaran 400 x. Campurkan satu tetes semen dengan dua tetes 1% (10 g/1) Eosin Y.1 Reagensia (1) (2) IV.I. 2.1 Reagcusia Eosin Y (C. 45380. 50420. Nigrosin (C. 1. larutan pemulas baku dapat dibeli dari sejumlah perusahaan di beberapa negara.2 Eosin-nigrosin (modifikasi icknik Blom) IV.I Many a Eosin Eosin Y.45380) dalam larutan NaCl cair 0.Lampiran IV Teknik pulasan vitalitas sperma I V.5%(5 g/l) Eosin Y (C. 1. (ii) Setelah 1 . 10 g/1. (iii) Cacah sperma yang tidak terwarnai (hidup) dan yang terwarnai (mati) sesuai dcngan cara yang telah diuraikan. IV.2.I.2 Tatacara (i) (ii) (iii) Letakkan satu tetes campuran semen-Eosin-Nigrosin pada kaca obyek dan buatlah apusan yang kemudian dikeringkan.5% (5 g/I) pada kaca obyek kemudian tutup dengan kaca tutup. yailu 1% dalam akuades). Setelah 30 detik bubuhkan 3 tetes dari 10% (100 g/1) larutan nigrosin pada campuran (i) kemudian aduk. 100 g/1. apusan tidak boleh terlalu tebal. IV.9% (9 g/I).

dan kemudian difiksasi dengan etanol (lihat lamp. Tatacara ini dapat mcnyebabkan artefak morfologi akibat kerusakan osmotik sel-sel tersebut dan ekstrasi komponen oleh etanol.1).H2O. Kaca obyek dikeringkan dan dapat disimpan dalam lemari pendingin kurang lebih seminggu.I (1) Reagensia Dapar Salin fosfat (PBS). Pendekatan yang sering digunakan untuk mengurangi artefak yaitu dengan merendam sel-sel tersebut dalam larutan isoosmotik (atau memflksasi secara ringan sel-sel tersebut dengan fiksatifaldehid) dan lekatkan sel-sel tersebut pada kaca obyek berlapisan poli-satu-lisin. Kaca obyek berlapiskan poly-1 -lysine dibuat dari larutan poly-1 -lisin* dalam dapar salin fosfat dengan meletakkan 1 0 . biarkan kering. dengan membiarkan sel-sel terlepas dari larutan tanpa pengeringan yaitu inembentuk preparat basah.VII. PBS terdiri dari 0. adalah perlu melekatkan sperma pada kaca obyek.PO4.8 g Na2HPO4. V. . Metode yang lazim untuk melakukan hal ini adalah membuat apusan sperma di atas kaca obyek. Protokol khusus adalah scbagai berikut.7H2O dan 16 g NaCl. bubuhkan akuades sampai 2000 ml.Lampiran V Pemeriksaan morfologi sperma : preparat basah Untuk melakukan pencacahan beda morfologi sperma dari siapan basah. (2) Kaca obyek berlapiskan poly-1-lysine.8 g NaH.2 0 µl larutan di bagian tengah lingkaran kecil yang digambar dengan pensil batu intan di atas kaca obyek. 3.

(ii) Letakkan kaca obyek berlapiskan poli-1-lisin dalam ruang lembab (contoh : kotak kaca obyek dengan handuk tangan basah). .V. Waktu yang diperlukan untuk sel-sel melekat mantap ditentukan secara empiris untuk pertama kali tata cara ini digunakan. 10 menit sudah cukup.5. tetapi dengan volume sebesar 10 ml. Dibawah kondisi ini sperma tidak akan mengalami kejutan osmotik dan morfologi akan bebas dari artefak akibat persiapan. (iii) Biarkan sperma mantap dalam larutan dan terikat dengan kaca obyek. Sperma tersebut sekarang dapat dilihat dengan mikroskop beda fase.2) atau dalam PBS.2 Tatacara (i) Encerkan semen sampai 1 x 10 sel/ml dalam larutan pengencer sperma (lihat bagian 2. (iv) Setelah sperma mantap ditutup langsung dengan kaca tutup. Taruh 10 µl semen yang diencerkan dalam lingkaran kecil di atas kaca obyek dan titutup ruang tersebut.

9): 320 ml KH2PO.066 m (mol/l. 400 ml Na2HPO4. 7 ml Romanovski-Giemsa. Atur pH dengan NaOH kemudian bubuhkan akuades sampai volume mencapai 1 liter. 11. IV . (iii) Pulas dalam pulasan Giemsa selama 30 menit. Keringkan pada suhu kamar.2 Tatacara (i) (ii) Fiksasikan apusan yang telah kering di udara dengan metanol untuk waktu sedikitnya 5 menit.I Reagensia (1)Dapar fosfat 0.1 g/I. (v) Keringkan pada suhu kamar. 9. (2)Larutan Giemsa (harus dibuat setiap kali sebelum dipakai).Lampiran VI Pulasan Giemsa untuk sperma dan inti sel lain I V. (iv) Bilas dengan dapar fosfat. 160 ml dapar fosfat. t .9 g/I. pH 6.

VII. Teknik pemulasan inodifikasi yang akan diuraikan ini telah terbukti berguna dalam analisis morfologi sperma dan pemeriksaan sel-sel benih muda.5 menit 4 menit 1 celupan 10 celupan 10 celupan . Namun pulasan Papanicolaou baku yang biasa digunakan untuk sitologi vagina memberi hasil yang buruk jika dipakai untuk sperma.1 Pcmbuatan Siapan .5 menit 2 celupan 3 .Lampiran VII Tatacara pulasan papanicolaou yang dimodifikasi untuk sperma Pulasan Papanicolaou dapat membedakan dengan jelas komponen sel yang basofil dan yang asidofil sehingga memungkinkan suatu pemeriksaan yang terperinci terhadap pola kromatin inti. VII. Oleh karena itu metode ini telah lazim digunakan untuk sitologi diagnostik yang rutin. J Apusan harus dikeringkan di udara kemudian di fiksasi dengan Iarutan etanol 95% (950 ml/I) dan eter dalam jumlah yang sama selama 5-15 menit.2 Tatacara pemulasan Apusan yang telah difiksasi dipulas sesuai dengan tatacara di bawah ini : Etanol 80%'(800 ml/I) Etanol 70% (700 ml/1) Etanol 50% (500 mi/I) Akuades Hematoksilin Mayer atau Harris Air mengalir Asam etanol Air mengalir Lanitan scotf Akuades Etanol 50% Etanol 70% 10 celupan 10 celupan 10 celupan 10 celupan 3 menit tepat 3 .

Pulasan dan larutan: Pulasan jadi Papanicolaou (EA-50 dan Orange G6) dapat dibeli.1 Susunan EA-36 sama dengan EA -50: EosinY (C.I.1. sebagai berikut: VII.0 • • Satu celupan kira-kira sama dengan satu detik. 3. pH harus 7.Etanol 80% Etanol 90% Orange G6 Etanol 95% Etanol 95% EA-50' Etanol 95% Etanol 95% Etanol 95% Etanol 99. dengan ongkos yang jauh lebih murah.4) digunakan jika air ledeng terlalu 'keras'. • lOcelupan 10 celupan 2 menit 10 celupan l0 celupan 5 menit 5 celupan 5 celupan 5 celupan 2 menit 1 menit dalam tiap bak Ganti silol jika rupanya berubah seperti susu. Larutan scott (lihat bagian VII. Penisaliaan yang sama biasanya juga membuat siapan hematoksilin. 21000) Akuades Etanol 95% Asarn fosfotungstat 10 g 10 g 10 g 300 ml 2000 ml 4g SF Hijau muda.3. 45380) Bismarck Coklat Y (C.I.3 Pembuatan pulasan Pulasan jadi yang dapat dibeli biasanya cukup baik tetapi pulasan dapat juga dibuat di laboratorium.1 Tatacara . kekuning-kuningan (C. 42095) Larutan litium karbonat jenuh (dalam akuades)0. Tutup siapan dengan Periksa keasaman ai r sebelum inembuat berbagai larutan etanol.I. • VII. 3.5% Silol (3 wadah pemulasan) kira-kira Depex atau medium scnipa.5 ml VII.

5 ml larutan litium karbonat jenuh.Larutan induk: (i) Buat larutan 10% (100 ml/1) dari tiap pulasan sebagai berikut: 10 g Eosin Y dalam 100 ml akuades. (iii)Tambahkan etanol 95% sampai 2000 ml. (iv) Aduk yang baik dan simpan dalam botol berwarna coklat tua yang tertutup rapat pada suhu kamar. . bubuhkan 4 g asam fosfotungstat dan 0. 10 g SF hijau muda dalam 100 ml akuades. Larutan tersebut stabil untuk 2 . Sebelum dipakai larutan harus disaring terlebih dahulu.3 bulan. (ii) Untuk membuat 2000 ml pulasan. 10 g Bismarck coklat Y dalam 100 ml akuades.5 ml Hijau Muda SF. campuran induk di atas sebagai berikut: 50 ml Eosin Y. 10 ml Bismarck Coklat Y 12.

3. (ii) (iii) Saring sebelum digunakan.15 gram asam fosfotungstat pada 1000 ml lamtan induk no.VII.5% (5 ml/I)).1.2.3 Susunan heniatoksilin Harris tanpa asam asetat (kristal gelap: C. Larutan induk no. 3.1 Tatacara Larutan induk no. 2.I. Pembuatannya sebagai berikut: (i) (ii) 50 ml lamtan induk no. Aduk yang baik dan simpan dalam botol berwarna coklat tua bertutup pada suhu kamar. Kocok yang baik kemudian simpan dalam botol berwama coklat tua pada suhu kamar selama satu minggu sebelum dipakai. Untuk pembuatan 1000 ml lamtan kcrja dari pulasan: (i) Bubuhkan 0. 16230) 10 g Akuadcs 100 ml Etanol 95% 100 ml Asam fosfotungstat 0. VII.3 bulan.2 Susunan Orange G6 Kristal Orange G (C.75290) 12H2O 8 80 160 1600 6 g ml g ml G Hematoksilin Etanol 95% AlNH4(S04)2 Akuades HgO . I Buat larutan cair 10% (100 ml/1) sebagai berikut: (i) (ii) Masukkan 10 g kristal Orange G kc dalam 100 ml akuadcs.15 g VII. Larutan kerja stabil untuk 2 . 2 (larutan Orange G6 0. 3. 1 dibubuhkan etanol 95% sampai 1000 ml.

VII.1 (i) Tatacara pembuatan campuran pemulas Larutkan alumunium sulfat dalam akuades dengan pemanasan. Angkat larutan dari pemanas dan sambil mengaduk bubuhkan oksida (ii) Larutkan (iii) (iv) Panaskan campuran sampai 95° C. Bubuhkan larutan hematoksilin ke larutan amonium sulfat. Larutan scott harus sering diganti. (v) merkuri secara perlahan-lahan. yaitu setelah dipakai untuk membilas 20 . kristal hematoksilin dalam etanol 95% (950 ml/1). 3. Warna lanitan akan menjadi ungu tua. 3.4 Susunan lanitan Scott NaHCO3 MgSO4. (vii) Simpan dalam botol berwania coklat tua pada sulu kamar selama 48 jam.7H2O Akuades 3.VII.25 siapan. 3.5 Susunan larutan etanol asam Etanol 99.5 g 20. (vi) Masukkanlah segera wadah itu ke dalam bak air dingin kemudian saring lanitan tersebut setclah dingin. VII.5% HCI pekat Akuades 300 ml 2.0 g 1000 ml Larutan scott hanya dipakai jika air Iedeng biasa 'keras'. (viii) Encerkan sejumlah yang diperlukan dengan sejumlah akuades yang sama dan saring kembali.0 ml 100 ml .3.

Setiap celup lamanya kira-kira 1 dctik.2celup Alirkan lambat-lambat • Ganti setelah dipakai 30 siapan.LAMPIRAN VIII Pulasan Bryan-Leishman untuk apusan morfologi sperma Catalan: Pakailah apusan baru yang dibuat dari siapan segar. Alkohol formalin 10% (100 ml/I) 1 menit Buat baru scliap kali Etilalkohol 80% (800 ml'!) 5 menit Buat baru sctelah 3 kali pemakaian Etilalkohol 70% (700 mi l ) 5 menit Buat baru sctclah 3 kali pemakaian Etilalkohol 50% (500 mi l ) 5 menit Buat baru sctclah 3 kali pemakaian Alfa-naflol 4 menit Buat baru sctclah 3 liari (Bubuhkan 0.8). biihuhkan 100 ml dapar (pl( 6. kemudian saring kcmbali scsaat scbclum dipakai).4 ml hidrogen pcroksida 3% (30 ml/I) kepada 200 ml alfa-naflol sesaat sebelum pemakaian: larutan itu akan aktifsclama 3 hari pada suhu kamar). Air Icdeng mcngalir I'ironin Y Air Icdeng mcngalir Dapar natrium siiral Akuadcs pulasan Pryan dimodillkasi 5 menit 4 menit 3 cclup 3 menit Alirkan lambat-lambat Buat baru sctiap minggu Alirkan lambat-lambat pH 7. jika anda memakai gelas pulas yang diisi dengan 30 pulasan. Air Iedeng mengalir Keringkan diudara (jangan gunakan kcrtas saring untuk nicngeringkan) l. dikeringkan di udara di atas kaca obyek yang bersih.5: dibuat baru setiap kali pemakaian Seliap kali baru Muat baru sctiap 2 kali pamakaian Alirkan lambat-lambat Alirkan lambat-lanihat Dtbuat baru sctiap kali pemakaian I menit yang 15 menit Asam asctat glasial l 2 celup %(10m!'l) Air Icdeng mcngalir I menit Dapar dan pulasan 30 menit leishman (Saring 80 ml larulan induk Leishman. • .

pulasan Bryan dan Leishman yang telah modifikasi harus disaring . (1) Pironin Y.I Perhatian khusus sebelum dipakai. Selain itu dapar dan larutan kerja Leishman harus disaring setiap kali akan dipakai untuk menyingkirkan endapan pulasan.VIII.

(iii) Saring sebelum dipakai. oleh karena itu larutan induk harus disimpan di dalam botol berwarna coklat tua dan di tempat yang gelap.10316) 1500 ml 0.5 g Hijau (fast green FCF) (C. (iv) Setelah masa tersebut. 42053) 0. (3) Hidrogen peroksida cepat rusak di tempat terang. 2. Periksalah intensitas yang diinginkan dengan mikroskop sebelum siapan ditutup.2 (i) (ii) (iii) Campur 0. Dapar . Setelah matang pulasan dieram dalam inkubator pada suhu 35°-37°C selama dua hari.(2) intensitas warna akhir dapat diperkuat dengan cara memulas lebih lama di dalam pulasan Leishman dalam dapar atau dikurangi dengan cara mencuci berulang kali.1 (i) Pembuatan larutan: Pulasan Bryan yang dimodifikasi Campur zat berikut ini: Asani asetat glasial 1% EosinY(C. 1.52015) Aduk yang baik dan biarkan menjadi matang di tempat gelap pada suhu kamar selama tujuh hari. C.5 g (iii) Aduk yang baik kemudian simpan dalam botol yang tertutup rapat. (4) Larutan induk pulasan Leishman harus dimatangkan sebelum dipakai dengan cara menyimpannya selama 7 hari pada suhu kamar dilanjutkan dengan mengeramnya pada suhu 25° . VIII. Larutan tersebut dapat diperoleh dari berbagai perusahaan kimia.2 VIII. 1. 2. serta jauhkan dari panas dan cahaya. Larutan yang telah matang akan stabil selama satu bulan jika disimpan di dalain wadah yang tertutup dan di ruang gelap.I. Waktu pemulasan harus disesuaikan untuk memperoleh hasil yang sama. Pemulasan dengan pulasan Jenner atau Wright dilakukan pada tahap pemulasan dengan pulasan Leishman. Larutan induk pulasan darah Leishman dan 300 ml metil alkohol absolut.I. VIII.5 g 0. Larutan induk pulasan darah lain yang dapat dipakai sebagai pengganti larutan Leishman ialah pulasan darah Jenner atau Wright.5 g metilen biru eosin (campuran eosin Y dan metilen biru.45380) Naftol kuning S (C.37° C di tempat gelap selama dua hari. maka larutan induk siap pakai dan harus disimpan di dalam botol tertutup rapat yang berwarna gelap.

periksalah kembali pH sebelum dipakai. . Jika tidak segera dipakai.8 dengan 200 ml akuades. pH 6.Campur 2 tablet dapar.

.

2 ml larutan hidrogen peroksida 3%.8 segera sebelum pemakaian. .5.I. 4 ml anilin. 2. dan 96 ml etilalkohol 40%.1 g pyronin (C. Jika perlu dapat dibubuhkan 0.1 g kalsium asetat setiap 200 ml larutan untuk menjamin agar pH netral (7. Formalin alkohol: Campur 10 ml larutan fomaldehid 37% dengan 90 ml etilalkohol 95%. (iv) Pyronin Y: 0. 45005).0). Sesaat sebelum pemakaian bubuhkan 0. (v) Dapar natrium sitrat: Campur 7 g natrium silrat dengan 1 liter NaCI 0. (iii) Alfa-naftol: Larutkan 1 g alfa-naftol dalam 100 ml etilalkohol 40%.3 (i) (ii) Larutan kerja pulasan darah Leishman Campur 80 ml larutan induk yang telah disaring dengan 100 ml dapar dengan pH 6.9% kemudian atur pH sehingga menjadi 7.VIII.

Germany. (2) IX.0 ml Asam asetat glasial Larulkan bubuk dalam alkohol hangat dan biarkan rnendingiii Bubuhkan dengan asam asetat di dalam kap penguapan dan saring.3 (1) 1 2 . Darmstadt. Ref (2) Amonium alkohol 95 ml etanol 75% + 5 ml amonium hidroksid 25% (250 ml/1) Larutan Shoor (Merk. 1 (Merk. 2. Tatacara pcmulasau Air mcngalir Hcmatoksilin Air mcngalir Amonium alkoliol Air mcngaiir 50% ml/I) Pcmulas Shorr 50% ctanol 75% ml/1) 95% ml/1) Etanol jcnuh Xylol IX. Rcagcnsia Hematoksilin erence 9253) Papanicolaou No.Lampiran IX Pulasan Shorr untuk aptisan morfologi sperma.1 5 cclupan 112-15 celupan 2 J mcnit 5 tcmpat masing-masing 5 mcnit 12-15 cclupan 5 mcnit 3 . 220 ml Etanol 50%.5 mcnit 5 mcnit 5 mcnit Etanol (500 ctanol ctanol (750 (950 5 mcnit 2 tcmpat masing-masing 5 mcnit 2 tempat masing-masing 5 menit. I (1) I'enyiapan apusan Apusan dibuatdari 20 (alsiapan (50-100 x 10*spcnnatozoa/ml)diatas kaca obyek bcrsih dan biarkan mcngcring.2. (3) 63 . IX. Reference 9275) atau bubuk BDH Shorr 4 gr. Fiksasi apusan dcngan 75% ctanol (750 ml/1) untuk kira-kira 1 mcnit.

Untuk tiijuan penapisan. O. "Bronson.5114.Clarke.A. -12:171-183.6H 2O NaCl NaHCO 3 Glukosa (g/1) 0..R.0 2. _. yang akan mengidentifikasi semua 'isot\pe'. Masukkan butir imun kcdalam 10 ml dapar I (lihat bawali) dan simpan pada siilui + 4°C. CA 944806.A.& Rosenfcld. 1 (1) Lampiran XI Uji Butir intuna Rcagcnsia Butir Imun: Bulir imun anti-IgG.2 0.7H. anti-IgA dan anti-IgM dapat diperolch dari Bio-Rad Laboratories (Bio Rad Chemical Division. dan -5 120sccara bcninitan).O 0.5106). D. butir-butir koinbinasi ant i-Ig (170 .2 0. Cooper. USA) (Katolog Nos.2 0./rer////(y and Sterility.N. " (2) digunakan. Bron.'ion.HPO.( 1990) Detection ofantisperm . . Dapar induk: Lanitan Tyrode alau PBS Dulbecco dapat 15111 Larutan Tyrodc CaCl2 X KCI NaH 2PO4 MgCl. dapat digunakan.O.1 0.0 PBS dulbecco (g/1) CaCI. San Pablo Avenue.. 9:61. & Rosenfcld. Archives of'Andrology.O NaCI Na.2 0.D. KCI KH2PO4 MgCI2.(1984) Sperm antibodies: their use in infertility.2 8.0 1. Richmond.6H..W..(1982) Detection of sperm specificanlibod-ics on the spermatozoa surface by iinmunobcad binding.G.. R. Coopcr. Campuran ini dapat disimpan selama satu bulan.W.66 XI.05 0.1705100.16 Larutan hams disaring dengan filter milipor (pori 22 inikroinetcr) scbelum dipakai.1 8.0 1.

Boca Raton. I n H a ndbook ofthe Laboratory Diagnosis Treatment of Infertility^.192.a n t i b t > d i e s u s i n g i m m u n o b e a d s .Keel & B. . Webster. 177 .W. CRC. B A. pp. Florida.

10 inenit.4% (4 g/1) albumin seaun bovine (BSA: Cohn fraction V). masukkan 0. Resuspensi dengan hati hati pellet spenna dengan dapar II ke volume cairan scmula. (v) Tabling (tabling) butir imun: tuang dan buang cairan yang di atas. Bubuhkan 5 yi\ suspensi spenna yang telah dicuci pada masing-masing tetesan butir dan aduk mcrata dengan menggunakan ujung pipet atau tepi kaca tutup.2 ml suspcnsi butir induk ke 10 ml (ii) Masukkan ke dalam tabling scntrifus tcrscbut jumlah semen yang dipcrkikan kemudinn bubuhkan dapar I schingga volume menjadi 10 ml. (5) XI. (vi) Tabling (tabling) spenna: tuang dan buang cairan yang di atas.8 1.0 g BSA ke dalam Iarutan dapar induk sehingga volume mencapai 100 ml.0 (iii) Sctrifiigasi tabling tabling tersebut pada 500 g selamaS . (4) Dapar II: berisi 5% (50 g/l) BSA.1 0 inenit.22 fim atau 0. (iv) Tabung(tabung) spenna : tuang dan buang cairan yang di atas (supernatant).%° > 40 <40 >40 <40 "Lihat bagian 2. masukkan 0.4 0. (vii) Letakkan 5 fil tetesan setiap tipe but ir imun di atas satu atau lebih kaca obyek. Resuspensi dengan hati hati pellet spenna dengan 10 ml dapar I yang barn dibuat dan sentrifugasi lagi dengan kecepatan 500 g selama 5 . Letakkan kaca tutup berukuran 20 sampai 24 nun2 pada setiap campuran dan setelah dibiarkan selama 10 menit .2 -' 0. Resuspensi dengan hati hati butir-butir tersebut dengan 0. Scimia lanilan hams disaring dengan filter milipor 0.4.45 (im sebcliiindipakai Tatacara dapar I dalam tabling sentrifus bagian dasarnya bcrbcntuk kcrucut yang terpisah. Jumlah semen yang dipcrhikan ditcntukan olch jumlah dan motilitas spemia scsuai tabcl bcrikut ini: Jumlah (106/ml) >50 20-50 20-50 20 20 Motilitas (katcgori (a)+(b).2 ml dapar II. masukkan 5.2 (i) Untuk sctiap tipe butir iimin.2 Semen yang dipcrhikan (ml) N 0.0 2.4 g BSA ke da lain Iarutan dapar induk schingga volume meacapai 100 ml.(3) Dapar I: berisi 0.

■ 67 .

Sennn ini dibuat sesuai dcngan XI.1 dapar II dan kemudian campur dengan 50 y.i klinis.3 dan diperiksa bersamaan dengan pelaksa-naan tiap uji. ckor. Kontrol positifdapat dibuat dengan memakai sennndari donor (misal. Cacah sekiirang-kurangnya 100 spenna motil per siapan.3 Uji butir imun tak lan^sunj^ Modifikasi ini dipakai untuk mcndctcksi apakah ada antibodi antispcnna dalam sennn. Spenna kemudian dicuci dua kali lagi Enccrkan 10 jjlcairan Spenna donor nonnal dicuci qua kali dengan dapar I . Uji dianggap posilifjika 20%alau lebih spcnna motil yang dilekati butir dan bcrmakna sccara klinis jika 50% atau lebih spenna motil disclubungi butir. atau ujung ekor). bagian tcngali. Ikatan yangtcrbatas pada ujungekortidak dianggap bcrmakna sccar. (iv). (iv) dan (vi) dan ujrtlilakukan seperti pada langkah (vii) darw(viii). Catat kclas (igG atau IgA) dan lctak pcrlekatan butir imun pada spenna (kcpala. (iii) uji dcngan 40 (j.akukan uji hams dilakukan kontrol positif dan negatif. atau getah servik larut dalajn brornclin. (iv) seperti pada XI. pria yang telnh vasektomi) dengan titer antibodi sperma serum yang tinggi yang ditentukan dengan uji butir imun tak langsung. (iii).] suspensi spenna yang telah dicuci. dan vi) di atas. (i) seperti yang dijelaskaii dalam XI. amati mcnggunakan mikroskop beda-fase dcngan pcinbcsaran 400 x sampai 500 x. Eram pada stihu 37°C sclama satu jam. (ii) Jumlah spenna yang telah dicuci kemudian disesuaikan sehingga dicapai jumlah 50 x lOVml dalam dapar II.2 langkah (iii). plasma semen. (viii) Skor secara tcrpisah pcrscnlase spcnna motil yang dilckati butir iinun dalajn siapan. XI.2 langkah (ii).4 Kontrol Setiap kali me'. XI.68 dalam ruangan yang lembab.

Lampiran XII Uji MAR Karena aiitibodi IgA hainpir tidak pernah timbul taiipa antibodi IgG. Tetesan semen dan partikel terlapis IgG dicampur tsrlebili dahulu. dan 10 p. Pada pemuilaan sperraa motil akan tampak berenang dengan dilekati sedikit atau segumpal partikel. suatu bukti bahwa siapan efektif. USA). Pada uji MAR (Ortlio spenna MAR kit dari Fertility Technologies Inc.1 antiserum terhadap IgG manusia (dari Hoechst Behring ORCM-0/05. 10 \i\ partikel lateks yang dilapisi IgG (dari Fertility Teclmologies Inc. maka partikel lateks akan tampak melekat pada spenna motil. maka sebagai metode penapisan mtin culcup untuk melakukan uji terhadap IgG saja. MA. dan kemudian tetes antiserum dicainpur dengan memakai suatu kaca tutup besar (40 mm x 24 mm) yang kemudian diletakkan di atas campuran. Jika tidak ada antibodi pelapis spenna.1 semen segar tidak dicuci. 69 . Persentase spenna motil yang dilekati partikel dihitung. yangdilakukan sebagai berikut: 10 (j. Akhiniya gumpalan partikel akan menjadi sedemikian besarnya sehingga spenna yang dilekati partikel partikel hanya dapat bergerak di tempat saja. Paling sedikit 100 spenna motil yang dicacah.) atau sel darah domba yang dilapisi IgG. Natick. atau Dakopatts A089. Jika ada antibodi spenna. maka spenna akan terlihat berenang bebas di antara partikei-partikel. yang akan berlekatan satu sama lain dalam bentuk kelompok. Setelah 2 sampai 3 menit dan sekali lagi setelah 10 menit siapan basah tersebut kemudian diamati dengan mikroskop biasaatau beda-fase dengan pembesaran 400 x atau 600 x. Denmark) diletakkan di atas kaca obyek.

ih dikcmbangkan imtuk pcncntuan scng dalam scnun.Stabilitas rcagcnsiu Pada suhu di bawah 25"C kit reagcnsia stabil imtuk bcberapa taluin {kit dapat dibcli dari: WakoPurc Clicinical Industries Ltd. cairan otak dan urin. KM35-440. <(>. International Journal of Andralngy. Plasma semen kemudian dituang ke tempat lain dan diencerkan 1 : 200 (yaitu 10 (j. Barn-barn ini.1 plasma semen dibubuhkan kepada 1.4 I'cmbuatan siapan Siaprn semen discntrifugasi sclama 20 menit pada 2000 g. uilai kadar scng yang dipcrolch dcngan cara ini dan yang dipcrolch dengan cara spcklroskopi absorbsi atom mciuinjukkan ada suatu korclasi yang baik antara cara ini dan cara spcklroskopi absorbsi atom.70 XIII.2 . XIII. . Catatan: Langkah pengendapan protein dcngan asam triklor asetat (TCA) tidak perlu karcna plasma semen tclali diencerkan banyak sckali sebelum reagen wania dibubuhkan. plasma.3 I'cmbuatan dan stabilitas larutan kromogen Campurreagcn wania A dan wania B dcngan pcrbandingan 4: I (yaitu 20 ml reagen wania A dan 5 ml reagen wania B). R (1987) Evaluation of a commercially available kit for the colonmclric determination of zinc in human seminal plasma. Lampiran XIII Pengukuran seng dalam plasma semen Latar bclakang Assay kolorimctrik mi icl. Lanitan kromogen ini jikan stabil untuk sntu minggu pada sului 2 . <fc Eliassnn.10"C atau dua hari pada suhu kamar.).99 ml akuades)." XIII. XIII. " Johnson. scliingga cara ini dapat dianjurkan iintiik digunakan di laboratorinin yang tidak mcmpunyai pcralatan spcktroskopi absorbsi atom. Campuran tcrsebut hams disimpan dalam Icmari pembeku (freezer) sampai saat akan dilakukan analisis.

5 ml plasma semen yang telah diencerkan.6 mikromol/1. (2) (3) Bubiihkan 2.7 Pcrhitungan Kadar seng dalam plasma semen dihitung berdasarkan nimus: A siapan Kadar seng (mmol/l) = —■—~~ A baku dimana 30.XIII. Ukur absorbansi dalam waktu satu jam pada 560 nm dcngan menggimakau nilai lanitan blangko sebagai acuan.8 71 Nilai normal 2.6 Tatacara assay Panjang gelombang Kuvet Suhu pengeraman 560 urn Tapak jalan caluiya 1 cm 20°-25<>c (1) Isi ke dalam tiga tabling reaksi masing-masing 0.6 x 200 -—---1000 dalam mikromol/1 dan 200 adalah . Hubungan antara absorbansi {A) dan kadar seng dalam plasma semen akan menipakan garis liuiis sampai sedikitnya 7 mM (mmol/l).5 ml air (sebagai blangko).5 ml lanitan baku.6 adalah kadar seng baku faktor pengenceran plasma semen.5 ml lanitan kcrja kromogen ke dalam tiap tabling. XIII. dan 0.S Seng baku Seng baku disediakan oleh penisahaan pembuat kit sebagai Ianitan yang mengandung seng 30. X 30. Campiiryangrata. t XH1. 0.4 (iinol atau lebih setiap ejakulat. kcmudian biarkan lanitan pada suhu kainarselama 5 menit. XIII.

i XIV.2 Ekstraksi (i) BubulikanO.CI2 kcpada lanitan tri-ctanolamin. Botol 2 (liase sitrat): Buat larutan 2 dcngan nicmbtibuhkan 0. 1. tclali lanit.20° C (stabi! selama 4 minggii).I XIV I. .2.l ml plasma semen ke dalam 4. AturpH scliingga menjadi 7.2 DaparTRA(pH7J) (i) Larutkan 14.3 ml akuadcs. (iii) ZP.Lampiran XIV Penentuan asani sitrat dalant plasma semen XI V. jika perlu bubuhkan NaOH agar menjadi lebih lindi. Ekstrak hams tampak jeniih.5 g natrium azida. (iv) XIV. Paslikan balnva sclunih ZnCI. U9706 (metnch ultraviolet) Satu kit cukup untuk 30 pcmcriksaan.9 g tri-ctanolamin dalam 750 ml akuadcs.1 (1) (2) Roa«cnsia Boehritiger Kit No. simpan pada suhu . pH hams lcbili besar dari 7.6 dcngan cara mcmbubuhkan HCI pckat (ii) Lanilkan 0. XIV.95 ml asam triklorastctat (TCA) 15%(150ml/L). 2.027 gZnCI2 dalam 250 ml akuadcs. (ii) ml 6M NaOH. Kit bcrisi: Botol 1 (scbagiajibcsarNADH):Bi:atlanitan 1 dcngan nieinbiibiihkan 12 ml akuadcs.75 XIV. Bubuhkan 0.20" C (stabiI sclama 4 minggu).2 Tatacara Sentrifugasi ejakulat pada 3000 g sclama 15 mcnit atau pada 2000 g sclama 20 mcnit. simpan pada suhu .1 Persiapan plasma semen Bubuhkan lanitan Bubuhkan 0.

5 ml lanitnn 1 2.) 6.3 ml dapar TRA 0. Absorbansi Bubuhkan 20 y.3 Pengukuran (i) Bubuhkan stiatu kuvet pengukur dengan: 0.A.2 ekstrak plasma semen (ii) Campurdan ukur absorbansi pada 340 nm. (iv) Campur dan Ukur absorbansi.-^x139 t XIV.\ lanitan 2. Absorbansi Ar Ar (iii) XIV. extinction' x 3. 2.4 Nilai Normal 52 timol atau lebih setiap ejakulat.2 m l Pcngcnccran absorbansi =______'_ x 58 x _______ . (v) Pcrhitungan Kadarasain sitrnt dalam mM (mmol/1) =-----------------------------x Pcngenceran ekstrak Koefisien (A.XIV. .02 m l 0.3 = 04.3 73 tunggu tcpat 5 menit.

pipet 20 (al plasma semen ke dalam 20 ^1 lanitan sodiumbisulfat dalam sebuah tabling Eppendorf(pHcampuran harus diantara 5 dan 6) untuk menstabilkan asam fosfatase selama penyimpanan pada suhu kamar untuk beberapa jam.il substrat per pengukuran.20° C untuk beberapa bulan.73 g asam sitrat bcbas air dalam akuadcs. larutan induk untuk kurva baku. Hitting volume substrat yang dipcrlukan dan larutkan jumlah garain disodium/>-nitrofenol fosfat yang dibutuhkan dalam dapar sitrat sampai kadar 4 ing/ml (100 f.1 M NaOH. Larutan (substrat)/?-nitrofcnol fosfat. dan jadikan 100 ml dalam labu ukur simpan pada suhu 4° C. (i) Tidak lebih dari 30 menit setelah pencairan. 12 g/l air) Mctode g selama 10 menit untuk memisahkan spenna.000 kali untuk assay.2 2 . W (1979) Acid Phospatase in seminal fluid: Method of estimation and diagnostic significance. (2) (3) 0. atau pada suhu .H.09 m (mol/l) dcngan pH 4. yaitu untuk siapan yang distabilkan (sudah diencerkan 1 : 1). 5 mm (mmol/1).8.2.74 XV.5 "Modifikasi dari Heite. Larutkan 0.0695 g PNP dalam akuadcs. 11 : 1 1 3 . (1) Lampiran XV Pengukuran asamfosfatase dalam plasma semena Regcnsia Daparsitrat. encerkan 10 u. Dibuat setiap hari. Jika siapan tidak diassay dengan segera. Encerkan plasma semen 10. panaskan lanitan jika pcrlu.0. Andrologia. Wetterner.1 dalam 0. atur pH sampai4. Larutkan 1. (4) /7-Nitrofcnol (PNP). 0. sentrifugasi ejakulat pada 300 (ii). contoh 8 mg dalam 2 ml lanitan untuk pengukuran duplikat dari 8 siapan dan satu blangko) atau gunakan tablet Sigma 5 mg jika penimbang jumlah kecil substrat yang akurat tidak ada.I. (5) Sodium bisulfat (NaHS04.8dengan 1 mNaOHdanbubuhkanairsainpai lOOmlsimpan pada suhu 4° C. pada suhu 4°C untuk beberapa hari. H g A. XV.

Nilai normal 75 = 200 U per ejakulat atau lebih. Siapkan dan baca PNP kurva baku tepat sebchun pembacaan siapan-siapan. 20.1 M (mol/l) NaOH (lanitan ini adalah 100 fiMyaitu umol/l). (v) Hcntikan rcaksi cnzim dengan membubuhkan 1 ml Ianitan NaOH dan baca absorbansi pada 405 nm tcrhadap assay blangko. ambil dua campuran (pools) plasma semen yang distabilkan. . satu berisi aktivitas fosfatase asam tinggi dan lairmya dengan aktivitas asam fosfatase rendah yang telah diassay sebelumnya. Tabung-tabung tanpa siapan juga dicram sebagai blangko.20° C.S)x FinU/ml = (A + .1M NaOH untuk rnendapal-kan baku dari 0.10 + 30 x 10000 Aktifitas asam fosfatase daiam plasma semen = (A -r.volume siapan + 30 menit x faktor pengencer plasma semen = 1110-=. (Pcmakaian tartrai untuk membedakan asam fosfatase lairmya dari cnzim prostat secara uimim tidak perlu dikarenakan aktivitas yang sangat tinggi enzim tcrscbut).iM dan baca absorbansinya. Absorbansi bersih siapan (A) = absorbansi yangdiukur-absorbansi blangko. Faktor (F) = totai volume pengeraman •*. simpan pada suhu . Masukkan 400 ^15 mM (mmol/1) Ianitan induk ke dalam labu ukur dan buat menjadi 20-ml dengan 0. (iv) Masukkan 0. j Larulkan 100 mm lanitan ini dengan 0. Bubuhkan siapan yang diencerkan dan eram pada suhu 37° C selama 30 menit tepat.1 ml ianitan snbstrat pada masing-masing tabling assay-dan panaskan selama 5 mcnit pada suhu 37° C. 80 dan 100 f.60. encerkan kedua campuran dan assay bcrsamaan dengan siapansiapan. Slope kurva baku (S) = absorbansi unit per \iM.40.V)x F+ 1000 U/ml = (A -filx 37 U/ml Total aktifitas = U/ml x volume ejakulan dalam ml = U per ejakulat.ml dapar sitrat dan selanjutnya encerkan 10 fil dari pengenceran ini ke da I am 1 ml dapar.3 Pcrhitungnn 1 unit asam fosfatase = I ftmol PNP yang dihasilkan per menit pada suhu 37°C. XV. (iii) Untuk mengontrol assay.

(5) Larutan kerja fruktosa haku: Pada hari akan dilakukan analisis.9 ml akuades.3 ml seng sulfat 1. Reagen lndol.8% ke dalam tabling di atas . (v) pada 2000 g selama 20 meuit. Biarkan tabling selama 15 menit kemudian scntrifugasi Gunakan 0. M.28 mM dan 0.Lampiran XVI Penentuan fruktosa dalam plasma semen manusia0 XVI. Bubuhkan 200 mg asam benzoat kcpada panas(kira-kira60°C).2 ml NaOH kemudian adtik yang rata. Lanitan kcmudian disaring dan disimpan pada 4°C.l'M (3) akuades.2 (i) Pcrsiapan plasma semen Encerkan plasma semen menjadi 1 : 50dcngancara mcmbubuhkanO.4 mg fruktosa dilanitkan ke dalam 100 ml akuades. dengan cara mcngocoknya dalam bak air 25 mg iudol. I (1) Rcagcnsia ZnSO4. Jikasclunih asam bciizoattclahlanit.5 ml dari cairan supernatan jemih untuk (Total pengenceran plasma semen adalah 50 x (1 + 0. yaitu 75 kali).S%(l.1 ml. (4) Larutan indukfruktosa bakti (2. Dapat disimpan dalam keadaanbcku dalam siapan yang sesuai. "Karvonen. 100 ml bubuhkan (2) NaOH0. XVI. MJ.& Malm. (iii) kemudian diaduk.3 + 0.14 mM. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. kemudiaii laniikar.O l. (1955) Colorimetric determinalion of fructose with intlol. satu bagian laaitan induk dicnccrkan mcnjadi masing-masingO. 7:305 -307 Bubulikan 0. 1 ml semen kepada 4. (iv) Bubuhkan 0.8 niM): 50.2) ml -s.7H. (ii> Masukkan 1 ml plasma semen yang telah diencerkan ke dalam tabling sentrifus. (vi) analisis.

5 ml reagen indol dan 5.28 mM.XVI.2).S'.5 ml dari 0. * jika penggunaan HCI pekat tidak menyenangkan.5 ml akuades (Reagensia blangko). XVL5 Nilai normal 13 HJTIOI atau lebih setiap ejakulat.5 (ii) Pada setiap tabling di auis bubuhkan 0. 139106).28 inM lanilan kerja fniktose baku. kemudian baca absorbansi pada 470 nm. Ke dalam tabling kedua masukkan 0. .28 diiuaua Sl dan . niciutn. sebagai gantinya tetapi nicrupakan 77 assayenziniatikyanglcbilinialialmenggunakan spektrofotometerultraviolet(Boehringer Mannlieim kit No.0 ml HCI pekat.14 F= •/.s--.) 0. (i) Ainbil 4 tabling gclas dengan penutup. mcnipakan bacaan rata-rata absorbansi untuk fruktosa beiku. dan F adalah rata-rata fnktor baku fruktosa. XVI. inasiiig-masing 0.14mM lamtan fniktose baku. Faktor pengenceran ^dari plasma semen adalah 75 (lihat XVI. dan ke dalam tabling keempat inasukkaii 0.5 ml dari 0.14 mM dan 0. ke dalam tabling ketiga masukkan 0.* (iii) Tiituplah tabling kemudian eram selaina 20 nienit pada temperatiir 50° C. f adalah pcngcnccran (fraksi volume) siapan.3 Tatacara cksperi men ml cairan supernntan plasma semen yang telah dien-cerkan dan dideproteinasi.it ninius: j 0.4 Pcrhitungan Kadar fruktosa (nimol/l) di nuiiui: dalam plasma semen: AtxFx <p As adalah absorbansi siapnn plasma semen.+ s. ( ----. . Ke da lain tabling pertama masokkan 0. (iv) Dinginkan dalam air es schingga mencapai suhu kamar.

Sisa larutan disimpan pada suhu -20° C. Atur pH sampai 6. Assay berikut incningkalkan kekhususan peng-ukuran alfaglukosidase scbagai pctanda cpididymis (Cooper dkk.PO.78 Lampiran XVII Penentuan alfa-glukosidase netral dalam plasma semen.HPO Jika pH kurang dari 6.1 (1) Kcagcnsia Dapar fosfat pH 6. volume yang diperlukan dibuat baru untuk setiap assay.8.CO.2 ml larutan tersebut pada suhu 4° C.9 ml akuades dan simpan 0. total aktifitas enziin diukur pada pF5 6.8 dengan lncnambahkan lebih banyak KH. plasma sen ten jnga ntcngandung isoenzim asam yang berasal dari prostat dan dapat dihambat sccara seleklif (Pagnin dkk.HPO4 (0. Tambahkan jumlah yang tepat dari PNPG ke volume yang diperlukan dari reagensia (contoh: 25 mg/5ml).8 (0. . Tepat sebclum dipakai.8. Panaskan dan adtik di atas piringan panas pada suhu 50° C untuk kira-kira 10 menit supaya larut.1 in) mengandung 1% sodium dodesjJsulfat (SDS) penghambat alfa-glucosidasc asam. 1990).53 ml akuades dan simpan pada suhu -20° C.2 M) dan 13 ml KH... (3) Kastanospcmtin (lmM. lanilkan SDS dalam volume dapar yang diperlukan (yaitu 50 mg untuk 5 ml).O dalam 500 ml akuades. (4) Na.1 M) Lamtkan 6.PO. Dalam scbagian besar studi klinik tcrdaluilu. dan jadikan 40 ml dengan akuades. Jadikan volume akhir 50 ml dan simpan pada suhu 4° C.20 g Na. Induk 10 mm: lamtkan 1 mg kastanospennin dalam 0. (0. Campur 12 ml K.1 ml induk 10 mM dalam 0. jika pH Icbih dari 6. 1984). Larutan lmM: bubuhkan 0. XVII.2 in). penghambat alfa-glukosidase).COvH. Scbagai tambahan nntiik isocnzim netral yang bcrasat dari cpidid>mis. (0. 5g/l dapar). substrat. (2) /7-Nitrofenol glukopiranosid (PNPG.8 atau lebih banyak K.

Eiiccrkan lanitan 100 uM (\i mol/1) dcugan 0.il air dalam 100 ul PNPG. 20.1 M Vortex masing-masing tabling dan cram sclama 4 Scbagai blangko semen masukkan 10 ul Sebagai baku internal Lctakkan duplikat 10 ul plasma semen (menggunakan pipct pemindah Cairkan dan vortex sperma bebas plasma semen yang disimpan pada . (vi) untuk kontrol interassay: 10 ul dari plasma semen yang incngandung glukosidase tinggi dan 10 f. XVir.80 dan 100 \\M dan baca absorbansi. (vii) plasma semen dari siapan dengau glukosidase tinggi dan rendah (atau siapan individu yang sama)masing-masing dalam |00ul PNPG. 5 mM. Simpan pada suhu 4° C dalam botol benvama coklat.(5) p-Nitrofenol (PNP. (iv) posiliO ke dalam 100 ul PNPG dalam tabling Eppcndorf dan vortex. (x) tabling ke 96 piring suinur (96-wellplate) dan baca absorbansi pada 405 nmgunakan blangko air untuk diatur kc angka 0. buat I am tan bam setiap 3 bulan. (viii) jam dakjm bak air pada suiiu 37° C (suhu dan waktu pengcraman yang tepat adalah mencntukan). 40. (laaitan in i adalah 100 |iM . paiiaskaii larutan jika perlu dan jadikan 100 ml dalam labu ukur.60.0695 g PNP dalam akuades.il dari plasma semen yang incngandung glukosidase rendah dan masukkan masingmasing kc dalam 100 ul PNPG.2 Mctodc (i) Siapkan bak air pada suhu 37° C untuk pcngeramaii. (xi) sebelum pembacaan absorbansi). (v) Scbagai blangko air: 10 f.3 Pcrhitungan I unitalfa-glukosidasc= 1 nmol PNPdihas!!kanpermenitpada37°C. XVII. Bubuhkanmasing-masing 5 ul kastanospenuiu. (ii) suhu -20° C.1 M Na.CO. (iii) Siapkan lanitan PNPG (2 x 100 ul untuk setiap siapanatau blangko). Larutkan 0.1 M Na2CO3 untuk memberikan baku 0. (ix) Na2CO3 pada masing-masing tabling dan vortex. Slope dari Siapkan kurva PNP baku (kurang dari 1 jam Pindahkan 250 ul dari masing-masing Henlikan pengcraman dengan penambahan 1 ml 0. untuk kurva baku). Masukkan 400 ul 5mM lanitan induk ke dalam labu ukur 20 ml dan jadikan 20 ml dengan 0.

Faktor (F) = total volume -s. Absorbansi bersih siapan (A) = absorbansi rata-rata blangko semen.kurva baku (S) = absorbansi unit nM.46 Aktifitas alfa-glukosidasc netral dalam siapan = (A + S) FmU/ml Aktifitas total = mU/ml x volume ejakulat = mU/ejakuIat.volume siapan H- 240 men it = 0. 79 .

R.H.5:277-82. International Jaurnai ofAndrology .T. . & Trcmblay. Chapdclaine. Dube. Rujukan Cooper. Jockcnliovel. J. P.. Catafa/i.XVII.1 ml) adalah untuk pemakai pembaca 96-well plate dan tabling Eppendorf.4glucosidase. F& Nieschlag.-volumeyangdigunakandalammetodediatas (volumetotal 1. C...G.4 Nilai normal 20 mil per ejakulat atau lebih.. Volume ini dapat ditakarkan sccara proporsional jika digunakan cuvettes spektrofotomcter dan tabling erain yang berbeda. R. (1990) Improvement in the assessment of human epididymal ftinction by the use of inhibitors in the asssay of-alfa-glucosidase in semional plasma. Journal of Andrology. Naslian. D. (1984) Similar biochemical properties of human seminal plasma and epididymal alfa-l... R. dan ko-reksi yang sesuai hams dilakukan untuk perhitungan hasil peme-riksaan. 13:279-305 Paquin. Ycung.Y.

2 Mctodc Panaskan I ml larutan pcnibcngknk dalain tabling Eppendarf tertutup pada suhu 37° C selama kira-kira 5 menit.l Larutan Pcmhcngkak Larutkan0.ZHjOdan t. Ulangi dua kali skor spenna yangmembengkakdalain 100 spenna yangdicacah dan hitung skor rata-rata. Simpan cairan larutan ini dalam keadaan bcku pada sului -20° C.Lampiran XVIII Uji Bengkak hipo-osmotik (Hypo-osmotic swelling test) untuk spermcf XVIir. b . Penamptlan ikentalik perubahan morfologi khas akibat pengaruh hipoosnwxik a lidak berubah.351gfmktosa ke dalain 100 ml akuadcs. sepcrti ditunjukkan pada gainbar.g bertMgai nucam perutiahan ekor. Daerah ekor ditandai yang membengkak ipfemi manusia arsinn (a) (e) (f) . Cairkan dan aduk dengan baik sebelum dipakai.735g sodiumsilratNajCjHjOj. XVIII. XVIII.1 ml semen yaag tclah incncair dan aduk dengan pipct secara hati-hati. Bengkak dari spenna dibuktrkan scbagai penibahan dalain bentuk ckor. Biarkan pada suhu 37° C paling sedikit 30 menit (tetapi tidak lebih lama dari 120 menit) dan periksa scl-sel spenna dengan mikroskop beda fase. Bubuhkan 0. 1.

(b) .

II.J. B..S. Van der Ven. II. L. M. Crabo.D.. I'crcz-Pclaez.. 70 -28 81 2 I 9 . (I 9S4) Development of an assay to asses the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics.G & Zaneveld. Journal of Reproduction MiJ Fenihiv.© J Jjyondra. R.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful