DIVERSIDAD Y DISTRIBUCIÓN DE LA VARIACIÓN GENÉTICA DENTRO Y ENTRE POBLACIONES DE ZAMIA LODDIGESII MIQ.

EN LA VERTIENTE DEL GOLFO DE MÉXICO

TESIS QUE PRESENTA FRANCISCO LIMÓN SALVADOR PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS

Xalapa, Veracruz, México (2012)

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Aprobación final del documento de tesis de grado:
“Diversidad y distribución de la variación genética dentro y entre poblaciones de Zamia loddigesii Miq. en la vertiente del Golfo de México”

Nombre Dr. Jorge González Astorga

Firma

Director

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Comité Tutorial

Dr. Alejandro Espinosa de los Monteros Solís Dr. Francisco Vergara Silva

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Jurado

Dra. Carla Gutierrez Rodríguez Dr. Fernando Nicolalde Morejón

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AGRADECIMIENTOS A Dios El presente estudio fue posible gracias a la beca número 58618, otorgada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología para realizar mis estudios de maestría (2010-2012). A los miembros de mi comité tutorial, Dr. Alejandro Espinosa de los Monteros Solís y Dr. Francisco Vergara Silva, por su gran ayuda durante todo el proceso de la maestría, en sus correcciones y aporte de ideas a mi investigación. A los Doctores que formaron parte de mi jurado, Dra. Carla Gutierrez Rodríguez y Dr. Fernando Nicolalde Morejón por la revisión de mi texto y sus sugerencias para enriquecer el manuscrito. A la M. en C. Janet Nolasco Soto y al Dr. Fernando Nicolalde-Morejón, por toda su ayuda en la colecta en el campo y durante el trabajo de laboratorio. A Martha Osorio por el empeño en la revisión de mi documento y las correcciones al mismo. En especial al Dr. Jorge González-Astorga, quien desde el principio ha dirigido este proyecto de investigación, aportando las formas y los medios para lograr la realización de esta tesis.

DEDICATORIA A mi esposa Faby, porque a lo largo de estos años ha estado a mi lado en todas las fases de este proceso, aportando ideas, aguantando mis quejas, desveladas y salidas. Por preocuparse por mí, de muchas formas y demostrarme así su amor en cada momento. A Zamia Sinaí, que aún no te conocemos, pero disfrutamos tu desarrollo todos los días. A mis padres Francisco Limón y Juanita Salvador porque siempre están al pendiente de mi. A Tatnai y a Topito. A mis amigos Ivan, Claus, Gabo, Moi, Nanche y Karina que aunque cada día los veo menos, siempre están ahí cuando más se necesitan.

La mente inteligente adquiere sabiduría, y los oídos sabios van en pos de la ciencia. Proverbios 18:15

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DECLARACIÓN
Excepto cuando es explícitamente indicado en el texto, el trabajo de investigación contenido en esta tesis fue efectuado por Francisco Limón Salvador como estudiante de la carrera de Maestro en Ciencias entre Septiembre del 2010 y Agosto del 2012, bajo la supervisión del Dr. Jorge González Astorga. Las investigaciones reportadas en esta tesis no han sido utilizadas anteriormente para obtener otros grados académicos, ni serán utilizadas para tales fines en el futuro. Candidato: Director de tesis: Biól. Francisco Limón Salvador Dr. Jorge González Astorga _____________________ _____________________

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ÍNDICE RESUMEN………………………………………………………………………………………………………………….. 09 INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….…………………………………..……. 10 CAPÍTULO 1: MARCO TEÓRICO………………….………………….………………………….…………………. 1.1 Zamia loddigesii Miq. ………………….………………….…………………………….……………. 1.1.2 Distribución y Hábitat………………….………………….…………………..………. 1.1.3 Descripción botánica………………….………………….…………………………….. 1.2 Marcadores moleculares………………….………………….……………………………...…….. 1.2.1 ISSR (Inter Simple Sequence Repeats)………………….………………...……. 1.3 PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN………………….………………….………………………..….…..…. 1.4 HIPÓTESIS …….………………….………………….………………….………………….………………….….… 1.5 OBJETIVOS……………………….………………….………………….………………….………………….….…. 1.5.1 Objetivo general………………….………………….………………….…………………….….…. 1.5.2 Objetivos específicos………………….………………….………………….………………...…. CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS………………….………………….………………………..…..... 2.1 Fase de Campo………………….………………….………………….………………….……………….………. 2.1.1 Colecta de material vegetal………………….………………….……………………..…...... 2.2 Fase de Laboratorio………………….………………….………………….………………….………………… 2.2.1 Extracción y Purificación de DNA………………….………………….………………..…… 2.2.2 Amplificación de fragmentos de DNA mediante primers ISSR…………...…… 2.2.3 Visualización de productos amplificados………………….……………………….….... 2.2.4 Registro de datos………………….………………….…………………………………………….. 2.3 Análisis de datos………………….………………….………………….………………………………………… 2.3.1 Especificaciones metodológicas………………….………………….………………………. 2.3.2 Caracterización y lectura de los primers ISSR………………….………………………. 2.3.3 Composición genética de las poblaciones………………….……………………………. 2.3.4 Estructura genética………………….………………….………………………………….………. 2.3.5 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA)………………….………………………....... 2.3.6 Distancias genéticas………………….………………….……………………………………...... 2.3.7 Análisis de agrupamiento………………….………………….…………………………………. 2.3.7.1 UPGMA………………….………………….………………….……………………....... 2.3.7.2 Neighbor-Joining (NJ)………………….………………….……………………..... 2.3.7.3 Análisis de Coordenadas Principales (PCoA)………………….………….. 2.3.8 Análisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA)…………………….…….….... 2.3.9 Prueba de Mantel………………….………………….………………….…………..…………... CAPÍTULO 3: RESULTADOS………………….………………….………………….………………….……..….. 3.1 Amplificación de fragmentos de DNA mediante primers ISSR………………..…. 3.2 Registro de datos………………….………………….………………….…………………………... 3.3 Características y atributos de los primers ISSR………………….………………..…..… 3.4 Composición genética de las poblaciones………………….……………………..………. 13 13 14 15 15 16 19 20 21 21 21 22 22 23 23 23 23 24 24 25 25 26 26 27 30 30 31 31 31 32 32 33 34 34 35 35 37 5

3.5 Estructura genética………………….………………….………………….………………..…….… 3.6 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA)………………….……………………..………… 3.7 Distancias genéticas………………….………………….………………….…………………….…. 3.8 Análisis de agrupamiento………………….………………….………………….……………..… 3.8.1 UPGMA………………….………………….………………….………………….…….….. 3.8.2 Neighbor-Joining (NJ)………………….………………….………………….….…… 3.8.3 Análisis de Coordenadas Principales (PCoA)………………….……..…..... 3.9 Análisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA)………………….………………… 3.10 Prueba de Mantel………………….………………….………………….……………….……….. CAPÍTULO 4: DISCUSIÓN………………….………………….………………….………………….…………..…. 4.1 Características y atributos de los primers ISSR………………….…………………….... 4.2 Composición genética de las poblaciones………………….………………………..….… 4.3 Estructura genética………………….………………….……………………………………..……. 4.4 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA)………………….……………………………… 4.5 Distancias genéticas………………….………………….………………….……………….….….. 4.6 Análisis de agrupamiento………………….………………….………………….………..……. 4.6.1 UPGMA………………….………………….………………….……………………………. 4.6.2 Neighbor-Joining (NJ)………………….………………….…………….……………. 4.6.3 Análisis de Coordenadas Principales (PCoA)……………..……………….. 4.7 Análisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA)………………...…..……………. 4.8 Prueba de Mantel………………….………………….………………….………..….…………….. 4.9 Implicaciones para la conservación………………….………………………………………… 4.10 Conclusiones………………….………………….………………….…………….….……………….

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LITERATURA CITADA………………….………………….………………….………………….……..…………….. 69

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LISTA DE CUADROS Cuadro 2.1 Diferentes configuraciones usadas en la optimización del modelo……………. 29 Cuadro 3.1 Lista de primers utilizados en el análisis ISSR, temperatura de alineamiento, número de bandas y sus respectivas secuencias…………………………..………. 34 Cuadro 3.2 Concentraciones finales de los reactivos…………………………………………..………. 34 Cuadro 3.3 Condiciones de tiempo y temperatura de cada fase del PCR…………………..… 34 Cuadro 3.4 Características de las bandas dentro de las cinco poblaciones de Zamia loddigesii estudiadas en esta tesis………………………………………………………………… 36 Cuadro 3.5 Resumen de la variación genética en Zamia loddigesii…………………….……….. 37 Cuadro 3.6 Estimador de la diferenciación genética promedio (FST) entre las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México……………………....………..………………. 38 Cuadro 3.7 Índices para los cuatro modelos de Hickory (Holsinger y Lewis, 2003)…..…. 39 Cuadro 3.8 Resumen de la diversidad genética de Zamia loddigesii, de acuerdo a los análisis bayesianos…………………………………………………………………….............. 40 Cuadro 3.9 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA) para las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México……………………………………………….…………………. 40 Cuadro 3.10 Estimadores de Distancia e Identidad genética de Nei entre pares de poblaciones en Zamia loddigesii………………………………………..……………………..…………….. 41 Cuadro 3.11 PCoA basado en distancias genéticas, porcentaje de variación explicado en los primeros tres ejes…………………………………………………………………..………….. 43 Cuadro 3.12 Resumen del Análisis Espacial de Varianza Molecular.……………………………. 44 Cuadro 3.13 Combinaciones usadas en la prueba de Mantel………………………………………. 45 Cuadro 4.1 Número de bandas entre especies de cícadas…………………………………………… 49 Cuadro 4.2 Comparación entre dos marcadores moleculares en las mimas poblaciones de Zamia loddigesii………………………………………………………………….. 53 Cuadro 4.3 Comparación de índices bajo dos enfoques………………………………………………. 55 Cuadro 4.4 Resumen de diferentes estudios usando marcadores moleculares………….. 58

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LISTA DE FIGURAS Figura 1.1 Zamia loddigesii. Tomado de Vovides et al. (1983)…………………………….………… Figura 2.1 Ubicación de las poblaciones colectadas de Zamia loddigesii.…………….……... Figura 2.2 Realce digital sobre las bandas amplificadas en varios primers de ISSR, en varios individuos de Zamia loddigesii………………………………………….…………….. Figura 3.1 Electroforesis del Primer 835 de la población de Zamia loddigesii en Oaxaca, México, indicando su codificación………..……………..…………………………………… Figura 3.2 Distribución de los atributos de las bandas entre las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México……………………………………………………………..…. Figura 3.3 Distribución de los índices de diversidad en las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México……………………………………………………….……….. Figura 3.4 Dendrograma usando la distancia sin sesgo de Nei (1978)………………………….. Figura 3.5 Dendrograma de Zamia loddigesii, obtenido con el método de Neighbor-Joining……………………………………………………………………………………………….……. Figura 3.6 Distribución en dos dimensiones de los 91 individuos de Zamia loddigesii mediante el análisis de coordenadas principales………………………………. Figura 3.7 Agrupación de las poblaciones de acuerdo al SAMOVA………………………………. Figura 4.1 Tendencia en las publicaciones con ISSR vs Aloenzimas…………………………..…. Figura 4.2 Reconstrucción de escenarios…………………………………………………………………..…

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Diversidad y distribución de la variación genética dentro y entre poblaciones de Zamia loddigesii Miq. en la vertiente del Golfo de México
RESUMEN En México se han realizado estudios sobre genética de poblaciones en cícadas, éstos han aportado información acerca de la diversidad y la estructura genética en los tres géneros que se distribuyen en nuetsro país (i. e., Zamia, Ceratozamia y Dioon), los cuales han revelado que las cícadas mexicanas poseen valores relativamente altos de diversidad genética comparadas con cícadas de otras regiones y especies vegetales con características de vida similares. Estos estudios se han realizado básicamente con marcadores aloenzimáticos, los cuales a pesar de aportar información muy valiosa, han venido a ser reemplazados por marcadores moleculares de DNA. En el presente trabajo se usaron once marcadores ISSR para estudiar la composición genética dentro y entre cinco poblaciones de Zamia loddigesii abarcando su distribución natural, en la vertiente del Golfo de México. Se obtuvieron 472 bandas, en algunos casos disminuyó su número gradualemente desde el norte al sur de la distribución de la especie. A nivel de especie, el porcentaje de polimorfismo fue del 97.28%, el número de alelos fue 1.97 y el índice de Shannon fue 0.38. Siguiendo aproximaciones convencionales y métodos bayesianos, se detectó una estructura poblacional de entre 40 y 56% (FST, GST, θ y ɸST), el flujo génico estimado fue de 0.36. Los análisis de agrupamiento diferenciaron escasamente a las poblaciones y la prueba de Mantel no fue significativa. Comparaciones con un estudio previo con aloenzimas, muestra valores superiores y un grado mayor de diferenciación entre poblaciones a lo reportado. Finalmente se propone un escenario histórico basado en la información obtenida y se proponen planes de conservación para preservar la diversidad genética de esta especie amenazada. Palabras clave: Cícadas, Diversidad y Estructura Genética, ISSR, México, Zamia loddigesii

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INTRODUCCIÓN El orden Cycadales es un grupo de plantas con semilla que está dentro de las gimnospermas, es un linaje monofilético que surgió hace ca. 300 millones de años, entre el Carbonífero y el Pérmico temprano (Jones, 1993; Norstog y Nicholls, 1997). Aunque es importante señalar que las cícadas contemporáneas (ca. 331 especies, Stevenson et al., 2012) se originaron de procesos de especiación ocurridos a finales del Mioceno – Plioceno (i.e., ca. 12 millones de años) (Nagalingum et al., 2011), en este sentido su caracterización como ‘fósiles vivientes’ queda en entredicho (Vergara-Silva et al., 2012). Con respecto a su conservación, son junto con las cactáceas y las orquídeas, entre otras, uno de los grupos de plantas más amenazados del planeta, ya que el 62% de sus especies válidas, se encuentran amenazadas de extinción (Hoffman et al., 2010; Da Silva et al., 2012). En México se encuentra la mitad de todas las especies de cícadas del continente y ocupa el segundo lugar en diversidad a nivel mundial, con alrededor de 53 especies, seguido de Australia (ca. 80 especies) (Nicolalde-Morejón et al., 2011; Stevenson et al., 2012). Nuestro país, además de ser muy diverso en este grupo, posee un gran porcentaje de endemismos (ca. 90%), por lo que es considerado un importante centro de diversidad del Neotrópico (Vergara-Silva et al., 2012). El género Zamia tiene ca. 71 especies (Stevenson et al., 2012), habita únicamente en el continente americano, desde Georgia y Florida en Estados Unidos hasta Bolivia y el suroeste de Brasil (Norstog y Nicholls, 1997; Stevenson, 2001; Nicolalde-Morejón et al., 2009). México cuenta con 15 especies de este género (Nicolalde-Morejón et al., 2009).

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Zamia loddigesii Miq. es una especie endémica a México, con una amplia distribución, presente en los estados de Tamaulipas, Hidalgo, Veracruz, Puebla, Oaxaca, Chiapas y Tabasco. La especie se ha adaptado a diversos tipos de hábitat desde ambientes conservados (Bosque Mesófilo de Montaña) hasta pastizales y lugares ampliamente perturbados, por lo que sus poblaciones se han visto afectadas y reducidas en tamaño (Nicolalde-Morejón et al., 2009). De acuerdo con la Lista Roja de Especies Amenazadas (Chemnick y Gregory, 2010a), Zamia loddigesii está en la categoría NT (casi amenazada), por lo que a nivel nacional se ha establecido legalmente su protección, así como a nivel internacional. Sin embargo, a pesar de ello, es muy colectada por su uso como planta de ornato, destinada principalmente a mercados nacionales e internacionales de coleccionistas. Con el surgimiento de técnicas moleculares de DNA, una serie de marcadores han surgido y se han aplicado en la caracterización de la variabilidad genética en especies de plantas. En particular, los marcadores ISSR (‘Inter Simple Sequence Repeats’ por sus siglas en inglés) han destacado por ser útiles en la identificación de variación genética entre y dentro de poblaciones, por lo que han sido aplicados en estudios de genética de poblaciones (Hartl y Clark, 1997), lo cual permite conocer la diversidad y la estructura genética de las especies, así como estimar las tasas de entrecruzamiento, la endogamia, el flujo génico, la selección natural y la deriva génica (Lewontin, 1974) y a partir de esta información, inferir cómo los procesos evolutivos han modulado la dinámica de los genes al seno de las poblaciones. Debido a que Zamia loddigesii es una especie endémica con tamaños poblacionales relativamente bajos y a los factores de riesgo a los que está sometida son extremos, es importante disponer de información detallada de su diversidad, variación genética y estructura

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genética, ya que de esta manera se puede obtener información valiosa para proponer programas de conservación y manejo sustentable (Yu et al., 2011). Por lo que los objetivos del presente estudio son: a) evaluar la diversidad genética en las poblaciones de Zamia loddigesii a lo largo de su distribución natural, utilizando como herramienta marcadores ISSR; b) conocer la distribución de la variación genética dentro y entre las poblaciones; c) estimar la correlación entre la diferenciación genética y la distancia geográfica entre poblaciones; d) calcular el flujo génico entre poblaciones; e) con base en los resultados obtenidos, diagnosticar los factores que están determinando la forma en cómo se distribuye la variación dentro y entre las poblaciones de la especie; finalmente f) proponer medidas de protección apropiadas a la especie, en base en los resultados obtenidos en esta tesis.

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CAPÍTULO 1: MARCO TEÓRICO Dentro del orden Cycadales, la Familia Zamiaceae está compuesta por ocho géneros (Chigua D.W. Stev., Dioon Lindl., Encephalartos Lehm., Lepidozamia Regel, Macrozamia Miq., Ceratozamia Brongn, Microcycas A. DC. y Zamia L.) cuya distribución se da en las regiones tropicales y subtropicales del planeta, i. e., África, Australia, América y Las Antillas (Stevenson, 1992). Zamia es uno de los géneros más diversos desde diferentes contextos, es el segundo género más numeroso con 71 especies, después de Cycas (107) (Stevenson et al., 2012), se distribuye a lo largo de toda la región tropical y subtropical del continente americano (NicolaldeMorejón et al., 2011). De igual manera, Zamia es uno de los géneros más complejos debido a su diversidad en patrones de variación morfológica, ecológica, citológica y genética (Vovides et al., 1983; Vovides y Olivares 1996; Marchant, 1968; Moretti y Sabato, 1984; Moretti, 1990a b; Moretti et al., 1991; Norstog y Nicholls, 1997; Nicolalde-Morejón, 2009; Nicolalde-Morejón et al., 2009; GonzálezAstorga et al., 2006; Limón-Salvador, 2009). 1.1 Zamia loddigesii Miq. Recibe su nombre en honor a Joachim Conrad Loddiges (1738-1826), proveedor de plantas exóticas con sede en Londres, destacado monografista y sistematizador de las cícadas del siglo XVIII, que mantenía una estrecha comunicación con Friedrich Anton Wilhelm Miquel (Haynes, 2009) quien la describió en 1843 (Aiton, 1789) (ver Figura 1.1). Coloquialmente se le conoce con los nombres de Teocinte, Teocintle, Teosinte, Camotillo, Cocalito, Palmiche, Palmilla, Cihua, Chacuhua (Bonta y Osborne, 2007) y Tzompollo (Contreras-Medina et al., 2003).

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Zamia loddigesii es una de las especies más colectadas dentro del género, junto con Zamia furfuracea (Chemnick y Gregory, 2010b) es apreciada por coleccionistas por su facilidad de manejo, crecimiento lento, así como a su resistencia a variaciones de temperatura y plagas. 1.1.2 Distribución y Hábitat Es endémica a México, se distribuye en los estados de Tamaulipas, Hidalgo, Veracruz, Tabasco, parte de Oaxaca y con sólo una localidad conocida en Chiapas (NicolaldeMorejón et al., 2009). Al ser de amplia distribución, los tipos de vegetación donde crece son variados, incluyen bosque tropical lluvioso, bosque tropical deciduo y sub-decíduo (sensu Rzedowski, 1978), asimismo en hábitats de sucesión secundaria como pastizales y cultivares (Nicolalde-Morejón et al., 2009) y conservados como el bosque
Figura 1.1 Zamia loddigesii. Tomado de Vovides et al., (1983)

mesófilo de montaña (Contreras-Medina et al., 2003). Comparte su distribución con otras seis especies (i. e., Zamia cremnophila, Z. katzeriana, Z. lacandona, Z. purpurea, Z. polymorpha y Z. spartea) y se encuentra en altitudes que van desde el nivel del mar hasta los 1000 m s.n.m. (Nicolalde-Morejón, 2009).

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1.1.3 Descripción botánica Es una planta con un tallo hipógeo, de ramificación dicotómica con la edad, de 10-45cm longitud, 8-15cm de diámetro, catáfilas cartáceas, persistentes, de base triangular, de 8.4-3.7cm a la base, amarillento tomentoso. Hojas 2-3 (4) ascendiendo a separarse, de 45-96 x 30-41cm, verde claro cuando emergen, verde a verde oscuro cuando maduras, peciolo de 15-25cm longitud, verde en hojas jóvenes, subterete, armado con espinas de hasta 4mm de longitud, raquis subterete de hasta 57cm de longitud, foliolos 12-23 pares, sésiles, coriáceos, linearlanceolados, de opuestos a subopuestos, base atenuada, márgenes serrulados (NicolaldeMorejón et al., 2009). Su número cromosómico diploide es 18 (Norstog, 1980; Moretti, 1990b). Aunque todas las cícadas se encuentran protegidas por convenios internacionales y nacionales (INE-SEMARNAP, 2000; Donaldson, 2003; IUNC, 2012; UNEP-WCMC, 2012), en la práctica existe poco o nulo cuidado en el manejo y protección de Zamia loddigesii, por lo que sus poblaciones son muy vulnerables a cambios de uso de suelo, extracciones ilegales y reducción de su hábitat (Vázquez-Torres et al., 1999; González-Astorga et al., 2006; Osborne y Vovides, 2007; Chemnick y Gregory, 2010a). Por lo anterior es de suma importancia conocer la distribución de la variación genética dentro y entre las poblaciones de Zamia loddigesii para poder entender y explicar patrones evolutivos así como para plantear con ello acciones de conservación (Vovides et al., 2002). 1.2 Marcadores moleculares El advenimiento de técnicas moleculares mostró claramente sus ventajas sobre los marcadores morfobioquímicos en el análisis de la diversidad genética de las poblaciones. Debido a que los marcadores moleculares son estables e independientes del entorno (temporal y espacialmente),

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han venido a reemplazar a los caracteres fenotípicos para detectar variación genética, no solo entre poblaciones, sino también entre individuos dentro de poblaciones (Azofeifa-Delgado, 2006). Además, permiten seleccionar regiones concretas del DNA, para ello el número de polimorfismos detectables es teóricamente ilimitado y permiten analizar tanto la información que se expresa fenotípicamente como la que no es expresada (Jiménez y Collada, 2000). Bajo este principio, se han desarrollado muchas técnicas moleculares, el primer marcador que se aplicó a plantas fueron los Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) (Beckman y Soller, 1983) y desde entonces el desarrollo de marcadores basados en PCR aplicados a plantas ha crecido, entre ellos están los Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) (Williams et al., 1990); los Microsatélites (SSR) (Ali et al., 1986), los Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) (Vos et al., 1995) y los Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) (Zietkiewicz et al., 1994), principalmente. Cada uno de estos marcadores moleculares tiene ventajas y desventajas para un estudio determinado, así la selección de la mejor técnica a utilizarse depende de los objetivos planteados, del material que se analizará y del tipo de datos y resultados esperados. 1.2.1 ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) Los ISSR (Inter Secuencias Simples Repetidas) son un tipo de marcadores genéticos, que permiten obtener la variación en regiones de DNA entre los microsatélites que se encuentran dispersas en todo el genoma, particularmente en el núcleo (Zietkiewicz et al., 1994). Los microsatélites son secuencias de DNA pequeñas (generalmente de 16 a 25 pares de bases) e hipervariables, se expresan como disimilitudes en las poblaciones y se caracterizan por ser repeticiones de mono, di, o trinucleótidos (Wolfe et al., 1998). Los ISSR son marcadores

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dominantes que se encuentran entre regiones de microsatelites, los “primers” diseñados para obtener estos marcadores son los propios microsatélites (secuencias simples repetidas de di o trinucleótidos) anclados a la terminación 3’ o 5’ del microsatélite con uno a tres nucleótidos (Zietkiewicz et al., 1994; Grupta et al., 1994; Wolfe y Liston, 1998). El principio de los ISSR es que los sitios complementarios del “primer” están dispersos en todo el genoma, así, hay altas probabilidades de que el primer se una a dos sitios localizados en hebras opuestas de DNA dentro de una distancia amplificable (Zietkiewicz et al., 1994; Culley y Wolfe, 2001). El primer es complementario a una región microsatélite blanco y el nucleótido extra permite que ocurra la amplificación, siempre y cuando el “primer” se pegue a la terminación del microsatélite con un primer del nucleótido disponible en la secuencia flanqueadora. Los nucleótidos extras juegan el papel de anclas y aseguran que la amplificación inicie siempre del extremo 3’ o 5’ del microsatélite. Así, el primer localiza dos regiones microsatélite separadas por una secuencia genómica amplificable del DNA blanco, por lo que la reacción de PCR generará una banda de tamaño particular (i.e., su peso molecular en pares de bases) para ese locus, representando la secuencia de DNA que se encuentra entre los microsatélites, i.e. el ISSR (Bornet y Branchard, 2001). Con frecuencia estas amplificaciones de un solo primer propicia altos niveles de bandas polimórficas (Wolfe y Liston, 1998; Culley y Wolfe, 2001), para ello las bandas obtenidas son analizadas como marcadores dominantes, lo cual significa que cada banda corresponde a un locus (Wolfe, 2005). Así, la presencia de la banda representa el genotipo dominante (tanto homócigo, como heterócigo), mientras que su ausencia representa el genotipo homócigo recesivo. Esto es válido si se asume que solamente existen dos alelos por locus.

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Los ISSR son usados en estudios de variabilidad genética en poblaciones naturales debido a que no se requiere información previa del genoma, su implementación tiene bajo costo y los procedimientos de laboratorio son fácilmente transferibles a cualquier especie, así como su alta reproducibilidad, debido principalmente a las altas temperaturas de alineación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Zietkiewicz et al., 1994; Wolfe et al., 1998; Wang, 2010). Además, para diseñar los primers no es necesario tener la información a priori de secuencias del genoma de las poblaciones bajo estudio (Godwin et al., 1997), por lo que se ha utilizado ampliamente en investigaciones de variación genética entre grupos de individuos filogenéticamente cercanos (Bornet y Branchard, 2001), así como en la identificación de variedades dentro de especies (Nagaoka y Ogihara, 1997; Wolfe et al., 1998). Las investigaciones que abordan el estudio de la diversidad y la estructura genética en cícadas utilizando marcadores enzimáticos han mostrado que aunque son, en general especies con distribución restringida, su diversidad genética en promedio es mayor a lo esperado en otras especies con las mismas características biológicas (Hamrick y Godt, 1996; Dioon edule: González-Astorga et al., 2003; Dioon angustifolium: González-Astorga et al., 2005; Zamia loddigesii: González-Astorga et al., 2006; Dioon sonorense, D. tomasellii y D. holmgrenii: González-Astorga et al., 2008; Dioon caputoi y D. merolae: Cabrera-Toledo et al., 2010). Respecto a marcadores moleculares de DNA, existen pocos estudios realizados en cícadas, los que se han realizado han sido en cícadas del continente asiático y recientemente en África; sin embargo, hasta el momento no existen trabajos publicados que aborden el estudio de la diversidad y estructura genética que utilicen marcadores moleculares de DNA en especies de cícadas en México, por lo que el presente trabajo también proveerá información novedosa a

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nivel de DNA para el género de Zamia y los resultados, discusión y conclusiones surgidas de esta investigación incrementarán nuestro conocimiento sobre la biología evolutiva de la cícadas. 1.3 PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN Zamia loddigesii, es una de las especies de más amplia distribución en México, pero también es una especie que se han reducido sus poblaciones naturales, lo cual ha influido en una disminución de su diversidad genética y un incremento en la diferenciación genética entre las poblaciones remanentes, generándose un fuerte aislamiento genético entre sus poblaciones (González-Astorga et al., 2006); con base en lo anterior, en este trabajo de tesis, nos preguntamos: ¿cuál será la manera en qué los marcadores de DNA ISSR detectarán este efecto?, esto con relación a lo detectado con otro tipo de marcador molecular como lo son las isoenzimas, esto a nivel de la diversidad y la estructura genética de las poblaciones remanentes de Zamia loddigesii en estado natural. De igual forma se ha probado que usando isoenzimas Zamia loddigesii posee valores relativamente altos de diversidad genética, otros estudios utilizando marcadores de DNA, han revelado mayores niveles de polimorfismo que los registrados con marcadores de isoenzimas, entonces la pregunta es si, ¿obtendremos índices de diversidad superiores a los ya reportados para la misma especie?

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1.4 HIPÓTESIS  Se espera que los niveles de diversidad genética en Zamia loddigesii detectados con ISSR sean superiores a los reportados con isoenzimas (González-Astorga et al., 2006), debido a que los marcadores de DNA tienden a ser más neutros que las enzimas, ya que estas últimas están más expuestas a la acción de la selección natural.  Se espera que la estructura genética en las poblaciones de Zamia loddigesii evaluada con ISSR sea mayor que lo reportado con isoenzimas, como se ha detectado en Cycas guizhouensis (Xiao et al., 2004), debido a que con los marcadores moleculares de DNA se está evaluando variación genética que ha estado expuesta durante mayor tiempo al efecto de la mutación, a la reordenación del genoma, a la fluctuación aleatoria de las frecuencias alélicas (i.e., deriva génica), principalmente, en tanto que los marcadores isoenzimáticos son más conservados, ya que debido a su alto efecto funcional, puede “purgar” las mutaciones que cambien el efecto funcional de la enzima respecto al sustrato. Por lo anterior, cabría esperar que la diferenciación genética (F ST o GST) sea mayor evaluada con ISSR que con isoenzimas.

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1.5 OBJETIVOS 1.5.1 Objetivo general Evaluar la diversidad y distribución de la variación genética dentro y entre poblaciones de Zamia loddigesii a lo largo de su rango de distribución natural utilizando para ello marcadores ISSR. 1.5.2 Objetivos específicos  Obtener el porcentaje de loci polimórficos (P), el número promedio de alelos por locus (A), la diversidad genética de Nei (HE) y el índice de diversidad de Shannon (I).  Evaluar la distribución de la variación genética entre y dentro de las poblaciones, utilizando los estimadores: FST o GST y análisis molecular de varianza (AMOVA).    Calcular las distancias genéticas entre las poblaciones. Determinar el flujo génico entre las poblaciones. Estimar la correlación entre la diferenciación genética y la distancia geográfica entre las poblaciones.  Realizar análisis de agrupamiento para determinar las relaciones entre las poblaciones estudiadas.    Analizar la correlación entre la distribución genética y la espacial, mediante un SAMOVA Diagnosticar los factores que influyen en la estructura genética de la especie. Proveer medidas de protección apropiadas a la especie, en base a su información genética.

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CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Fase de Campo Para el desarrollo de esta tesis, se muestrearon cinco poblaciones de Zamia loddigesii: una en el estado de Tamaulipas, dos en Veracruz, otra más en Oaxaca y la última en Tabasco, en todo este rango incluye toda la distribución geográfica de la especie, las ubicaciones se señalan en la Figura 2.1, las colectas se hicieron entre las altitudes de los 85 y los 250 m s.n.m.

Figura 2.1 Localización de las poblaciones colectadas de Zamia loddigesii.

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2.1.1 Colecta de material vegetal Se tomaron entre tres y cinco foliolos de cada individuo, estas muestras fueron etiquetadas individualmente y guardadas en nitrógeno líquido para evitar la degradación del DNA. Finalmente las almacenamos, para su posterior análisis, en un ultracongelador a -70°C. 2.2 Fase de Laboratorio La parte experimental se realizó en el Laboratorio de Genética de Poblaciones, del Instituto de Ecología (INECOL) A. C. campus Xalapa, Veracruz, durante los meses de Febrero a Julio del 2011. 2.2.1 Extracción y Purificación de DNA Con la ayuda de un mortero maceramos individualmente con nitrógeno líquido todas las muestras hasta pulverizarlas. Se siguió el protocolo de extracción DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, 2006) que, a diferencia del método CTAB ofrece la ventaja de no requerir de una extracción con Fenoles o Cloroformo, además de ser más rápido (Haymes et al., 2004). Al terminar, se tomaron 3ul de DNA y 2.5ul de Ficol de cada individuo y fueron colocados en geles de Agarosa al 1%, éstos se corrieron por 40 minutos a 150V x 50mA, para comprobar la calidad de las purificaciones. Finalmente todas las muestras las almacenamos en tubos etiquetados a una temperatura de -20°C en un congelador Fagor. 2.2.2 Amplificación de fragmentos de DNA mediante primers ISSR Para la amplificación de fragmentos de DNA fueron probados 100 primers ISSR procedentes de la serie No. 9 de la Unidad de Servicios de Proteínas y Ácidos Nucleicos de la Universidad de Columbia Británica, Vancouver, Canadá. Los resultados dudosos o poco visibles fueron repetidos y realizamos todos los ensayos con un control negativo que contenía todos los reactivos de la PCR excepto la solución de DNA, para comprobar la ausencia de contaminación en los reactivos.

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Todas las reacciones de PCR las hicimos en un termociclador Biometra T-personal (Whatman Biometra, Goettingen, Alemania). También realizamos ensayos para determinar las concentraciones óptimas de Cloruro de Magnesio, Buffer, DNTPs, Taq Polimerasa, Templado de DNA y de los Primers. El número de ciclos y las temperaturas de alineamiento para cada primer fueron optimizados en una termocicladora de gradientes “MasterCycler Gradient” (Eppendorf International). 2.2.3 Visualización de productos amplificados Separamos los productos obtenidos del PCR por medio de electroforesis en geles de agarosa al 1%, utilizando TBE 0.5X como buffer de corrida con un pH de 8.4. En cada población se colocó también 3μl de una escalera o ladder (Quiagentm) de peso molecular conocido para calcular el tamaño en pares de bases de los diferentes loci amplificados. Las muestras fueron corridas a 150V y 50mA por una hora y se les agregó bromuro de etidio para ser visualizados con luz UV. Al terminar la corrida electroforética cada gel fue visualizado y registrado con una cámara digital Canon Power Shot A650 IS con filtro UV. 2.2.4 Registro de datos De la colección de fotografías agrupamos todas las poblaciones por primer de ISSR, usando los pesos moleculares como referencias; fueron registradas las bandas amplificadas para cada individuo y cada primer; adicionalmente se realizó un tratamiento digital a las fotografías con el fin de discriminar mejor las bandas (Figura 2.2), el cual consistió en un contraste (emboss) en el que cada pixel de la imagen, se sustituye, ya sea por un resalte o una sombra, dependiendo de la luz u obscuridad de los límites de la imagen original, generando un relieve entre las bandas, del fondo obscuro o de los barridos del corrimiento del gel.

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Figura 2.2 Realce digital sobre las bandas amplificadas en varios primers de ISSR, en varios individuos de Zamia loddigesii.

A la presencia de una banda se asignó el valor “1”, mientras que las ausencias se registraron con “0” (Wolfe, 2005). Las bandas poco definidas o de difícil interpretación no fueron consideradas en el registro de datos. Se construyó una matriz binaria con todos los datos y ésta fue utilizada para todos los diferentes paquetes de análisis, realizando algunos ajustes de formato cuando fuera necesario. 2.3 Análisis de datos Los ISSR son marcadores moleculares dominantes, esto es, que no se pueden distinguir directamente individuos heterocigotos, de homocigotos dominantes (González y Aguirre, 2007), lo que genera una dificultad para calcular las frecuencias alélicas a partir de estos resultados. Asimismo, la ausencia de una banda puede interpretarse como pérdida del locus a través de inserción o deleción del sitio, una mutación o de rearreglos cromosómicos (Wolfe y Liston, 1998; González y Aguirre, 2007). 2.3.1 Especificaciones metodológicas Los análisis estadísticos se realizaron asumiendo que las poblaciones se encuentran en

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Equilibrio Hardy-Weinberg (EHW), esto se debe a la naturaleza de los marcadores y la imposibilidad de distinguir homocigotos recesivos, esta asunción debe ser hecha para la mayoría de programas en genética de poblaciones que analizan datos de marcadores dominantes y generalmente utilizan la corrección de Lynch y Milligan (1994) para reducir el sesgo. 2.3.2 Caracterización y lectura de los primers ISSR A partir de la matriz binaria se obtuvo el número de bandas por individuo, el número de bandas polimórficas, el número de bandas fijas (dentro de la población y a nivel especie) y el número de bandas privadas, esto es el número de bandas que son únicas a una sola población, utilizando el programa FAMD v1.25 (Schlüter y Harris, 2006). Además se obtuvo el número de bandas para toda la población y el número de bandas comunes (con una frecuencia mayor o igual a 5%) con el programa GenAlEx v6.41 (Peakall y Smouse, 2006). 2.3.3 Composición genética de las poblaciones Dentro de una especie se encuentran tanto diferencias genéticas entre poblaciones, como entre los individuos dentro de poblaciones. Estas diferencias pueden surgir como resultado de la acción de procesos aleatorios, que aunado al flujo génico puede generar una nueva población, proceso que Wright (1978) nombró ‘efecto del fundador’, en estas poblaciones que en general tienen tamaños efectivos relativamente inferiores a la población o poblaciones originales es probable que se fijen o se pierdan alelos debido al efecto del azar, proceso que se le conoce como deriva (Templeton, 1991). También, las diferencias entre poblaciones pueden surgir de manera sistemática, especialmente si el entorno en varios lugares expone a los individuos a diferentes óptimos para su supervivencia y reproducción, estas divergencias son especialmente

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fuertes y rápidas, cuando existe poco flujo génico entre las poblaciones, por ejemplo en plantas debido a la dispersión limitada de semillas o polen o por barreras fisiográficas; así con el transcurrir de las generaciones, esas diferencias entre, eventualmente se acumularán y resultarán en el desarrollo de una nueva especie (Templeton, 2006). La diversidad genética evaluada en esta tesis se basó en estimadores que incorporan la variación de alelos dentro de las poblaciones así como la divergencia de las poblaciones. Para ello se calculó: el número observado de alelos (Na) y el número efectivo de Alelos (Ne), donde este último se refiere a los alelos con capacidad de pasar a la siguiente generación (Kimura y Crow, 1964). El índice de diversidad genética de Nei (HE) (Nei, 1973), esto es la heterocigosidad esperada para la diversidad dentro de las poblaciones (HS) y a nivel de especie (HT); el número de loci polimórficos (NLP) y el índice de información de Shannon (I), éste índice no asume que haya equilibrio en Hardy-Weinberg (Lewontin, 1972), los análisis fueron realizados con el programa Popgene versión 1.31 (Yeh et al., 1999). Se estimó también, el Porcentaje de Loci Polimórficos (PLP), con respecto al número promedio de loci examinados, éste análisis se calculó usando el programa TFPGA versión 1.3 (Miller, 1997). 2.3.4 Estructura genética El perfil genético del total de las poblaciones típicamente varía de un lugar a otro a través del rango de la especie, esto podemos verlo reflejado en el grado de diferenciación entre las poblaciones, el cual puede ser calculado siguiendo uno o varios estadísticos. Los dos métodos más usados para marcadores moleculares de tipo dominante son el índice de fijación de Wright (FST) (Wright 1969, 1978) y el coeficiente de variación genética de Nei (Gst) (Nei, 1973) estos índices son funciones de como la heterocigosidad es particionada dentro y entre poblaciones.

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El índice de fijación (FST), mide el efecto de las divisiones de una población en la heterocigocidad de las subpoblaciones debido a la deriva génica. Este coeficiente es el más útil y el más utilizado para determinar las divergencias genéticas entre las subpoblaciones. El índice FST es siempre positivo. Tiene un valor cercano a 0 cuando no hay subdivisión (i. e., con apareamientos al azar) por lo que no existen divergencias genéticas entre las poblaciones; y tiene un valor cercano a 1 cuando existe subdivisión extrema (aislamiento completo), de manera que valores de FST menores a 0.05 indican una diferenciación genética insignificante, mientras que valores mayores a 0.25 muestran una diferenciación genética significativa entre las poblaciones. Para estimar el grado de diferenciación genética entre las poblaciones (F ST de Wright), se utilizó el método de Weir y Cockerham (1984) donde el índice θ (theta) corresponde al coeficiente FST. Con los datos de las cinco poblaciones estudiadas, se utilizó el programa TFPGA versión 1.3 (Miller, 1997) para estimar el valor de θ; para esto se realizó un análisis ‘Jackknife’ (i.e., réplicas de eliminación secuencial de loci) a todos los datos para obtener estimados de varianza, así como un ‘Bootstrap’ sobre todos los loci para obtener uno intervalos de confianza al 95% y 99%. La medida de diferenciación genética a través de los loci (GST), es un índice que ha sido usado ampliamente para describir la estructura genética de las poblaciones, con especial enfoque en los efectos de la deriva génica y migración, que son fuerzas evolutivas que reflejan las características demográficas que se encuentran bajo selección neutral y se espera que afecten a todos los loci de la misma forma (Ryman y Leimar, 2009). Tiene además la propiedad de ser utilizado para uno o varios loci, no necesita de un número especifico de poblaciones y el

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estadístico es relativamente responsable de cambios en las frecuencias alélicas en el tiempo (Falk et al., 2001), éste análisis fue realizado con el programa Popgene, de Yeh et al., (1999) versión 1.31. A partir del resultado, se calculó también el flujo génico (Nm) como: Nm = ¼ (1/GST - 1). Debido a la naturaleza dominante de los ISSR se utilizó el método de análisis propuesto por Holsinger et al., (2002) implementado en el programa Hickory version 1.1, el cual no asume que las poblaciones están en equilibrio Hardy-Weinberg (Holsinger y Wallace, 2004), y estima análogos bayesianos de FST y FIS, designados como θ-II (Theta II) y f, respectivamente (Holsinger y Wallace, 2004). Este programa permite la estimación de cuatro diferentes modelos; el primero es un modelo completo en el que θ-II y f son estimados simultáneamente. Después utiliza dos modelos alternativos que asumen que no hay endogamia dentro de las poblaciones (f = 0) y que no hay estructura entre las poblaciones (θ-II = 0). Finalmente, el cuarto modelo permite que la estimación de f varíe conforme avanza el modelo. Al mismo tiempo se calcula la heterocigosidad local y total (HS y HT, respectivamente) con lo que se obtiene la GST sobre la misma matriz de datos. El programa corre los cuatro modelos probando diferente número de iteraciones (ver Cuadro 2.1), y del modelo seleccionado se realizaron al menos diez repeticiones para comparar los resultados, los valores fueron muy similares Cuadro 2.1 Diferentes configuraciones usadas en la optimización del modelo. nBurnin nSample thin Test1 20000 10000 10 Test2 50000 50000 50 Test3 50000 100000 50 Test4 50000 250000 50 Test5 100000 1000000 50

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Posteriormente, los modelos probados fueron comparados usando el criterio de información de la Desviación (DIC) que combina una medición de ajuste del modelo (Dbar) con uno de complejidad del modelo (pD, número efectivo de parámetros). Lo modelos con menor valor de DIC son los elegidos, pero es requerida una diferencia de más de seis unidades para que el modelo esté estadísticamente soportado (Holsinger et al., 2002). 2.3.5 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA) El grado de diferenciación dentro entre poblaciones puede ser evaluado mediante el AMOVA, este es utilizado para determinar la varianza total existente entre individuos dentro de poblaciones y entre las poblaciones, y puede ser realizado a partir de una matriz de distancias genéticas (Excoffier et al., 1992). Para ello, el estimador ФST del AMOVA es análogo del estadístico FST. El AMOVA, se hizo en el programa Arlequin version 3.1 (Excoffier y Schneider, 2005) usando 10,000 permutaciones y los intervalos de confianza fueron obtenidos con un bootstrap de 10 mil iteraciones. 2.3.6 Distancias genéticas El cálculo de distancias o identidades genéticas es muy útil para tener una idea general de que tan similares (o diferentes) son las poblaciones; las matrices de identidades y distancias genéticas entre poblaciones fueron construidas con el método original de Nei (1972) para medidas de distancia e identidades que considera a los cambios en las frecuencias alélicas derivados tanto de mutaciones como de efectos de deriva genética. Asimismo se utilizó el estimador no sesgado de Nei (1978), ambas frecuencias fueron estimadas con el método de expansión de Taylor de Lynch y Milligan (1994), recomendado para marcadores dominantes y que considera que las poblaciones están en equilibrio de Hardy-Weinberg, esto, utilizando el

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software TFPGA versión 1.3. También se construyó una matriz utilizando el coeficiente de Dice (1945), debido a que éste excluye de su análisis la ausencia de bandas y además no se asume el equilibrio Hardy-Weinberg (Meyer et al., 2004; Dalirsefat et al., 2009). 2.3.7 Análisis de agrupamiento A partir de las distancias genéticas, se construyeron dos árboles para conocer la estructura de agrupamiento de los datos, los cuales dieron lugar a representaciones visuales de las relaciones genéticas existentes entre los individuos analizados (Hollingsworth y Ennos, 2004). Para ello seguimos dos aproximaciones, estas fueron: el método no ponderado de apareamiento de grupos a través de la media aritmética (UPGMA) y el análisis del vecino más cercano o NeighborJoining. 2.3.7.1 UPGMA El UPGMA (‘Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean’ por sus siglas en ingés), agrupa a los individuos en forma aglomerada y jerárquica con base los promedios de similitud, como resultado de ello se obtiene un dendrograma, mediante el cual se puede observar la formación de grupos a distintos valores de similitud. El UPGMA se elaboró basado en las distancias genéticas de Nei (1978), utilizando el software TFPGA versión 1.3, este programa permite realizar un bootstrap a los datos y arroja “índices de consistencia” que permiten inferir la fuerza relativa de los nodos producidos, calculados para cada nodo generado por el set de datos originales (Miller, 2007). 2.3.7.2 Neighbor-Joining El análisis de Neighbor-Joining o del vecino más cercano permite determinar a los individuos

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que se encuentran más y menos relacionados entre sí dependiendo de sus similitudes. La cercanía de dos individuos y el hecho de que se formen de una misma rama indican el grado de similitud entre ellos. Para este análisis, utilizamos el método Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987) implementado en el software MEGA v5.0.1. El cual produce un árbol sin raíz, porque no requiere asumir una tasa de evolución constante, que a diferencia del UPGMA produce árboles enraizados y requiere presuponer una tasa constante de evolución, es decir, se asume un árbol en el que las distancias desde la raíz a cada extremo de las ramas son iguales. 2.3.7.3 Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) Además se realizó un Análisis de Coordenadas Principales (PCoA), que permite conocer el patrón de agrupamiento de todos los individuos en el espacio. El PCoA utiliza directamente la información de los datos reunidos en la matriz de similitud genética, para extraer información relevante y así generar nuevas variables denominadas como componentes principales. Este análisis se llevó a cabo en FAMD (‘Fingerprint Analysis with Missing Data’ por sus siglas en inglés) versión 1.23 beta, utilizando como medida de distancia el coeficiente de Dice. También se construyó en GenAlex (Genetic Analysis in Excel) versión 6.2, ya que dicho software, permite observar en los primeros tres ejes, el porcentaje de variación que es explicada por cada uno. 2.3.8 Análisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA) Se realizó un Análisis Espacial de la Varianza Molecular (SAMOVA) (Dupanloup et al., 2002), usando el programa SAMOVA versión 1.0. Este análisis, maximiza la proporción de varianza genética total debida a diferencias entre grupos de poblaciones y minimiza la varianza dentro de estos, llegando a definir grupos e identificando la presencia de barreras genéticas entre estos grupos, permitiendo inferir posibles barreras genéticas que expliquen el aislamiento entre

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grupos de poblaciones. El SAMOVA utiliza al AMOVA y datos de información geográfica, e involucra la definición de grupos de poblaciones sin la necesidad de una delimitación a priori, maximizando la diferenciación entre poblaciones (Excoffier et al., 1992). La significancia de la varianza de componentes de ФCT (entre grupos), ФSC (entre poblaciones dentro de grupos) y ФST (dentro de poblaciones) fue probada usando 10,000 permutaciones para cada nivel jerárquico. Las pruebas se realizaron con dos (k = 2), tres (k = 3) y cuatro (k = 4) grupos. 2.3.9 Prueba de Mantel Para conocer si hay una relación significativa entre la distancia geográfica y las distancias genéticas de las poblaciones, se llevó a cabo la prueba de Mantel (1967). La prueba de Mantel es una regresión en donde las variables son matrices de distancia que resumen la disimilaridad entre grupos. Se busca, por tanto, evaluar si la asociación (positiva o negativa) es más robusta de lo que se esperaría por azar (Reynolds y Houle, 2002). Este análisis fue llevado a cabo en el programa TFPGA versión 1.3. Las distancias geográficas se compararon con las siguientes variables: Distancias genéticas de Nei 1972, 1978; ФST del AMOVA e índices de Shannon.

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CAPÍTULO 3: RESULTADOS 3.1 Amplificación de fragmentos de DNA mediante primers ISSR De los 100 primers de la serie 9 de la UBC, 51 amplificaron con más de cuatro bandas y de ellos se utilizaron los once que mostraron el mayor número de bandas, lo cual se consideró un mínimo de diez bandas (Cuadro 3.1). Las concentraciones óptimas para cada uno de los reactivos utilizados en los ensayos se muestran en el cuadro 3.2; el número de ciclos y temperaturas de alineamiento con mejores resultados se muestran en el cuadro 3.3. Cuadro 3.1 Lista de primers utilizados en el análisis ISSR, temperatura de alineamiento, número de bandas y sus respectivas secuencias Primer T° Alineamiento Intervalo de Secuencia 5`a 3` # Bandas ISSR (°C ) Peso Molecular UBC 846 CACACACACACACACART 52 23 350-1600 UBC 881 GGGTG GGGTG GGGTG 52 22 300-1550 UBC 841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 52 21 220-1400 UBC 840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 52 18 250-1000 UBC 848 CACACACACACACACARG 52 18 300-1700 UBC 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 52 17 300-1200 UBC 886 VDVCTCTCTCTCTCTCT 48 16 350-1200 UBC 844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 52 15 500-1600 UBC 873 GACAGACAGACAGAC A 52 15 500-1200 UBC 835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 52 14 380-1400 UBC 836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA 52 10 300-970 R = A, G; Y = C, T; V = A, C o G; D = A, G o T Cuadro 3.2 Concentraciones finales de los reactivos Reactivo Cantidad Buffer 4μl MgCl 2.5μl Formamida (2%) 0.4μl DNTP 0.4μl Primer 2μl Taq Polimerasa 0.2μl Templado DNA 1μl H 20 9.5μl Volumen Total 20μl Cuadro 3.3 Condiciones de tiempo y temperatura de cada fase del PCR Fase Temperatura Tiempo Denaturación inicial 94 5 Min 44 Denaturación 94 30 Seg Ciclos Alineamiento 52 45 Seg Extensión 72 2 Min Extensión Final 72 7 Min *48°C para primer 886

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3.2 Registro de datos Cada uno de los geles se almacenó en una serie de fotografías, registrando el nombre de la población, el número de individuo más un control negativo, la escalera, el primer utilizado, la temperatura de alineamiento, voltaje y miliamperaje, duración y fecha de la corrida electroforética, así como el número de PCR registrado en la bitácora (Figura 3.1)

Figura 3.1 Electroforesis del Primer 835 de la población de Zamia loddigesii en Oaxaca, México, indicando su codificación.

3.3 Características y atributos de los primers de ISSR De los once primers, en las cinco poblaciones estudiadas (91 individuos), registramos un total de 472 bandas diferentes, la población de Monte Oscuro en Veracruz presenta el mayor número de bandas totales. El mayor número de bandas por individuo, número de bandas fijas, bandas localmente comunes y el menor número de bandas únicas, se encontraron en la población de Aldama en Tamaulipas. En general, los valores más bajos se encuentran en la población de Tabasco, ya que es la que tiene menor número de bandas totales, bandas por Individuo, bandas

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fijas y bandas localmente comunes (Cuadro 3.4), incluso sus valores están debajo del promedio de las cinco poblaciones que fueron analizadas. Cuadro 3.4 Características de las bandas dentro de las cinco poblaciones de Zamia loddigesii estudiadas en esta tesis
Población Aldama Misantla Monte Oscuro Oaxaca Tabasco Total N 20 20 20 15 16 91 #Bandas 95 96 101 94 86 472 Bandas por Individuo 60.65 60.55 57.35 57.2 55.25 58.38 # Band. # Bandas localmente #Bandas fijas Únicas comunes 18 6 25 14 18 21 14 13 19 10 14 19 10 13 17 66 64 5*

N = Número de individuos muestreados # Bandas = Número de bandas Diferentes en la población BPI = Bandas por individuo # Bandas Localmente Comunes = Encontradas en 50% o menos en la población # Bandas Únicas = Número de bandas únicas a la población # Bandas fijas en el grupo de datos (Población) [*Para todo el conjunto de datos]

Existe además un patrón latitudinal cualitativo, donde tres grupos de datos (i.e., bandas por Individuo, bandas locales y bandas fijas) decrecen de norte a sur a lo largo de la distribución de la especie (Figura 3.2).

Figura 3.2 Distribución de los atributos de las bandas entre las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México

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3.4 Composición genética de las poblaciones Un resumen de la variación genética en las cinco poblaciones estudiadas se presenta en el cuadro 3.5, donde se observa que la población más al norte (Aldama, Tamaulipas) presenta los valores más bajos para el número efectivo de alelos, el índice de Shannon y la diversidad genética de Nei. De forma opuesta, los valores más altos los presenta la población de Oaxaca. A nivel especie, Zamia loddigessi, presenta altos valores de polimorfismo (97.28%), así como la mayoría de los indicadores de diversidad genética. Cuadro 3.5 Resumen de la variación genética en Z. loddigesii
Población Aldama Misantla Monte Oscuro Oaxaca Tabasco Promedio Especie (DE) Na 1.3804 1.4076 1.4457 1.4076 1.3750 1.40326 1.9728 (0.163) Ne 1.2190 1.2538 1.2392 1.2593 1.2463 1.24346 1.3843 (0.3246) HE 0.1286 0.1490 0.1435 I 0.1934 0.2215 0.2181 NLP 70 75 82 75 69 74.2 179 PP 38.04 40.76 44.57 40.76 37.50 40.326

0.1499 0.2224 0.1402 0.2063 0.1423 0.2121 0.2408* 0.3813 (0.0256) (0.2104)

97.28

Na = Número observado de alelos; Ne = Número efectivo de alelos; HE = Diversidad genética de Nei *HT; I = Índice de Shannon; NLP = Numero de loci polimórficos; PP = Porcentaje de loci polimórficos

En la figura 3.3 se esquematiza la distribución de los diferentes estimadores de la diversidad genética en las poblaciones de Zamia loddigesii. Las líneas más cercanas al centro indican bajos valores, mientras que los más alejados del centro, muestran los valores más altos y a la población a la que pertenecen. La población de Aldama en Tamaulipas, muestra valores relativamente bajos de diversidad genética, mientras que los estimadores más altos ocurren en las poblaciones de Misantla en Veracruz, la de Oaxaca y la de Monte Oscuro en el centro de Veracruz, principalmente.

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Figura 3.3 Distribución de los índices de diversidad en las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México.

3.5 Estructura genética Con base en los dos métodos más utilizados para evaluar la estructura genética de las poblaciones, tenemos que el coeficiente de endogamia de Wright (FST), fue de 0.444  0.023, lo cual indica que el 44.47% de la diversidad genética de la especie, está distribuida entre las poblaciones. Los resultados obtenidos con las poblaciones, se muestran en el cuadro 3.6, junto con sus intervalos de confianza. Cuadro 3.6 Estimador de la diferenciación genética promedio (FST) entre las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en México. Se muestra la desviación estándar (DE) del estimador, así como los intervalos de confianza al 95 y al 99% FST 95% IC. 99% IC 0.4447 Superior: 0.489 Superior: 0.5027 (DE) 0.023 Inferior: 0.3978 Inferior: 0.384

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El estimador de la diferenciación genética a través de todos los loci fue GST = 0.409, a partir del mismo estimador, se calculó el flujo génico como Nm = 0.361, lo cual indica un flujo génico muy limitado entre las poblaciones. Para el cálculo de FST, a partir de métodos bayesianos, de las diferentes combinaciones la configuración del ‘test2’ fue seleccionado, ya que se observó después de las pruebas, que aunque se aumentaran el número de iteraciones, los valores ya no variaban. En el Cuadro 3.7 se muestran los resultados para los cuatro modelos, el modelo completo (full) es el que muestra el valor más bajo de (DIC) que es el índice de criterio de desviación, el cual combina una medida del ajuste del modelo (Dbar), con una medida de la complejidad del modelo (pD), donde pD = Dbar - Dhat. Los valores más bajos, son los recomendados de acuerdo a Holsinger y Wallace (2004). Cuadro 3.7 Índices para los cuatro modelos de Hickory (Holsinger y Lewis, 2003) Modelo Dbar Dhat pD DIC Full 1676.14 1321.57 354.57 2030.71 f=0 1677.01 1286.7 390.313 2067.33 Θ=0 8721.46 8556.18 165.28 8886.74 Free model 1766.34 1329.68 436.656 2202.99 DIC es el índice de criterio de desviación Los valores de -II (análogos al FST (Weir y Cockerham, 1984)), y GST-B (Análogo Bayesiano al GST de Nei (1973)), se encuentran entre 0.56 y 0.45, respectivamente (Cuadro 3.8). Esto indica que la mayor proporción de variación genética se atribuye a la diferencia entre las poblaciones. Para estas pruebas bayesianas, los estimadores: HS y HT en el cuadro 3.8 son similares a los estadísticos de Nei (1973), mientras que la f es el equivalente a la endogamia local (FIS) resultó ser de 0.778, lo cual refleja muy altos niveles de endogamia local en las poblaciones de

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Zamia loddigesii. Cuadro 3.8 Resumen de la diversidad genética de Zamia loddigesii, de acuerdo a los análisis bayesianos
f 0.778 (0.25) θ -II 0.560 (.51) HS[1] 0.139 (0.13) hS[2] 0.164 (0.15) hS[3] 0.157 (0.14) hS[4] 0.168 (0.15) hS[5] 0.148 (0.13) HS 0.155 (0.15) HT 0.284 (0.26) GST-B 0.452 (0.39)

3.6 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA) A fin de detectar la estructura genética de las poblaciones, se realizó un AMOVA usando los 184 loci detectados para las cinco poblaciones de Zamia loddigesii. Los resultados del AMOVA se resumen en el cuadro 3.9, donde se indica que el mayor porcentaje de variación genética (i.e., 52.23%) es debido a las diferencias entre las poblaciones, en tanto que el 47.77% de la varianza genética total restante se debe a la variación promedio dentro de las poblaciones entre individuos. Cuadro 3.9 AMOVA para las poblaciones de Zamia loddigesii en México
Fuente de variación Suma de Cuadrados Entre poblaciones 1162.336 Dentro de Poblaciones 1200.192 Total 2362.527 ФST = 0.52226 valor de P < 0.00001 Cuadrados Medios 290.584 13.956 Varianza de los componentes 15.25647 13.95572 29.21218 Porcentaje de variación 52.23 47.77 100.00

3.7 Distancias genéticas En el cuadro 3.10 se muestran los datos para distancias e identidad genética entre las diferentes poblaciones comparadas (1. Aldama, 2. Misantla, 3. Monte Oscuro, 4. Oaxaca y 5. Tabasco) con el estimador genético de Nei (1972) y el estimador sin sesgo de Nei (1978).

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Cuadro 3.10 Estimadores de Distancia e Identidad genética de Nei entre pares de poblaciones en Zamia loddigesii
Poblaciones Distanciaa Identidada Distanciab Identidadb Comparadas 1 vs. 2 0.1626 0.8499 0.1584 0.8535 1 vs. 3 0.1526 0.8585 0.1485 0.8620 1 vs. 4 0.1939 0.8238 0.1888 0.8280 1 vs. 5 0.1357 0.8731 0.1311 0.8772 2 vs. 3 0.1504 0.8603 0.1460 0.8641 2 vs. 4 0.1542 0.8571 0.1487 0.8618 2 vs. 5 0.1773 0.8375 0.1723 0.8418 3 vs. 4 0.1307 0.8775 0.1253 0.8822 3 vs. 5 0.1289 0.8790 0.1240 0.8834 4 vs. 5 0.1300 0.8781 0.1240 0.8833 1.Aldama 2.Misantla 3.Monte Oscuro 4.Oaxaca 5.Tabasco a b Nei 1972 Nei 1978

3.8 Análisis de agrupamiento 3.8.1 UPGMA Siguiendo el método de UPGMA, utilizamos las distancias genéticas de Nei (1978), usando 10,000 permutaciones, con este método las poblaciones de Monte Oscuro (Veracruz) y Tabasco resultaron ser más próximas, seguidas de Oaxaca (Figura 3.4).

Figura 3.4 Dendrograma usando la distancia sin sesgo de Nei (1978).

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3.8.2 Neighbor-Joining La Figura 3.5 muestra el dendrograma obtenido del análisis de Neighbor-Joining, usando para ello 10,000 réplicas con el programa MEGA versión 5.0, las distancias fueron calculadas siguiendo el método de distancia-p. Además de la agrupación de las poblaciones, así como la distribución de los individuos dentro de las mismas, este dendrograma nos permite visualizar si hay individuos mezclados en poblaciones a las que no pertenecen. En este sentido, se observa que ningún individuo está fuera de la población a la que corresponde y, de acuerdo con este análisis, las poblaciones más próximas entre sí fueron Monte Oscuro y Oaxaca, seguidas por la de Tabasco.

Figura 3.5 Dendrograma de Zamia loddigesii, obtenido con el método de Neighbor-Joining.

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3.8.3 Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) En la figura 3.6 se muestran los resultados obtenidos con GenAlEx. Espacialmente las cinco poblaciones de Zamia loddigesii aquí estudiadas se separan claramente, sin embargo para evitar confusiones (sobre todo en las poblaciones de Oaxaca, Tabasco y Monte Oscuro en Veracruz), se unieron con una línea del mismo color todos los integrantes de cada población.

Figura 3.6 Distribución en dos dimensiones de los 91 individuos de Zamia loddigesii mediante el análisis de coordenadas principales

En el cuadro 3.11 se muestra el porcentaje de variación que explica cada coordenada, el primer componente explica el 31.67% de la variación total, en tanto que el segundo explica el 24.94% y el tercero el 17.92%. Dentro de cada una de las cinco agrupaciones (poblaciones) se observa que la distancia a la que se encuentran separados los individuos de las poblaciones de Oaxaca y Tabasco es relativamente más estrecha que las poblaciones de Misantla y Monte Oscuro, ambas en Veracruz. Cuadro 3.11 PCoA basado en distancias genéticas, porcentaje de variación explicado en los primeros tres ejes 1 2 3 Eje 31.67 24.94 17.92 % % Acumulado 31.67 56.61 74.53 43

3.9 Análisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA) Se analizaron tres escenarios, los cuales se compararon para conocer la agrupación de las poblaciones incluyendo los datos genéticos y el espacio geográfico. Similar al UPGMA y otros árboles (no publicados), cuando se consideran dos grupos (K = 2), la población de Misantla en Veracruz resulta separarse de las demás (Cuadro 3.12); de igual manera cuando se contemplan tres y cuatro grupos (K = 3 y K = 4, respectivamente) presentan un comportamiento similar al observado en los dendrogramas, sin embargo ninguna de las tres formas de agrupación de éste análisis fue significativo.

Cuadro 3.12 Resumen del Análisis Espacial de Varianza Molecular. Entre paréntesis se muestran las poblaciones que se agrupan de acuerdo al número de conjuntos seleccionados
Varianza de Porcentaje Índice de componentes de Variación Fijación K= 2 Grupos: (Aldama, Monte Oscuro, Oaxaca, Tabasco) (Misantla) ФCT Entre grupos 1 2.87893 9.33 0.09331 ФSC Entre poblaciones 3 14.01765 45.43 0.50111 dentro de grupos ФST Dentro de poblaciones 86 13.95572 45.23 0.54766 K = 3 Grupos: (Monte Oscuro, Oaxaca, Tabasco) (Aldama) (Misantla) ФCT Entre grupos 2 3.14775 10.48 0.10481 ФSC Entre poblaciones 2 12.92904 43.05 0.48091 dentro de grupos ФST Dentro de poblaciones 86 13.95572 46.47 0.53531 K = 4 Grupos: (Misantla) (Monte Oscuro, Tabasco) (Aldama) (Oaxaca) ФCT Entre grupos 3 3.12082 10.57 0.10574 ФSC Entre poblaciones 1 12.43827 42.14 0.47125 dentro de grupos ФST Dentro de poblaciones 86 13.95572 47.28 0.52716 Fuente de Variación G.L. Valor de P 0.194 ± 0.013 0.00 ± 0.0 0.00 ± 0.0 0.112 ± 0.000 0.00 ± 0.0 0.00 ± 0.0 0.100 ± 0.008 0.00 ± 0.0 0.00 ± 0.0

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Figura 3.7 Agrupación de las poblaciones de acuerdo al SAMOVA.

3.10 Prueba de Mantel Con la finalidad de conocer la relación existente entre la composición genética y la localización geográfica correspondiente a cada población se aplicó una prueba de Mantel, la cual compara matrices pareadas. De todas las comparaciones realizadas (Cuadro 3.13), los resultados de la prueba de Mantel indican que la variabilidad o distancia genética observada es independiente de la distancia geográfica de las poblaciones de Zamia loddigesii, es decir no existe una relación significativa entre ambas matrices. Cuadro 3.13 Combinaciones usadas en la prueba de Mantel
Combinación Distancia geográfica vs Fst-1 Distancia geográfica vs Distancia Genética Nei Distancia geográfica vs Fst-1 quitando Aldama-Tabasco Distancia geográfica vs PhiPt (AMOVA) Distancia geográfica vs Shannon Correlación (r) 0.4201 -.0540 0.7410 0.3306 -.1113 Probabilidad superior (p) 0.1640 0.4960 0.0070 0.2210 0.6080 Probabilidad inferior (p) 0.8480 0.5110 1.0000 0.7850 0.4000

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CAPITULO 4: DISCUSIÓN En esta tesis se estudió la diversidad y la estructura genética en cinco poblaciones de Zamia loddigesii en todo su ámbito de distribución, pare ello se utilizaron once primers de ISSR, que fueron seleccionados de 100 primers, el criterio que se utilizó para escoger los primers fue que como mínimo presentaran diez bandas, este criterio se utilizó a partir de la revisión de más de un centenar de publicaciones científicas que abordan el estudio de la genética de poblaciones en plantas desde 1996 a la fecha, para ello las primeras tres publicaciones que se registraron en una búsqueda en el ISI Web de Thomson Reurtes fueron: Tsumura et al., (1996), Esselman et al., (1999) y Ge y Sun (1999); en tanto que durante el 2011 se publicaron mas de una veintena de artículos, en los que en su mayoría utilizan al menos diez primers de ISSR y con diez bandas como mínimo. Lo anterior es evidencia de que los datos y resultados de esta tesis son

consistentes con lo reportado en otros estudios con plantas. En el caso del orden Cycadales el primer estudio donde se utilizan los ISSR como marcadores de diversidad y estructura genética es en 12 poblaciones de Cycas guizhouensis K. M. Land y R. F. Zou en el sur de China, donde utilizaron 11 primers de ISSR (Xiao et al., 2004), lo cual coincide con el mismo número de marcadores que usé en esta tesis. Los estudios con marcadores moleculares a nivel del DNA suelen, en general, detectar mayor diversidad genética que con proteínas enzimaticas, esto puede ser explicado primero, por la naturaleza conservativa de las secuencias codificantes en los genes muestreados por isoenzimas, en contraste con las secuencias no codificantes por RAPD e ISSR (Fahima et al., 1999; Aboel-Atta, 2009), por lo que las isoenzimas podrían subestimar la diversidad genética (Culley y Wolfe, 2001). Segundo, en el caso de los microsatélites que son secuencias repetitivas

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cortas en tándem, con una longitud de apenas unos pares de bases, son muy abundantes a lo largo del genoma; en este contexto Condit y Hubell (1991) estiman que hay 5 x 103 a 3 x 105 microsatélites en cada organismo. Así los microsatélites están dispersos a través de todo el genoma y son altamente polimórficos debido al deslizamiento del DNA (Hamada y Kakunaga, 1982). Por lo tanto, usar un marcador ISSR compuesto de una secuencia microsatélite, anclada por dos a cuatro nucleótidos y con frecuencia degenerando en las terminaciones 3’ or 5’ (Zietkiewicz et al., 1994), podría detectar muchas más bandas polimórficas por primer que los marcadores RAPD (Quian y Hong, 2001), adicionalmente este tipo de marcadores (dominantes), son neutrales, de manera que no se ven afectados por la acción de la selección natural (Nagaoka y Ogihara, 1997). En esta tesis, trabajando con cinco poblaciones de Zamia loddigesii usando marcadores ISSR fue posible detectar suficiente variación genética entre poblaciones y entre individuos dentro de las poblaciones. En este contexto, se ha reportado que los ISSR pueden ser más informativos y tener un mejor desempeño que los RAPD (Ge y Sun, 1999; Korbin et al., 2002; Galván et al., 2003; Wu et al., 2004; Souframanien y Gopalakrishna, 2004; Vijayan et al., 2004). Los ISSR son superiores a los RAPD, principalmente en términos de bandas polimórficas detectadas por primer y por ser mas reproducibles (Culley y Wolfe, 2001; Quian y Hong, 2001). Finalmente, cuando comparamos la información genética obtenida a partir de marcadores de isoenzimas, una desventaja que caracteriza a los ISSR es su naturaleza dominante, que resulta en un menor contenido de información, esto al no poder detectar los heterocigotos. Sin embargo, como afirma Ge y Sun (1999), esta desventaja es compensada por el alto número de loci polimórficos que se obtienen y por la capacidad de muestrear un mayor

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número de regiones del genoma. Es importante mencionar que existe un renovado interés en la evaluación de la diversidad, tanto en ecología como en genética de poblaciones (Jost, 2007; Ricotta y Burrascano, 2008; Ryman y Leimar, 2009; Gregorius, 2010; Meirmans y Hedrick, 2011; Whitlock, 2011), así como el aumento en el número de publicaciones en revistas indizadas (Figura 4.1) utilizando ISSR como marcadores para conocer la diversidad de las especies, a la vez que van en desuso los métodos enzimáticos (a pesar la información que ellos aportan), desde 1995 a la fecha.

Figura 4.1 Tendencia en las publicaciones con ISSR vs Aloenzimas

4.1 Características y atributos de los primers de ISSR Los resultados obtenidos, concuerdan con otros estudios en cícadas donde se emplean marcadores moleculares ISSR. Para ello, de los once primers utilizados en la presente tesis, cinco han sido reportados en otros estudios con cícadas: los primers 835, 836 y 840 también son reportados por Xiao et al., (2004), Xiao y Gong (2006), Jianguang et al., (2005) y Xiao et al., (2005), el primer 841 por Xiao y Gong (2006), Jianguang et al., (2005) y Xiao et al., (2005), así como el primer 842 (Xiao et al., 2004; Xiao y Gong, 2006; Xiao et al., 2005). En las dos cícadas asiáticas, Cycas guizhouensis y Cycas debaoensis Y. C. Zhong y C. J. Chen, que reportan el número de bandas obtenido por cada primer, se puede observar que en

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todos los casos las especies asiáticas presentan un menor número de bandas por primer, comparadas con Zamia loddigesii (Cuadro 4.1). Cuadro 4.1 Número de bandas entre especies de cícadas Primer Zamia Cycas Cycas ISSR loddigesii guizhouensis debaoensis UBC 835 14 11 8 UBC 836 10 7 8 UBC 840 18 8 7 UBC 842 17 7 Cycas guizhouensis: (Xiao et al., 2004); Cycas debaoensis: (Xie et al., 2005) Aunque no se incluyeron en el análisis, durante las pruebas preeliminares con los 100 primers, los primers 808 y 810 mostraron variación de bandas como lo reportan Xiao et al., 2004; Xiao et al., 2005; Jianguang et al., 2005; Xiao y Gong, 2006 (datos no publicados), pero en el presente estudio, no se incluyeron por mostrar pocas bandas (cinco y seis, respectivamente). La temperatura de alineamiento para la mayoría de los primers fue de 52°C, excepto para el primer 886 que fue de 48°C, estos son resultados similares a los reportados por Xiao y Gong (2006). Con la presente información podemos indicar que los primers utilizados podrían aplicarse a posteriores estudios con cícadas de otros géneros, así como en especies tanto de América como del resto del mundo. El promedio de individuos muestreados en las poblaciones de Zamia loddigesii fue de 18.2. Respecto a esto Nybom (2004) reporta en un meta análisis, con marcadores moleculares en 307 especies estudiadas, principalmente dominantes (RAPD, AFLP, ISSR), que el número medio de plantas por población varía entre 14.5 y 18.5, resultado que indica que en esta tesis se tiene un muestreo consistente. En Zamia loddigesii, se detectaron un total de 472 bandas diferentes y un promedio de 94.4 bandas en cada población, aunque existe poca información sobre el numero de bandas 49

necesarias para los análisis, Staub et al., (2000) en su estudio indica que casi no existen cambios con respecto a los coeficientes de variación genética más allá de 80 bandas, en Zamia loddigesii este número fue mayor que 80 en todas las poblaciones. Como se muestra en las figuras 3.2 y 3.3, la distribución de las bandas entre las poblaciones no es homogénea, por el contario, los diferentes valores tienden hacia una u otra población de acuerdo a diversos factores; sin embargo, es importante señalar que el número de bandas únicas es muy similar entre las poblaciones del sureste, lo mismo sucede con el número de bandas locales, lo que hace que la especie, dentro de estas poblaciones sea genéticamente muy similar, debido a que comparten un número alto de alelos. Con respecto al número de alelos (bandas) por individuo y al número de bandas locales, se observa una disminución de norte a sur, a lo largo de la distribución de la especie. Esta disminución en el número de bandas podría implicar que el origen de la distribución de la especie sea probablemente la población de Aldama (i. e., más norteña) ya que posee más bandas siendo esta característica un atributo ancestral. En este contexto, Gonzalez-Astorga et al., (2006) encontraron un resultado similar para las mismas poblaciones de Zamia loddigesii usando aloenzimas, detectándose una disminución de la frecuencia de un alelo (i.e., Malato deshidrogenesa, MDH), desde el norte al sur de la distribución de la especie. Slatkin (1985) señala que el número de alelos privados es un estimador indirecto del flujo génico, y cuanto más bajo sea éste, más alelos de este tipo surgen, y son fijados por eventos de mutación en una población. Las frecuencias encontradas en los alelos privados de Z. loddigesii (entre 6.3 y 18.7% de la población total), indican que probablemente las poblaciones estudiadas presentan ciertas limitaciones de flujo génico entre ellas (i.e. aislamiento). Lo que se

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explica por la gran distancia geográfica entre la población de Aldama y las otras cuatro. Todas las poblaciones presentaron en mayor o menor grado un número de alelos fijos, lo que sugiere la existencia de grandes diferencias genéticas entre estas. Además, la presencia de estos alelos, parece distintivo de especies antiguas y relictas (Reátegui-Zirena et al., 2009), algo que es caraterístico en las cícadas. 4.2 Composición genética de las poblaciones Una de las aproximaciones para la estimación de la diversidad genética, usando marcadores dominantes, es integrar los análisis incluyendo información obtenida con datos de marcadores codominantes y así evitar asumir equilibrio Hardy-Weinberg (Narzary et al., 2010). En el presente estudio, se hicieron pruebas con los datos de isoenzimas publicados por GonzálezAstorga et al., (2006), integrando el coeficiente de endogamia (endogamia local: FIS) para los datos de ISSR, sin embargo las diferencias obtenidas fueron mínimas (datos no publicados) y se optó por no considerar este enfoque para permitir la comparación con otros estudios. Ge y Sun (1999) reportan haber encontrado también muy poca diferencia cuando integraron datos de aloenzimas a ISSR. La variación genética dentro de las poblaciones es el reflejo de diversos procesos evolutivos, los cuales pueden ser interpretados a partir de la información obtenida de los diferentes estimadores de diversidad genética. A nivel de poblaciones presentan altos números de alelos; además, existe una gran similitud en el número de alelos, las heterocigosis, el índice de Shannon y el porcentaje de loci polimórficos, entre las poblaciones de Misantla en Veracruz y Oaxaca.

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El polimorfismo en las poblaciones de Aldama y Tabasco, es el más bajo en la especie (38% y 37.5%, respectivamente), son valores incluso más bajos que el promedio de las demás y coincide que ambas poblaciones son las que se encuentran en los extremos de la distribución de la especie, lo cual puede indicar el aislamiento que han tenido, mientras que la población con los valores más altos se encuentra en el centro de su distribución (Monte Oscuro, 44%). Wright (1946) demostró que especies con niveles de endogamia significativa pueden resultar de la pérdida o fijación de ciertos alelos dentro de una población, dando como resultando una baja diversidad genética, esto es particularmente visible en la población de Aldama, que presenta el mayor número de bandas fijas y el menor número de bandas únicas dentro del análisis. A nivel de especie, el porcentaje de loci polimórficos es relativamente alto (97.28%), estos loci son los de mayor importancia en aspectos de la biología de la restauración, debido a que estos loci polimórficos pueden o no estar adecuadamente representados dependiendo del diseño y ejecución de un programa de restauración y conservación de las especies (Falk et al., 2001). La diversidad genética resulta también ser mucho más alta a nivel de especie (HT 0.240) que a nivel de poblaciones (HS = 0.142), resultados similares se obtuvieron con ISSR en Magnolia officinalis (Yu et al., 2011) y Emmenopterys henryi (Li y Jin, 2008), árboles que al igual que las cícadas, son especies primitivas, de larga vida y amenazadas en la actualidad por reducción de su hábitat natural. Esta abundante variación en las poblaciones y a nivel de la especie, es atribuida como una característica heredada de sus ancestros, lo cual explica la alta diversidad genética a nivel de especie (Ge y Sun, 1999; Li y Jin, 2008; Yu et al., 2011).

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De acuerdo a nuestra hipótesis que contrasta los niveles de diversidad con aloenzimas e ISSR, cuando comparamos nuestros resultados, se observa que a nivel de especie, con similar número de individuos por población analizados, el porcentaje de polimorfismo y el número de alelos por locus son más altos con ISSR que con aloenzimas, resultados que se muestran similares a los reportados en otros estudios (i.e., Buso et al., 1998; Ge y Sun, 1999; Ayers et al., 1999; Xiao et al., 2004; Aboel-Atta, 2009; Jonavičienė et al., 2009). Sin embargo, entre las poblaciones sucede lo contrario, esto puede deberse a que el haber muestreado 15 loci aloenzimáticos, la representación del genoma haya sido muy limitada y por lo tanto los resultados exhiban una información restringida. Aunque también es importante considerar que los marcadores aloenzimáticos pueden ser afectados por la selección natural, para ello los loci elegidos podrían estar adaptados en cuanto a su dinámica enzimática. Mientras que los marcadores ISSR al ser neutrales y no verse afectados por la acción de la selección natural, incluyen información de genes no codificantes y la diversidad de la especie podría ser menor que lo detectado por las aloenzimas. Cuadro 4.2 Comparación entre dos marcadores moleculares en las mimas poblaciones de Zamia loddigesii.
Aloenzimas* Población N PP Aldama 20.8 66.6 Misantla Monte 19.5 73.3 Oscuro Oaxaca 21.5 60.0 Tabasco 19.2 66.6 Especie 20.25 66.6 *González-Astorga et al. (2006). Na 1.93 1.73 1.80 1.73 1.80 HE 0.291 0.233 0.273 0.268 0.266 N 20 20 20 15 16 PP 38.04 40.76 44.57 40.76 37.50 97.28 ISSR Na 1.38 1.40 1.44 1.40 1.37 1.97 HE 0.128 0.149 0.143 0.149 0.140 0.240

4.3 Estructura genética La estructura genética de la población puede ser resultado de muchos factores, incluyendo el efecto de la deriva génica, el sistema de cruzamiento, el flujo génico, la selección natural y la

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historia ecológica de la especie, lo cual implica cambios en la distribución de los poblaciones y de los individuos al seno de las mismas, por efecto de la fragmentación del hábitat, lo cual da como resultado el aislamiento geográfico entre poblaciones (Ellstrand y Ellam, 1993). De acuerdo al análisis con el estimador theta (FST) de TFPGA, nuestros resultados indican, un grado de diferenciación del 44.4% entre las poblaciones. Este resultado sugiere que existe una mayor estructuración genética en las poblaciones de Zamia loddigesii usando ISSR, que respecto a lo que se había reportado para esas mismas poblaciones con aloenzimas (cf. FST = 0.179; González-Astorga, et al., 2006). El estadístico GST es típicamente usado para describir la cantidad promedio de diferenciación observada sobre múltiples loci (Ryman y Leimar, 2009), en nuestro estudio este valor es de 0.4092. Aunque GST suele ser usado como un análogo al FST, los resultados obtenidos no fueron exactamente los mismos, esto puede deberse a que el valor de GST es afectado por las diferencias en las tasas de mutación en los distintos loci evaluados (Ryman y Leimar, 2009). También, la discordancia entre FST y GST se puede deber a que los estimadores de diversidad por población sean muy variables (Nei, 1973), cosa que no es el caso de los resultados de esta tesis (ver Cuadro 3.5) ya que las diferencia entre FST y la GST es de solo el 3%. Los resultados que se obtienen con los métodos convencionales a partir de los estadísticos de Wright, son similares a los obtenidos siguiendo la aproximación de modelos bayesianos (Holsinger et al., 2002); siendo estos últimos ligeramente más consistentes ya que no se requiere asumir el equilibrio Hardy-Weinberg en las poblaciones. Los resultados obtenidos a partir de diferentes enfoques, nos permiten tener una mayor verosimilitud, ya que ante la imposibilidad de calcular el índice de endogamia (F IS) con

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marcadores dominantes y asumir a las poblaciones en equilibrio Hardy-Weinberg como en los enfoques tradicionales, permite comparar los resultados y observar las diferencias y similitudes (Cuadro 4.3). Además, considerando que el abordaje que se plantea con los modelos

bayesianos involucra el no tener que definir si las poblaciones están o no en equilibrio, sino que conforme las iteraciones avanzan, éste valor es estimado. Cuadro 4.3 Comparación de índices bajo dos enfoques
Índice Θ [HS] Aldama [HS]Misantla [HS]Monte Oscuro [HS]Oaxaca [HS]Tabasco HT GST-B PopGene 0.525 0.1286 0.1490 0.1435 0.1499 0.1402 0.2408 0.4092 Hickory 0.560 0.139 0.164 0.157 0.168 0.148 0.284 0.452

Hubo sin embargo un detalle en la estimación de FIS que se observó al comparar los resultados obtenidos de aloenzimas (cf. González-Astorga et al., 2006) y los estimados con el programa Hickory, esto es, que el valor estimado de este último es de f = 0.778, mientras que con datos de marcadores codominantes el estimado de la endogamia local es de FIS = 0.041, esto aparentemente surge no como un problema de sentido biológico, sino como un aspecto de la forma como se analizan los datos y se estiman los estadísticos (Holsinger y Lewis, 2003), donde se advierte que los marcadores dominantes pueden no ser muy apropiados para estimar ƒ (FIS), al menos bajo un marco bayesiano, lo cual se explica a partir de que los tamaños de muestra de las poblaciones son bajos; sin embargo otros estudios con poblaciones naturales y con simulaciones (Levsen et al., 2008) indican que es un problema que va más allá del tamaño de las poblaciones y se recomienda no confiar demasiado en estos valores si los resultados son muy contrastantes.

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4.4 Análisis de Varianza Molecular (AMOVA) En Zamia loddigesii, la mayor riqueza en diversidad genética está distribuida entre sus poblaciones (52.2%), más que dentro de ellas (47.7%). Se ha planteado que el nivel de heterogeneidad genética entre poblaciones es mayor en especies con poblaciones geográficamente disjuntas, que especies con distribuciones continuas (Hamrick y Godt, 1996). El rango de distribución de Z. loddigesii ha sido gradualmente limitado a pequeñas áreas aisladas y eventualmente se ha dividido en pequeñas poblaciones tipo islas. Así, la diferenciación genética probablemente haya ocurrido después de que estas barreras hayan surgido. En general, muchos estudios suelen considerar en el análisis de diferenciación, a los estadísticos FST, GST y ФST como equivalentes, aunque nuestros resultados muestran que los índices no son idénticos, sí podemos afirmar que en todos los casos, el grado de estructuración entre las poblaciones de Z. loddigesii es relativamente alto, de un 40.9% al 56%. A partir del valor de GST se estimó el flujo génico (Nm), que se refiere al movimiento de individuos entre las poblaciones, donde Nm = 0.361, lo cual nos indica que menos de un individuo está migrando por generación. Ellstrand y Ellam (1993) sostienen que una tasa de migración de 0.5 es considerado suficiente para superar los efectos de la deriva génica, por lo que podemos deducir que la deriva génica está moldeando la estructura al interior de las poblaciones. Esto se corrobora con los estimados de tamaño efectivo detectados con marcadores dominantes en las mismas poblaciones, donde se encontró que este tamaño efectivo varía de 9 a 57 individuos por población con una media de Ne = 20  15 (cf. GonzálezAstorga et al., 2006), lo cual es sintomático de que las poblaciones remanentes son relativamente pequeñas, y siguiendo a Octavio-Aguilar et al., (2009) esto representa

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aproximadamente la cuarta parte de la población de tamaño demográfico N T el cual variaría de entre ca. 40 a 200 plantas por población. De acuerdo a Hamrick y Godt (1996) y Hamrick et al., (1991), la distribución de la variación genética está fuertemente relacionada con caracteres de historia de vida, particularmente con los sistemas reproductivos y la dispersión, para ello el flujo génico también puede ser obstruido por barreras físicas, que impidan a un migrante atravesarlas, así como también pueden impedir el paso de un polinizador o dispersor (Levin, 1981; Slatkin, 1987). Al respecto, el nivel de flujo génico vía polen depende de la capacidad migratoria del polinizador. La evidencia nos indica que muchas cícadas tienen asociaciones simbióticas con insectos específicos, la mayoría escarabajos y gorgojos. Tales insectos son atraídos a los conos de las cícadas, algunas veces por fragancias, algunas veces por comida, albergue, lugar de cría y probablemente por combinaciones de todas ellas (Norstog y Fawcett, 1989; Norstog et al., 1992; Stevenson et al., 1998; Vovides, 1991; Vovides et al., 1997), dando oportunidad a la polinización; sin embargo, con los cambios en la reducción de las poblaciones, el saqueo de plantas, los incendios a los que se ven sometidas, causa que los polinizadores también se vean afectados (cf. Negrón-Ortíz y Breckon, 1989; Negrón-Ortíz et al., 1996). Por lo que con el transcurso del tiempo las poblaciones se vuelven cada vez más aisladas, y el tránsito de los polinizadores es muy probable que sea cada vez más difícil. En este contexto, y acentuando el aislamiento de las poblaciones de cícadas por la biología de los polinizadores, Hall et al., (2004) encontraron que el movimiento del polen por parte de los machos de curculionidos es muy bajo, menos de cinco metros en Lepidozamia peroffskyana.

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En el cuadro 4.4, se resume la información de un estudio previo de Zamia loddigesii con aloenzimas (González-Astorga et al., 2006), junto con los estudios que se han realizado en cícadas que utilizan marcadores dominantes de DNA; se incluye el único artículo donde se analizan ISSR en diferentes especies de plantas y se discute con su forma de vida, área de distribución y forma de reproducción (Nybom, 2004), finalmente realizamos una revisión de artículos donde se incluyen 74 plantas de larga vida y con algún grado de amenaza en sus poblaciones, usando únicamente marcadores ISSR. Cuadro 4.4 Resumen de diferentes estudios usando marcadores moleculares
Zamia loddigesii Cycas fairylakea Encephalartos latifrons Encephalartos barteri Cycas guizhouensis Cycas parvula Cycas balansae Cycas debaoensis Cycas balansae Promedio sin los datos propios 14 estudios 74 árboles Primers 11 6 16 11 12 12 9 12 11.14 11.9 PP 97.28 60.22 84.17 93.75 35.90 25.00 40.00 57.40 60.19 57.03 64.62 Na 1.38 I 0.38 0.232 0.347 0.169 0.083 0.192 0.315 0.316 0.236 0.250 HE GST/FST 0.240 0.409 0.356 0.315 0.138 0.026 0.297 0.231 0.108 0.432 0.054 0.098 0.13 0.400 0.215 0.342 0.211 0.602 0.188 0.220 0.232 0.305 0.340 0.379 ΦST 0.525 0.257 0.590 0.323 0.125 0.370 Nm 0.361 0.544 9.365 0.832 0.328 2.305 0.374 0.481 0.330 0.727 0.735 ISSR ISSR Nybom 2004 Marcador Referencia ISSR Presente tesis AFLP Jian et al., 2006 AFLP Da Silva et al., 2012 RAPD Ekué et al., 2008 ISSR Xiao et al., 2004 ISSR Xiao et al., 2005 ISSR Xiao et al., 2005 ISSR Xie et al., 2005 ISSR Xiao y Gong 2006

1.93 1.09 1.23 1.36 1.40 1.30

0.226 0.350 0.368

En un análisis con los principales marcadores moleculares dominantes Nybom (2004) indica que las especies de larga vida son las que presentan los valores más bajos de diferenciación genética entre poblaciones (ΦST = 0.25), así como los más altos en diversidad genética dentro de las poblaciones (HS = 0.25), mientras que los valores más altos corresponden a las formas de vida anuales (ΦST = 0.62 y HS = 0.13, respectivamente), los resultados obtenidos en Zamia loddigesii, son más parecidos a los encontrados en especies anuales, que a especies de larga vida. De igual forma, tomado en cuenta el sistema reproductivo en Z. loddigesii que es por fecundación cruzada, respecto los valores que reporta Nybom (2004), en nuestro estudio es más

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parecido a las especies vegetales con autofecundación (ΦST = 0.65), que a las especies con fecundación cruzada (ΦST = 0.27). Comparando los resultados presentados por Nybom (2004), con los obtenidos en nuestro análisis de 74 especies, se nota que la información es muy similar a lo ya reportado. Se observa que en las poblaciones de Zamia loddigesii hay valores de diversidad mayores a varias especies de plantas de larga vida, así como en el número de alelos y el índice de diversidad de Shannon, mientras es evidente que el grado de diferenciación entre las poblaciones es más alto en Z. loddigesii que en especies de vida larga, este último resultado se puede deber a que las poblaciones estudiadas estén expuestas al efecto de la fragmentación del hábitat, aunque aún no ha habido efecto de pérdida de diversidad genética, la cual se mantiene en plantas las adultas. Quizá una forma de detectar este efecto es evaluar otros estadios como semillas y plántulas (cf. González-Astorga y Núñez-Farfán, 2001; González-Astorga y Castillo-Campos, 2004), aunque en un estudio por categorías de historia de vida en Dioon edule, Octavio-Aguilar et al., (2009) encontraron que la cohorte de las semillas son un reservorio de variación genética, cosa que también podría estar ocurriendo en las poblaciones de Z. loddigesii. Al comparar únicamente entre especies de cícadas, vemos que Encephalartos barteri Carruth ex Miq., posee también altos índices de diversidad, pero a pesar de ser una especie vulnerable de acuerdo a la IUCN, se encuentran menos estructuradas sus poblaciones y mantiene un flujo mayor de individuos que Z. loddigesii. En promedio para los datos acumulados de cícadas, el porcentaje de polimorfismo que se obtiene es muy inferior (57.03%), comparado a los valores de Z. loddigesii.

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Con el número de primers usados, se obtuvieron buenos resultados para la detección de diversidad genética en Zamia loddigesii, es hasta ahora la especie con más altos índices de polimorfismo; así, en otras cuatro especies (Xiao et al., 2005; Xiao y Gong, 2006; Ekué et al., 2008) se han empleado un mayor número de primers en sus estudios (de 12 a 16) y la diversidad muestreada no ha sido tan alta, tampoco en el número de bandas reportadas por individuo. Es de resaltar los bajos índices reportados en Cycas parvula (25% de polimorfismo), donde se emplearon 12 primers, nuestros resultados indican que con el número de primers usados, se tiene una buena representación del genoma, que aporta información sobre la diversidad genética de Z. loddigesii. Ha sido reportada una alta diversidad genética en otras cícadas que tienen distribución restringida y bajas densidades poblacionales (cf. Macrozamia riedlei: Byrne y James, 1991; Dioon edule: González-Astorga et al., 2003; D. angustifolium: González-Astorga et al., 2005; D. sonorense, D. tomasellii y D. holmgrenii: González-Astorga et al., 2008). Otra información que se obtiene de estas comparaciones es ver que en la mayoría de estudios sobre diversidad genética con especies del orden cicadales, ha mostrado que las cícadas se caracterizan por baja variación dentro de las poblaciones y alta diferenciación entre poblaciones (Ellstrand et al., 1990; Walters y Decker Walters, 1991; Yang y Meerow, 1996; Sharma et al., 1999; González-Astorga et al., 2003, 2005, 2006, 2008; Xiao et al., 2004, 2005; Xiao y Gong, 2006; Cibrián-Jaramillo et al., 2010; Xiao et al., 2004; Xiao et al., 2005; Da Silva et al., 2012), resultados que concuerdan con la hipótesis planteada para Z. loddigesii, donde se esperaba que de acuerdo con estos antecedentes la diferenciación fuera mayor entre poblaciones, que dentro de ellas.

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4.5 Distancias genéticas Las distancias genéticas en algunas poblaciones fueron muy similares. La menor distancia está entre las poblaciones de Monte Oscuro y Tabasco (0.1289), se esperaría que estos valores bajos fueran entre las poblaciones de Misantla y Monte Oscuro (ambas en Veracruz) por ser las más próximas geográficamente. Por otro lado, las distancias genéticas entre las poblaciones de Monte Oscuro, Oaxaca y Tabasco fueron muy parecidas, algo que en los dendrogramas complica la construcción de los nodos. Esta falta de concordancia se puede deber al origen diferencial de las poblaciones. 4.6 Análisis de agrupamiento Debido a los resultados obtenidos y comentados en las distancias genéticas entre las poblaciones y entre los individuos, los dos métodos de agrupación usados difieren en cuanto a las agrupaciones obtenidas. 4.6.1 UPGMA El dendrograma usando el método de Nei (1978) se construyó siguiendo varios algoritmos y entre todas las repeticiones tenemos que en ocasiones las poblaciones de Oaxaca y Tabasco, son las más emparentadas, mientras que en otras, se agrupan Monte Oscuro y Tabasco (como el dendrograma mostrado en la figura 3.4). Esta dificultad obedece a que el método, ejecuta una reducción progresiva de la matriz de similaridad por lo que en ocasiones el programa asocia de una manera, y de forma diferente en otras, seleccionando a una población distinta con la misma probabilidad. Esto es evidente entre el nodo que agrupa a Monte Oscuro con Tabasco cuya distancia es de 0.128, mientras que en el siguiente nivel que incluye a la población de Oaxaca la distancia

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es de 0.130, por lo que la diferencia entre estas tres poblaciones es muy escasa. 4.6.2 Neighbor-Joining Los resultados para Zamia loddigesii muestran que todos los individuos pertenecen a sus correspondientes poblaciones, sin embargo debido a que los modelos utilizan distancias genéticas y como se comentó previamente, los resultados variaron entre las diferentes repeticiones. Manteniendo de forma general una agrupación entre las poblaciones de Monte Oscuro en Veracruz, Oaxaca y Tabasco. 4.6.3 Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) Los dendrogramas construidos para Zamia loddigesii, aportan poca información sobre la distribución de las poblaciones, sin embargo con un PCoA se puede apreciar cómo se organizan los individuos en un espacio tridimensional. Las poblaciones que resultaban en complicaciones para los dendrogramas, cuando las poblaciones que resultaban en complicación para los dendrogramas se visualizan en el espacio tridimensional, se puede notar que se encuentran muy próximas y que cualquier individuo podría estar fácilmente relacionado con la población vecina. Por otra parte, la población de Misantla en Veracruz, que se ubica en el centro de la distribución de la especie, resultó ser la más distanciada de las demás poblaciones, lo que nos proporciona indicios de una falta de relación entre la distancia genética y geográfica de la especie. 4.7 Análisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA) El SAMOVA, mostró que ninguno de los tres escenarios probados fuera significativo. Sin embargo, la forma de agrupamiento entre poblaciones en consistente con los UPGMA construidos. Cuando se formaron tres grupos (K = 3), el análisis incluyó en el mismo grupo a las

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poblaciones de Monte Oscuro en Veracruz, Oaxaca y Tabasco (sureste) y separó a Aldama en Tamaulipas y Misantla en Veracruz, esto como resultado de las diferencias tanto en la mayoría de índices, donde la población de Aldama es una de las menos diversas, mientras que Monte Oscuro en Veracruz, Oaxaca y Tabasco son muy similares entre ellas, incluso geográficamente y Misantla es separada del análisis por poseer valores más altos que los demás, a pesar de encontrarse geográficamente relacionada con el grupo del sureste, algo que podría deberse a un origen relativamente reciente de la población de Misantla. 4.8 Prueba de Mantel Respecto a la relación de la distancia geográfica con la distancia genética, nuestra hipótesis planteada suscribe que las poblaciones más cercanas, serán más semejantes genéticamente. Sin embargo la prueba de Mantel confirma que no existe una relación significativa entre ambas distancias, lo cual sugiere que Zamia loddigesii no sigue un modelo de aislamiento por distancia sensu Wright (1943). Éstos resultados contrastan con otros estudios en cícadas como el caso de Dioon edule donde sí se encontró una relación entre la distancia geográfica y la genética (Gonzalez-Astorga et al., 2003) A pesar de que los resultados muestran que no existe correlación entre la distancia geográfica y la distancia genética entre todas las poblaciones analizadas, se puede decir que hay una tendencia a considerar que la distancia influye en la diferenciación genética de algunas agrupaciones, en particular en la disminución de la diversidad. Por ejemplo, las poblaciones de Aldama y Tabasco son las poblaciones que se encuentran más distanciadas, esto es, en ambos extremos de la distribución de la especie y son también estas poblaciones las que poseen los valores más bajos de diversidad en polimorfismos.

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Generalmente, el grado de diferenciación de una especie surge con el incremento de la distancia geográfica (Wright, 1946; Moyle, 2006; Pusadee et al., 2009), sin embargo esto no aplica para Z. loddigesii (prueba de Mantel). Los resultados mostraron que la diferenciación genética es afectada no solo por deriva genética y aislamiento geográfico, sino por otros factores. Primero, al comparar los resultados obtenidos con las distancias geográficas, la población de Monte Oscuro en todos los análisis, se agrupa con las poblaciones del sur: Oaxaca y Tabasco, donde la distancia que los separa es de 141.1 y 398.6 km respectivamente, mientras que existe muy poca relación genética con la población de Misantla, donde la distancia que los separa es de apenas 70km, estos resultados podrían sugerir que la deriva génica es una fuerza que ejerce presión sobre estas poblaciones (Xiao et al., 2004). Segundo, la destrucción/reducción del área de distribución, afecta el flujo génico de la especie. Aldama puede representar una población genéticamente aislada con un tamaño de población, relativamente pequeño, debido a su tamaño y endogamia en marcha, aumentada por deriva genética, podría explicar la fijación de bandas y un número muy bajo en el número de alelos efectivos (Templeton, 2006). Por lo tanto, una existencia discontinua y pequeños tamaños de población relacionadas con esta distribución, son factores importantes que resultan en un alto grado de diferenciación entre poblaciones. Tercero, las distancias genéticas sugieren que existen ciertas restricciones geográficas influenciando las agrupaciones entre las poblaciones. Un factor importante podría ser la franja que representa el Eje Neovolcánico Transversal, ya que es una barrera geográfica que podría limitar la distribución no solo de los individuos, sino constituir una barrera insuperable para los

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polinizadores de Zamia loddigesii, principalmente insectos de la superfamilia Curculionoidea (Norstog y Fawcett, 1989; Norstog et al., 1992, Vovides et al., 1997). Finalmente, sustentados en la acumulación de esta información, así como el alto número de bandas únicas que la caracteriza y estar alejada genéticamente del resto de las poblaciones (PCoA, figura 3.6), nos lleva a proponer que Misantla es una población de origen reciente y podría haberse originado a partir de la población de Monte Oscuro, considerando su alta diversidad y sobre todo la proximidad geográfica y genética que las une. 4.9 Implicaciones para la conservación El conocimiento de la variación genética entre y dentro de las poblaciones de especies raras y amenazadas juega un papel muy importante en la formulación de estrategias apropiadas para su manejo y conservación. Nuestros resultados indican que Zamia loddigesii posee relativamente altos niveles de diversidad genética y una alta diferenciación espacial en su rango de distribución. Considerando el alto nivel de diferenciación genética entre las poblaciones, todas las poblaciones deben ser protegidas in situ para conservar la variación existente en la especie. La preocupación principal está en las poblaciones de Monte Oscuro, Misantla y Oaxaca, que son las más diversas y poseen alelos particulares, en contraste, son poblaciones que no están protegidas localmente, por lo que es importante tomar acciones para resguardarlas. El establecimiento de áreas protegidas alrededor de estas poblaciones podría ser la mejor opción para conservar los recursos genéticos de la especie. La población de Monte Oscuro es la única donde ya se han tomado ciertas medidas para proteger a la población y seguir un uso sustentable de la población (Vovides et al., 2002). Dicho lo anterior, de considerarse la

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conservación ex situ, las semillas deben ser colectadas, pero evitando ser mezcladas entre las poblaciones para mantener su estructura genética. El plan de acción de cícadas de la IUCN/SSC (Donaldson, 2003) identificó un número de posibles intervenciones para el manejo de poblaciones pequeñas de cícadas, incluyendo la introducción de plántulas a jardines botánicos, polinización artificial de plantas silvestres y la translocación de plantas para crear subpoblaciones viables con proporciones de sexos balanceadas. De este modo se favorecería la conservación in situ al disminuir la extracción de ejemplares de las poblaciones naturales y la conservación ex situ al promover la supervivencia de ejemplares fuera de su medio natural (Primack, 1993). 4.10 Conclusiones Zamia loddigesii, es una especie de amplia distribución en México, puede vivir en diferentes tipos de hábitats y adaptarse a condiciones adversas, lo que le ha permitido permanecer como especie. Los marcadores moleculares ISSR son una herramienta útil en el estudio de la diversidad genética en especies que han sido poco estudiadas, estos marcadores, proveen de un alto número de bandas, e información para caracterizar a nivel de individuos y poblaciones. De acuerdo a nuestras hipótesis, los niveles de diversidad genética fueron superiores a los reportados con aloenzimas y se encontró una mayor diversidad entre las poblaciones, que dentro de ellas. Sin embargo a diferencia de lo que se esperaba en nuestra hipótesis, la distribución de la especie no sigue un modelo de aislamiento por distancia, sino que la distribución actual de las poblaciones obedece a procesos más allá de la distancia.

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Zamia loddigesii, posee altos niveles de diversidad a nivel de especie, pero a nivel de poblaciones su diversidad es baja. Los resultados indican que las poblaciones ubicadas en los extremos de la distribución de la especie, presentan problemas en la fijación de bandas y pérdida de diversidad. Numerosos estudios teóricos y empíricos predicen que la reducción en el tamaño efectivo de la población y un incremento en el aislamiento de las poblaciones puede llevar a una erosión genética a través de una mayor deriva genética (Ellstran y Elam, 1993), mayor endogamia (Keller y Waller, 2002) flujo génico restringido y reducidas tasas de inmigración (Couvet, 2002; Li y Jin, 2008). La dificultad para separar en los fenogramas a las poblaciones de Monte Oscuro, Oaxaca y Tabasco, obedece a la similitud que comparten en el número de alelos, diversidad de Shannon y de Nei. Esta información nos lleva a proponer una reconstrucción de los eventos que pudieron dar origen a la estructuración actual de las poblaciones (Figura 4.2). Planteamos que Zamia loddigesii, tuvo una distribución continua desde Tamaulipas, hasta Tabasco o Chiapas, posiblemente originado del Norte, debido a su mayor número de bandas por individuo. En un segundo momento, hubo una reducción y aislamiento en la población de Aldama, esto por su alto número de bandas fijas y sus bajos valores de diversidad en general. Con el tiempo, surge la población de Misantla a partir de una población con alta diversidad: Monte Oscuro (y tal vez Oaxaca), de igual forma, las distancias genéticas y geográficas las avecinan. Finalmente, la población de Tabasco presenta bajos valores de diversidad, pudiendo ser esto como consecuencia de un aislamiento que empieza a notarse en la fijación de sus bandas, que para este caso, representa pocas bandas por individuo y por lo

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tanto menor polimorfismo. Esto potenciado por los bajos valores de flujo génico que existe entre todas las poblaciones.

Figura 4.2 Reconstrucción de escenarios

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