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UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIN LIC.

BIOLOGA GENTICA MOLECULAR PROFESOR: FRANCISCO BECERRA

Jeisson Mayorga Riveros

20052140040

Tcnicas de PCR

La electroforesis es la tcnica estndar de referencia para tipificar la mayora de bacterias, hongos y parsitos con importancia clnica, debido a que posee un elevado poder de discriminacin pero es muy laboriosa y duradera (la mayora de los protocolos de trabajos requieren ms de 4 das para poder obtener y analizar por este motivo se utilizan las diferentes tcnicas de PCR que son tambin muy eficaces pero que son menos complicadas, menos costosas, y mas rpidas. La tcnica de PCR-RFLP se basa en la digestin con enzimas de restriccin de productos de amplificacin de genes o secuencias de ADN polimrficas por lo que su poder de discriminacin y reproducibilidad suelen ser algo inferiores al de los mtodos pero ms sencillas por lo que la principal ventaja de la PCR-RFLP radica en la rapidez y simplicidad de la tcnica, que permite la obtencin de resultados en una sola jornada, lo que implica bajo costo y adems tiene tambin una reproductibilidad alta lo que la hace ms eficiente.

La rep-PCR es otra tcnica de tipificacin en la que se utilizan cebadores que hibridan con secuencias de ADN repetidas o repetitivas (secuencias rep) que se encuentran distribuidas en el cromosoma de muchas enterobacterias y algunas bacterias grampositivas y hongos, como estas secuencias son cortas es muy poco el material gentico el que es necesario replicar, por lo que esta tcnica es de las ms eficientes ya que ubica deleciones o inserciones de ADN y es muy utilizada

para la identificacin de enterobacterias, se necesita muy poco tiempo para los resultados, y es fcil reproductibilidad por lo que tambin produce un bajo costo. La tcnica de REP-PCR se caracteriza por su simplicidad (no requiere el uso de enzimas de restriccin, ni tcnicas electroforticas especiales), la tcnica posee un poder de discriminacin y reproducibilidad inferiores a los de la PFGE, aunque para algunas bacterias, como A. baumannii, se ha visto que la REP-PCR presenta un poder de discriminacin similar al de la PFGE y superior al de la AP-PCR En la amplificacin al azar de ADN polimrfico (RAPD) o PCR con iniciadores arbitrarios (AP-PCR) se utilizan uno o varios cebadores con secuencias de nucletidos aleatorias y de corta longitud (8-12 nucletidos) que hibridan con regiones inespecficas del genoma en condiciones de baja estringencia (temperatura de anillamiento a 36-45 C y > 2 mM MgCl2), pensara que es la tcnica ms cuestionada porque no tiene una buena reproductibilidad ya que es muy sensible a variaciones como la temperatura, la muestra o hasta el termociclador , y los resultados varan entre laboratorios, por lo dems la tcnica es econmica, y no requiere mucho tiempo, adems de ser la ms sencilla, y la mas fcil para la interpretacin de resultados. Es utilizado para la identificacin de varias bacterias aunque no es tan sensible. El estudio del polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP) se fundamenta en la amplificacin mediante PCR de fragmentos de restriccin (generados a partir de ADN cromosmico) a los que previamente se les ha unido unos adaptadores que hibridan con cebadores especficos, Los protocolos de AFLP ms utilizados suelen emplear 2 enzimas de restriccin y cebadores fluorescentes. Las ventajas ms interesantes de este mtodo son su elevada sensibilidad y su excelente poder de discriminacin Los protocolos de AFLP ms utilizados suelen emplear 2 enzimas de restriccin y cebadores fluorescentes. Las ventajas ms interesantes de este mtodo son su elevada sensibilidad y su excelente poder de discriminacin. Esta tcnica aunque es menos discriminativa que la tcnica PFGE podramos decir que es una tcnica muy comercial ya que identifica bacterias como la salmonella, y otras que tienen implicaciones en la salud de los humanos Entre los principales inconvenientes de esta tcnica hay que destacar su laboriosidad, el elevado coste del equipo, por que hace que no sea del todo comercial, pero se podra optimizar con la mejor comprensin y optimizacin del bandeo

la (MLST) basada en la amplificacin y secuenciacin de genes denominados housekeeping, genes ribosomales y/o genes relacionados con factores de virulencia, pueden utilizarse como mtodo preliminar para el estudio de la relacin

clonal entre microorganismos de una misma especie, esta tcnica es complicada, necesita de especialistas, es de alto costo por lo mismo pero podra ser una tcnica eficiente en la deteccin de muchos virus sin diagnostico de laboratorio

La PCR Mltiple utiliza mtodos de control lo que la hace muy eficiente en la deteccin de sepas completas, permite ponderar la deteccin de la mayor cantidad de microorganismos especificados por parte de la tcnica evaluada y la ausencia de reaccin positiva con otros gneros y especies relacionados. La seleccin de un mnimo de 50 cepas puras de microorganismos relacionados y la seleccin de un mnimo de 30 cepas potencialmente competitivas deben ser analizadas como cultivos puros, esta tcnica tiene una alta confiabilidad, tiene un costo moderado y es de fcil reproducibilidad, no es muy costosa pero requiere ms tiempo y mano de obra que las otras tcnicas.

La RT-PCR se usa para el anlisis cuantitativo del mRNA del regulador transductansa transmembranal de fibrosis cstico CFTR. Este mtodo proporciona un conveniente mtodo a travs del formato puesto para QC RT-PCR. Esta tcnica se hace en tiempo real observando el tinte fluorescente que va tiendo secciones de ADN especifico segn el primer esta tcnica permite detectar secciones del mARN que codifican para la sntesis precursores para algunas enfermedades congnitas, en este caso la de la fibrosis qustica, se hace en tiempo real para que se permita observar el bandeo y la intensidad de las bandas lo que permite identificar secciones especificas durante la prueba

A lo largo de los aos se han desarrollado varias tcnicas de PCR para la amplificacin de secciones e ADN lo que ha ayudado en la identificacin en su mayora de enfermedades ya sea producidas por agentes patgenos como por factores congnitos, cada una mas especifica, sencilla o econmica que la anterior, es una tcnica muy efectiva y muy til para muchas otras cosas, como en la biotecnologa, lo que la hace una tcnica que con el tiempo va a coger ms fuerza y va a tener muchas mas aplicaciones tanto en la medicina como en la economa mundial.