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INTERAES ANTGENO-ANTICORPO

Deteco, quantificao e caracterizao dos anticorpos e seu uso como ferramenta para pesquisa e diagnstico

RESPOSTA DE ANTICORPOS
l Especificidade
Habilidade do Ac distinguir seu imungeno de outros Ag.

l Quantidade
N de clulas B x taxa de sntese do Ac x persistncia aps sua produo. l Isotipo Determina a persistncia (meia vida in vivo diferente). A composio determina a funo dos Ac e os locais onde so encontrados.
l Afinidade

Fora de ligao do Ag com o Ac, em um nico stio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac ser necessrio.
l

Avidez: fora total de ligao, nos dois stios.

Avidez x Afinidade

INTERAES
l l

Reaes reversveis.

Ligaes no covalentes: -Pontes de hidrognio -Interaes hidrofbicas -Interaes de Van der Waals -Ligaes inicas

MTODOS
1)

Reagentes no marcados Reao de precipitao Reao de aglutinao Reagentes marcados RIA ELISA Imunofluorescncia Western Blotting

2)

MTODOS
l

PRECIPITAO

APLICAES
- Pesquisa - Diagnstico - Soroepidemiologia

- Imunodifuso dupla - Imunodifuso radial - Imunoeletroforese

AGLUTINAO

- Aglutinao direta e indireta - Inibio da aglutinao - Teste de Coombs

IMUNOENSAIOS

- RIA - ELISA - Imunofluorescncia e Citometria de Fluxo - Western Blotting

PRECIPITAO X AGLUTINAO
l

Precipitao:

Formao de complexos Ag/Ac.


l Aglutinao: o agrupamento de partculas, usualmente por molculas de Ac que se ligam a Ag na superfcie de partculas adjacentes.

As reaes de precipitao e de aglutinao decorrem, respectivamente da ligao entre o Ac e Ag solvel e particulado.


l

REAES DE PRECIPITAO
l l l l

Interao entre Ac e Ag solvel Ac precisa ser bivalente Ag precisa ser bi ou polivalente A reao pode ser afetada pelo n de stios de ligao que cada Ac possui para seu Ag VALNCIA

PRECIPITADO

importante levar-se em conta como ocorre a ligao Ag-Ac em diferentes concentraes dos mesmos. Observe abaixo: +

Anticorpo livre Antgeno livre 100%-Percentual de complexo imune precipitado

+ -

Zona de Zona de excesso equivalncia de anticorpo

Zona de excesso de antgeno

Quantidade de antgeno adicionado

TCNICAS DE PRECIPITAO EM GEL


IMUNODIFUSO
Imunodifuso Dupla:

Coloca-se agarose sobre uma lmina:

Faz-se em seguida, pequenos orifcios no gel e so adicionadas as solues testes de Ag e Ac, como por exemplo, mostrado abaixo:

Ac

IMUNODIFUSO DUPLA l As solues sofrem difuso


l

e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalncia, se observa a reao pela formao de uma linha de precipitao: Pode ser visualizada ps lavagem do gel , para remoo das protenas solveis, por colorao dos arcos de precipitao com corante
Utilizao: muito usada em pesquisa e diagnstico de algumas doenas, como cisticercose

Ag

Ag

Ac Ag Ag

Ag

Ag

Ac

Ac

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IMUNODIFUSO RADIAL
l l

Permite a quantificao do antgeno ou do anticorpo. O processo continua at ser atingida a zona de equivalncia, com os complexos precipitandose em um anel (halo) em torno do orifcio.

Utilizao: dosagem de IgG, IgA e IgM e protenas sricas. Agarose contendo anticorpos anti-IgG humana

Poos onde so colocados padres e amostras a serem dosados Halo de precipitao IgG antiIgG

IMUNOELETROFORES E l

Pode-se fazer comparao de misturas complexas de Ag que so separados em gel de agarose, pela aplicao de uma corrente eltrica. l As molculas migram para o plo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas eltricas. l Uma canaleta recortada entre os poos e preenchida com Ac, que se difunde. l Ag e Ac formam arcos de precipitao.
1- Separao de antgenos
A g A g

2- Anti-soro na coluna canaleta


canaleta

3- Difuso e precipitao

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REAES DE AGLUTINAO
Ac + Ag multivalente particulado l Ttulo: maior diluio que ainda causa aglutinao (semi-quantitativo) l P-zona: excesso de Ac l Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga eltrica (repulso) l Agregao visvel de partculas = Eritrcitos, bactrias, fungos e ltex
l

AGLUTINAO DIRETA
Clulas ou partculas insolveis + Ac = Aglutinao Exemplo: tipagem sangunea em lminas (sistema ABO)
1) Amostra de sangue na placa teste:

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

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AGLUTINAO DIRETA
4) Mistura-se:

3) Controle negativo:

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AGLUTINAO DIRETA
5) Leitura do resultado:

negativo

positivo

Um resultado positivo indicado por uma aglutinao visvel (aglomerao dos eritrcitos na placa teste), como ilustrado acima.

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AGLUTINAO INDIRETA (PASSIVA)


Ag solveis associados a outras superfcies (Partculas de ltex ou superfcie de hemcias) Exemplo: Hemaglutinao Passiva para a Doena de Chagas: As hemcias so revestidas com Ag do T. cruzi (ligao covalente) e ento distribudas nos poos da placa.

O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diludos, so adicionados aos poos da referida placa.

Se houver Ac especfico contra o Ag, as hemcias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poo. Quando no existe Ac especfico, as clulas formam um boto no fundo do poo. Aglutinao Positiva

Negativa

INIBIO DA AGLUTINAO
Exemplo: presena de hCG na urina (gravidez)

+
Urina Soro anti hCG Adicionamse Partculas revestidas com hCG So incubados e colocados numa placa

Resultado positivo:
(presena de hCG na urina): no ocorre aglutinao. Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubao inicial

Resultado negativo: (ausncia de hCG na urina). Ocorre aglutinao, pois os anticorpos anti-hCG no so bloqueados na incubao inicial, porque no havia o hormnio na urina. Livres, podem aglutinar as partculas revestidas de hCG.

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TESTE DE COOMBS
l l l l l l

Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs); DHRN me produz IgG anti-Rh; No aglutinam os eritrcitos; Direto: Ac ligados aos eritrcitos fetais; Indireto: Ac anti-Rh no aglutinantes no soro materno. Permite detectar incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN.

IMUNOENSAIOS
Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, istopos) l Tipos:
l
- RIA - ELISA - IFA /

CITOMETRIA DE FLUXO - WESTERN BLOTTING

IMUNOFLUORESCNCIA (IFA)
Princpio da tcnica:
l

Anticorpos ou antgenos so conjugados (ligados de modo covalente) a uma substncia (fluorocromo), que, quando excitada por radiaes UV, emite luz no espectro visvel. Assim, como a ligao Ag-Ac especfica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antgeno e vice-versa. A reao feita em lminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observao tem lugar num microcpio com luz UV (microscpio de fluorescncia). Principais fluorocromos: fluorescena (isotiocianato de fluorescena FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduche.

Microscpio de fluorescncia com epiluminao

luz UV atinge o material examinado

fluorescncia emitida chega ao observador

TIPOS DE IMUNOFLUORESCNCIA

APLICAO DA TCNICA
IFA direta:
l Deteco

direta de microrganismos em secrees, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Tambm utilizada na fenotipagem de clulas tumorais.

IFA indireta:
l Diagnstico

sorolgico de vrias doenas infecciosas como a Doena de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenas autoimunes. uma tcnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescncia mais intensa) e especificidade.

IMAGENS

CITOMETRIA DE FLUXO
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Ferramenta que detecta e quantifica clulas individuais passando em uma corrente atravs de um feixe de Laser. Separa as clulas por fluorescncia ativada. Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. um teste qualitativo e quantitativo.

APLICAES
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Tipo de linfcitos; Quantidade, tamanho, granulosidade; Isolamento de populaes celulares; HIV

Ensaio Imunoadsorvente Ligado Enzima - ELISA


l

O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.
Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase

O produto final corado surge por ao da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudana de cor de uma substncia indicadora). A quantidade de Ag ou Ac de leitura em fotocolormetro. produto final corado, atravs

l l

Principais tipos de ELISA: indireto, sanduche, competio e captura.

TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto

INDIRETO

DIRETO OU SANDUCHE

PLACA UTILIZADA

ELISA Indireto

ELISA Direto ou Sanduche

ELISA Competitivo

Aplicaes do ELISA: Testes de rotina em Laboratrios Clnicos e de Pesquisa

Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo

RADIOIMUNOENSAIO - RIA
Marcaes: l I125: emite raios gama l H3: raios beta Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g) Desvantagem a manipulao de istopo radioativo. Aplicaes:

Triagem vrus da hepatite B em doadores de sangue, Hormnios,


protenas sricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa

WESTERN BLOTTING
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Eletroforese de protenas. Identifica antgenos ou anticorpos.

WESTERN BLOTTING

WESTERN BLOTTING