Flores Avilés Irving

Tópicos Selectos de Biotecnología II

BIOINSECTICIDA BIFUNCIONAL: GENES Lin EN BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP. AIZAWAI, PROTEÍNAS CRY Y DEGRADACIÓN DE AGROTÓXICOS OBJETIVO: El objetivo consiste en clonar el gen Lin A de Sphingomonas japonicum UT26, primer paso en la ruta de degradación de el compuesto organoclorado toxico “lindano” utilizado como insecticida químico en Bacillus Thuringiensis Subsp. Aizawai para conferirle una doble función; la original como bioinsecticida a través de las proteínas cry y la segunda como degradador del agro toxicó objetivo.

Fig 1. Primer paso de la Ruta de degradación del “Lindano” en S.Japonicum UT26 (Ngata et al., 2010)

Material y Metodo. PLASMIDO. La razón por la cual se escoge el vector lanzadera E.coli-Bt pHT315 es porque este ha sido construido usando pHT1030 un fragmento de DNA 2.6-kb HpaI-BalI que contiene el origen de replicación y la región de estabilidad que fue aislado de un plasmido pHT1035 6.3-kb residente original estable de B.Thuriengiensis al cual se le quito el sitio de restricción de HindIII previamente. Un fragmento 1.2-kb Kpn1-BamH1 que contiene el gen constitutivo de resitencia a eritromicina de Tn1545 (TrieuCuot et al., 1990). Se prosiguió con que cada región HpaI-BalI fue clonada en el sitio de restricción SspI de pUC19 con el fragmento que contiene el gen de resistencia a eritromicina atraves de una ligacion conjunta en un solo paso(three-way ligation). (Arantes and Lereclus et al., 1991). Asi disponemos para su utilización del Sitio Multiple de Clonación de pUC19 para introducir nuestro gen de interés.

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Se ha reportado que este vector funciona mejor en comparación con otros vectores construidos debido a que presenta un mayor número de clonas. (Seker et al.,2005. Y debido a que se ha reportado que se han construido vectores en base a el E.coli/B.Thuringiensis vector lanzadera pHT135 para introducir genes en Bacillus thuringiensis subsp. Aizawai (Wang et al., 2006) y para sobreexpresar el gen cry3Aa11 de Bacillus thuringiensis subs Mm2 (Kurt y Ozcengiz et al. 2009)

Fig 2. Construccion del vector lanzadera E.Coli/B.Thuringiensis pHT135 (Arantes and Lereclus et al., 1991).

FRAGMENTO de DNA
Enzima de interés: “gamma-hexaclorociclohexano deshidroclorinasa”

LinA
gtgcgaaatg acttccacac actgattacc ccgcgctcac gccagagtac cctcaatggt tgtctacggc tgtctagatc aatgccggcc cccgtcacgg ttcgacgaga aaattccaag gttattggcc ccactctgca aatgagcttg actcat ttatg agcggggtga cgctcatact tttccaagga cgcagattgg aaatcgaggg tcatcccacc tcagagtaga cgccggacgg aatagttcgt catccgtgaa gaaggacgtc ttccataatg cgccttccgg aaatagaagc ggtcctgaat tgcgaaatga gcatgcgttg gaccgcagcg gccaatacca aatacattcg gcccttgtag gagacggccc cgcggcccgg atgccgggcg cgcttagaga ataagaatcg tttaccttgt tgaaacattg gtgccgattc tcttggcgct cttgcaagtc

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METODO: Ligación por medio de enzimas de restricción. Analizando los sitios de corte presentes en el fragmento de ADN de interés.

Habiendo identificado 2 enzimas de restricción que no cortan el gen de interés y que están presentes en el MCS de pUC19.

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Pasos:

1.- Incorporar los sitios de restricción en el 5’ terminal de los primers específicos Forward y Reverse para el gen. La amplificación de LinA del genoma de S.Japonicum UT26 puede llevarse a cabo utilizando los siguientes primers.

FORWARD- 5’-GTCGACTTATGCGCCGGACGGTGCGA-3’

REVERSE- 5’-CTGCAGATGAGTGATCTAGACAGACT-3’

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2.-Realizar la amplificación de el gen de interés con PCR, purificar el producto y digerir el amplicon del PCR con las enzimas de restricción Sal y PstI. 3.- Paralelo a esto, digerir el vector lanzadera E.coli/B.Thuringiensis pHT315 con las mismas enzimas de restriccion.

4.- Ligar el producto de PCR y el vector, previamente digeridos.

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Se utiliza el pUC19 dado que únicamente se requiere asegurar que el gen puede ser introducido en el MCS de este con los primers diseñados puesto que pUC19 es parte de el vector lanzadera E.coli/B.Thuringiensis pHT135. Conclusiones: El desarrollo de una nuevas estrategias de clonación y la construcción de nuevos vectores de expresión en Bacillus Thuringiensis nos permitirá ampliar la gama de compuestos organicos persistentes y toxicos para el medio ambiente que Bt podra degradar mientras realiza su función principal de bioinsecticida. Como primer acercamiento se introdujo el Gen LinA a Bt en este trabajo, pero se deben de adapatar las tecnologías recientes como MultiSite Gateway® Pro Kits para poder clonar hasta 4 o mas fragmentos de DNA de interés que participan en la ruta de degradación de interés.

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Comprobando el marco de lectura

Referencias:
      Arantes, Lereclus (1991) Gene. 108 115-l 19 Kurt, Ozcengiz (2011) Turk J Biol35 585-592 Lin-Chao, S., Chen, W.-T. and Wong, T.-T. (1992) Mol. Microbiol., 6, 3385–3393 Sansinenea, Vazquez, Ortiz.(2010) Biotechnol Lett 32:1549–1557

S. Thamthiankul . W. J. Moar . M. E. Miller .W. Panbangred (2004) Appl Microbiol Biotechnol (2004) 65: 183–192 Ginxin Yan, Fuping Song (2009) Biotechnol Lett 31:697–703

Guangjun Wang . Jie Zhang . Fuping Song . Jun Wu . Shuliang Feng Dafang Huang (2006) Appl Microbiol Biotechnol 72: 924–930

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